In Arricchimento vitro di Ovarian Cancer Cells-tumorali avvio

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House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells. J. Vis. Exp. (96), e52446, doi:10.3791/52446 (2015).

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Abstract

Introduction

Il cancro ovarico è il tumore maligno ginecologica più letale negli Stati Uniti con la principale causa di morbilità e mortalità essere i altamente ricorrenti, caratteristiche chemioresistenti di questa malattia. Il trattamento primario di solito comprende chirurgia citoriduttiva massima e successiva terapia a base di platino, anche se c'è qualche evidenza a suggerire la terapia neoadiuvante potrebbe essere utile in alcuni casi 1. La maggior parte dei pazienti risponde positivamente al trattamento primario, ma purtroppo la metà sarà recidiva entro 18 mesi 2.

La maggior parte delle neoplasie ovariche sono carcinomi epiteliali e possono provenire gli epiteli della superficie del tubo 3,4 ovaio o di Falloppio. Diversi studi sostengono l'esistenza di cellule staminali somatiche nel sistema riproduttivo femminile che presumibilmente aiutare nella riparazione dei tessuti che è necessario dopo l'ovulazione 5,6. L'alta attività proliferativa sia l'ovaio e tube di Falloppio durante Övülzione potrebbe essere un fattore importante per lo sviluppo del cancro ovarico (Gharwan, et al. manoscritto presentato). La derivazione di cellule tumorali che formano non è chiara, ma potrebbe derivare da cellule staminali normali, le cellule progenitrici, o cellule differenziate attraverso mutazioni che li rendono in grado di regolare la divisione o il destino. Queste cellule sono state anche chiamate "cellule staminali del cancro", o "le cellule tumorali-avvio," e possano diventare cancerogeni, sferoidi multicellulari in condizioni basse di fissaggio. Anche se il modello gerarchico di sviluppo TIC può essere dinamico, TIC condividono molte delle stesse caratteristiche di cellule staminali normali compreso quiescenza, la resistenza alla chemioterapia, a lungo termine di auto-rinnovamento e la capacità di differenziarsi in vari lignaggi cellulari 7,8.

Diversi studi sostengono l'esistenza di TIC nel carcinoma ovarico e gli attuali sforzi sono in corso per chiarire il meccanismo (s), con cui queste cellule sostengono tumorigenesi 9-11. Numerosi indicatori sono stati proposti per identificare TIC ovariche con maggiore tumorigenicità compreso CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, e MyD88, anche se l'esatto contributo di ciascun indicatore è chiara e può essere tipo cellulare specifico 11-16. Mentre un indicatore universale o un insieme di marcatori non è stata inequivocabilmente stabilito per TIC ovariche, diversi gruppi hanno isolato TIC ovarici più comunemente selezionando per CD44 +, CD133 + e / o cellule con elevata aldeide deidrogenasi (ALDH) Attività 13,17-21. CD44 è una glicoproteina transmembrana che agisce come un recettore per l'acido ialuronico e regola diversi processi importanti per la progressione del tumore, compreso adesione, proliferazione, migrazione, differenziazione angiogenesi e 22. CD133 è una glicoproteina transmembrana la cui funzione non è ancora chiaro, ma gli studi suggeriscono che organizza membrana plasmatica topologia 23. ALDH, un enzima intracellulare che catalizza l'ossidazione di aldeidi, può essere il più universal marcatore di TIC come alta attività è stato identificato in cellule staminali isolate da una varietà di tessuti e molteplici ruoli sono stati attribuiti a ALDH nel sostenere cellule staminali normali e TIC 24. A partire da ora, CD133 e ALDH1 sembrano essere gli indicatori più riproducibili di tic ovarica 13,21.

Oltre a comprendere le caratteristiche delle TIC, vi è anche un grande sforzo per identificare i farmaci che colpiscono specificamente questa sottopopolazione. Il tasso di ricaduta elevato associato al cancro ovarico può essere dovuto al fallimento di chemioterapie attuali per sradicare successo TIC. Sebbene la maggior parte del tumore è suscettibile di terapie esistenti, tic si pensa siano resistenti e ad una densità non rilevabile con metodi standard. Chiarire i meccanismi di resistenza alla terapia e di recidiva del tumore sono di vitale importanza per migliorare i tassi di risposta e di sopravvivenza globale dei pazienti con tumore ovarico.

