डिम्बग्रंथि के कैंसर के ट्यूमर शुरुआत कोशिकाओं की इन विट्रो संवर्धन में

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House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells. J. Vis. Exp. (96), e52446, doi:10.3791/52446 (2015).

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Abstract

Introduction

डिम्बग्रंथि कैंसर रुग्णता और मृत्यु दर इस रोग की अत्यधिक आवर्तक, chemoresistant सुविधाओं होने का प्रमुख कारण के साथ संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे घातक स्त्रीरोगों द्रोह है। कुछ मामलों 1 में फायदेमंद हो सकता है neoadjuvant चिकित्सा का सुझाव करने के लिए कुछ सबूत है, हालांकि वहां प्राथमिक उपचार आमतौर पर अधिक से अधिक cytoreductive सर्जरी और बाद में प्लैटिनम आधारित थेरेपी शामिल हैं। रोगियों के बहुमत प्राथमिक उपचार के लिए अनुकूल प्रतिक्रिया है, लेकिन दुर्भाग्य से आधे 18 महीने 2 के भीतर पलटा जाएगा।

अधिकांश डिम्बग्रंथि कैंसर उपकला कार्सिनोमा हैं और अंडाशय या फैलोपियन ट्यूब 3,4 की सतह epithelia में ही शुरू हो सकता है। कई अध्ययनों से संभवतः ovulation के 5,6 निम्नलिखित की जरूरत है कि ऊतकों की मरम्मत में सहायता कि महिला प्रजनन प्रणाली में दैहिक स्टेम कोशिकाओं के अस्तित्व का समर्थन है। ovul दौरान अंडाशय और फैलोपियन ट्यूब दोनों पर उच्च proliferative गतिविधिसमझना (। Gharwan, एट अल प्रस्तुत पांडुलिपि) डिम्बग्रंथि के कैंसर के विकास में एक महत्वपूर्ण कारक हो सकता है। ट्यूमर के गठन की कोशिकाओं की व्युत्पत्ति स्पष्ट नहीं है, लेकिन वे विभाजन या भाग्य को विनियमित करने में असमर्थ हैं उन्हें प्रस्तुत करना है कि म्यूटेशन के माध्यम से सामान्य स्टेम सेल, पूर्वज कोशिकाओं, या विभेदित कोशिकाओं से उत्पन्न हो सकती है। इन कोशिकाओं को भी ", कैंसर की शुरुआत कोशिकाओं" "कैंसर स्टेम कोशिकाओं," या करार दिया गया है और कम लगाव शर्तों के तहत tumorigenic, बहुकोशिकीय spheroids के रूप में विकसित कर सकते हैं। घरेलू विकास की पदानुक्रमित मॉडल गतिशील हो सकता है, tics कीमोथेरेपी, लंबी अवधि के आत्म नवीकरण और विभिन्न सेल प्रजातियों 7,8 में अंतर करने की क्षमता के लिए निष्क्रियता है, प्रतिरोध सहित सामान्य स्टेम कोशिकाओं के रूप में एक ही सुविधाओं के कई साझा करते हैं।

कई अध्ययनों से डिम्बग्रंथि के कैंसर में tics के अस्तित्व का समर्थन और वर्तमान प्रयासों इन कोशिकाओं tumorigenesis 9-11 का समर्थन व्यवस्था है जिसके द्वारा (ओं) को स्पष्ट करने के लिए चल रहे हैं। प्रत्येक मार्कर की सटीक योगदान स्पष्ट नहीं है और 11-16 विशेष सेल प्रकार का हो सकता है, हालांकि कई मार्करों, CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, और MyD88 सहित बढ़ाया tumorigenicity साथ डिम्बग्रंथि tics की पहचान करने के लिए प्रस्तावित किया गया है। एक सार्वभौमिक मार्कर या मार्कर का सेट स्पष्ट डिम्बग्रंथि tics के लिए स्थापित नहीं किया गया है, वहीं विभिन्न समूहों उच्च एल्डिहाइड डिहाइड्रोजनेज (ALDH) गतिविधि 13,17-21 साथ CD44 + के लिए CD133 + और ​​/ या कोशिकाओं का चयन करके और अधिक सामान्यतः डिम्बग्रंथि tics अलग है। CD44 Hyaluronic एसिड के लिए एक रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है और आसंजन, प्रसार, प्रवास, angiogenesis और भेदभाव 22 सहित ट्यूमर प्रगति के लिए महत्वपूर्ण कई प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है कि एक transmembrane ग्लाइकोप्रोटीन है। CD133 समारोह जिसका अभी स्पष्ट नहीं है लेकिन अध्ययन से यह प्लाज्मा झिल्ली टोपोलॉजी 23 का आयोजन का सुझाव एक transmembrane ग्लाइकोप्रोटीन है। ALDH, एल्डीहाइड के ऑक्सीकरण catalyzes कि एक intracellular एंजाइम, सबसे विश्वविद्यालय में हो सकता हैउच्च गतिविधि के रूप में tics के अल मार्कर सामान्य स्टेम कोशिकाओं और tics 24 के समर्थन में ALDH करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है ऊतकों और कई भूमिकाओं की एक किस्म से पृथक स्टेम कोशिकाओं को पहचान लिया गया है। अब के रूप में, CD133 और ALDH1 डिम्बग्रंथि tics 13,21 के सबसे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मार्करों होना दिखाई देते हैं।

Tics की विशेषताओं को समझने के लिए इसके अलावा, विशेष रूप से इस उप-जनसंख्या लक्ष्य है कि दवाओं की पहचान के लिए एक बड़े प्रयास भी है। डिम्बग्रंथि के कैंसर के साथ जुड़े उच्च पलटा दर सफलतापूर्वक tics उन्मूलन के लिए वर्तमान chemotherapies की विफलता की वजह से हो सकता है। ट्यूमर के थोक मौजूदा उपचार के लिए अतिसंवेदनशील है, tics प्रतिरोधी और मानक विधियों द्वारा undetectable एक घनत्व में माना जाता है। चिकित्सा प्रतिरोध और ट्यूमर पतन की elucidating तंत्र की प्रतिक्रिया और डिम्बग्रंथि के कैंसर के रोगियों की कुल जीवित रहने की दरों में सुधार के लिए महत्वपूर्ण हैं।

