Dans l'Enrichissement vitro du cancer des ovaires cellules initiatrices de tumeurs

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House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells. J. Vis. Exp. (96), e52446, doi:10.3791/52446 (2015).

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Abstract

Introduction

Cancer de l'ovaire est le cancer gynécologique le plus mortel aux États-Unis avec la principale cause de morbidité et de mortalité étant les très récurrentes, les caractéristiques de chimiorésistantes de cette maladie. Le traitement primaire comprend habituellement la chirurgie de réduction tumorale maximale et la thérapie à base de platine ultérieure, bien qu'il y ait des preuves pour suggérer traitement néoadjuvant pourrait être bénéfique dans certains cas une. La majorité des patients répondent favorablement au traitement primaire, mais malheureusement la moitié rechute dans les 18 mois 2.

La plupart des tumeurs malignes de l'ovaire sont des carcinomes épithéliaux et peuvent provenir de l'épithélium de surface du tube 3,4 ovaires ou de Fallope. Plusieurs études confirment l'existence de cellules souches somatiques dans le système reproducteur femelle qui aident probablement dans la réparation des tissus qui est nécessaire après l'ovulation 5,6. L'activité de prolifération élevé à la fois l'ovaire et trompe de Fallope pendant Övülation pourrait être un facteur important dans le développement du cancer de l'ovaire (Gharwan, et al. manuscrit soumis). La dérivation des cellules tumorales de formation ne est pas claire, mais ils peuvent provenir de cellules souches normales, des cellules progénitrices ou des cellules différenciées par des mutations qui les rendent incapables de réguler ou de division sort. Ces cellules ont également été appelés «cellules souches cancéreuses», ou «cellules cancéreuses initiatrices," et peut devenir, sphéroïdes multicellulaires tumorigènes dans des conditions de fixation faibles. Bien que le modèle hiérarchique du développement TIC peut être dynamique, TIC ne partagent bon nombre des mêmes caractéristiques que les cellules souches normales, y compris quiescence, résistance à la chimiothérapie, à long terme d'auto-renouvellement et la capacité de se différencier en diverses lignées cellulaires 7,8.

Plusieurs études confirment l'existence des TIC dans le cancer de l'ovaire et les efforts actuels sont en cours pour clarifier le mécanisme (s) par lequel ces cellules soutiennent la tumorigenèse 9-11. Plusieurs marqueurs ont été proposées pour identifier les TIC de l'ovaire avec tumorigénicité accrue y compris CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, et MyD88, bien que la contribution exacte de chaque marqueur est pas claire et peut être de type spécifique de cellules 11-16. Alors un marqueur ou un ensemble de marqueurs universelle n'a pas été clairement établi pour TIC de l'ovaire, les différents groupes ont isolé TIC de l'ovaire plus communément en sélectionnant avec une grande aldéhyde déshydrogénase (ALDH) 13,17-21 activité pour CD44 +, CD133 + et / ou de cellules. CD44 est une glycoprotéine transmembranaire qui agit comme un récepteur de l'acide hyaluronique et régule divers processus importants pour la progression tumorale, y compris l'adhérence, la prolifération, la migration, l'angiogenèse et la 22 différenciation. CD133 est une glycoprotéine transmembranaire dont la fonction est encore incertain, mais des études suggèrent qu'il organise topologie de la membrane plasmique 23. ALDH, une enzyme intracellulaire qui catalyse l'oxydation d'aldéhydes, peut être le plus universal marqueur des TIC comme une activité élevée a été identifié dans les cellules souches isolées à partir d'une variété de tissus et de multiples rôles ont été attribués à ALDH en soutenant les cellules souches normales et TIC 24. A partir de maintenant, CD133 et ALDH1 semblent être les marqueurs les plus reproductibles de TIC de l'ovaire 13,21.

En plus de comprendre les caractéristiques des TIC, il ya aussi un grand effort pour identifier les médicaments qui ciblent spécifiquement cette sous-population. Le taux de rechute élevé associé à un cancer de l'ovaire peut être dû à l'échec de chimiothérapies actuelles pour éradiquer avec succès TIC. Bien que la majeure partie de la tumeur est sensible aux thérapies existantes, les tics sont pensés pour être résistant et à une densité indétectable par des procédés classiques. Mécanismes élucider de résistance de la thérapie et de rechute de la tumeur sont essentiels pour améliorer la réponse et les taux de survie globale des patients atteints de cancer de l'ovaire.

