In vitro Anreicherung des Eierstockkrebs Tumor-initiierenden Zellen

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House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells. J. Vis. Exp. (96), e52446, doi:10.3791/52446 (2015).

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Abstract

Introduction

Eierstockkrebs ist die tödlichste gynäkologischen Malignomen in den Vereinigten Staaten mit der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität als die hochwiederkehrenden, chemoresistenten Merkmale dieser Krankheit. Primäre Behandlung besteht in der Regel maximal onkologischer Chirurgie und anschließender Platin basierende Therapie, allerdings gibt es einige Hinweise auf eine neoadjuvante Therapie nahelegen könnten, in einigen Fällen vorteilhaft 1 sein. Die Mehrzahl der Patienten reagieren positiv auf primäre Behandlung, aber leider die Hälfte wird innerhalb von 18 Monaten 2 Rückfall.

Meist Eierstockmalignitäten epitheliale Karzinome und in der Oberfläche Epithelien des Ovars oder Eileiter 3,4 stammen. Mehrere Studien belegen die Existenz von somatischen Stammzellen in der weiblichen Fortpflanzungsorgane, die vermutlich in die Reparatur von Gewebe, das nach dem Eisprung 5,6 benötigt wird helfen. Die hohe Proliferationsaktivität sowohl am Eierstock und Eileiter während Övülation könnte ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung von Eierstockkrebs sein (Gharwan, et al. Manuskript eingereicht). Die Ableitung der tumorbildenden Zellen ist unklar, aber sie durch Mutationen, die sie nicht in der Lage Teilung oder Schicksal zu regulieren machen aus normalen Stammzellen, Vorläuferzellen oder differenzierten Zellen entstehen können. Diese Zellen sind auch "Krebsstammzellen" oder genannt worden "krebsauslösenden Zellen," und kann in tumorigenen, vielzelligen Sphäroide unter niedrigen Anbaubedingungen wachsen. Obwohl das hierarchische Modell der TIC Entwicklung können dynamisch sein, nicht TICs teilen viele der gleichen Funktionen wie normale Stammzellen einschließlich Ruhe, Resistenz gegen Chemotherapie, langfristige Selbsterneuerung und Fähigkeit, sich in verschiedenen Zelllinien 7,8 unterscheiden.

Mehrere Studien belegen die Existenz TICs bei Eierstockkrebs und die derzeitigen Bemühungen sind im Gange, um den Mechanismus (n), mit der diese Zellen unterstützt Tumorgenese 9-11 klären. Mehrere Marker wurden vorgeschlagen, um Eierstock TIC mit verbesserten Tumorigenität einschließlich CD133, ALDH1A1, CD117, CD44 und MyD88 identifizieren, obwohl der genaue Beitrag jeder Marker ist unklar und möglicherweise zelltypspezifische 11-16 sein. Während eine universelle Marker oder ein Satz von Markern wurde nicht eindeutig für Eierstock TIC eingerichtet, verschiedene Gruppen haben ovarian TIC häufiger durch Selektion auf CD44 +, CD133 + und / oder Zellen mit hoher Aldehyddehydrogenase (ALDH) -Aktivität 13,17-21 isoliert. CD44 ist ein Transmembran-Glykoprotein, das als Rezeptor für Hyaluronsäure wirkt und reguliert verschiedene Prozesse wichtig für Tumorprogression, einschließlich Adhäsion, Proliferation, Migration, Angiogenese und Differenzierung 22. CD133 ist ein Trans Glykoprotein, deren Aufgabe es ist noch unklar, aber Studien legen nahe, sie organisiert Plasmamembran-Topologie 23. ALDH, ein intrazelluläres Enzym, das die Oxidation von Aldehyden katalysiert, können die meisten univers seinal Marker TIC hohe Aktivität in Stammzellen, die aus einer Vielzahl von Geweben und mehrere Rollen getrennt haben ALDH unterstützen normale Stammzellen und TIC 24 zurückgeführt identifiziert. Ab sofort CD133 und ALDH1 scheinen die reproduzierbare Markierungen von Eierstock-TICs 13,21 sein.