इधर, संस्कृति तकनीक वें वर्णित हैंपर स्थापित किया है और प्राथमिक डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों से tics के लिए समृद्ध। इस के साथ साथ वर्णित संस्कृति शर्तों स्टेम सेल गुणों 11,12,14,16,20 साथ tics या अंडाकार आकृति कोशिकाओं के प्रसार को प्रेरित करने के लिए कई समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया है। सामान्यतः tics समृद्ध बनाने के लिए इस्तेमाल किया कई स्टेम सेल संस्कृति medias और पूरक हालांकि वहाँ / spheroids हम EGF और FGF के साथ एक सीरम मुक्त मीडिया फार्मूला इस्तेमाल किया, लेकिन B27 या एन-2 की खुराक के अलावा बिना। सामान्यतः neuronal सेल संस्कृति और स्टेम कोशिकाओं के लिए समृद्ध बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है इन पूरक, एक mesenchymal फेनोटाइप 25,26 बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है और एक mesenchymal या उपकला फेनोटाइप होने tics अधिक tumorigenic रहे हैं कि क्या करने के रूप में मैदान में कुछ अनिश्चितता बनी हुई है किया गया है 27-29 । अनिश्चितताओं और चर को कम से कम करने के लिए हम हम उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं, के बाद से सबसे आम सूत्र का उपयोग करने का विकल्प चुना।

एक कम लगाव फ्लास्क में सीरम मुक्त मीडिया में कोशिकाओं को बनाए रखनेअंडाकार आकृति के गठन की सुविधा और CD133 अभिव्यक्ति और उच्च ALDH गतिविधि के साथ कोशिकाओं के प्रसार का समर्थन करता है। हमारा काम आगे सामान्य पक्षपाती शर्तों के तहत अस्थायी कोशिकाओं को भी एक और अधिक tumorigenic टिक आबादी का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं दिखाया गया है। Athymic नग्न चूहों में इन परिस्थितियों में विकसित कोशिकाओं के इंजेक्शन सीरम की उपस्थिति में जुड़ी शर्तों में विकसित कोशिकाओं की तुलना में अधिक है tumorigenic संभावित की ओर जाता है। डिम्बग्रंथि के कैंसर दीक्षा, प्रगति, चिकित्सकीय प्रतिक्रिया है, और रोग पतन में tics की भूमिका के बारे में ज्यादा जानकारी के लिए इन तकनीकों के उपयोग के माध्यम से प्राप्त की जा सकती है।

Protocol

डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों के 1. पारंपरिक संस्कृति (पक्षपाती शर्तें)

नोट: कोशिकाओं और मीडिया के सभी हैंडलिंग एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में जगह ले जाना चाहिए

  1. पारंपरिक सेल संस्कृति मीडिया तैयार करें। एक DMEM: 1 का प्रयोग करें F12 (एल glutamine, 15 मिमी HEPES) और 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक। 0.45 माइक्रोन वैक्यूम फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर समाधान।
  2. Interest.Remove की सेल लाइन अल्ट्रा कम फ्रीजर या तरल नाइट्रोजन से कोशिकाओं की शीशी में से एक पारंपरिक नाम, तारीख के साथ लेबल polystyrene के 75cm 2 टिशू कल्चर फ्लास्क, और बीतने संख्या तैयार करें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखकर Defrost।
  3. 3 मिलीग्राम (ऊपर) तैयार पारंपरिक सेल संस्कृति मीडिया वाले एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में शीशी से स्थानांतरण निलंबन। 400 x जी पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र निलंबन। इस बीच, फ्लास्क 16 मिलीलीटर पारंपरिक सेल संस्कृति मीडिया जोड़ें।
  4. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला। गोली और हस्तांतरण निलंबन फ्लास्क ढीला करने के लिए ऊपर और नीचे 2 मिलीलीटर पारंपरिक सेल संस्कृति मीडिया pipet कोशिकाओं का उपयोग करना। धीरे रॉक कुप्पी में समान रूप से 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के लिए सेट humidified सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में cells.Place कुप्पी वितरित करने के लिए। 80% संगम तक पहुँच जाता है जब तक दैनिक कोशिकाओं मॉनिटर।
  5. दो सेल संस्कृति हुड में: कोशिकाओं रहे हैं एक बार में 80% मिला हुआ संस्कृति एक विभाजित। महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और (कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना) गर्म फॉस्फेट बफर खारा के साथ धोने (पीबीएस)। 1.5 मिलीलीटर ट्रिप्सिन 0.25% -EDTA जोड़ें और आरटी पर 3-5 मिनट सेते हैं।
  6. 2 नए polystyrene के 75cm 2 बोतल तैयार है और प्रत्येक फ्लास्क को 16 मिलीलीटर पारंपरिक सेल संस्कृति मीडिया जोड़ें। नई बोतल में से प्रत्येक के 4 मिलीलीटर पारंपरिक सेल संस्कृति मीडिया और विभाज्य बराबर मात्रा में trypsinized कोशिकाओं Resuspend।
  7. Humidified सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें बोतल 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के लिए निर्धारित किया है। 80% संगम तक पहुँच जाता है जब तक दैनिक कोशिकाओं मॉनिटर। कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए जारी रखें और-80 पर या तरल नाइट्रोजन में संस्कृति या फ्रीज और दुकान।

फ्लोटिंग या पक्षपाती कोशिकाओं का प्रयोग डिम्बग्रंथि कैंसर कोशिका लाइनों से बहुकोशिकीय spheroids 2. जनरेशन

नोट: कोशिकाओं और मीडिया के सभी हैंडलिंग एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में जगह ले जाना चाहिए। 2 के लिए पारंपरिक संस्कृति के तरीकों के तहत सेल लाइनों संवर्धन के बाद - 3 मार्ग (खंड 1) निम्न चरणों के साथ आगे बढ़ें।