Ici, les techniques de culture sont décrits eà enrichir en TIC provenant de lignées cellulaires de cancer ovarien établies et primaires. Les conditions de culture décrites ici ont été utilisés par plusieurs groupes pour induire la propagation des tics ou des cellules sphéroïdes ayant des qualités de cellules souches 11,12,14,16,20. Bien qu'il existe plusieurs supports de culture de cellules souches et des suppléments couramment utilisés pour enrichir TIC / sphéroïdes nous avons utilisé une formule de milieu sans sérum avec de l'EGF et le FGF, mais sans l'addition d'B27 ou N-2 complète. Ces suppléments, couramment utilisés pour la culture de cellules neuronales et enrichissante pour les cellules souches, ont été montré pour favoriser un phénotype mésenchymateuses 25,26 et il reste une certaine incertitude dans le domaine de savoir si TIC ayant un phénotype mésenchymateuses ou épithéliales sont plus tumorigène 27-29 . Pour minimiser les incertitudes et les variables nous avons opté pour utiliser la formule la plus courante, puisque nous traitons avec des cellules de cancer ovarien épithélial.

Le maintien des cellules dans un milieu sans sérum dans un flacon de fixation basfacilite la formation sphéroïde et soutient la propagation des cellules avec une expression de CD133 et une forte activité de ALDH. Notre travail a en outre montré que les cellules flottantes dans des conditions normales adhérentes peuvent également représenter une population de TIC plus tumorigène. L'injection de cellules cultivées dans ces conditions sur des souris nude athymiques conduit à potentiel tumorigène élevé par rapport à des cellules cultivées en conditions liées à la présence de sérum. Beaucoup d'informations sur le rôle des TIC dans l'initiation de cancer ovarien, la progression, la réponse thérapeutique, et de rechute de la maladie peut être obtenue par l'utilisation de ces techniques.

Protocol

1. Culture traditionnelle de l'ovaire lignées cellulaires de cancer (Conditions adhérentes)

NOTE: Toutes les manipulations des cellules et des médias devrait avoir lieu dans une culture de tissus stériles hotte

  1. Préparer un milieu de culture cellulaire traditionnel. Utiliser 1: 1 de DMEM: F12 (+ L-glutamine, 15 mM de HEPES +) et compléter avec du sérum bovin à 10% inactivé par la chaleur fœtal et 1% de pénicilline / streptomycine. solution de filtrage en utilisant 0,45 um filtre à vide.
  2. Préparer un polystyrène traditionnelle 75cm flacon de culture de tissu 2 étiqueté avec le nom, la date et le nombre de passages de la lignée cellulaire de interest.Remove le flacon de cellules de très faible congélateur ou de l'azote liquide. Dégivrage par mise en 37 ° C bain d'eau pendant 5 min.
  3. Transfert suspension du flacon dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant 3 ml de milieu de culture cellulaire traditionnel (préparé ci-dessus). Centrifuger la suspension à 4 ° C pendant 5 min à 400 x g. Pendant ce temps, ajouter 16 milieux de culture cellulaire classiques ml dans le ballon.
  4. Aspirer surnageant. Utilisation 2 ml de cellules de pipettes de milieux de culture de cellules traditionnelles de haut en bas pour desserrer culot et le transfert suspension flacon. Doucement flacon roche afin de répartir uniformément cells.Place fiole dans humidifié incubateur de culture cellulaire réglé sur 37 ° C et 5% de CO 2. Surveiller cellules tous les jours jusqu'à 80% de confluence est atteint.
  5. Une fois que les cellules sont confluentes à 80% diviser la culture 1: 2 dans une culture cellulaire capot. Aspirer le surnageant et laver avec du phosphate chaude saline tamponnée (sans calcium et magnésium) (PBS). Ajouter 1,5 ml de trypsine 0,25% EDTA et incuber 3-5 min à température ambiante.
  6. Préparer deux nouvelles polystyrène 75cm 2 flacons et ajouter 16 ml de milieu de culture cellulaire traditionnel dans chaque fiole. Remettre en suspension les cellules trypsinisées dans 4 ml de milieux de culture cellulaire traditionnel et aliquotes des volumes égaux de chacun des nouveaux flacons.
  7. Placer les flacons dans un incubateur humidifié de culture cellulaire fixées à 37 ° C et 5% de CO 2. Surveiller cellules tous les jours jusqu'à 80% de confluence est atteint. Continuer à diviser les cellules etla culture ou la congeler et conserver à -80 ou dans l'azote liquide.