Qui, tecniche di coltura sono descritte tha arricchire per IAT di linee cellulari di cancro ovarico consolidati e primari. Le condizioni di coltura qui descritti sono stati utilizzati da diversi gruppi per indurre la propagazione di tic o cellule sferoidali con qualità di cellule staminali 11,12,14,16,20. Sebbene vi siano diversi media di coltura delle cellule staminali e integratori comunemente usati per arricchire TIC / sferoidi abbiamo usato una formula supporto privo di siero con EGF e FGF, ma senza l'aggiunta di B27 o N-2 integratori. Questi integratori, comunemente usati per la coltura delle cellule neuronali e arricchimento per cellule staminali, hanno dimostrato di promuovere un fenotipo mesenchimale 25,26 e rimane qualche incertezza nel campo come se TIC aventi un fenotipo mesenchimale o epiteliali sono più tumorigenica 27-29 . Per ridurre al minimo le incertezze e le variabili abbiamo scelto di utilizzare la formula più comune, dal momento che si tratta di cellule di cancro ovarico epiteliale.

Mantenere le cellule in mezzi senza siero in un pallone basso attaccamentofacilita la formazione sferoide e sostiene la diffusione di cellule con espressione CD133 e alta attività ALDH. Il nostro lavoro ha inoltre dimostrato che le cellule galleggianti in normali condizioni aderenti possono anche rappresentare una popolazione TIC più oncogeno. Iniezione di cellule cresciute in queste condizioni in topi nudi atimici porta ad una maggiore potenzialità oncogeno rispetto a cellule coltivate in condizioni allegate in presenza di siero. Molte informazioni per quanto riguarda il ruolo delle TIC in iniziazione ovarico cancro, la progressione, la risposta terapeutica, e la ricaduta di malattia può essere acquisita tramite l'uso di queste tecniche.

Protocol

1. Cultura tradizionale Ovarian Cancer Cell Lines (aderenti Conditions)

NOTA: Tutte manipolazione di cellule e dei media dovrebbe avvenire in una cappa coltura tissutale sterile

  1. Preparare terreni di coltura cellulare tradizionale. Utilizzare 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutammina, + HEPES 15 mm) e integrare con il 10% di calore inattivato siero fetale bovino e 1% di penicillina / streptomicina. Soluzione Filter utilizzando 0,45 micron filtro a vuoto.
  2. Preparare un polistirene 75 centimetri fiasco cultura tradizionale 2 tessuto etichettato con il nome, la data e il numero di passaggio della linea cellulare del interest.Remove flaconcino di cellule da ultra low freezer o in azoto liquido. Scongelare mettendo in 37 ° C bagnomaria per 5 min.
  3. Sospensione Trasferimento da flacone in un tubo da centrifuga da 15 ml contenente 3 ml mezzi di coltura cellulare tradizionale (preparata in precedenza). Sospensione Centrifugare a 4 ° C per 5 min a 400 x g. Nel frattempo, aggiungere 16 mezzi di coltura cellulare tradizionali ml a pallone.
  4. Aspirare il surnatante. Utilizzando 2 ml di coltura cellulare cellule supporti pipette tradizionali su e giù per allentare pellet e sospensione trasferimento a boccetta. Delicatamente pallone roccia per distribuire uniformemente pallone cells.Place in umidificata incubatore coltura cellulare impostato a 37 ° C e 5% di CO 2. Monitorare le cellule tutti i giorni fino a raggiungere l'80% di confluenza.
  5. Una volta che le cellule sono l'80% confluenti dividere la cultura 1: 2 in cappuccio coltura cellulare. Aspirare il surnatante e lavare con fosfati calda salina tamponata (senza calcio e magnesio) (PBS). Aggiungere 1,5 ml tripsina 0,25% -EDTA e incubare 3-5 minuti a temperatura ambiente.
  6. Preparare 2 nuovi polistirolo 75 centimetri 2 palloni e aggiungere 16 ml di mezzi di coltura cellulare tradizionale per ogni pallone. Risospendere le cellule in 4 ml trypsinized media tradizionali coltura cellulare e volumi uguali aliquote a ciascuno dei nuovi flaconi.
  7. Inserire palloni in coltura cellulare incubatore umidificato impostati a 37 ° C e 5% CO 2. Monitorare le cellule tutti i giorni fino a raggiungere l'80% di confluenza. Continuare a dividere le celle ecultura o congelare e conservare a -80 o in azoto liquido.