  1. स्टेम सेल मीडिया तैयार करें। एक DMEM: F12 (एल glutamine, 15 मिमी HEPES) और, 1% पीटा सीरम रिप्लेसमेंट (100 यू के अंतिम एकाग्रता / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / स्ट्रेप्टोमाइसिन के लिए) 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक 1 का प्रयोग करें , 0.4% गोजातीय सीरम albumin, और 0.1% इंसुलिन transferrin-सेलेनियम। 0.45 माइक्रोन वैक्यूम फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर समाधान।
  2. 20 एनजी / एमएल और 10 एन के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पुनः संयोजक मानव epidermal वृद्धि कारक (EGF) और मानव पुनः संयोजक बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (FGF) के साथ पूरक स्टेम सेल मीडियाग्राम / मिलीलीटर, क्रमशः।
    नोट: विकास कारकों सही उपयोग करने से पहले स्टेम सेल मीडिया के लिए नए सिरे से जोड़ा जाना चाहिए।
  3. फ्लोटर टिक संस्कृति बनाएँ। पारंपरिक पक्षपाती संस्कृति की स्थिति में उगाया 80% मिला हुआ कोशिकाओं की कुप्पी निकालें। पीछे पक्षपाती आबादी छोड़ रहा है, मीडिया और सभी अस्थायी कोशिकाओं (एकल और समुच्चय) ले लीजिए, और 50 एमएल polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब को हस्तांतरण। 400 x जी पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र निलंबन।
    नोट: अस्थायी कोशिकाओं और समुच्चय स्पष्ट कर रहे हैं 24-72 घंटा पक्षपाती कोशिकाओं पारंपरिक संस्कृति के तहत कुप्पी से जुड़े होते हैं के बाद। लगभग 1.0 की एक 80% मिला हुआ प्लेट पुनः प्राप्ति से - 5.0 एक्स 10 5 व्यवहार्य अस्थायी कोशिकाओं सेल लाइन पर निर्भर करता है, उम्मीद की जा सकती। इस अध्ययन में एक 80% मिला हुआ पक्षपाती संस्कृति से एकत्र अस्थायी कोशिकाओं की औसत संख्या थी: OVCAR5 5.0 ACI-23, 4.8 के लिए x 10 5 एक्स 10 5, CAOV3 के लिए 3.5 एक्स 10 5, और TGS- के लिए 1.0 x 10 5 3। स्थानांतरण पर, multicellयह कुछ हद तक सेल लाइन निर्भर है, हालांकि पारंपरिक और फ्लोटर टिक संस्कृति में ular अंडाकार आकृति गठन के कुछ दिनों के भीतर होता है। उदाहरण के लिए, ACI-23 कोशिकाओं समुच्चय और अधिक आसानी से CAOV3 कोशिकाओं के रूप में।
  4. इस बीच, नाम, तारीख, और सेल लाइन के पारित होने के संख्या के साथ लेबल एक अल्ट्रा कम लगाव सतह polystyrene के 75 सेमी 2 टिशू कल्चर कुप्पी तैयार करते हैं। कुप्पी के लिए वृद्धि कारकों के साथ पूरक सेल मीडिया स्टेम एमएल 10 जोड़ें।
  5. Centrifugation गोली ढीला करने के लिए नीचे सेल मीडिया स्टेम ml 6 जोड़ने और ऊपर pipetting और से कम लगाव कुप्पी को पूरा, महाप्राण मीडिया और हस्तांतरण गोली है एक बार। Humidified सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें बोतल 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के लिए निर्धारित किया है। अंडाकार आकृति गठन निरीक्षण करने के लिए 3 दिन - हर 2 कोशिकाओं मॉनिटर।
  6. पारंपरिक टिक संस्कृति बनाएँ। पारंपरिक पक्षपाती संस्कृति की स्थिति में उगाया 80% मिला हुआ कोशिकाओं की कुप्पी निकालें। महाप्राण मीडिया और गर्म पीबीएस से धो लें। 1.5 मिलीलीटर trypsin 0.25% EDTA जोड़ें और सेते 3-5आरटी पर मि।
  7. नाम, तारीख, और सेल लाइन के पारित होने के संख्या के साथ लेबल एक अल्ट्रा कम लगाव सतह polystyrene के 75 सेमी 2 टिशू कल्चर कुप्पी तैयार करें। फ्लास्क, के रूप में वर्णित, EGF और FGF के साथ पूरक सेल मीडिया, स्टेम एमएल 10 जोड़ें।
  8. Trypsin के साथ कुप्पी के लिए सेल मीडिया स्टेम ml छह जोड़ें। Pipet सेल समाधान ऊपर और नीचे और कुप्पी की सतह से कोशिकाओं को ढीला करने के लिए प्रयास करते हैं। कोशिकाओं की पूरी मात्रा स्थानांतरण 10 सेल मीडिया स्टेम एमएल युक्त अल्ट्रा कम लगाव कुप्पी। Humidified सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में रखें कुप्पी 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के लिए निर्धारित किया है।
  9. क्रमशः, एमएल 20 एनजी / के अंतिम सांद्रता और 10 एनजी / एमएल के लिए सेल मीडिया और ताजा EGF और FGF स्टेम ml एक अतिरिक्त 2 के साथ 72 घंटा - घरेलू संस्कृतियों हर 48 अनुपूरक।
  10. 80% संगम तक पहुँच जाता है - 60 तक कोशिकाओं मॉनिटर। दो नई अल्ट्रा कम लगाव बोतल में बराबर मात्रा में रखने और 18 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए नए सिरे से स्टेम सेल मीडिया जोड़कर स्प्लिट संस्कृतियों। वैकल्पिकभंडारण, अपकेंद्रित्र 400 x जी पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूरे निलंबन। स्टेम सेल मीडिया में Resuspend कोशिकाओं EGF और FGF के साथ पूरक और नए अल्ट्रा कम लगाव बोतल में समान रूप से वितरित। कोशिकाओं passaging के लिए एकल कक्ष निलंबन में अलग होने की जरूरत नहीं है।
    नोट: इस बिंदु पर संस्कृतियों विभाजित है और सुसंस्कृत, जमे हुए, या प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए चालाकी से किया जा करने के लिए जारी कर सकते हैं। 60 से कम - 80% संगम कोशिकाओं के निम्नलिखित सांद्रता ACI-23 के लिए पुनः प्राप्त कर रहे थे: 8.0 पारंपरिक पक्षपाती के लिए एक्स 10 6, पारंपरिक टिक 4.0 एक्स 10 6, और फ्लोटर टिक संस्कृतियों के लिए 5.0 एक्स 10 6। यह सेल लाइन पर निर्भर हो सकता है, हम 5 पाया है कि - संस्कृति में 10 दिनों CD133 + ALDH + कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में टिक संवर्धन के लिए इष्टतम है पहले 3 दिनों के भीतर कम है, 5 में चोटियों - 10 दिन, और कम से फिर से घटता है 14 दिन।