Zusätzlich zum Verständnis der Merkmale der TIC, gibt es auch einen großen Aufwand, um Medikamente, die speziell auf diese Subpopulation zu identifizieren. Die hohe Rückfallrate mit Eierstockkrebs verbunden kann durch den Ausfall des aktuellen Chemotherapien erfolgreich auszurotten TICs sein. Obwohl der Großteil der Tumor empfänglich ist, um den bestehenden Therapien, werden TIC gedacht beständig und in einer Dichte nachweisbar durch Standardverfahren zu sein. Aufklärung Mechanismen der Therapieresistenz und Tumorrezidiv sind entscheidend für die Reaktion und die allgemeine Überlebensrate von Patienten mit Eierstockkrebs zu verbessern.

Dabei werden Kulturmethoden th beschriebenbei bereichern für TICs von etablierten und primären Eierstockkrebszelllinien. Die hierin beschriebenen Kulturbedingungen wurden von mehreren Gruppen verwendet worden, um die Ausbreitung von Tics oder Sphäroid Zellen mit Stammzelleigenschaften 11,12,14,16,20 induzieren. Obwohl es mehrere Stammzellkultur-Medien und Ergänzungen üblicherweise zur Anreicherung TIC verwendet / Sphäroide verwendeten wir eine serumfreie Medien Formel mit EGF und FGF, jedoch ohne Zusatz von B27 oder N-2 ergänzt. Diese Zusätze, die üblicherweise für die neuronale Zellkultur und Anreicherung von Stammzellen verwendet werden, haben gezeigt, dass eine mesenchymale Phänotyp 25,26 fördern und es verbleibt eine gewisse Unsicherheit im Bereich, ob TIC mit einem mesenchymalen oder epithelialen Phänotyp tumorigener 27-29 . Um Unsicherheiten und Variablen zu minimieren wir entschieden, die häufigste Formel zu verwenden, da es sich um epithelialen Eierstockkrebszellen zu tun haben.

Aufrechterhalten Zellen in serumfreiem Medium in einem Niedrigbefestigungskolbenerleichtert Sphäroid Bildung und unterstützt die Ausbreitung der Zellen mit CD133-Expression und hohe ALDH Aktivität. Unsere Arbeit hat sich weiter gezeigt, dass Zellen unter normalen Schwimm adhärenten Bedingungen können auch eine tumorerzeugende TIC Bevölkerung. Injektion von Zellen unter diesen Bedingungen in athymischen Nacktmäusen gewachsen zu höheren tumorigenes Potential verglichen mit Zellen in entsprechenden Bedingungen in Anwesenheit von Serum gezüchtet. Viel Information über die Rolle des TIC bei Ovarialkarzinom Initiation, Progression, therapeutische Reaktion und Krankheitsrückfall kann durch die Verwendung dieser Techniken gewonnen werden.

Protocol

1. Traditionelle Kultur von Eierstockkrebs-Zelllinien (Adherent AGB)

HINWEIS: Alle Umgang mit Zellen und Medien sollte in einem sterilen Gewebekultur Haube nehmen