2. Génération de multicellulaire Sphéroïdes de l'ovaire lignées cellulaires de cancer en utilisant des cellules flottantes ou adhérentes

NOTE: Toutes les manipulations des cellules et des médias devrait avoir lieu dans une hotte de culture de tissu stérile. Après la culture des lignées de cellules de moins de méthodes de culture traditionnelles pour deux à trois passages (section 1) procéder aux étapes suivantes.

  1. Préparer des milieux de cellules souches. Utiliser 1: 1 de DMEM: F12 (+ L-glutamine, + 15 mM de HEPES) et compléter avec 1% de pénicilline / streptomycine (à une concentration finale de 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine), 1% de remplacement de sérum KO , 0,4% de sérumalbumine bovine, et 0,1% d'insuline-transferrine-sélénium. solution de filtrage en utilisant 0,45 um filtre à vide.
  2. support de cellules souches de supplément avec le facteur recombinant humain de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance des fibroblastes basique humain recombinant (FGF) pour une concentration finale de 20 ng / ml et 10 ng / ml, respectivement.
    NOTE: Les facteurs de croissance devraient être ajoutées frais aux médias de cellules souches juste avant l'utilisation.
  3. Créer culture flotteur TIC. Retirer la fiole de 80% de cellules confluentes cultivées dans des conditions traditionnelles de culture adhérentes. Recueillir les médias et toutes les cellules flottantes (simples et les granulats), laissant la population adhérente derrière, et transfert à 50 ml polypropylène tube de centrifugeuse. Centrifuger la suspension à 4 ° C pendant 5 min à 400 x g.
    NOTE: les cellules et les agrégats flottants sont apparents de 24 à 72 h après que les cellules adhérentes sont fixées dans le ballon sous la culture traditionnelle. Du point de confluence de la plaque de récupération de 80% de l'ordre de 1,0 à 5,0 x 10 5 cellules viables flottants peut se attendre, en fonction de la lignée cellulaire. Dans cette étude, le nombre moyen de cellules flottantes recueillies à partir d'une culture confluente adhérente était de 80%: 5,0 x 10 5 à ACI-23, 4,8 x 10 5 à OVCAR5, 3,5 x 10 5 à Caov3, et 1,0 x 10 5 à TGS 3. Lors du transfert, multicellulairela formation de sphéroïde en parti- TIC culture traditionnelle et floater se produit au bout de quelques jours bien que ce soit un peu lignée cellulaire dépendante. Par exemple, ACI-23 cellules forment des agrégats plus facilement que les cellules Caov3.
  4. Pendant ce temps, préparer un faible attachement surface polystyrène 75 cm 2 flacon de culture de tissus ultra étiqueté avec le nom, la date et le nombre de passages de la lignée cellulaire. Ajouter 10 ml de cellules souches médias supplémenté avec des facteurs de croissance dans le ballon.
  5. Une fois la centrifugation est terminée, les médias et le transfert aspirer granulés à faible flacon de fixation en ajoutant 6 ml endiguer milieux cellulaires et aspiration et refoulement pour desserrer culot. Placer les flacons dans un incubateur humidifié de culture cellulaire fixées à 37 ° C et 5% de CO 2. Surveiller cellules tous les 2-3 jours pour observer la formation sphéroïde.
  6. Créer culture traditionnelle TIC. Retirer la fiole de 80% de cellules confluentes cultivées dans des conditions traditionnelles de culture adhérentes. Aspirer le milieu et laver avec du PBS chaud. Ajouter 1,5 ml de trypsine 0,25% EDTA et incuber 3-5min à température ambiante.
  7. Préparer un faible attachement surface polystyrène 75 cm 2 flacon de culture de tissus ultra étiqueté avec le nom, la date et le nombre de passages de la lignée cellulaire. Ajouter 10 ml de cellules souches médias, complétés avec de l'EGF et le FGF, comme décrit dans le ballon.
  8. Ajouter 6 ml endiguer les médias de la cellule dans le ballon avec le trypsine. Solution de cellules pipette de haut en bas et de tenter de desserrer les cellules de la surface du ballon. Transfert volume entier de cellules à ultra basse flacon de fixation contenant les 10 ml découlent milieu cellulaire. Lieu ballon dans un incubateur humidifié de culture cellulaire réglé sur 37 ° C et 5% de CO 2.
  9. Supplément cultures TIC tous les 48 à 72 heures avec un supplément de 2 ml endiguer médias cellulaires et frais EGF et FGF pour des concentrations finales de 20 ng / ml et 10 ng / ml, respectivement.
  10. Surveiller cellules jusqu'à 60 à 80% de confluence est atteint. cultures Split en plaçant volumes égaux dans deux nouveaux flacons ultra faible de fixation et ajout de médias de cellules souches frais pour atteindre un volume final de 18 ml. Alternatively, centrifuger la suspension entière à 4 ° C pendant 5 min à 400 x g. Resuspendre les cellules dans les médias sur les cellules souches complétées avec de l'EGF et FGF et distribuent également dans de nouveaux flacons ultra-faible fixation. Les cellules ne doivent pas être dissociées en des suspensions de cellules simples de passages.
    NOTE: A ce stade, les cultures peut continuer à être divisé et cultivé, congelés, ou expérimentalement manipulé pour analyse. A 60-80% de confluence les concentrations suivantes de cellules ont été récupérées à ACI-23: 8,0 x 10 6 à traditionnel adhérent, 4,0 x 10 6 à traditionnel TIC, et 5,0 x 10 6 pour les cultures renflée TIC. Bien qu'il puisse être lignée cellulaire dépendante, nous avons constaté que de 5 à 10 jours de culture est optimale pour TIC enrichissement comme le pourcentage de CD133 + ALDH + cellules est faible dans les 3 premiers jours, des pics à 5 à 10 jours, et diminue à nouveau 14 jours.

