En Enriquecimiento vitro de células iniciadoras del tumor del cáncer de ovario

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House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells. J. Vis. Exp. (96), e52446, doi:10.3791/52446 (2015).

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Abstract

Introduction

El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal en los Estados Unidos con la mayor causa de morbilidad y mortalidad de ser las características altamente recurrentes, quimiorresistentes de esta enfermedad. El tratamiento primario por lo general comprende la cirugía de citorreducción máxima y la terapia basada en platino posterior, aunque existe cierta evidencia que sugiere la terapia neoadyuvante podría ser beneficioso en algunos casos 1. La mayoría de los pacientes responden favorablemente al tratamiento primario, pero desafortunadamente la mitad recaerá en 18 meses 2.

La mayoría de los tumores malignos de ovario son carcinomas epiteliales y pueden tener su origen en el epitelio superficial del ovario o 3,4 tubo de Falopio. Varios estudios apoyan la existencia de células madre somáticas en el sistema reproductor femenino que, presumiblemente, ayudar en la reparación de los tejidos que se necesita después de la ovulación 5,6. La alta actividad proliferativa, tanto en el ovario y la trompa de Falopio durante ovulación podría ser un factor importante en el desarrollo de cáncer de ovario (Gharwan, et al. manuscrito presentado). La derivación de las células tumorales de formación está claro pero puede surgir a partir de células madre normales, células progenitoras, o células diferenciadas a través de mutaciones que las hacen incapaces de regular la división o el destino. Estas células también se han denominado "células madre del cáncer", o "células iniciadoras del cáncer", y pueden crecer en esferoides multicelulares tumorígenos, bajo condiciones de poca fijación. Aunque el modelo jerárquico de desarrollo TIC puede ser dinámico, TICs comparten muchas de las mismas características que las células madre normales, incluyendo la quietud, la resistencia a la quimioterapia, a largo plazo la auto-renovación y la capacidad de diferenciarse en varios linajes celulares 7,8.

Varios estudios apoyan la existencia de las TICs en el cáncer de ovario y de los esfuerzos actuales están llevando a cabo para aclarar el mecanismo (s) por el cual estas células apoyan tumorigénesis 9-11. Se han propuesto varios marcadores para identificar TIC de ovario con tumorigenicidad mejorada incluyendo CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, y MyD88, aunque la contribución exacta de cada marcador no está clara y puede ser de tipo celular específico 11-16. Mientras que un marcador universal, o conjunto de marcadores no se ha demostrado de manera inequívoca para TICs ováricos, diferentes grupos han aislado TICs ováricos más comúnmente mediante la selección de CD44 +, CD133 + y / o células con alta aldehído deshidrogenasa (ALDH) actividad 13,17-21. CD44 es una glicoproteína transmembrana que actúa como receptor para el ácido hialurónico y regula varios procesos importantes para la progresión tumoral, incluyendo la adhesión, proliferación, migración, la angiogénesis y la diferenciación 22. CD133 es una glicoproteína transmembrana cuya función todavía no está claro, pero los estudios sugieren que organiza topología de la membrana plasmática 23. ALDH, una enzima intracelular que cataliza la oxidación de aldehídos, puede ser la más universal marcador de TIC como alta actividad ha sido identificada en células madre aisladas de una variedad de tejidos y múltiples funciones han sido atribuidas a ALDH en el apoyo a las células madre normales y los tics 24. A partir de ahora, CD133 y ALDH1 parecen ser los marcadores más reproducibles de TICs ovario 13,21.

Además de conocer las características de las TICs, también hay un gran esfuerzo para identificar fármacos que se dirigen específicamente a esta subpoblación. La alta tasa de recaída asociado con el cáncer de ovario puede ser debido al fracaso de las quimioterapias actuales para erradicar con éxito tics. Aunque la mayor parte del tumor es susceptible a las terapias existentes, tics se cree que son resistentes y con una densidad indetectable por métodos estándar. Elucidar los mecanismos de resistencia a la terapia y la recaída del tumor son vitales para mejorar la respuesta y las tasas de supervivencia global de los pacientes con cáncer de ovario.