  1. Bereiten traditionellen Zellkulturmedien. Verwenden Sie 1: 1 DMEM: F12 (+ L-Glutamin, + 15 mM HEPES) und ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin. Filter-Lösung mit 0,45 um-Vakuumfilter.
  2. Bereiten Sie eine traditionelle Polystyrol 75cm 2 Zellkulturflasche mit dem Namen, Datum beschriftet und Durchgang Nummer der Zelllinie interest.Remove die Ampulle von Zellen aus ultra low Gefrierschrank oder flüssigem Stickstoff. Tauen Sie, indem Sie im 37 ° C Wasserbad für 5 min.
  3. Transfer-Suspension aus dem Fläschchen in die 15-ml-Zentrifugenröhrchen, das 3 ml traditionellen Zellkulturmedien (vorstehend hergestellt). Zentrifuge Suspension bei 4 ° C für 5 min bei 400 x g. Inzwischen werden 16 ml traditionellen Zellkulturmedien zu Kanne.
  4. Überstand entfernen. Mit 2 ml traditionellen Zellkulturmedien Pipetten Zellen nach oben und unten zu lockern Pellets und Übertragung Suspension Kanne. Gently Rock Kolben gleichmäßig cells.Place Kolben in befeuchteten Zellkulturbrutschrank auf 37 ° C und 5% CO 2 zu verteilen. Überwachen Zellen täglich bis 80% Konfluenz erreicht ist.
  5. Sobald die Zellen 80% konfluent spaltete die Kultur 1: 2 in der Zellkultur Kapuze. Überstand wird abgesaugt und mit warmem phosphatgepufferter Salzlösung (ohne Calcium und Magnesium) (PBS). 1,5 ml 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation 3-5 min bei RT.
  6. Bereiten Sie 2 neue Polystyrol 75 cm 2-Kolben und fügen Sie 16 ml traditionellen Zellkulturmedien zu jedem Kolben. Resuspendieren der trypsinierten Zellen in 4 ml traditionellen Zellkulturmedien und Aliquots gleichen Volumina an jede der neuen Kolben.
  7. Platz Kolben in befeuchteten Zellkulturbrutschrank auf 37 ° C und 5% CO 2 eingestellt. Überwachen Zellen täglich bis 80% Konfluenz erreicht ist. Weiter zu spalten Zellen undKultur oder einfrieren und bei -80 oder in flüssigem Stickstoff.

2. Erzeugung von vielzelligen Sphäroide von Eierstockkrebs-Zelllinien mithilfe der schwebenden oder adhärenter Zellen

HINWEIS: Alle Umgang mit Zellen und Medien sollte in einem sterilen Gewebekultur Haube nehmen. Nach Kultivierung Zelllinien unter herkömmlichen Kulturmethoden für 2 - 3 Passagen (Abschnitt 1) ​​fahren Sie mit den folgenden Schritten.