3. génération de Cancer ovarien épithéliale primaire lignées cellulaires et multicellulaires Sphéroïdesd'ascite Patient chimiorésistantes

REMARQUE: approbation Institutional Review Board a été obtenu pour ce protocole. Toutes les manipulations des cellules et des médias devrait avoir lieu dans une hotte de culture de tissus stériles.

  1. liquide d'ascite une des plaques: 1 avec des milieux de culture cellulaire traditionnelle. Préparer les médias comme décrit dans l'article 1 et ajouter 10 ml à plusieurs traditionnelles polystyrène 75 flacons de culture de tissus cm 2.
  2. fluide ascite est généralement fourni en 1 L bouteilles thermos stérile; retirer le bouchon de vide. Ajouter avec précaution 10 ml de liquide d'ascite dans le ballon contenant 10 ml de médias traditionnels et placer dans un incubateur humidifié de culture de cellules fixées à 37 ° C et 5% de CO 2. Laissez reposer pendant 72 à 96 h, avant de faire un changement de milieu complet. Changer de support tous les 2-3 jours jusqu'à ce que les cellules atteignent 60 à 80% de confluence
  3. Une fois les cellules atteignent 60 à 80% de confluence, diviser 1: 2 comme décrit dans la section 1. Démarrer cultures TIC comme décrit dans l'article 2.
    NOTE: Les érythrocytes présents dans ascites seront enlevés après le premier changement de support car ils sont non-adhérentes. Les fibroblastes présents seront largement éliminés après traitement à la trypsine car ils sont plus sensibles et soulever avec une exposition minimale à la trypsine. La pureté des cellules de cancer de l'ovaire a été déterminée par analyse de cytométrie en flux en utilisant un anticorps pour la CA-125 (MUC16).