Aquí, las técnicas de cultivo se describen ésimoa enriquecer para los tics de líneas celulares de cáncer de ovario establecidos y primarios. Las condiciones de cultivo descritas en el presente documento se han usado por varios grupos para inducir la propagación de células tics o esferoide con cualidades de células madre 11,12,14,16,20. Aunque hay varios medios de cultivo de células madre y suplementos comúnmente usados ​​para enriquecer TIC / esferoides se utilizó una fórmula medios libres de suero con EGF y FGF, pero sin la adición de B27 o N-2 suplementos. Estos suplementos, comúnmente utilizados para el cultivo celular neuronal y enriquecedora para las células madre, se han demostrado para promover un fenotipo mesenquimal 25,26 y hay cierta incertidumbre en el campo de si TIC que tienen un fenotipo mesenquimal o epiteliales son más tumorigénico 27-29 . Para minimizar las incertidumbres y las variables se optó por utilizar la fórmula más común, ya que se trata de células de cáncer de ovario epitelial.

El mantenimiento de las células en medio libre de suero en un matraz bajo adjuntofacilita la formación de esferoides y apoya la propagación de células con expresión CD133 y alta actividad ALDH. Nuestro trabajo ha puesto de manifiesto, además, que las células flotantes en condiciones normales adherentes también pueden representar una población TIC más tumorigénico. La inyección de células cultivadas en estas condiciones en ratones desnudos atímicos conduce a un mayor potencial tumorigénico en comparación con las células cultivadas en condiciones adjuntas en presencia de suero. Mucha información sobre el papel de las TICs en la iniciación del cáncer ovárico, la progresión, la respuesta terapéutica, y la recaída de la enfermedad puede ser adquirida a través de la utilización de estas técnicas.

Protocol

1. Cultura de ovario líneas celulares de cáncer (adherentes Condiciones)

NOTA: Toda la manipulación de las células y los medios de comunicación debe tener lugar en una campana de cultivo de tejido estéril

  1. Preparar medios de cultivo celular tradicional. Use 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamina, + 15 mM HEPES) y suplementar con suero fetal inactivado por calor al 10% de bovino y 1% de penicilina / estreptomicina. Filtrar la solución usando 0,45 micras filtro de vacío.
  2. Preparar una tradicional poliestireno 75cm frasco de cultivo de tejido 2 etiquetada con el nombre, la fecha y el número de paso de la línea celular de interest.Remove el vial de células de ultra baja congelador o nitrógeno líquido. Descongele colocando en baño a 37 ° C durante 5 min.
  3. Suspensión Traslado del vial en un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 3 ml de medio de cultivo celular tradicional (preparado anteriormente). La suspensión se centrifuga a 4 ° C durante 5 min a 400 x g. Mientras tanto, añadir 16 medios de cultivo celular tradicionales ml al matraz.
  4. Aspirar el sobrenadante. El uso de 2 ml de cultivo celular células pipeta medios tradicionales hacia arriba y abajo para aflojar pellet y suspensión traslado al frasco. Suavemente frasco roca para distribuir uniformemente frasco cells.Place en humidificado incubadora de cultivo celular se establece en 37 ° C y 5% de CO 2. Monitorear las células diariamente hasta que se alcanzó el 80% de confluencia.
  5. Una vez que las células son 80% confluentes dividió el cultivo 1: 2 en campana de cultivo celular. Aspirar el sobrenadante y lavar con solución salina tamponada con fosfato caliente (sin calcio y magnesio) (PBS). Añadir 1,5 ml de tripsina al 0,25% EDTA y se incuba 3-5 min a TA.
  6. Prepare 2 nuevos 75cm 2 frascos de poliestireno y añadir 16 ml de medio de cultivo celular tradicional a cada matraz. Resuspender las células tratadas con tripsina en 4 ml de medios tradicionales de cultivo celular y alícuotas volúmenes iguales de cada uno de los nuevos matraces.
  7. Colocar en frascos humidificado incubadora de cultivo celular ponen a 37 ° C y 5% de CO 2. Monitorear las células diariamente hasta que se alcanzó el 80% de confluencia. Continúe dividir celdas yla cultura o la congelación y almacenar a -80 o en nitrógeno líquido.

2. Generación de esferoides multicelulares de ovario líneas celulares de cáncer Uso de células flotantes o adherentes

NOTA: Toda la manipulación de las células y los medios de comunicación debe tener lugar en una campana de cultivo de tejido estéril. Después de cultivar las líneas celulares bajo los métodos de cultivo tradicionales para 2-3 pasajes (sección 1) continuar con los siguientes pasos.