  1. Bereiten Stammzellmedien. Anwendung 1: 1 DMEM: F12 (+ L-Glutamin, + 15 mM HEPES) und ergänzt mit 1% Penicillin / Streptomycin (bis zu einer Endkonzentration von 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin), 1% Serumersatz knockout , 0,4% Rinderserumalbumin und 0,1% Insulin-Transferrin-Selen. Filter-Lösung mit 0,45 um-Vakuumfilter.
  2. Supplement Stammzellenmedium mit humanem rekombinantem epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und humaner rekombinanter basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) für eine Endkonzentration von 20 ng / ml und 10 ng / ml betrugen.
    HINWEIS: Wachstumsfaktoren sollten unmittelbar vor Gebrauch frisch auf die Stammzellmedien hinzugefügt werden.
  3. Erstelle Floater TIC Kultur. Kolben von 80% konfluenten Zellen in traditionellen adhärenten Kulturbedingungen gewachsen entfernen. Sammeln Medien und alle schwebenden Zellen (Einzel- und Aggregate), hinter dem Verlassen des haftenden Bevölkerung, und Transfer zum 50-ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge Suspension bei 4 ° C für 5 min bei 400 x g.
    HINWEIS: Schwimmzellen und Aggregate offensichtlich sind 24-72 h nach adhärenten Zellen werden in den Kolben unter traditionellen Kultur verbunden ist. Aus einer 80% konfluenten Platte Abruf von ca. 1.0 - 5.0 x 10 5 lebensfähige Schwimmzellen erwartet werden kann, abhängig von der Zelllinie. In dieser Studie wurde die durchschnittliche Anzahl der schwebenden Zellen aus einer 80% konfluenten adhärenten Kultur gewonnen wurde: 5,0 x 10 5 für ACI-23, 4,8 x 10 5 für OVCAR5, 3,5 x 10 5 für Caov3 und 1,0 x 10 5 für TGS- 3. Bei der Übertragung multicelldere Sphäroidbildung in traditionellen und Schwimmer TIC Kultur erfolgt innerhalb weniger Tage, obwohl dies etwas Zelllinie abhängig. Beispielsweise ACI-23 Zellen bilden Aggregate leichter als Caov3 Zellen.
  4. Unterdessen bereiten ein ultra low Befestigungsfläche Polystyrol 75 cm 2 Zellkulturflasche mit dem Namen, das Datum und Gang Anzahl der Zelllinie gekennzeichnet. 10 ml Zellmedium mit Wachstumsfaktoren in den Kolben ergänzt einzudämmen.
  5. Nach Zentrifugation abgeschlossen ist, absaugen Medien und Übertragungs Pellets zu geringen Anbau Kolben durch Zugabe von 6 ml Zellmedien stammen und Auf-und Abpipettieren zur Pellet zu lösen. Platz Kolben in befeuchteten Zellkulturbrutschrank auf 37 ° C und 5% CO 2 eingestellt. Monitor-Zellen alle 2-3 Tage, um Sphäroidbildung beobachten.
  6. Erstellen traditionelle TIC Kultur. Kolben von 80% konfluenten Zellen in traditionellen adhärenten Kulturbedingungen gewachsen entfernen. Absaugen Medien und warmem PBS. 1,5 ml Trypsin 0,25% EDTA und Inkubation 3-5min bei RT.
  7. Bereiten Sie ein Ultra-Low-Befestigungsfläche Polystyrol 75 cm 2 Zellkulturflasche mit dem Namen, das Datum und die Anzahl der Durchgangszelllinie gekennzeichnet. 10 ml Zellmedium, ergänzt mit EGF und FGF, wie beschrieben, in den Kolben herrühren.
  8. 6 ml Zellmedium in den Kolben mit dem Trypsin einzudämmen. Pipettieren Zelllösung auf und ab und versuchen, Zellen von der Flaschenoberfläche zu lösen. Übertragen gesamte Volumen der Zellen, um Ultra-Low-Anlage der Kolben mit 10 ml Zellmedien stammen. Danach wird der Kolben in befeuchteten Zellkulturbrutschrank auf 37 ° C und 5% CO 2 eingestellt.
  9. Ergänzen TIC Kulturen jedes 48-72 h mit einer zusätzlichen 2 ml Zellmedium und frische EGF und FGF für Endkonzentrationen von 20 ng / ml und 10 ng / ml Stamm sind.
  10. Monitor-Zellen, bis 60-80% Konfluenz erreicht ist. Split Kulturen, indem gleiche Volumina in 2 neue Ultra Low Befestigung Kolben und Zugabe von frischem Stammzellmedien, um ein Endvolumen von 18 ml zu erzielen. Alternatively, zentrifugieren Sie das gesamte Suspension bei 4 ° C für 5 min bei 400 x g. Die Zellen in der Stammzellmedien mit EGF und FGF ergänzt und gleichmäßig verteilt in die neue Ultra-Low Befestigung Kolben. Die Zellen müssen nicht in Einzelzellsuspensionen für das Passagieren getrennt werden.
    HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt werden die Kulturen weiter zu spalten und kultiviert werden, eingefroren oder experimentell für die Analyse bearbeitet. Bei 60-80% Konfluenz wurden die folgenden Konzentrationen an Zellen für ACI-23 abgerufen: 8.0 x 10 6 für traditionelle Adhärente, 4,0 x 10 6 für traditionelle TIC und 5,0 x 10 6 für Schwimmer TIC Kulturen. Obwohl es Zellinie abhängig zu sein, haben wir festgestellt, dass 5 - 10 Tagen in Kultur optimal für TIC Anreicherung als Prozentsatz der CD133 + ALDH + Zellen niedrig ist innerhalb der ersten 3 Tage, Peaks bei 5 - 10 Tagen, und nimmt wieder 14 Tage.

3. Erzeugung von Primär epithelialen Ovarialkarzinom-Zelllinien und vielzelligen Sphäroidevon chemoresistenten Patienten Aszites

HINWEIS: Institutional Review Board Genehmigung wurde für dieses Protokoll erhalten. Alle Umgang mit Zellen und Medien sollte in einem sterilen Gewebekultur Haube nehmen.