2. Generazione di multicellulare Spheroids da ovariche linee di cancro cella utilizzando galleggianti o aderenti Cells

NOTA: Tutte manipolazione di cellule e dei media dovrebbe avvenire in una cappa coltura tissutale sterile. Dopo coltura linee cellulari sotto i metodi di coltura tradizionali per 2 - 3 passaggi (sezione 1) procedere con le seguenti operazioni.

  1. Preparare supporti di cellule staminali. Utilizzare 1: 1 DMEM: F12 (+ L-glutammina, + HEPES 15 mM) e integrare con 1% di penicillina / streptomicina (ad una concentrazione finale di 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina), 1% di siero rimontaggio knockout , 0,4% di albumina sierica bovina, e 0,1% di insulina transferrina selenio. Soluzione Filter utilizzando 0,45 micron filtro a vuoto.
  2. Supporto di cellule staminali Supplemento con fattore umano ricombinante di crescita epidermico (EGF) e del fattore di crescita ricombinante base di fibroblasti umani (FGF) per una concentrazione finale di 20 ng / ml e 10 ng / ml, rispettivamente.
    NOTA: I fattori di crescita dovrebbero essere aggiunti fresco al supporto di cellule staminali a destra prima dell'uso.
  3. Creare cultura floater TIC. Rimuovere pallone di 80% di cellule confluenti coltivate in condizioni tradizionali di coltura aderenti. Raccogliere i media e tutte le cellule galleggianti (singole e aggregati), lasciando la popolazione aderenti alle spalle, e trasferimento in tubo da 50 ml centrifuga in polipropilene. Sospensione Centrifugare a 4 ° C per 5 min a 400 x g.
    NOTA: le celle galleggianti e aggregati sono evidenti 24-72 ore dopo cellule aderenti sono attaccati al pallone sotto cultura tradizionale. Da un 80% confluenti piastra recupero di circa 1.0 - 5.0 x 10 5 cellule vitali galleggianti può prevedere, a seconda della linea cellulare. In questo studio il numero medio di cellule galleggianti raccolti da una coltura confluente aderente 80% era: 5,0 x 10 5 per ACI-23, 4,8 x 10 5 per OVCAR5, 3,5 x 10 5 per CAOV3, e 1,0 x 10 5 per TGS- 3. Dopo il trasferimento, multicellformazione sferoide colare nella cultura TIC tradizionale e floater si verifica nel giro di pochi giorni, anche se questo è un po linea cellulare dipendente. Ad esempio, ACI-23 cellule formano aggregati più facilmente rispetto alle cellule CAOV3.
  4. Nel frattempo, preparare un basso attaccamento polistirolo superficie 75 centimetri 2 pallone di coltura di tessuto ultra etichettato con il nome, la data e il numero di passaggio della linea cellulare. Aggiungere 10 ml staminali supporti cellulari integrati con fattori di crescita per il pallone.
  5. Una volta centrifugazione è completa, i media e il trasferimento Aspirare pellet a basso pallone di attacco aggiungendo 6 ml staminali supporti cellulari e pipettando su e giù per allentare pellet. Inserire palloni in coltura cellulare incubatore umidificato impostati a 37 ° C e 5% CO 2. Monitorare le cellule ogni 2 - 3 giorni di tempo per osservare la formazione sferoide.
  6. Creare cultura TIC tradizionale. Rimuovere pallone di 80% di cellule confluenti coltivate in condizioni tradizionali di coltura aderenti. Supporti Aspirare e lavare con caldo PBS. Aggiungere 1,5 ml di tripsina 0,25% EDTA e incubare 3-5min a RT.
  7. Preparare un basso attaccamento polistirolo superficie 75 centimetri 2 pallone di coltura di tessuto ultra etichettato con il nome, la data e il numero di passaggio della linea cellulare. Aggiungere 10 ml staminali supporti cellulari, integrati con EGF e FGF, come descritto, al pallone.
  8. Aggiungere 6 ml staminali supporti cella a pallone con la tripsina. Soluzione di cellule Pipettare su e giù e tentare di allentare le cellule dalla superficie fiasco. Trasferire tutto il volume delle cellule di pallone attacco ultra low contenente i 10 ml staminali supporti cellulare. Inserire pallone in coltura cellulare incubatore umidificato impostato 37 ° C e 5% CO 2.
  9. Supplemento culture TIC ogni 48-72 ore con un ulteriore 2 ml staminali supporti cellulari e EGF fresco e FGF per concentrazioni finali di 20 ng / ml e 10 ng / ml, rispettivamente.
  10. Monitorare le cellule fino a 60 - a raggiungere l'80% di confluenza. Culture Split mettendo volumi uguali in 2 nuovi palloni ultra bassa di attaccamento e l'aggiunta di supporto di cellule staminali fresche per ottenere un volume finale di 18 ml. Alternativaly, centrifugare l'intera sospensione a 4 ° C per 5 min a 400 x g. Risospendere le cellule in mezzi cellule staminali integrate con EGF e FGF e distribuiscono equamente in nuove bottiglie ultra-low di fissaggio. Le cellule non devono essere dissociate in sospensioni di cellule singole per passaging.
    NOTA: A questo punto le culture possono continuare ad essere diviso e colta, congelato, o sperimentalmente manipolato per l'analisi. A 60 - 80% di confluenza le seguenti concentrazioni di cellule sono state recuperate per ACI-23: 8.0 x 10 6 per tradizionale Adherent, 4,0 x 10 6 per tradizionale TIC, e 5,0 x 10 6 per culture Floater TIC. Anche se potrebbe essere la linea cellulare dipendente, abbiamo scoperto che 5-10 giorni in coltura è ottimale per TIC arricchimento come la percentuale di CD133 + ALDH cellule + è basso entro i primi 3 giorni, picchi a 5-10 giorni e diminuisce di nuovo a 14 giorni.