  1. Preparar los medios de comunicación de células madre. Use 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutamina, + 15 mM HEPES) y suplementar con 1% de penicilina / estreptomicina (a una concentración final de 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina), 1% de reemplazo de suero knockout , 0,4% de albúmina de suero bovino y 0,1% de insulina-transferrina-selenio. Filtrar la solución usando 0,45 micras filtro de vacío.
  2. Medios de células madre Suplemento con el factor recombinante humano de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico recombinante humano (FGF) para una concentración final de 20 ng / ml y 10 ng / ml, respectivamente.
    NOTA: Los factores de crecimiento se deben agregar fresco a los medios de comunicación de células madre justo antes de su uso.
  3. Crear cultura flotador TIC. Retire frasco de 80% de células confluentes cultivadas en condiciones de cultivo adherentes tradicionales. Recoger medios de comunicación y todas las células flotantes (individuales y agregados), dejando a la población adherente detrás, y la transferencia a 50 ml tubo de centrífuga de polipropileno. La suspensión se centrifuga a 4 ° C durante 5 min a 400 x g.
    NOTA: Las células flotantes y agregados son evidentes 24-72 horas después de células adherentes se unen al matraz en la cultura tradicional. Desde un 80% de recuperación de la placa confluente de aproximadamente 1.0 - 5.0 x 10 5 células flotantes viables se puede esperar, dependiendo de la línea celular. En este estudio, el número medio de células flotantes recogidas de un cultivo adherente confluentes 80% fue: 5,0 x 10 5 para ACI-23, 4,8 x 10 5 para OVCAR5, 3,5 x 10 5 para Caov3, y 1,0 x 10 5 para TGS- 3. Tras la transferencia, multicelularla formación de esferoides ular en cultivo tradicional y TIC flotador se produce dentro de unos pocos días aunque esto es algo dependiente línea celular. Por ejemplo, ACI-23 células forman agregados más fácilmente que las células Caov3.
  4. Mientras tanto, prepare un ultra bajo apego poliestireno superficie 75 cm 2 frasco de cultivo de tejido etiquetado con el nombre, la fecha y el número de paso de la línea celular. Añadir 10 ml de células madre medios suplementados con factores de crecimiento al matraz.
  5. Una vez que se completa la centrifugación, medios de aspirado y la transferencia de pellets a matraz bajo apego añadiendo 6 ml tallo medio celular y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para aflojar pellet. Colocar en frascos humidificado incubadora de cultivo celular ponen a 37 ° C y 5% de CO 2. Monitor de células cada 2 - 3 días para observar la formación de esferoides.
  6. Crear cultura TIC tradicional. Retire frasco de 80% de células confluentes cultivadas en condiciones de cultivo adherentes tradicionales. Medios Aspirar y lavar con PBS caliente. Añadir 1,5 ml de tripsina al 0,25% de EDTA y se incuba 3-5min a TA.
  7. Preparar un ultra bajo apego poliestireno superficie 75 cm 2 frasco de cultivo de tejido etiquetado con el nombre, la fecha y el número de paso de la línea celular. Añadir 10 ml de células madre medios de comunicación, suplementado con EGF y FGF, como se describe, al matraz.
  8. Añadir 6 ml de medio de células madre en el matraz con la tripsina. Solución de células Pipetear hacia arriba y hacia abajo y tratar de aflojar las células de la superficie del matraz. Transfiera todo el volumen de las células a la ultra baja frasco adjunto que contiene los 10 ml provienen medio celular. Coloque el frasco en humidificado incubadora de cultivo celular establece en 37 ° C y 5% de CO 2.
  9. Suplemento culturas TIC cada 48 a 72 hr con un adicional de 2 ml detener los medios de comunicación celulares y EGF y FGF fresco para concentraciones finales de 20 ng / ml y 10 ng / ml, respectivamente.
  10. Monitorear las células hasta 60 - se alcanza el 80% de confluencia. Culturas divididas por la colocación de volúmenes iguales en 2 frascos nuevos de ultra bajo de fijación y la adición de medios de células madre frescas para alcanzar un volumen final de 18 ml. AlternativaLy, centrífuga de toda la suspensión a 4 ° C durante 5 min a 400 x g. Resuspender las células en medios de células madre complementados con EGF y FGF y distribuyen por igual en nuevos frascos de ultra bajo de apego. Las células no tienen que ser disociado en suspensiones de células individuales para pases.
    NOTA: En este punto, las culturas se seguirá dividiéndose y culta, congelado, o experimentalmente manipulado para su análisis. En 60 a 80% de confluencia se recuperaron las siguientes concentraciones de células de ACI-23: 8,0 x 10 6 para Tradicional Adherente, 4,0 x 10 6 para Tradicional TIC, y 5,0 x 10 6 de culturas Floater TIC. Aunque podría ser línea celular dependiente, hemos encontrado que de 5 - 10 días de cultivo es óptimo para el enriquecimiento TIC como el porcentaje de CD133 + ALDH + células es baja dentro de los primeros 3 días, los picos a los 5 - 10 días, y disminuye de nuevo en 14 días.