प्राथमिक उपकला डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों और बहुकोशिकीय spheroids 3. पीढ़ीChemoresistant रोगी जलोदर से

नोट: संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी इस प्रोटोकॉल के लिए प्राप्त हुई थी। कोशिकाओं और मीडिया के सभी हैंडलिंग एक बाँझ टिशू कल्चर हुड में जगह ले जाना चाहिए।

  1. पारंपरिक सेल संस्कृति मीडिया के साथ 1: 1 द्रव प्लेट जलोदर। धारा 1 में वर्णित के रूप में मीडिया को तैयार है और कई पारंपरिक polystyrene के 75 सेमी 2 टिशू कल्चर बोतल के लिए 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. जलोदर तरल पदार्थ आम तौर पर एक एल बाँझ वैक्यूम बोतलों में प्रदान की जाती है; वैक्यूम टोपी को हटा दें। ध्यान से 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के लिए सेट humidified सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 10 मिलीलीटर पारंपरिक मीडिया और जगह युक्त कुप्पी द्रव 10 मिलीलीटर जलोदर जोड़ें। एक पूरा मीडिया परिवर्तन करने से पहले, 96 घंटा - 72 के लिए अछूता छोड़ दें। 80% संगम - कोशिकाओं को 60 तक 3 दिन - हर 2 मीडिया बदलें
  3. धारा 2 में वर्णित के रूप में खंड 1. स्टार्ट टिक संस्कृतियों में वर्णित के रूप में 2: - कोशिकाओं को 60 तक पहुँच जाने के बाद 80% संगम, एक विभाजित।
    नोट: ascit में मौजूद एरिथ्रोसाइट्सवे गैर-पक्षपाती हैं के रूप में तों पहले मीडिया परिवर्तन के बाद हटा दिया जाएगा। वे और अधिक संवेदनशील होते हैं और trypsin करने के लिए कम से कम जोखिम के साथ लिफ्ट के रूप में उपस्थित किसी भी fibroblasts के बड़े पैमाने पर trypsin के साथ उपचार के बाद हटा दिया जाएगा। डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं की पवित्रता सीए-125 (MUC16) के लिए एंटीबॉडी का उपयोग प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया था।

घरेलू मार्करों के फ्लो पुष्टि के लिए कोशिकाओं की 4. धुंधला

  1. घरेलू संस्कृतियों लीजिए। 50 एमएल polypropylene अपकेंद्रित्र ट्यूब में कुप्पी की सामग्री को स्थानांतरित। 400 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र निलंबन। महाप्राण मीडिया और गर्म पीबीएस से धो लें। Clumps को तोड़ने के लिए और एकल कक्षों में अलग कर देना करने के लिए नीचे 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए, और ऊपर pipet और - 2 मिलीलीटर गैर एंजाइमी सेल हदबंदी समाधान जोड़ें 3 सेते हैं। सेल मीडिया स्टेम ml 4 जोड़ें।
  2. पक्षपाती संस्कृतियों लीजिए। महाप्राण मीडिया और गर्म पीबीएस से धो लें। 3 मिलीग्राम गैर एंजाइमी सेल हदबंदी समाधान जोड़ें और 3 सेते हैं - 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट। पारंपरिक सेल 3 मिलीलीटर जोड़ेंसंस्कृति मीडिया को pipet और बार-बार नीचे कुप्पी से कोशिकाओं को अलग करने के लिए और अपकेंद्रित्र ट्यूब में इकट्ठा करने और।
  3. अपकेंद्रित्र घरेलू और 400 x जी पर 5 मिनट के लिए पक्षपाती निलंबन दोनों। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 3% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त 1 मिलीलीटर पीबीएस में प्रत्येक गोली resuspend। आर टी 30 मिनट पर सेते हैं। इस बीच, trypan नीले रंग का उपयोग कर व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या गिनती। Spheroids एकल कक्षों में अलग कर रहे हैं पुष्टि करने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का पालन।
  4. मुआवजे के लिए 1) बेदाग (बेदाग नियंत्रण) मुआवजे के लिए, 2) ALDH (एकल दाग सकारात्मक नियंत्रण) मुआवजे के लिए, 3) CD133 (एकल दाग सकारात्मक नियंत्रण), 4: निम्नलिखित संस्कृति शर्तों में से प्रत्येक के लिए लेबल 5 एक्स 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब ) ALDH + CD133 (प्रायोगिक परीक्षण नमूना), और 5) फ्लोरिडा -1 और फ्लोरिडा-चार चैनलों, क्रमशः) में DEAB + ALDH (पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए नकारात्मक नियंत्रण।
  5. 400 x जी पर 5 मिनट के लिए 4. अपकेंद्रित्र निलंबन - ट्यूबों के लिए # 1 लगभग 5 x 10 5 कोशिकाओं प्रत्येक बांटो। महाप्राण supernata500 μl Aldefluor परख बफर में NT और resuspend छर्रों। प्रयोगात्मक नकारात्मक नियंत्रण के लिए ट्यूब # 5 से 10 μl DEAB (aldh अवरोध करनेवाला) जोड़ें।
  6. मुआवजा सकारात्मक नियंत्रण और मिश्रण करने के लिए झटका के लिए ट्यूब # 2 के लिए Aldefluor अभिकर्मक सक्रिय 5 μl जोड़ें। प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए ट्यूब # 4 को Aldefluor अभिकर्मक सक्रिय 5 μl जोड़ें। झाड़ ट्यूब मिश्रण और तुरंत DEAB में शामिल है, जो ट्यूब # 5 (250 μl) में ट्यूब # 4 से कोशिकाओं की आधी मात्रा स्थानांतरित करने के लिए।
  7. झाड़ ट्यूबों मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए। प्रकाश से सुरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट - 30 के लिए सभी ट्यूबों को सेते हैं। झाड़ ट्यूबों आधे रास्ते ऊष्मायन अवधि के माध्यम से कोशिकाओं के नीचे करने के लिए आदी हो जाएगा के रूप में। अपकेंद्रित्र 400 x जी पर 5 मिनट के लिए सभी ट्यूबों। 500 μl Aldefluor परख बफर में महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं।
  8. CD133 धुंधला के साथ ट्यूबों के लिए (# 3 और # 4), सीधे Aldefluor परख बफर में CD133-एपीसी 01:11 जोड़ें। प्रकाश से सुरक्षित बर्फ पर 15 मिनट सेते हैं। 400 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र CD133 ट्यूबों। के साथ एक बार धोएंपरख बफर Aldefluor 500 μl। क्रमशः 500 μl Aldefluor परख बफर में Resuspend कोशिकाओं।
  9. सेल झरनी टोपी के साथ अलग-अलग polystyrene दौर नीचे ट्यूब में फिल्टर निलंबन। पूरी मात्रा टोपी के माध्यम से फ़िल्टर्ड है कि सुनिश्चित करें।
  10. सेल की आबादी का विश्लेषण करने के लिए एक प्रवाह cytometer का उपयोग। मुआवजा नियंत्रण स्थापित करने के लिए ट्यूबों # 1-3 का उपयोग करें। सेलुलर मलबे को बाहर निकालने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है, कोशिकाओं आगे का प्रयोग और पक्ष तितर बितर मापदंडों, गेट। ALDH + और CD133 + क्रमशः, फ्लोरिडा -1 और फ्लोरिडा-चार चैनलों का उपयोग डबल कोशिकाओं स्थापित करना।
  11. एक cytometric विश्लेषण प्रोग्राम का उपयोग करना, संस्कृति की स्थिति में इन दो मार्करों के लिए उच्च धुंधला होना चाहिए टिक-समृद्ध संस्कृति के रूप में टिक कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ाया पुष्टि करें।
    नोट: CD133 और ALDH के अलावा, अन्य markersof डिम्बग्रंथि के कैंसर tics प्रवाह की क्षमताओं पर निर्भर किसी भी एक नमूने में इस्तेमाल किया मार्कर की संख्या के साथ विश्लेषण किया जा सकता है।