3. Generazione di primaria epiteliale ovarico cancro linee cellulari e pluricellulari Spheroidsda chemioresistente ascite Paziente

NOTA: approvazione Institutional Review Board è stato ottenuto per questo protocollo. Tutti manipolazione di cellule e dei media dovrebbe avvenire in una cappa coltura tissutale sterile.

  1. Ascite piastra del fluido 1: 1 con mezzi di coltura cellulare tradizionale. Preparare media come descritto nella sezione 1 e aggiungere 10 ml di diversi tradizionali polistirolo 75 palloni cm 2 coltura dei tessuti.
  2. Liquido ascitico è di solito fornito in 1 L bottiglia vuoto sterile; rimuovere il tappo di vuoto. Aggiungere con cautela 10 ml ascite fluidi a pallone contenente 10 ml di media tradizionali e mettere in coltura cellulare umidificata incubatore impostati a 37 ° C e 5% di CO 2. Lasciare riposare per 72-96 ore, prima di fare un cambiamento multimediale completo. Cambiare i media ogni 2 - 3 giorni fino cellule raggiungono 60 - 80% di confluenza
  3. Una volta che le cellule raggiungono 60 - 80% di confluenza, dividere 1: 2 come descritto nella sezione 1. culture Inizio TIC come descritto nella sezione 2.
    NOTA: Gli eritrociti presenti in ASCITes saranno rimossi dopo il primo cambio dei media come sono non-aderenti. Eventuali fibroblasti presenti saranno in gran parte rimossi dopo il trattamento con tripsina in quanto sono più sensibili e alzerà con l'esposizione minima tripsina. Purezza delle cellule di cancro ovarico è stata determinata mediante citometria a flusso utilizzando anticorpi per CA-125 (MUC16).