3. Generación de líneas de células epiteliales primarias de cáncer de ovario y multicelulares esferoidesde ascitis Paciente quimiorresistente

NOTA: aprobación de la Junta de Revisión Institucional se obtuvo para este protocolo. Toda la manipulación de las células y los medios de comunicación debe tener lugar en una campana de cultivo de tejido estéril.

  1. Placa de fluido de ascitis 1: 1 con medio de cultivo celular tradicional. Preparar los medios de comunicación como se describe en la sección 1 y añadir 10 ml de varios frascos tradicionales cm2 de cultivo de tejidos de poliestireno 75.
  2. El líquido ascítico se suele realizar en 1 L de botellas de vacío estéril; retire la tapa de vacío. Añadir con cuidado 10 ml de líquido ascítico al frasco que contiene 10 ml de medios de comunicación tradicionales y lugar en humidificado incubadora de cultivo celular establecidos a 37 ° C y 5% de CO 2. Deje reposar durante 72 a 96 horas, antes de hacer un cambio de medio completo. Cambie medios cada 2-3 días hasta que las células alcanzan 60-80% de confluencia
  3. Una vez que las células alcanzan 60-80% de confluencia, dividir 1: 2 como se describe en el apartado 1. culturas Inicio TIC como se describe en la sección 2.
    NOTA: Los eritrocitos presentes en ascites serán removidos después del primer cambio de medio, ya que son no adherentes. Cualquier fibroblastos presentes serán eliminados en gran medida después del tratamiento con tripsina ya que son más sensibles y levantar con una exposición mínima a la tripsina. La pureza de las células de cáncer de ovario se determinó mediante análisis de citometría de flujo usando el anticuerpo de CA-125 (MUC16).