  1. Platte Ascitesflüssigkeit 1: 1 mit herkömmlichen Zellkulturmedien. Bereiten Medien, wie in Kapitel 1 beschrieben, und 10 ml bis zu mehreren traditionellen Polystyrol 75 cm 2 Gewebekulturflaschen.
  2. Aszites-Flüssigkeit ist in der Regel in 1 l steriles Vakuumflaschen vorgesehen ist; entfernen Vakuumkappe. Vorsichtig 10 ml Aszitesflüssigkeit zu Kolben, die 10 ml traditionellen Medien und in befeuchteten Zellkulturbrutschrank auf 37 ° C und 5% CO 2 eingestellt. Lassen Sie ungestört für 72 bis 96 Stunden, bevor Sie eine komplette Medienwechsel. Ändern Medien alle 2-3 Tage bis Zellen erreichen 60-80% Konfluenz
  3. Sobald Zellen erreichen 60-80% Konfluenz im Verhältnis 1: 2, wie in Abschnitt 1. Starten TIC Kulturen beschrieben, wie in Kapitel 2 beschrieben.
    HINWEIS: in ascit vorhanden Erythrozytenes wird nach dem ersten Medienwechsel entfernt werden, da sie nicht-adhärenten. Eventuell vorhandene Fibroblasten weitgehend nach Trypsinbehandlung entfernt werden, da sie empfindlicher sind und mit minimaler Einwirkung von Trypsin zu heben. Reinheit von Eierstockkrebszellen wurde durch Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung von Antikörpern für die CA-125 (MUC16) bestimmt.

4. Die Färbung der Zellen für die Durchflusszytometrie Bestätigung der TIC-Marker

  1. Sammeln TIC Kulturen. Übertragen Sie Inhalte der Kolben in 50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge Suspensionen 5 min bei 400 x g. Absaugen Medien und warmem PBS. 2 ml nicht-enzymatische Zelldissoziationslösung, Inkubation 3-5 Minuten bei 37 ° C, und pipettieren nach oben und unten, um Klumpen aufzubrechen und distanzieren in einzelne Zellen. 4 ml Zellmedien stammen.
  2. Sammeln adhärenten Kulturen. Absaugen Medien und warmem PBS. 3 ml nicht-enzymatischen Zelldissoziationslösung inkubieren 3-5 min bei 37 ° C. 3 ml traditionellen ZellKulturmedien und pipettieren nach oben und unten mehrmals, um Zellen aus Kolben lösen und sammeln in Zentrifugenröhrchen.
  3. Zentrifuge sowohl TIC und haftSuspensionen 5 min bei 400 x g. Überstand verwerfen und Resuspendieren jedes Pellet in 1 ml PBS, das 3% fötales Rinderserum. Inkubation bei RT 30 min. Inzwischen zählen Anzahl lebensfähiger Zellen mit Trypanblau. Beachten Zellen unter dem Mikroskop, um zu bestätigen Sphäroide in einzelne Zellen dissoziiert.
  4. Label 5 x 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für jede der folgenden Kulturbedingungen: 1) Ungefärbte (ungefärbten Kontrolle auf Schadensersatz), 2) ALDH (Einzel Fleck Positivkontrolle für die Vergütung), 3) CD133 (Einzel Fleck Positivkontrolle für die Entschädigung), 4 ) ALDH + CD133 (experimentelle Testprobe), und 5) DEAB + ALDH (negative Kontrolle für die Hintergrundfluoreszenz im FL-1 und FL-4-Kanäle bezeichnet).
  5. Verteilen Sie ca. 5 x 10 5 Zellen je nach Rohre # 1 - 4. Zentrifugieren Suspensionen für 5 Minuten bei 400 x g. Saugen Sie supernatant und resuspendieren Pellets in 500 ul Aldefluor Assaypuffer. In 10 ul DEAB (ALDH-Hemmer) zur Rohr # 5 für experimentelle Negativkontrolle.
  6. In 5 ul aktiviert Aldefluor Reagenz Rohr # 2 auf Ersatz positive Kontrolle und Streifen zu mischen. In 5 ul aktiviert Aldefluor Reagenz Rohr # 4 für die experimentelle Analyse. Röhrchen klopfen, um zu mischen und sofort übertragen die Hälfte des Volumens von Zellen aus Rohr # 4 in Rohr # 5 (250 ul), die die DEAB enthält.
  7. Flick Röhrchen gut mischen. 45 min bei 37 ° C vor Licht geschützt - Alle Röhrchen für 30 inkubiert. Flick Rohre Hälfte Inkubationszeit wie Zellen am Boden absetzen. Zentrifuge alle Röhrchen für 5 min bei 400 x g. Überstand entfernen und Zellen in 500 ul Aldefluor Assaypuffer.
  8. Bei Rohren mit einem CD133-Färbung (# 3 und # 4), fügen CD133-APC 01.11 direkt in Aldefluor Assay-Puffer. Inkubieren Sie 15 Minuten auf Eis vor Licht geschützt. Zentrifuge CD133 Rohre für 5 min bei 400 x g. Einmal mit Waschen500 ul Aldefluor Assay-Puffer. Zellen in 500 ul Aldefluor Assaypuffer auf.
  9. Filter Suspensionen in einzelne Polystyrol Rundbodenröhrchen mit Zellsieb Kappe. Sicherzustellen, dass das gesamte Volumen wird durch die Kappe filtriert.
  10. Nutzen Sie ein Durchflusszytometer, die Zellpopulation zu untersuchen. Verwenden Rohre # 1-3 zur Einstellung Entschädigung Kontrollen. Mit Vor- und Nebenstreuparameter, Tor die Zellen, sicher zu sein, um Zelltrümmer aus. Stellen ALDH + und CD133 + Doppelzellen mit FL-1 und FL-4 Kanäle auf.
  11. Mit einem zytometrische Analyse-Programm, bestätigen die Kulturbedingungen verbessert den Prozentsatz der TIC-Zellen als die TIC-reichen Kulturen sollte höher Färbung für diese beiden Marker haben.
    HINWEIS: Neben CD133 und ALDH andere markersof Ovarialkarzinom TIC kann mit der Anzahl von Markierungen in einem Proben abhängig von den Fähigkeiten des Durchflusszytometer verwendet analysiert werden.