5. में विवो

नोट: संस्थागत समीक्षा बोर्ड की मंजूरी इस प्रोटोकॉल के लिए प्राप्त हुई थी। 3 के पिंजरों में प्रयोगात्मक समूहों में 8 सप्ताह की आयु और इंजेक्शन के लिए पहले कुछ दिनों के लिए acclimate करने की अनुमति - athymic महिला नग्न चूहों 6 बांटो। एनआईएच पशु की देखभाल और उपयोग समिति के अनुसार मानवीय प्रयोगात्मक दिशा निर्देशों के तहत चूहों का पालन करें; वजन घटाने या 20% से अधिक लाभ, क्षीण उपस्थिति, दस्त या जिल्द की सूजन सहित शरीर के वजन, शारीरिक उपस्थिति पर नजर रखने और सीओ 2 श्वासावरोध द्वारा इन मानदंडों ढाले चूहों euthanize।

  1. 1 मिलीलीटर पीबीएस में खंड 2. Resuspend प्रत्येक सेल की आबादी के रूप में वर्णित संस्कृतियों लीजिए। Trypan नीले परख का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना।
  2. 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयार करें। तीन प्रतियों के लिए उपायों प्रत्येक ट्यूब में 2 मिलीलीटर पीबीएस में पतला 1.5 एक्स 10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं को जोड़ने (0.5 मिलीलीटर की मात्रा में 5 x 10 5 कोशिकाओं subcutaneously च सही में इंजेक्ट किया जाएगाप्रत्येक माउस का दुबला)। केवल नियंत्रण चूहों के लिए 0.5 मिलीलीटर पीबीएस तैयार करें।
  3. 27 जी सुइयों का उपयोग करना, समूह प्रति तीन चूहों में से प्रत्येक की सही दिशा में टिक संस्कृतियों फ्लोटर, या पीबीएस, पारंपरिक पक्षपाती संस्कृतियों, पारंपरिक घरेलू संस्कृतियों से 0.5 मिलीलीटर सेल निलंबन subcutaneouslyinject। मूल पिंजरों के बाद इंजेक्शन के लिए चूहों लौटें।
  4. चूहों का वजन और लंबाई और चौड़ाई की स्थापना, वर्नियर कैलिपर weeklyby दो बार दो आयामों में कोई स्पष्ट ट्यूमर को मापने।
    नोट: ट्यूमर विलंबता समय आमतौर पर 20 है - सेल लाइन के आधार पर 50 दिनों के लिए।
  5. मानक तरीकों (वी = (चौड़ाई) 2 एक्स लंबाई / 2) द्वारा ट्यूमर गीला मात्रा की गणना।
    नोट: इस अध्ययन केवल इसी तरह की परिस्थितियों के अधीन हो tics के vivo धारावाहिक passaging दूसरों 11,20 से पूरा हो चुका है पहली पीढ़ी के लिए पक्षपाती कोशिकाओं बनाम tics की tumorigenicity तुलना में हालांकि।

Representative Results

घरेलू संस्कृति की स्थिति में उगाई ही कोशिकाओं घरेलू आबादी में आम अंडाकार आकृति आकृति विज्ञान, अस्थायी प्रदर्शन, जबकि डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों और संलग्न सीरम शो, cobblestone आकारिकी की उपस्थिति में परंपरागत पक्षपाती संस्कृति की स्थिति में उगाई जाने वाली एक प्राथमिक जलोदर सेल लाइन की स्थापना की। चित्रा 1 ए में प्रदर्शित brightfield छवियों स्पष्ट रूप से संस्कृति की स्थिति में रूपात्मक मतभेद दिखा। चित्रा 1 बी पारंपरिक पक्षपाती परिस्थितियों में ACI-23 और TGS-तीन घरेलू संस्कृतियों replating के बाद हासिल की विभेदित morphologies पता चलता है। ठेठ पक्षपाती कोशिकाओं जैसी सिर्फ 24 घंटा पक्षपाती की स्थिति में वापस बोने के बाद, बहुकोशिकीय spheroids के बहुमत अलग कर देना और सतह के लिए देते हैं।