4. La tinción de células para Citometría de Flujo Confirmación de TIC Marcadores

  1. Reunir culturas TIC. Transferir contenido del frasco en 50 ml tubo de centrífuga de polipropileno. Suspensiones Centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Medios Aspirar y lavar con PBS caliente. Añadir 2 ml de solución de disociación celular no enzimática, incubar 3 - 5 min a 37 ° C, y pipetear arriba y abajo para romper los grumos y se disocian en células individuales. Añadir 4 ml detener los medios de comunicación celulares.
  2. Recoger cultivos adherentes. Medios Aspirar y lavar con PBS caliente. Añadir 3 ml de solución de disociación celular no enzimática y se incuba 3 - 5 min a 37 ° C. Añadir 3 ml de células tradicionalmedios de cultivo y pipeta hacia arriba y abajo varias veces para separar las células del frasco y recogen en el tubo de centrífuga.
  3. Centrifugar tanto TIC y suspensiones adherentes durante 5 minutos a 400 x g. Desechar el sobrenadante y resuspender cada sedimento en 1 ml de PBS que contenía suero bovino fetal al 3%. Incubar a RT 30 min. Mientras tanto, contar el número de células viables utilizando azul de tripano. Observar las células bajo el microscopio para confirmar esferoides se disocian en células individuales.
  4. Etiqueta de 5 x 1,5 ml tubos Eppendorf para cada una de las siguientes condiciones de cultivo: 1) no teñida (control de mancha de indemnización), 2) ALDH (de control sola mancha positivo para la compensación), 3) CD133 (control positivo sola mancha de indemnización), 4 ) ALDH + CD133 (muestra experimental de prueba), y 5) DEAB + ALDH (controles negativos para la fluorescencia de fondo en FL-1 y FL-4 canales, respectivamente).
  5. Distribuir aproximadamente 5 x 10 5 células cada uno de los tubos # 1 - 4. suspensiones Centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Aspirar supernatant y volver a suspender las pastillas en 500 l Aldefluor tampón de ensayo. Añadir 10 l DEAB (inhibidor de ALDH) al tubo # 5 para el control negativo experimental.
  6. Añadir 5 l activados reactivo Aldefluor al tubo # 2 para el control positivo de compensación y la película para mezclar. Añadir 5 l activados reactivo Aldefluor al tubo # 4 para el análisis experimental. Flick tubo para mezclar y transferir inmediatamente la mitad del volumen de células de tubo # 4 en el tubo # 5 (250 l) que contiene el DEAB.
  7. Tubos Flick se mezclen bien. Incubar todos los tubos durante 30 - 45 min a 37 ° C protegido de la luz. Tubos Flick a mitad de período de incubación como células se depositan en el fondo. Centrifugar todos los tubos durante 5 min a 400 x g. Sobrenadante y volver a suspender las células Aspirar en 500 l Aldefluor tampón de ensayo.
  8. Para tubos con tinción CD133 (# 3 y # 4), añadir CD133-APC 1:11 directamente en tampón de ensayo Aldefluor. Incubar 15 minutos en hielo protegido de la luz. Tubos de centrífuga de CD133 para 5 min a 400 x g. Lavar una vez con500 l Aldefluor tampón de ensayo. Resuspender las células en 500 l de tampón de ensayo Aldefluor, respectivamente.
  9. Filtrar suspensiones en tubos de fondo redondo de poliestireno individuo con tapa filtro celular. Asegúrese de que todo el volumen se filtra a través de la tapa.
  10. Utilizar un citómetro de flujo para analizar la población celular. Utilice tubos # 1-3 para ajustar los controles de compensación. Utilizando hacia adelante y los parámetros secundarios de dispersión, puerta de las células, asegurándose de excluir los desechos celulares. Establecer células dobles utilizando FL-1 y FL-4 canales, respectivamente ALDH + y CD133 +.
  11. Utilizando un programa de análisis de citometría, confirman las condiciones de cultivo mejorado el porcentaje de células TIC como las culturas Tic-ricos deberían tener una mayor tinción para estos dos marcadores.
    NOTA: Además de CD133 y ALDH, otros TIC cáncer de ovario markersof se puede analizar con el número de marcadores usados ​​en cualquier muestra dependen de las capacidades de citómetro de flujo.

5. En vivo

NOTA: aprobación de la Junta de Revisión Institucional se obtuvo para este protocolo. Distribuir ratones desnudos hembra atímicos 6-8 semanas de edad en grupos experimentales en jaulas de 3 y permitir que se aclimaten durante unos días antes de las inyecciones. Siga ratones bajo directrices experimentales humanas como por NIH Cuidado de Animales y el empleo Comisión; controlar el peso corporal, la apariencia física, incluyendo la pérdida o ganancia de peso superior al 20%, aspecto demacrado, la diarrea o la dermatitis y la eutanasia a los ratones encajan estos criterios por CO 2 asfixia.

  1. Reunir culturas como se describe en la sección 2. Resuspender cada población celular en 1 ml de PBS. Contar las células viables mediante ensayo de azul tripán.
  2. Preparar 15 ml tubos de centrífuga. Para triplicado medidas añaden 1,5 x 10 6 células viables diluidos en 2 ml de PBS en cada tubo (5 x 10 5 células en un volumen de 0,5 ml se inyectaron por vía subcutánea en la derecha flacio de cada ratón). Preparar 0,5 ml de PBS sólo para los ratones de control.
  3. El uso de agujas 27 G, subcutaneouslyinject 0,5 ml de suspensión de células a partir de cultivos adherentes tradicionales, culturas TIC tradicionales, flotador culturas TiC, o PBS en el flanco derecho de cada uno de 3 ratones por grupo. Ratones Regreso al jaulas originales después de la inyección.
  4. Pesar los ratones y medir cualquier tumores palpables en dos dimensiones dos veces weeklyby Vernier pinza, el establecimiento de longitud y anchura.
    NOTA: el tiempo de latencia del tumor es generalmente 20 a 50 días, dependiendo de la línea celular.
  5. Calcular el volumen de tumor en húmedo por métodos estándar (V = (anchura) 2 x longitud / 2).
    NOTA: Aunque este estudio se comparó la tumorigenicidad de las TIC frente a las células adherentes de la primera generación sólo, pasada en serie en vivo de las TICs cultivadas bajo condiciones similares ha sido completado por otros 11,20.