5. In vivo

HINWEIS: Institutional Review Board Genehmigung wurde für dieses Protokoll erhalten. Verteilen athymischen weiblichen Nacktmäusen 6-8 Wochen alt in experimentellen Gruppen in Käfigen von 3 und lassen Sie sie für ein paar Tage vor Injektionen akklimatisieren. Folgen Sie Mäusen unter humanen Versuchsrichtlinien nach NIH Animal Care und Verwenden Committee; Körpergewicht, körperliche Erscheinung wie Gewichtsverlust oder gewinnen mehr als 20%, ausgemergelten Erscheinungsbild, Durchfall oder Hautentzündung überwachen und einschläfern Mäuse Montage diese Kriterien durch CO 2 Ersticken.

  1. Sammeln Kulturen, wie in Abschnitt 2. Resuspendieren jedes Zellpopulation in 1 ml PBS beschrieben. Graf lebensfähigen Zellen unter Verwendung von Trypanblau-Assay.
  2. Bereiten Sie 15 ml Zentrifugenröhrchen. Für Dreifach Maßnahmen fügen 1,5 x 10 6 lebensfähigen Zellen in 2 ml PBS verdünnt, in jede Röhre (5 x 10 5 Zellen in einem Volumen von 0,5 ml wird subkutan in die rechte f injiziert werdenlank jeder Maus). Bereiten Sie 0,5 ml PBS nur für Kontrollmäuse.
  3. Mit 27 G Nadeln subcutaneouslyinject 0,5 ml Zellsuspension aus traditionellen adhärenten Kulturen, traditionelle TIC Kulturen, Schwimmer TIC Kulturen oder PBS in die rechte Flanke von jedem der drei Mäuse pro Gruppe. Zurück Mäuse auf das Original Käfige nach der Injektion.
  4. Wiegen und messen Mäuse keine tastbaren Tumoren in zwei Dimensionen zweimal weeklyby Messschieber, zur Schaffung Länge und Breite.
    HINWEIS: Tumorlatenzzeit ist in der Regel 20 bis 50 Tage, je nach Zelllinie.
  5. Berechnen Tumornassvolumen nach Standardverfahren (V = (Breite) 2 x Länge / 2).
    Hinweis: Obwohl diese Studie verglichen Tumorigenität TIC gegen adhärenten Zellen für die erste Generation nur in vivo serielle Passagierung TIC unter ähnlichen Bedingungen gezüchtet durch andere 11,20 abgeschlossen.