विश्लेषण डिम्बग्रंथि tics के दो आम मार्कर का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था cytometry के घरेलू स्थितियों के प्रवाह स्टेम सेल मार्कर के साथ कोशिकाओं के लिए समृद्ध सत्यापित करें कि - CD133 expression और ALDH गतिविधि। चित्रा 2 में दिखाया गया डॉट भूखंडों एक कम लगाव, सीरम मुक्त परिस्थितियों में CD133 + कोशिकाओं की वृद्धि प्रतिशत पर प्रकाश डाला। इसी तरह, ALDH एंजाइम की गतिविधि पारंपरिक पक्षपाती संस्कृति की स्थिति की तुलना में इन परिस्थितियों में अधिक है। पारंपरिक पक्षपाती संस्कृतियों CD133 + कोशिकाओं, अंडाकार आकृति गठन बढ़ाने कि शर्तों के तहत प्रतिशत बढ़ जाती है होते हैं। एक pluripotency मार्कर का विश्लेषण, टीआरए-1-60, घरेलू स्थितियों tics, चित्रा 2 बी के लिए समृद्ध है कि आगे समर्थन करती है। चित्रा 2 सी में मात्रा का ठहराव डबल सकारात्मक (CD133 + ALDH +) ACI-23 कोशिकाओं को काफी हद तक टिक बढ़ाने शर्तों के अधीन हो संस्कृतियों के लिए सीमित कर रहे हैं कि यह दर्शाता है। घरेलू परिस्थितियों में संस्कृति के पांच दिनों के बाद ACI-23 कोशिकाओं में पाए जाते हैं कि अलग ट्रांसक्रिप्शनल कारकों में से प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन भी जांच की गई। मार्कर से प्रत्येक में एक प्रगतिशील वृद्धिएस पक्षपाती संस्कृति में देखा अपेक्षाकृत कम स्तर, चित्रा 2 डी की तुलना में घरेलू स्थितियों फ्लोटर पारंपरिक से देखा जाता है। दिलचस्प बात यह विभिन्न परिस्थितियों में उगाया एक मानव जलोदर सेल लाइन फ्लोटर घरेलू परिस्थितियों में कोई धुंधला वर्तमान, चित्रा 2 ई के लिए थोड़ा के साथ परंपरागत घरेलू परिस्थितियों के तहत उच्चतम मार्कर फेनोटाइप प्रदर्शित करता है।

घरेलू संस्कृति शर्तों के tumorigenicity athymic नग्न चूहों के साथियों में सभी शर्तों से प्राप्त व्यवहार्य कोशिकाओं के बराबर संख्या के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से मान्य किया गया था। 3 दर्शाता है कि यह आंकड़ा ACI-23 (ए, बी) और OVCAR-5 (सी) कोशिकाओं से पारंपरिक पक्षपाती संस्कृतियों टिक संस्कृतियों से उन लोगों की तुलना में कम tumorigenic थे। फ्लोटर टिक संस्कृतियों पारंपरिक पक्षपाती या पारंपरिक टिक संस्कृतियों की तुलना में समय की एक छोटी अवधि में बड़ा ट्यूमर का उत्पादन किया है कि ध्यान दें। ये घअता भी डिम्बग्रंथि घरेलू मार्कर में एक मामूली वृद्धि के साथ, एक नाटकीय प्ररूपी बदलाव नहीं आया है कि सलाह देते हैं। हालांकि अन्य सेल लाइनों (नहीं दिखाया गया है) के साथ पारंपरिक टिक संस्कृतियों पारंपरिक पक्षपाती और फ्लोटर टिक संस्कृति कोशिकाओं की तुलना में अधिक tumorigenic थे।