Representative Results

Establecido líneas celulares de cáncer de ovario y una línea celular de ascitis primaria cultivada en condiciones de cultivo tradicionales adherentes en la presencia de suero espectáculo adjunta, la morfología de adoquines, mientras que las mismas células cultivadas en condiciones de cultivo TIC pantalla flotante morfología esferoidal, común en las poblaciones de TIC. Imágenes de campo claro mostradas en la Figura 1 A muestran claramente las diferencias morfológicas en las condiciones de cultivo. La Figura 1B muestra las morfologías diferenciadas obtenidos después de resiembra las ACI-23 y TGS-3 culturas TIC en condiciones adherentes tradicionales. Sólo 24 hr después de la siembra de nuevo en condiciones adherentes, la mayoría de los esferoides multicelulares se disocian y se adhieren a la superficie, se asemeja a las células adherentes típicas.

Para verificar que las condiciones TIC enriquecen de células con marcadores de células madre de citometría de flujo se realizó un análisis utilizando dos marcadores comunes de TICs de ovario - CD133 expression y la actividad de ALDH. Las gráficas de puntos que se muestran en la Figura 2 A resaltar el aumento del porcentaje de células CD133 + en poco apego, condiciones libres de suero. Del mismo modo, la actividad de la enzima ALDH es mayor en estas condiciones en comparación con condiciones de cultivo adherentes tradicionales. Aunque los cultivos adherentes tradicionales contienen células CD133 +, los incrementos porcentuales en condiciones que mejoran la formación de esferoides. Análisis de un marcador de pluripotencia, TRA-1-60, se presta más apoyo que las condiciones TIC enriquecen de TICs, Figura 2 B. La cuantificación de la Figura 2 C demuestra que (CD133 + ALDH +) ACI-23 células doble positivas se limitan en gran parte a los cultivos que crecen bajo condiciones que mejoran TIC. También se examinaron los cambios en los niveles de proteína de diferentes factores de transcripción que se producen en las células de ACI-23 después de cinco días de cultivo en las condiciones TIC. Un aumento progresivo de cada uno de el marcadors se ve desde lo tradicional a flotador condiciones TIC en comparación con los niveles relativamente bajos observados en el cultivo adherente, Figura 2 D. Curiosamente una línea celular humana ascitis crecido en las diversas condiciones muestra el fenotipo marcador más alto que las condiciones TIC tradicionales con poca o ninguna tinción presente en las condiciones TIC flotador, la Figura 2 E.

La tumorigenicidad de las condiciones de cultivo TIC se validó a través de inyecciones subcutáneas de números iguales de células viables obtenidas a partir de todas las condiciones en cohortes de ratones desnudos atímicos. La Figura 3 demuestra que ACI-23 (A, B) y OVCAR-5 (C) células de cultivos adherentes tradicionales fueron menos tumorigénicas que los de las culturas TIC. Tenga en cuenta que las culturas TIC flotantes producen tumores más grandes en un período corto de tiempo que las culturas tradicionales TIC adherentes o tradicionales. Estos data sugieren que incluso con un modesto aumento en los marcadores de TIC de ovario, hay un cambio fenotípico dramático. Sin embargo, con otras líneas celulares (no se muestra) las culturas TIC tradicionales eran más tumorigénico de las células del cultivo TIC adherentes y flotador tradicionales.