Representative Results

Gegründet Eierstockkrebszelllinien und Primär Aszites-Zelllinie in der traditionellen adhärenten Kulturbedingungen in Gegenwart von Serum-Show befestigt, mit Kopfsteinpflaster Morphologie gewachsen, während die gleichen Zellen in TIC Kulturbedingungen gewachsen Display schwimm Sphäroid Morphologie, in TIC Bevölkerung verbreitet. Hellfeldbilder in Figur 1 A dargestellt zeigen deutlich die morphologischen Unterschiede in den Kulturbedingungen. 1B zeigt die differenzierten Morphologien nach Neubelegung ACI-23 und TGS-3 TIC Kulturen in herkömmlichen haftBedingungen erreicht. Nur 24 Stunden nach dem Aussäen zurück in adhärenten Bedingungen, die Mehrheit der mehrzelligen Sphäroiden distanzieren und heften sich an die Oberfläche, ähnlich typischen anhaftenden Zellen.

Um zu überprüfen, dass die TIC Bedingungen bereichern für Zellen mit Stammzellmarker Durchflusszytometrie Analyse wurde mit zwei gemeinsamen Marker von Eierstock-TIC - CD133 expression und ALDH-Aktivität. Dot in Abbildung 2 dargestellt Parzellen A markieren Sie den erhöhten Anteil an CD133 + Zellen in geringen Anhaftung, serumfreien Bedingungen. Ebenso ist die Aktivität des Enzyms ALDH unter diesen Bedingungen im Vergleich zu herkömmlichen adhärenten Kulturbedingungen höher. Obwohl die traditionellen adhärenten Kulturen enthalten CD133 + Zellen unter Bedingungen, die Sphäroidbildung Verbesserung der Prozentsatz erhöht. Analyse eines Pluripotenz Marker, TRA-1-60, spricht ferner, dass die TIC Bedingungen bereichern für TIC, 2 B. Quantifizierung in Abbildung 2 C zeigt, dass doppelt positiven (CD133 + ALDH +) ACI-23-Zellen sind weitgehend auf Kulturen unter TIC fördernde Rahmenbedingungen gewachsen begrenzt. Veränderungen in den Proteinniveaus verschiedener Transkriptionsfaktoren, die in den ACI-23-Zellen nach fünf Tagen in Kultur in den TIC Bedingungen auftreten wurden ebenfalls untersucht. Eine fortschreitende Zunahme in jeder der Markers ist von der traditionellen gesehen im Vergleich zu den relativ niedrigen Niveau in der adhärenten Kultur gesehen, 2 D TIC Bedingungen Schwimmer. Interessanter ein Mensch Aszites-Zelllinie in den verschiedenen Bedingungen gewachsen zeigt den höchsten Markerphänotyps unter den traditionellen TIC Bedingungen mit wenig bis gar keine vorhanden Färbung in den Schwimmer TIC Bedingungen Abbildung 2 E.

Die Tumorigenizität der TIC Kulturbedingungen wurde durch subkutane Injektionen von gleicher Zahl der lebensfähigen Zellen von allen Bedingungen in Kohorten von athymischen nackten Mäusen erhalten validiert, Fig. 3 zeigt, dass die ACI-23 (A, B) und OVCAR-5 (C) Zellen aus traditionellen adhärenten Kulturen waren weniger tumorigen als die aus den TIC Kulturen. Beachten Sie, dass die Schwimmer TIC Kulturen größeren Tumoren in einem kürzeren Zeitraum als die traditionellen anhaftenden oder traditionelle TIC Kulturen. Diese data legen nahe, dass selbst bei einem moderaten Anstieg der Eierstock-TIC Marker gibt es einen dramatischen phänotypischen Veränderungen. Jedoch mit anderen Zelllinien (nicht gezeigt) die traditionellen TIC Kulturen waren tumorigener als die herkömmlichen Anhänger und Schwimmer TIC Kulturzellen.