4. La colorazione di Celle per Citometria a Flusso Conferma di TIC Marcatori

  1. Raccogliere culture TIC. Trasferire contenuto del flacone in tubo da 50 ml centrifuga in polipropilene. Sospensioni di centrifugazione per 5 min a 400 x g. Supporti Aspirare e lavare con caldo PBS. Aggiungere 2 ml di soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica, incubare 3 - 5 min a 37 ° C, e pipettare su e giù per rompere grumi e dissociare in cellule singole. Aggiungere 4 ml staminali supporti cellulari.
  2. Raccogliere culture aderenti. Supporti Aspirare e lavare con caldo PBS. Aggiungere 3 ml di soluzione dissociazione cellulare non enzimatica e incubare 3-5 minuti a 37 ° C. Aggiungere 3 ml di cellule tradizionaleterreni di coltura e pipettare su e giù più volte per staccare le cellule dal pallone e raccolgono in provetta da centrifuga.
  3. Centrifugare sia TIC e sospensioni aderenti per 5 min a 400 x g. Eliminare il surnatante e risospendere ogni pellet in 1 ml di PBS contenente siero bovino fetale 3%. Incubare a RT 30 min. Nel frattempo, contare il numero di cellule vitali mediante trypan blu. Osservare le cellule sotto il microscopio per confermare sferoidi sono dissociate in singole cellule.
  4. Label 5 x 1,5 ml provette Eppendorf per ciascuna delle seguenti condizioni di coltura: 1) senza macchia (controllo senza macchia per la compensazione), 2) ALDH (singola macchia di controllo positivo di risarcimento), 3) CD133 (singola macchia di controllo positivo di risarcimento), 4 ) ALDH + CD133 (campione sperimentale), e 5) Deab + ALDH (controlli negativi per fluorescenza di fondo in FL-1 e FL-4 canali, rispettivamente).
  5. Distribuire circa 5 x 10 5 cellule ciascuno per tubi # 1 - 4. sospensioni centrifuga per 5 minuti a 400 x g. Aspirare supernatant e risospendere pellet in 500 microlitri Aldefluor tampone del saggio. Aggiungere 10 ml Deab (inibitore ALDH) per tubo # 5 per il controllo sperimentale negativo.
  6. Aggiungere 5 ml attivati ​​Aldefluor reagente tubo # 2 di risarcimento controllo positivo e flick a mescolare. Aggiungere 5 ml attivati ​​Aldefluor reagente tubo # 4 per l'analisi sperimentale. Tubo Flick per mescolare e trasferire la metà del volume di cellule dalla provetta # 4 nel tubo # 5 (250 microlitri) che contiene il Deab immediatamente.
  7. Tubi Flick per mescolare bene. Incubare tutte le provette per 30 - 45 min a 37 ° C al riparo dalla luce. Tubi Flick a metà periodo di incubazione, come le cellule si depositerà sul fondo. Centrifugare tutte le provette per 5 min a 400 x g. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 500 microlitri Aldefluor tampone del saggio.
  8. Per tubi con CD133 colorazione (# 3 e # 4), aggiungere CD133-APC 01:11 direttamente in tampone Aldefluor. Incubare 15 min in ghiaccio al riparo dalla luce. Provette CD133 per 5 min a 400 x g. Lavare una volta con500 microlitri Aldefluor tampone. Risospendere le cellule in 500 microlitri tampone Aldefluor rispettivamente.
  9. Filtro sospensioni in tubi tondi fondo polistirene individuale con tappo filtro cella. Assicurarsi che l'intero volume è filtrato attraverso il tappo.
  10. Utilizzare un citometro a flusso per analizzare la popolazione cellulare. Utilizzare tubi # 1-3 per impostare i controlli di compensazione. Utilizzando in avanti e parametri laterale scatter, porta le cellule, essendo sicuri di escludere detriti cellulari. Stabilire celle doppie con FL-1 e FL-4 canali, rispettivamente ALDH + e CD133 +.
  11. Utilizzando un programma di analisi di citometria, confermano le condizioni di coltura migliorato la percentuale di cellule TIC come le culture ricche di TIC dovrebbe avere maggiore colorazione per questi due marcatori.
    NOTA: Oltre al CD133 e ALDH, altre TIC cancro ovarico markersof può essere analizzato con il numero di marcatori utilizzati in qualsiasi campione dipendono dalle capacità del citometro a flusso.

5. In vivo

NOTA: approvazione Institutional Review Board è stato ottenuto per questo protocollo. Distribuire topi nudi atimici femmina 6 - 8 settimane di età in gruppi sperimentali in gabbie di 3 e lasciare acclimatare per alcuni giorni prima di iniezioni. Seguire i topi sotto le linee guida sperimentali umani come da NIH Animal Care and Use Committee; monitorare il peso corporeo, l'aspetto fisico tra cui la perdita di peso o aumento superiore al 20%, aspetto emaciato, diarrea o dermatiti e eutanasia topi che corrispondono a questi criteri da CO 2 asfissia.

  1. Raccogliere le culture, come descritto nella sezione 2. Sospendere ogni popolazione di cellule in 1 ml di PBS. Contare cellule vitali utilizzando trypan dosaggio blu.
  2. Preparare 15 ml provette. Per triplicato misure aggiungono 1,5 x 10 6 cellule vitali diluite in 2 ml di PBS in ogni provetta (5 x 10 5 cellule in un volume di 0,5 ml vengono iniettati sottocute in destra flank di ogni mouse). Preparare 0,5 ml PBS solo per topi di controllo.
  3. Utilizzando 27 aghi G, subcutaneouslyinject 0,5 ml di sospensione cellulare da culture aderenti tradizionali, culture TIC tradizionali, floater culture TIC, o PBS nel fianco destro di ciascuno dei 3 topi per gruppo. Topi Rientro gabbie originale post-iniezione.
  4. Pesare topi e misurare eventuali tumori palpabili in due dimensioni due volte weeklyby Vernier pinza, stabilire la lunghezza e la larghezza.
    NOTA: il tempo di latenza dei tumori è di solito 20-50 giorni a seconda della linea cellulare.
  5. Calcolare il volume del tumore bagnata con metodi standard (V = (larghezza) 2 x lunghezza / 2).
    NOTA: Anche se questo studio ha confrontato oncogenesi della TIC contro cellule aderenti per la prima generazione solo passaggio in serie in vivo delle TIC coltivate in condizioni simili è stato completato da altri 11,20.