Figura 1
Figura 1. Esferoide de desarrollo en diferentes condiciones de cultivo. (A) de la empresa de ovario líneas celulares de cáncer de células primarias derivadas del paciente ascitis (TGS-3) obtenidas en matraces de fijación con bajos libre de suero (ACI-23, OVCAR-5 y Caov3) y tallo medio celular forma fácilmente esferoides multicelulares. Las imágenes muestran las condiciones de cultivo adherentes tradicionales mantienen la morfología de adoquines epitelial en ACI-23, OVCAR-5, Caov3 y TGS-3 células, mientras que las mismas células formadas esferoides dentro de las 96 horas en condiciones de TIC. Barra de escala 100 micras. (B) Tras la exposición de 24 horasa condiciones de cultivo adherentes tradicionales, las morfologías de cultivo TIC muestran un fenotipo diferenciado se asemeja a la morfología original de adherente. Barra de escala 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Baja-apego, condiciones libres de suero para enriquecer células con marcadores de TIC. (A) análisis de citometría de células ACI-23 utilizando APC conjugado anticuerpo CD133 flujo demuestra un aumento del porcentaje de células CD133 + en frascos bajos de apego con tallo sin suero medios de comunicación celulares. Utilizando análisis de citometría de flujo muestra de ensayo Aldefluor aumento de la actividad ALDH en células cultivadas en matraces bajas de fijación con los medios de células madre libre de suero. Control negativo CD133 no contiene anticuerpos y con negativo ALDHcontrol es el sustrato activado en presencia del inhibidor de ALDH (DEAB). (B) Análisis utilizando FITC conjugado anticuerpo TRA-1-60 muestra mayor porcentaje de células TRA-1-60 + en los flotadores condiciones TIC en ACI-23 células. El control negativo no contiene anticuerpo. (C) CD133 + ALDH + células son las más altas en el tradicional TIC y flotador condiciones TIC en la línea celular de ACI-23. Las barras de error: SEM, n = 6, * p <0,05. (D) Análisis de transferencia de Western que muestra aumento en los niveles de proteína de marcadores transcripcionales de las células madre en las células ACI-23 cultivadas en condiciones TIC durante 5 días. Lisados ​​de células enteras (50 g) se analizaron con GAPDH como control de carga. (E) gráficos de puntos representativos de TGS-3 células de ascitis primarios analizados como en A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 3. Low-apego, condiciones libres de suero enriquecen para las células con un aumento de la tumorigenicidad. (A) 5 x 10 5 ACI-23 células viables se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos por triplicado. Los ratones se pesaron y se midieron los tumores mediante un calibre dos veces por semana. A = cultura tradicional adherente, cultura F = Flotante TIC, la cultura S = tradicional TIC. * P <0,05. (B) Imágenes representativas de los tumores formados a partir de ACI-23 después de 25 días usando células cultivadas bajo diferentes condiciones de cultivo. (C) 5 x 10 5 células viables OVCAR-5 se inyecta por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos por triplicado y monitoreado como en A. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El protocolo descrito aquí presenta un método eficiente y consistente para enriquecer cultivos de células con características de células madre a partir de líneas celulares de cáncer de ovario establecidos y es aplicable a muestras primarias de pacientes. Este método enriquece con éxito para los tics a través de una variedad de líneas celulares. Permite la identificación oportuna de las condiciones que enriquecen a un TIC y / o fenotipo tumorigénico, sin tomarse el tiempo para ordenar físicamente las TICs de los no TICs dentro de la población. De esta manera, los niveles relativos de las diferentes vías de señalización pueden ser evaluados por su contribución al fenotipo TIC mediante la comparación de cultivos adherentes tradicionales para Tic culturas que utilizan una variedad de ensayos funcionales. Si se desea una población pura TIC, el aislamiento se puede conseguir fácilmente mediante la incorporación de un paso de fluorescencia asistida o magnético de clasificación en el protocolo de citometría de flujo.