चित्र 1
अलग संस्कृति की स्थिति में चित्रा 1. उपगोल विकास। (ए) की स्थापना की डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों (ACI-23, OVCAR -5 और CAOV3) और सीरम मुक्त के साथ कम लगाव बोतल में उगाई जाने वाली प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न जलोदर कोशिकाओं (TGS -3) स्टेम सेल मीडिया आसानी से बहुकोशिकीय spheroids के रूप में। छवियाँ घरेलू परिस्थितियों में 96 घंटे के भीतर spheroids का गठन ही कोशिकाओं, जबकि, पारंपरिक पक्षपाती संस्कृति शर्तों ACI-23 में उपकला cobblestone आकारिकी बनाए रखने OVCAR -5, CAOV3 और TGS-तीन कोशिकाओं दिखा। स्केल बार 100 माइक्रोन। 24 घंटा जोखिम पर (बी)पारंपरिक पक्षपाती संस्कृति की स्थिति के लिए, घरेलू संस्कृति morphologies मूल पक्षपाती आकृति विज्ञान जैसी एक विभेदित फेनोटाइप प्रदर्शित करते हैं। स्केल बार 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. कम लगाव, सीरम मुक्त शर्तों टिक मार्कर के साथ कोशिकाओं के लिए समृद्ध। (ए) CD133 एंटीबॉडी संयुग्मित एपीसी का उपयोग कर ACI-23 कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण सीरम मुक्त स्टेम के साथ कम लगाव बोतल में CD133 + कोशिकाओं की वृद्धि प्रतिशत दर्शाता सेल मीडिया। Aldefluor परख शो का उपयोग कर प्रवाह cytometry विश्लेषण सीरम मुक्त स्टेम सेल मीडिया के साथ कम लगाव बोतल में संवर्धित कोशिकाओं में ALDH गतिविधि में वृद्धि हुई। CD133 नकारात्मक नियंत्रण कोई एंटीबॉडी और ALDH नकारात्मक चुनाव होता हैtrol ALDH अवरोध करनेवाला (DEAB) की उपस्थिति में सक्रिय सब्सट्रेट है। FITC संयुग्मित टीआरए-1-60 एंटीबॉडी का उपयोग (बी) के विश्लेषण ACI-23 कोशिकाओं में फ्लोटर घरेलू परिस्थितियों में टीआरए-1-60 + कोशिकाओं के सर्वोच्च प्रतिशत को दर्शाता है। नकारात्मक नियंत्रण कोई एंटीबॉडी शामिल हैं। (सी) CD133 + ALDH + कोशिकाओं पारंपरिक घरेलू में सबसे अधिक हैं और ACI-23 सेल लाइन में घरेलू स्थितियों फ्लोटर। त्रुटि सलाखों: SEM, एन = 6, * पी <0.05। (डी) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण 5 दिनों के लिए घरेलू परिस्थितियों में सुसंस्कृत ACI-23 कोशिकाओं में स्टेम कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्शनल मार्करों के प्रोटीन के स्तर में वृद्धि दर्शाता है। पूरे सेल lysates (50 माइक्रोग्राम प्रति) एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में GAPDH के साथ विश्लेषण किया गया। (ई) ए में के रूप में विश्लेषण TGS-तीन प्राथमिक जलोदर कोशिकाओं के प्रतिनिधि डॉट भूखंडों। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 3. कम लगाव, सीरम मुक्त शर्तों वृद्धि हुई tumorigenicity के साथ कोशिकाओं के लिए समृद्ध। (ए) 5 एक्स 10 5 व्यवहार्य ACI-23 कोशिकाओं subcutaneously तीन प्रतियों में athymic नग्न चूहों में इंजेक्शन थे। चूहे तौला गया और ट्यूमर दो बार साप्ताहिक कैलीपर द्वारा मापा। एक = पारंपरिक पक्षपाती संस्कृति, एफ = फ्लोटर टिक संस्कृति, एस = पारंपरिक टिक संस्कृति। * पी <0.05। (बी) के अलग संस्कृति की शर्तों के तहत विकसित कोशिकाओं का उपयोग कर 25 दिनों के बाद ACI-23 से गठित ट्यूमर के प्रतिनिधि छवियाँ। (सी) 5 एक्स 10 5 व्यवहार्य OVCAR-5 कोशिकाओं subcutaneously तीन प्रतियों में athymic नग्न चूहों में इंजेक्शन और एक के रूप में निगरानी की गई। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल स्थापित डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइनों से स्टेम सेल सुविधाओं के साथ कोशिकाओं के लिए संस्कृतियों समृद्ध बनाने के लिए एक कुशल और सुसंगत विधि प्रस्तुत करता है और प्राथमिक रोगी के नमूने के लिए लागू है। इस पद्धति को सफलतापूर्वक सेल लाइनों की एक किस्म में tics के लिए समृद्ध करती है। यह शारीरिक रूप से जनसंख्या भीतर गैर tics से tics सॉर्ट करने के लिए समय लेने के बिना, एक घरेलू और / या tumorigenic phenotype के लिए समृद्ध है कि शर्तों के समय पर पहचान के लिए अनुमति देता है। इस तरीके में, अलग-अलग संकेत दे रास्ते के सापेक्ष स्तरों कार्यात्मक assays के एक किस्म का उपयोग संस्कृतियों टिक करने के लिए परंपरागत पक्षपाती संस्कृतियों की तुलना द्वारा घरेलू phenotype के लिए उनके योगदान के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। एक शुद्ध घरेलू आबादी वांछित है, अलगाव आसानी प्रोटोकॉल प्रवाह cytometry में एक प्रतिदीप्ति की सहायता या चुंबकीय छँटाई कदम शामिल करके प्राप्त किया जा सकता है।

यह, हालांकि, यह ध्यान रखें कि करने के लिए महत्वपूर्ण है घरेलू मार्कर की अभिव्यक्तिऐसे CD133, CD44, या ALDH के रूप में, सेल लाइनों या यहां तक ​​कि एक ही ट्यूमर के प्रकार के रोगी के नमूने के बीच भिन्न हो सकते हैं। उदाहरण के लिए हम उलटा ACI-23 के लिए सच है, जबकि OVCAR-5 कोशिकाओं, CD133 के लिए CD44 रिश्तेदार के उच्च अभिव्यक्ति है कि पाया। यह चूहों में ट्यूमर दीक्षा पर भरोसा करते हैं और घरेलू उपस्थिति की निश्चित रूप प्रवाह cytometry विश्लेषण करने के लिए इसलिए प्रासंगिक है। डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को स्टेम सेल की स्थिति में बड़े हो रहे थे जब इस प्रोटोकॉल के बाद, उच्च ALDH गतिविधि लगातार मनाया गया। ALDH फ्लोटर घरेलू परिस्थितियों में सबसे अधिक है, जबकि दिलचस्प है, CD133 अभिव्यक्ति, पारंपरिक घरेलू संस्कृति की स्थिति में उगाई ACI-23 कोशिकाओं में लगातार अधिक है। इसके विपरीत TGS-तीन प्राथमिक जलोदर कोशिकाओं फ्लोटर टिक शर्तों के तहत CD133 सकारात्मकता में एक छोटे से वृद्धि हुई है, लेकिन पारंपरिक टिक शर्तों के तहत ALDH गतिविधि में एक उल्लेखनीय वृद्धि प्रदर्शित करते हैं। इन निष्कर्षों डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं की विविधता और आमतौर पर tics के साथ जुड़े plasticity के पर प्रकाश डाला। आगे सीएलए का समर्थन करने के लिएइन तरीकों tics बढ़ाने कि आईएम, टीआरए-1-60 सकारात्मक कोशिकाओं के संवर्धन भी मनाया गया। टीआरए-1-60 एक pluripotency मार्कर है और प्रोस्टेट कैंसर tics 30-32 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भ्रूणीय अंडाशय की कार्सिनोमा और वृषण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हमारे तरीके में कई सेल लाइनों के साथ सफल रहे हैं, यद्यपि यह संशोधित फ्लोटर स्थिति बेहतर अन्य डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल आबादी में tics के लिए समृद्ध है, जबकि मानक घरेलू परिस्थितियों, कुछ डिम्बग्रंथि के कैंसर की कोशिकाओं को बेहतर करने के लिए उपयुक्त हो सकता है कि संभव है। यह फिर से दोनों रोगी ली गई है और स्थापित डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिका लाइनों के भीतर होने की उम्मीद है विविधता को रेखांकित करता है।