Representative Results

Fondata linee di cellule di cancro ovarico e una linea di cellule ascite primario coltivate in condizioni tradizionali aderenti coltura in presenza di siero spettacolo allegato, ciottoli morfologia, che le stesse cellule cresciute in condizioni di coltura TIC visualizzano fluttuante sferoide morfologia, comune nelle popolazioni TIC. Immagini Brightfield visualizzate in Figura 1 A mostrano chiaramente le differenze morfologiche nelle condizioni di coltura. Figura 1B mostra le morfologie differenziate raggiunti dopo replating gli ACI-23 e TGS-3 culture TIC in condizioni aderenti tradizionali. Appena 24 ore dopo la semina di nuovo in condizioni di aderenti, la maggioranza dei sferoidi multicellulari dissocia e allegare alla superficie, simile cellule tipiche aderenti.

Per verificare che le condizioni TIC arricchiscono di cellule con marcatori di cellule staminali citometria a flusso analisi è stata effettuata utilizzando due indicatori comuni di tic ovariche - CD133 expression e l'attività ALDH. Trame Dot illustrati nella Figura 2 A evidenziare l'aumento della percentuale di cellule CD133 + in basso attaccamento, condizioni di assenza di siero. Analogamente, l'attività dell'enzima ALDH è maggiore in queste condizioni rispetto alle tradizionali condizioni di coltura aderenti. Anche se le tradizionali culture aderenti contengono cellule CD133 +, la percentuale aumenta in condizioni che migliorano la formazione sferoide. Analisi di un marcatore pluripotenza, TRA-1-60, presta ulteriore supporto che le condizioni TIC arricchiscono di tic, Figura 2 B. La quantificazione in Figura 2 C dimostra che doppia positivi (CD133 + ALDH +) ACI-23 cellule sono in gran parte limitati a colture coltivate in TIC condizioni migliorando. Sono stati esaminati anche cambiamenti nei livelli di proteina di diversi fattori di trascrizione che si verificano nelle cellule ACI-23, dopo cinque giorni di cultura nelle condizioni TIC. Un aumento progressivo ogni del marcatores è visto dal tradizionale al floater condizioni TIC rispetto ai livelli relativamente bassi registrati nella cultura aderenti, Figura 2 D. È interessante notare che una linea cellulare umana ascite coltivato in varie condizioni mostra la più alta fenotipo marcatore nelle condizioni TIC tradizionali con poca o nessuna colorazione presente nelle condizioni TIC floater, Figura 2 E.

La tumorigenicità delle condizioni di coltura TIC è stato validato attraverso iniezioni sottocutanee di un numero uguale di cellule vitali ottenute da tutte le condizioni in coorti di topi nudi atimici. Figura 3 dimostra che ACI-23 (A, B) e OVCAR-5 (C), le cellule da culture tradizionali aderenti erano meno oncogeno di quelli delle culture TIC. Si noti che i floater culture TIC prodotte tumori più grandi in un periodo di tempo più breve rispetto ai tradizionali culture TIC aderenti o tradizionali. Questi data suggeriscono che anche con un modesto aumento dei marker TIC ovarici, vi è un drammatico cambiamento fenotipico. Tuttavia con altre linee cellulari (non mostrati) le tradizionali culture TIC erano più tumorigenica rispetto alle tradizionali celle di coltura TIC aderenti e galleggiante.