Es importante tener en cuenta, sin embargo, que la expresión del marcador de TICs, tales como CD133, CD44, o ALDH, puede variar entre líneas celulares o muestras incluso del mismo tipo de tumor de pacientes. Por ejemplo encontramos que las células OVCAR-5 tienen una mayor expresión de CD44 en relación con CD133, mientras que lo contrario es cierto para ACI-23. Por tanto, es pertinente que confiar en la iniciación del tumor en ratones y análisis de citometría de flujo como definitiva de la presencia TIC. Siguiendo este protocolo, actividad alta ALDH fue constantemente observada cuando las células de cáncer de ovario se cultivaron en condiciones de células madre. Curiosamente, la expresión CD133 es consistentemente mayor en las células de ACI-23 cultivadas en condiciones tradicionales de cultivo de TIC, mientras que ALDH es mayor en flotador condiciones TIC. En contraste los TGS-3 células de ascitis primarios muestran un pequeño aumento en CD133 positividad bajo condiciones flotador TIC, pero un aumento notable en la actividad ALDH en condiciones TIC tradicionales. Estos resultados ponen de manifiesto la heterogeneidad de las células del cáncer de ovario y la plasticidad comúnmente asociado con las TICs. Para apoyar aún más la claim que estos métodos mejoran TIC, también se observó el enriquecimiento de TRA-1-60 células positivas. TRA-1-60 es un marcador de pluripotencia y se ha utilizado para identificar carcinomas embrionarios del ovario y testículos, así como cáncer de próstata TICS 30-32. Aunque nuestros métodos han tenido éxito con numerosas líneas de células, es posible que las condiciones TIC estándar pueden ser más adecuado para algunas células de cáncer de ovario, mientras que las condiciones flotador modificados mejor enriquecen para los tics en otras poblaciones de células de cáncer de ovario. De nuevo, esto pone de manifiesto la heterogeneidad esperada dentro de las dos líneas celulares de cáncer de ovario-derivados de pacientes y establecidos.

Además de los marcadores de superficie celular hay varios factores de transcripción que se ha demostrado para caracterizar TIC cáncer de ovario incluyendo Nanog, Sox2, Oct-4 11, aunque estos marcadores no son específicos de TIC de cáncer de ovario y más bien representan factores importantes para la pluripotencia de células madre embrionarias y difdiferencia- 33,34. Se examinaron los cambios en los niveles proteicos de estos factores y encontró que los niveles Nanog aumentan en condiciones de cultivo de TIC, de acuerdo con los demás 13,35 así como CD133, TRA-1-60, y CD117. Una matriz de ADNc marcador de células madre humanas mostró además un incremento en los genes CD133, Nanog, Melk y Podxl en las condiciones TIC en comparación con las condiciones adherentes tradicionales. Es importante destacar que, cabe señalar que, como con marcadores de superficie celular, factores de transcripción asociados con tics ováricos pueden variar entre líneas celulares y muestras de pacientes.

Hemos observado que las células pueden ser más tumorigénico y expresan niveles más altos de marcadores de células madre si son inherentemente no adherente in vitro (es decir, células que no se adhieren fácilmente a una placa adherente flotante). En cultivo, líneas celulares tales como ACI-23 normalmente tienen muchas células y / o células viables flotantes que crecen verticalmente en una manera de apilamiento bajo Condit cultura tradicionaliones. Aunque el enriquecimiento exitosa de TICs de las células flotantes y agregados podría ser líneas celulares aplicables a relativamente pocos incluidas las del presente estudio y OVCAR-3 12, nuestros hallazgos sugieren que esto podría representar una población más tumorigénico. Por lo tanto, la recolección de la población "flotante" de las células cultivadas en placas de cultivo de tejidos y medios de comunicación estándar puede servir como un método alternativo de enriquecimiento de TIC, para las células que se adaptan mal a los medios de comunicación de células madre comercial.

El uso de los diferentes métodos de cultivo que se presentan en este manuscrito permitirá el enriquecimiento rápido de las poblaciones de TIC y una mejor comprensión de cuáles son los factores apoyar este fenotipo en diferentes células. Las aplicaciones actuales de este método incluyen caracterizadora que las vías de señalización son vitales para mantener la propagación de esta población única de células. Los resultados de estos estudios ayudarán a aclarar los mecanismos de progresión del tumor y la recaída.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask Corning 3814
75 cm2 Tissue Culture Flask Sarstedt 83.1813.002
Aldefluor Kit Stemcell Technologies 1700
CD133-APC Miltenyi Biotec Inc. 130-090-826
Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant Sigma-Aldrich F0291 Prepared according to manufacturer's instructions
Epidermal Growth Factor - human recombinant Sigma-Aldrich E9644 Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS
DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) Gibco 11330-032
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning cellgro 21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution Corning Cellgro 25-056-CI
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-10G
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 51500-056
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Fetal Bovine Serum (heat inactivated) Gemini 100-106
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) Nalgene 450-0045
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430052
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl Lonza 17-942E

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