4. coloration des cellules pour cytométrie en flux Confirmation de TIC Marqueurs

  1. Recueillir cultures TIC. Transférer le contenu du ballon dans 50 ml polypropylene centrifuge tube. suspensions de centrifugation pour 5 min à 400 x g. Aspirer le milieu et laver avec du PBS chaud. Ajouter 2 ml non enzymatique solution de dissociation cellulaire, incuber 3-5 min à 37 ° C, et pipette de haut en bas pour briser les mottes et se dissocier en cellules individuelles. Ajouter 4 ml endiguer milieux cellulaires.
  2. Recueillir cultures adhérentes. Aspirer le milieu et laver avec du PBS chaud. Ajouter 3 ml non enzymatique solution de dissociation des cellules et incuber 3-5 min à 37 ° C. Ajouter 3 ml cellule traditionnellemilieux de culture et pipette de haut en bas à plusieurs reprises pour détacher les cellules du flacon et placer dans un tube de centrifugeuse.
  3. Centrifugeuse à la fois TIC et suspensions adhérentes pendant 5 min à 400 x g. Rejeter le surnageant et remettre en suspension chaque culot dans 1 ml de PBS contenant 3% de sérum bovin foetal. Incuber à température ambiante 30 min. Pendant ce temps, compter le nombre de cellules viables à l'aide de bleu trypan. Respecter les cellules au microscope pour confirmer sphéroïdes sont dissociées en cellules individuelles.
  4. Label 5 x 1,5 ml tubes Eppendorf pour chacune des conditions de culture suivantes: 1) Unstained (contrôle tache d'indemnisation), 2) ALDH (seule tache contrôle positif pour la compensation), 3) CD133 (seule tache contrôle positif pour la compensation), 4 ) ALDH + CD133 (Extrait d'essai expérimental), et 5) DEAB + ALDH (contrôles négatifs pour la fluorescence de fond dans FL-1 et FL-4 canaux, respectivement).
  5. Distribuer environ 5 x 10 5 cellules chacun des tubes N ° 1 - 4. suspensions de centrifugation pendant 5 min à 400 x g. Aspirer supernatant et remettre les pastilles dans 500 ul Aldefluor tampon de dosage. Ajouter 10 ul DEAB (inhibiteur de l'ALDH) au tube n ° 5 pour le contrôle négatif expérimentale.
  6. Ajouter 5 ul activés réactif Aldefluor au tube n ° 2 d'indemnisation contrôle positif et film pour mélanger. Ajouter 5 ul de réactif Aldefluor activés au tube n ° 4 pour l'analyse expérimentale. tube de Flick pour mélanger et immédiatement transférer la moitié du volume des cellules à partir du tube n ° 4 dans le tube n ° 5 (250 pi) qui contient le DEAB.
  7. tubes de Flick pour bien mélanger. Incuber tous les tubes pendant 30 à 45 min à 37 ° C à l'abri de la lumière. tubes de Flick mi-période d'incubation que les cellules se déposent au fond. Centrifuger tous les tubes pendant 5 min à 400 x g. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 500 ul Aldefluor tampon de dosage.
  8. Pour les tubes avec CD133 coloration (n ° 3 et n ° 4), ajoutez-CD133 APC 01h11 directement dans le tampon d'essai Aldefluor. Incuber 15 min sur la glace abri de la lumière. Tubes Centrifugeuse CD133 pour 5 min à 400 x g. Laver une fois avec500 ul de tampon de dosage Aldefluor. Resuspendre les cellules dans 500 ul de tampon de dosage Aldefluor, respectivement.
  9. Filtrer les suspensions dans des tubes à fond rond de polystyrène individuelle avec bouchon de crépine cellulaire. Se assurer que le volume entier est filtré à travers le bouchon.
  10. Utiliser un cytomètre en flux pour analyser la population de cellules. Utiliser des tubes # 1-3 pour le réglage des commandes de compensation. Utilisation avant et paramètres côté-scatter, porte les cellules, en étant sûr d'exclure les débris cellulaires. Établir ALDH + et CD133 + cellules doubles utilisant FL-1 et FL-4 canaux, respectivement.
  11. Utilisation d'un programme d'analyse cytométrique, confirment les conditions de culture amélioré le pourcentage de cellules TIC que les cultures de TIC riches devraient avoir une coloration plus élevé pour ces deux marqueurs.
    NOTE: En plus de l'ALDH et CD133, d'autres tics cancer de l'ovaire markersof peut être analysé avec le nombre de marqueurs utilisés dans l'une quelconque échantillon dépendent des capacités de cytomètre de flux.

5. In vivo

REMARQUE: approbation Institutional Review Board a été obtenu pour ce protocole. Distribuer des souris athymiques nu féminin 6-8 semaines d'âge en groupes expérimentaux dans des cages de trois et laisser acclimater pendant quelques jours avant les injections. Suivez souris vertu des lignes directrices expérimentales humaines que par NIH protection des animaux et l'utilisation Comité; surveiller le poids du corps, l'apparence physique y compris la perte de poids ou gain supérieur à 20%, l'apparence émaciée, la diarrhée ou une dermatite et euthanasier les souris montage de ces critères par le CO 2 asphyxie.

  1. Recueillir cultures comme décrit dans la section 2. Remettre en suspension de chaque population de cellules dans 1 ml de PBS. Compter les cellules viables en utilisant dosage bleu trypan.
  2. Préparer 15 ml tubes de centrifugation. Pour trois exemplaires mesures ajoutent 1,5 x 10 6 cellules viables dilué dans 2 ml de PBS dans chaque tube (5 x 10 5 cellules dans un volume de 0,5 ml sont injectées par voie sous- cutanée en droit fmaigre de chaque souris). Préparer 0,5 ml de PBS pour les souris de contrôle.
  3. En utilisant 27 g d'aiguilles, subcutaneouslyinject 0,5 ml de suspension cellulaire à partir de cultures adhérentes, des cultures traditionnelles TIC traditionnels, floater cultures TiC, ou de PBS dans le flanc droit de chacun de trois souris par groupe. Souris Retour à la post-injection de cages d'origine.
  4. Peser et mesurer les souris des tumeurs palpables en deux dimensions deux fois weeklyby Pied à coulisse, établissant longueur et la largeur.
    REMARQUE: Le temps de latence des tumeurs est généralement de 20 à 50 jours en fonction de la lignée cellulaire.
  5. Calculer le volume tumoral humide par des procédés standard (V = (largeur) 2 x longueur / 2).
    REMARQUE: Bien que cette étude a comparé tumorigénicité des TIC par rapport aux cellules adhérentes pour la première génération uniquement, passages en série in vivo des TIC cultivées dans des conditions similaires a été complété par d'autres 11,20.