Figura 1
Figura 1. sviluppo Spheroid in diverse condizioni di coltura. (A) Fondata ovarico linee di cellule di cancro (ACI-23, OVCAR-5 e CAOV3) e le cellule primarie derivate da pazienti ascite (TGS-3), coltivate in fiaschi bassi di attaccamento con senza siero staminali supporti di cellule facilmente formare sferoidi multicellulari. Immagini mostrano condizioni tradizionali di coltura aderenti mantengono epiteliale ciottoli morfologia ACI-23, OVCAR-5, CAOV3 e TGS-3 celle, mentre le stesse cellule sferoidi formate entro 96 ore in condizioni di TIC. Scale bar 100 micron. (B) Dopo 24 ore di esposizionealle condizioni tradizionali di coltura aderenti, le morfologie cultura TIC mostrano un fenotipo differenziato simile morfologia aderenti originale. Bar Scala 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Basso-attaccamento, condizioni di assenza di siero arricchiscono di cellule con marcatori TIC. (A) di citometria a flusso analisi ACI-23 cellule utilizzando APC coniugato anticorpo CD133 dimostra una maggiore percentuale di cellule CD133 + in fiaschi bassi di attaccamento con stelo senza siero supporti cellulari. Citometria a flusso analisi utilizzando Aldefluor spettacoli di analisi maggiore attività ALDH in cellule coltivate in fiaschi bassi di attaccamento con i media di cellule staminali senza siero. Controllo negativo CD133 contiene anticorpi e ALDH con negativocontrollo è il substrato attivato in presenza dell'inibitore ALDH (Deab). (B) Analisi utilizzando FITC coniugato TRA-1-60 anticorpi dimostra più alta percentuale di + cellule TRA-1-60 in floater condizioni TIC in ACI-23 cellule. Controllo negativo non contiene anticorpi. (C) CD133 + ALDH cellule + sono più alti nel tradizionale TIC e Floater condizioni TIC nella linea cellulare ACI-23. Le barre di errore: SEM, N = 6, * p <0.05. (D) analisi Western Blot mostrando aumento dei livelli di proteina di marcatori trascrizionali di cellule staminali nei ACI-23 cellule in coltura in condizioni di TIC per 5 giorni. Lisati cellulari Whole (50 mcg) sono stati analizzati con GAPDH come controllo di caricamento. (E) dot plots rappresentativi di TGS-3 cellule ascite primarie analizzate come in A. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.


Figura 3. Low-attaccamento, condizioni di assenza di siero arricchiscono di celle con maggiore tumorigenicità. (A) 5 x 10 5 valide ACI-23 cellule sono state via sottocutanea iniettato in topi nudi atimici in triplice copia. I topi sono stati pesati e misurati da tumori pinza due volte alla settimana. A = Cultura tradizionale aderente, cultura F = Floater TIC, cultura S = Tradizionale TIC. * P <0,05. (B) Immagini rappresentative di tumori formati da ACI-23 dopo 25 giorni utilizzando cellule cresciute in diverse condizioni di coltura. (C) 5 x 10 5 valide OVCAR-5 cellule sono state via sottocutanea iniettato in topi nudi atimici in triplice copia e monitorati come in A. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il protocollo qui descritto presenta un metodo efficace e coerente per arricchire le culture per le cellule con caratteristiche di cellule staminali provenienti da linee di cellule di cancro ovarico stabiliti ed è applicabile a campioni primari. Questo metodo arricchisce successo per TIC attraverso una varietà di linee cellulari. Esso consente la tempestiva individuazione delle condizioni che arricchiscono di TIC e / o fenotipo tumorigenico, senza prendere tempo per risolvere fisicamente gli IAT di non-TIC all'interno della popolazione. In questo modo, i livelli relativi di diverse vie di segnalazione possono essere valutati per il loro contributo al fenotipo TIC confrontando culture aderenti tradizionali per Tic culture utilizzando una varietà di test funzionali. Se una popolazione pura TIC è desiderato, l'isolamento può essere facilmente ottenuto incorporando un passo fluorescenza assistita o magnetico classificare in citometria a flusso di protocollo.