इन मार्करों डिम्बग्रंथि के कैंसर tics के लिए विशिष्ट नहीं कर रहे हैं और नहीं बल्कि भ्रूण स्टेम सेल pluripotency के लिए महत्वपूर्ण कारकों का प्रतिनिधित्व करते हैं, हालांकि कोशिका की सतह मार्करों के अलावा Nanog, Sox2, अक्टूबर-4 11 सहित डिम्बग्रंथि के कैंसर tics चिह्नित करने के लिए दिखाया गया है कि कई ट्रांसक्रिप्शनल कारकों, वहाँ रहे हैं और अलगferentiation 33,34। हम इन कारकों में से प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन की जांच की और Nanog स्तरों दूसरों 13,35 के साथ ही CD133, टीआरए-1-60, और CD117 के साथ समझौते में, घरेलू संस्कृति की स्थिति में है कि वृद्धि पाया। एक मानव स्टेम सेल मार्कर सीडीएनए सरणी आगे पारंपरिक पक्षपाती शर्तों की तुलना में घरेलू परिस्थितियों में CD133, Nanog, Melk, और PODXL जीन में वृद्धि देखी गई। महत्वपूर्ण बात है, यह कोशिका की सतह मार्कर के साथ के रूप में, डिम्बग्रंथि tics के साथ जुड़े ट्रांसक्रिप्शनल कारकों सेल लाइनों और रोगी के नमूने के बीच भिन्न हो सकते हैं, कि ध्यान दिया जाना चाहिए।

हम वे इन विट्रो में स्वाभाविक गैर पक्षपाती हैं यदि कोशिकाओं को और अधिक tumorigenic हो सकता है और स्टेम सेल मार्कर के उच्च स्तर व्यक्त कर सकते हैं कि मनाया है (यानी, आसानी से एक पक्षपाती थाली करने के लिए संलग्न नहीं है कि कोशिकाओं फ्लोटिंग)। संस्कृति में, इस तरह के ACI-23 के रूप में सेल लाइनों आमतौर पर पारंपरिक संस्कृति Condit के तहत एक स्टैकिंग फैशन में खड़ी हो जाना है कि कई व्यवहार्य अस्थायी कोशिकाओं और / या कोशिकाओं हैआयनों। अस्थायी कोशिकाओं और समुच्चय से tics के सफल संवर्धन वर्तमान अध्ययन और OVCAR-3 12 में उन सहित अपेक्षाकृत कुछ करने के लिए लागू सेल लाइनों हो सकता है, हमारे निष्कर्ष यह एक अधिक tumorigenic आबादी का प्रतिनिधित्व हो सकता सुझाव देते हैं। इसलिए, वाणिज्यिक स्टेम सेल मीडिया के लिए खराब अनुकूलन है कि कोशिकाओं के लिए, घरेलू संवर्धन का एक वैकल्पिक पद्धति के रूप में सेवा कर सकता है मानक टिशू कल्चर प्लेट और मीडिया में विकसित कोशिकाओं की "अस्थायी" जनसंख्या कटाई।

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत अलग संस्कृति तरीकों का उपयोग घरेलू आबादी के त्वरित संवर्धन और विभिन्न कोशिकाओं में इस phenotype का समर्थन कारकों की एक बेहतर समझ के लिए सक्षम हो जाएगा। इस विधि के प्रचलित अनुप्रयोग संकेत दे रास्ते कोशिकाओं की इस अनूठी आबादी के प्रचार-प्रसार का समर्थन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं जो निस्र्पक शामिल हैं। इन अध्ययनों के परिणाम से ट्यूमर प्रगति और पतन के तंत्र को स्पष्ट करने में मदद मिलेगी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask Corning 3814
75 cm2 Tissue Culture Flask Sarstedt 83.1813.002
Aldefluor Kit Stemcell Technologies 1700
CD133-APC Miltenyi Biotec Inc. 130-090-826
Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant Sigma-Aldrich F0291 Prepared according to manufacturer's instructions
Epidermal Growth Factor - human recombinant Sigma-Aldrich E9644 Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS
DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) Gibco 11330-032
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning cellgro 21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution Corning Cellgro 25-056-CI
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-10G
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 51500-056
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Fetal Bovine Serum (heat inactivated) Gemini 100-106
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) Nalgene 450-0045
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430052
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl Lonza 17-942E

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References

  1. Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer. Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).
  2. Ushijima, K. Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse. J Oncol. 2010, 497429 (2010).
  3. Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).
  4. King, S. M., et al. The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer. Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).
  5. Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
  6. Paik, D. Y., et al. Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation. Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).
  7. Connor, M. L., et al. Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward. Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).
  8. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).
  9. Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).
  10. Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).
  11. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
  12. Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).
  13. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).
  14. Meng, E., et al. CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).
  15. Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
  16. Chen, J., et al. Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures. BMC Cell Biol. 14, 7 (2013).
  17. Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3. Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).
  18. Curley, M. D., et al. CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer. Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).
  19. Baba, T., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells. Oncogene. 28, 209-218 (2009).
  20. Liao, J., et al. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism. PLoS One. 9, e84941 (2014).
  21. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).
  22. Jaggupilli, A., Elkord, E. Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity. Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).
  23. Irollo, E., Pirozzi, G. CD133: to be or not to be, is this the real question. Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).
  24. Ma, I., Allan, A. L. The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells. Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).
  25. McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma–associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).
  26. Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors. Biochimie. (2014).
  27. Brabletz, T. EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells. Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).
  28. Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, e46858 (2012).
  29. Liu, S., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).
  30. Malecki, M., et al. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries. J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).
  31. Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).
  32. Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-κB signalling. Nat Commun. 2, 162 (2011).
  33. Loh, Y. H., et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet. 38, 431-440 (2006).
  34. Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation. Nature. 455, 1124-1128 (2008).
  35. Lee, M., et al. Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).

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