Representative Results

Fondée lignées cellulaires du cancer de l'ovaire et une lignée de cellules d'ascite primaire cultivées dans des conditions de culture adhérentes traditionnelles en présence d'émission de sérum attachée, pavée morphologie, alors que les mêmes cellules cultivées dans des conditions de culture TIC Affichage flottant sphéroïde morphologie, fréquente dans les populations TIC. Images en fond clair affichés dans la figure 1 A montrent clairement les différences morphologiques dans les conditions de culture. Figure 1B montre les morphologies différenciés obtenus après les plaquant les ACI-23 et TGS-trois cultures TIC dans des conditions adhérentes traditionnels. Juste 24 heures après l'ensemencement de retour dans des conditions adhérentes, la majorité des sphéroïdes multicellulaires dissocier et attacher à la surface, ressemblant à des cellules adhérentes typiques.

Pour vérifier que les conditions TIC enrichissent pour les cellules avec des marqueurs de cellules souches cytométrie en flux analyse a été réalisée en utilisant deux marqueurs communs de TIC de l'ovaire - CD133 expression et de l'activité de l'ALDH. Dot parcelles représentées sur la figure 2 A soulignent l'augmentation du pourcentage de cellules CD133 + dans faible attachement, des conditions sans sérum. De même, l'activité de l'enzyme ALDH est plus élevée dans ces conditions par rapport aux conditions traditionnelles de culture adhérentes. Bien que les cultures adhérentes traditionnels contiennent CD133 + cellules, le pourcentage augmente dans des conditions qui favorisent la formation sphéroïde. Analyse d'un marqueur de la pluripotence, TRA-1-60, étaye davantage que les conditions TIC pour enrichir tics, Figure 2 B. Quantification de la figure 2 C montre que la double positifs (CD133 + ALDH +) de l'ACI-23 cellules sont largement limitées aux cultures cultivées sous conditions TIC améliorant. Changements dans les niveaux de différents facteurs de transcription qui se produisent dans les ACI-23 cellules après cinq jours de culture dans les conditions TIC protéines ont également été examinés. Une augmentation progressive de chacun des marqueurss est vu du traditionnel au floater conditions TIC par rapport aux niveaux relativement faibles observés dans la culture adhérente, Figure 2 D. Il est intéressant d'une lignée cellulaire humaine cultivée ascitique dans les diverses conditions affiche le phénotype le plus élevé du marqueur dans les conditions de TIC traditionnelles avec peu ou pas de coloration présent dans les conditions TIC de flottaison, la figure 2 E.

La tumorigénicité des conditions de culture TIC a été validée par des injections sous-cutanées d'un nombre égal de cellules viables obtenues à partir de toutes les conditions dans les cohortes de souris nudes athymiques. La figure 3 montre que l'ACI-23 (a, b) et OVCAR-5 (C) des cellules provenant de cultures adhérentes traditionnels étaient moins tumorigènes que ceux des cultures TIC. Notez que le flotteur cultures TIC produites tumeurs plus volumineuses dans un court laps de temps que les cultures de TIC adhérentes ou traditionnelles traditionnels. Ces data suggèrent que même avec une modeste augmentation des marqueurs de TIC de l'ovaire, il ya un changement phénotypique dramatique. Cependant, avec d'autres lignées cellulaires (non représentés) les cultures de TIC traditionnelles étaient plus tumorigène de cellules adhérentes et flotteur culture traditionnels TIC.