E 'importante tenere a mente, però, che l'espressione di marcatore TICs, come CD133, CD44, o ALDH, possono variare tra linee cellulari o campioni, anche dello stesso tipo di tumore paziente. Ad esempio, abbiamo scoperto che le cellule OVCAR-5 hanno una maggiore espressione di CD44 rispetto al CD133, mentre l'inverso è vero per ACI-23. È quindi pertinente fare affidamento su l'iniziazione del tumore nei topi e citometria a flusso di analisi come definitivo della presenza TIC. A seguito di tale protocollo, l'attività di alta ALDH stata costantemente osservata quando le cellule tumorali ovariche sono state coltivate in condizioni di cellule staminali. È interessante notare che l'espressione CD133 è costantemente superiore a ACI-23 cellule cresciute in condizioni di coltura tradizionali TIC, mentre ALDH è più alta in floater condizioni TIC. In contrasto con le TGS-3 celle ascite primarie mostrano un lieve aumento della CD133 positività in floater condizioni TIC, ma un notevole aumento dell'attività ALDH in condizioni TIC tradizionali. Questi risultati evidenziano l'eterogeneità delle cellule di cancro ovarico e la plasticità comunemente associati con TIC. Per supportare ulteriormente la claim che questi metodi aumentano TIC, è stato osservato anche l'arricchimento di-1-60 TRA cellule positive. TRA-1-60 è un marcatore pluripotenza ed è stato utilizzato per identificare carcinomi embrionali delle ovaie e dei testicoli e il cancro alla prostata TICS 30-32. Anche se i nostri metodi hanno avuto successo con numerose linee cellulari, è possibile che le condizioni TIC standard possono essere più adatto di alcune cellule di cancro ovarico, mentre le condizioni floater modificate meglio arricchiscono di TIC in altre popolazioni di cellule di cancro ovarico. Questo sottolinea ancora una volta l'eterogeneità atteso entro entrambe le linee di cellule di cancro ovarico-paziente derivati ​​e affermati.

Oltre ai marcatori di superficie delle cellule ci sono diversi fattori trascrizionali che sono stati indicati per caratterizzare TIC cancro ovarico tra cui Nanog, Sox2, Oct-4 11, anche se questi marcatori non sono specifici di TIC cancro ovarico e piuttosto rappresentano fattori importanti per embrionali pluripotenza delle cellule staminali e difdifferenzia- 33,34. Abbiamo esaminato i cambiamenti nei livelli di proteina di questi fattori e abbiamo scoperto che i livelli di Nanog aumentano in condizioni di coltura TIC, in accordo con gli altri 13,35 e CD133, TRA-1-60, e CD117. Un array di cDNA marker delle cellule staminali umane ha mostrato inoltre un aumento di geni CD133, Nanog, Melk, e PODXL nelle condizioni TIC rispetto alle condizioni tradizionali aderenti. Importante, va notato che, come marcatori di superficie cellulare, fattori trascrizionali associati con tic ovarici possono variare tra linee cellulari e campioni dei pazienti.

Abbiamo osservato che le cellule possono essere più tumorigenica ed esprimono livelli elevati di marcatori di cellule staminali se sono intrinsecamente non aderente in vitro (cioè, le cellule non rapidamente attaccano ad una piastra aderenti flottante). Nella cultura, linee cellulari quali ACI-23 hanno tipicamente molte cellule vitali galleggianti e / o cellule che crescono verticalmente in modo tradizionale impilabile sotto condit culturaioni. Sebbene arricchimento successo di tic da cellule galleggianti e aggregati potrebbe essere applicabile a relativamente poche linee cellulari compresi quelli nel presente studio e OVCAR-3 12, i nostri risultati suggeriscono che questo potrebbe rappresentare una popolazione più oncogeno. Pertanto, la raccolta la popolazione "fluttuante" di cellule coltivate in piastre e terreni di coltura dei tessuti normali può servire come un metodo alternativo di TIC arricchimento, per le cellule che si adattano poco ai media di cellule staminali commerciale.

L'uso dei vari metodi di coltura presentati in questo manoscritto consentirà pratica arricchimento delle popolazioni TIC e una migliore comprensione di ciò fattori supportare questo fenotipo in celle diverse. Le attuali applicazioni di questo metodo includono caratterizzante che vie di segnalazione sono vitali per sostenere la propagazione di questa popolazione unica di cellule. I risultati di questi studi contribuiranno a chiarire i meccanismi di progressione del tumore e di recidiva.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask Corning 3814
75 cm2 Tissue Culture Flask Sarstedt 83.1813.002
Aldefluor Kit Stemcell Technologies 1700
CD133-APC Miltenyi Biotec Inc. 130-090-826
Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant Sigma-Aldrich F0291 Prepared according to manufacturer's instructions
Epidermal Growth Factor - human recombinant Sigma-Aldrich E9644 Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS
DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) Gibco 11330-032
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning cellgro 21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution Corning Cellgro 25-056-CI
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-10G
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 51500-056
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Fetal Bovine Serum (heat inactivated) Gemini 100-106
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) Nalgene 450-0045
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430052
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl Lonza 17-942E

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