Figure 1
Ovaire lignées cellulaires du cancer Figure 1. de développement Spheroid dans différentes conditions de culture. (A) Établi (ACI-23, OVCAR-5 et Caov3) et les cellules primaires provenant de patients ascite (TGS-3) cultivés dans des flacons de fixation faibles avec sans sérum endiguer les médias de cellule, forment facilement sphéroïdes multicellulaires. Images montrent conditions traditionnelles de culture adhérentes maintenir épithéliale pavée morphologie dans ACI-23, OVCAR-5, Caov3 et TGS-3 cellules, alors que les mêmes cellules formées sphéroïdes dans les 96 heures dans des conditions TIC. Barre d'échelle de 100 um. (B) Lors de l'exposition de 24 heuresà des conditions traditionnelles de culture adhérentes, les morphologies de culture TIC présentent un phénotype différencié ressemblant à la morphologie adhérente originale. Barre d'échelle de 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Basse-attachement, des conditions sans sérum enrichissent pour les cellules avec des marqueurs TIC. (A) La cytométrie en flux analyse des ACI-23 cellules en utilisant APC conjugué anticorps CD133 démontre un pourcentage accru de CD133 + dans des flacons de fixation bas avec tige sans sérum support de cellules. La cytométrie de flux en utilisant l'analyse Aldefluor dosage montre une activité accrue de l'ALDH dans des cellules cultivées dans des flacons de faibles support de fixation avec des cellules souches sans sérum. CD133 contrôle négatif contient aucun anticorps et ALDH con négativele substrat commande est activé en présence de l'inhibiteur de l'ALDH (DEAB). (B) Analyse utilisant FITC conjugué anticorps TRA-1-60 montre plus haut pourcentage de cellules + TRA-1-60 dans les flotteurs conditions TIC dans l'ACI-23 cellules. Contrôle négatif contient aucun anticorps. (C) + CD133 + ALDH cellules sont les plus élevés en TIC traditionnelle et Floater conditions TIC dans la lignée cellulaire ACI-23. Les barres d'erreur: SEM, N = 6, * p <0,05. (D) analyse Western blot montrant augmentation des niveaux de marqueurs de la transcription de cellules souches dans les ACI-23 cellules cultivées dans des conditions TIC pour cinq jours protéines. Le total des lysats cellulaires (50 ug) d'avec la GAPDH ont été analysés en tant que témoin de chargement. (E) tracés de points représentatifs de TGS-trois cellules d'ascite primaires analysés comme dans Un. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 3. Faible-attachement, des conditions sans sérum pour enrichir les cellules avec augmentation de la tumorigénicité. (A) 5 x 10 5 viables ACI-23 cellules ont été injection sous-cutanée dans des souris nude athymiques en triple. Les souris ont été pesées et les tumeurs mesurées deux fois par semaine par étrier. A = La culture traditionnelle adhérente, la culture F = Floater TIC, la culture traditionnelle S = TIC. * P <0,05. (B) images représentatifs de tumeurs formées d'ACI-23 après 25 jours en utilisant des cellules cultivées dans différentes conditions de culture. (C) 5 x 10 5 cellules viables OVCAR-cinq injection sous-cutanée à des souris nude athymiques en triple exemplaire et surveillé comme dans Un. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit ici présente une méthode efficace et cohérente pour enrichir les cultures des cellules avec des caractéristiques de cellules souches à partir de lignées cellulaires de cancer ovarien établies et est applicable aux échantillons primaires de patients. Cette méthode avec succès pour enrichit TIC à travers une variété de lignées cellulaires. Il permet d'identifier en temps opportun des conditions qui enrichissent une TIC et / ou phénotype tumorigène, sans prendre le temps de trier physiquement les TIC de non-TIC au sein de la population. De cette manière, les niveaux relatifs des différentes voies de signalisation peuvent être évalués pour leur contribution au phénotype TIC en comparant les cultures adhérentes traditionnelles pour Tic cultures en utilisant une variété de tests fonctionnels. Si une population pure TIC est désiré, l'isolement peut être facilement obtenu en incorporant une étape assistée par fluorescence ou tri magnétique dans la cytométrie de flux de protocole.

Il est important de garder à l'esprit, cependant, que l'expression de marqueur TICs, comme CD133, CD44, ou ALDH, peut varier selon les lignées cellulaires ou des échantillons de patients, même du même type de tumeur. Par exemple, nous avons constaté que les cellules OVCAR-cinq ont une plus forte expression de CD44 par rapport à CD133, alors que l'inverse est vrai pour l'ACI-23. Il est donc pertinent de se appuyer sur l'initiation de la tumeur chez les souris et analyse par cytométrie de flux comme définitive présence de TIC. À la suite de ce protocole, une forte activité de ALDH est constamment observée lorsque les cellules du cancer des ovaires ont été cultivées dans des conditions de cellules souches. Fait intéressant, l'expression CD133 est systématiquement plus élevée dans l'ACI-23 cellules cultivées dans des conditions traditionnelles de culture TIC, alors que ALDH est le plus élevé dans flottaison conditions TIC. En revanche, les cellules TGS-3 ascitiques primaires présentent une légère augmentation de la positivité CD133 flottaison sous conditions TiC, mais une augmentation remarquable de l'activité de ALDH dans des conditions de TIC traditionnelles. Ces résultats mettent en évidence l'hétérogénéité des cellules de cancer ovarien et la plasticité communément associé à tics. Pour soutenir davantage la claim que ces méthodes améliorent TIC, l'enrichissement de la TRA-1-60 cellules positives a également été observée. TRA-1-60 est un marqueur de la pluripotence et a été utilisé pour identifier les carcinomes embryonnaires de l'ovaire et les testicules ainsi que le cancer de la prostate TICS 30-32. Bien que nos méthodes ont été couronnés de succès avec de nombreuses lignées cellulaires, il est possible que les conditions de TIC standards peuvent être mieux adaptées à certaines cellules de cancer de l'ovaire, tandis que les conditions de flottaison modifiés meilleur enrichissement en TIC dans d'autres populations de cellules de cancer de l'ovaire. Cela souligne à nouveau l'hétérogénéité attendue dans les deux lignées cellulaires de cancer ovarien provenant de patients et établis.

En plus des marqueurs de surface cellulaire, il existe plusieurs facteurs de transcription qui ont été montrés pour caractériser tics cancer de l'ovaire, y compris Nanog, Sox2, Oct-4 11, bien que ces marqueurs ne sont pas spécifiques à des tics cancer de l'ovaire et représentent plutôt des facteurs importants pour embryonnaire pluripotence des cellules souches et difdifféren- 33,34. Nous avons examiné les changements dans les niveaux de ces facteurs protéiques et a constaté que les niveaux augmentent Nanog dans des conditions de culture TIC, en accord avec les autres 13,35 ainsi que CD133, TRA-1-60, et CD117. Un marqueur de cellules souches matrice d'ADNc humain en outre montré une augmentation dans les gènes CD133, Nanog, Melk, et dans les conditions PODXL TIC adhérentes par rapport aux conditions traditionnelles. Fait important, il convient de noter que, comme avec des marqueurs de surface cellulaire, des facteurs de transcription associés à CIT ovariens peuvent varier entre les lignées cellulaires et des échantillons de patients.

Nous avons observé que les cellules peuvent être plus tumorigène et expriment des niveaux plus élevés de marqueurs de cellules souches se ils sont par nature non adhérente in vitro (par exemple, les cellules qui ne se fixent pas facilement à une plaque adhérente flottante). En culture, les lignées cellulaires telles que les ACI-23 ont typiquement beaucoup de cellules et / ou flottantes de cellules viables qui croissent verticalement dans un mode d'empilage sous condit de culture traditionnelions. Bien que l'enrichissement réussie des TIC à partir de cellules flottantes et agrégats pourrait être applicables à relativement peu de lignées cellulaires, y compris ceux de la présente étude et OVCAR-3 12, nos résultats suggèrent que cela pourrait représenter une population plus tumorigène. Par conséquent, la récolte de la population "flottante" des cellules cultivées en plaques et les milieux de culture de tissus standards peut servir une autre méthode d'enrichissement TIC, pour les cellules qui se adaptent mal aux médias sur les cellules souches commerciale.

L'utilisation de différentes méthodes de culture présentées dans ce manuscrit permettra l'enrichissement rapide des populations TIC et une meilleure compréhension de ce que les facteurs soutenir ce phénotype dans des cellules différentes. Les applications actuelles de cette méthode comprennent caractérisation des voies de signalisation qui sont essentiels pour soutenir la propagation de cette population unique de cellules. Les résultats de ces études aideront à clarifier les mécanismes de progression de la tumeur et de rechute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask Corning 3814
75 cm2 Tissue Culture Flask Sarstedt 83.1813.002
Aldefluor Kit Stemcell Technologies 1700
CD133-APC Miltenyi Biotec Inc. 130-090-826
Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant Sigma-Aldrich F0291 Prepared according to manufacturer's instructions
Epidermal Growth Factor - human recombinant Sigma-Aldrich E9644 Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS
DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) Gibco 11330-032
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning cellgro 21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution Corning Cellgro 25-056-CI
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-10G
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 51500-056
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Fetal Bovine Serum (heat inactivated) Gemini 100-106
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) Nalgene 450-0045
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430052
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl Lonza 17-942E

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