Figur 1
Abbildung 1. Spheroid Entwicklung in verschiedenen Kulturbedingungen. (A) Fest Ovarialkarzinomzellen (ACI-23 OVCAR-5 und Caov3) und Primär Patienten stammende Aszites-Zellen (TGS-3) Nebenbefestigungs Kolben mit serumfreien gezüchtet Stammzell-Medien bilden leicht mehrzelligen Sphäroiden. Bilder zeigen traditionelle adhärenten Kulturbedingungen halten epithelialen Kopfsteinpflastermorphologie in ACI-23, OVCAR-5, Caov3 und TGS-3-Zellen, während die gleichen Zellen in TIC Bedingungen gebildet Sphäroide innerhalb von 96 Stunden. Maßstabsbalken 100 um. (B) Bei der 24-Stunden-Expositionzu den traditionellen adhärenten Kulturbedingungen, zeigen die TIC Kultur Morphologien einen differenzierten Phänotyp ähnlich dem ursprünglichen adhärenten Morphologie. Maßstabsbalken 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Low-Anlage, serumfreien Bedingungen zu bereichern für Zellen mit TIC-Marker. (A) Durchflusszytometrie Analyse von ACI-23 Zellen mit APC konjugiert CD133-Antikörper zeigt einen erhöhten Anteil an CD133 + Zellen in niedrigen Befestigungsflaschen mit Serum-freien Stamm Zellmedien. Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung Aldefluor Assay zeigt erhöhte ALDH-Aktivität in Zellen, die in niedrigen Befestigungs Kolben mit serumfreien Stammzellenmedium kultiviert. CD133 Negativkontrolle keine Antikörper und ALDH negativen con enthältSteuerung ist die aktivierte Substrat in der Gegenwart des ALDH-Inhibitor (DEAB). (B) Analyse mit FITC-konjugierten TRA-1-60 Antikörper zeigt höchsten Prozentsatz der TRA-1-60 + Zellen in den Schwimmer TIC Bedingungen in ACI-23-Zellen. Negativkontrolle enthält keine Antikörper. (C) CD133 + ALDH + Zellen am höchsten in der traditionellen TIC und Schwimmer TIC Bedingungen in der ACI-23-Zelllinie. Die Fehlerbalken: SEM, N = 6, * p <0,05. (D) Westernblot-Analyse, die Erhöhung der Proteinspiegel von transkriptionalen Marker von Stammzellen in den ACI-23-Zellen in TIC Bedingungen 5 Tage lang kultiviert. Die gesamten Zellysate (50 ug) wurden mit GAPDH als Ladekontrolle analysiert. (E) Vertreter Dot-Plots von TGS-3 primären Asciteszellen wie in A analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.


Abbildung 3. Niederbefestigungs, serumfreien Bedingungen reichern für Zellen mit erhöhten Tumorigenität. (A) 5 x 10 5 lebensfähige ACI-23-Zellen wurden subkutan in athymische Nacktmäuse dreifach eingespritzt wird. Die Mäuse wurden gewogen und die Tumore mit einem Tastzirkel zweimal wöchentlich gemessen. A = Traditionelle adhärenten Kultur, F = Floater TIC Kultur, S = Traditionelle TIC Kultur. * P <0,05. (B) Repräsentative Bilder von Tumoren nach 25 Tagen unter Verwendung von Zellen unter verschiedenen Kulturbedingungen gezüchtet von ACI-23 gebildet. (C) 5 × 10 5 lebensfähigen OVCAR-5-Zellen wurden subkutan in Nacktmäusen ohne Thymus dreifach injiziert und wie in A überwacht werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll stellt eine effiziente und konsistente Methode zur Anreicherung von Kulturen für Zellen mit Stammzelleigenschaften von etablierten Ovarialkrebs-Zelllinien und ist an die Primärpatientenproben. Diese Methode erfolgreich bereichert für TIC in einer Vielzahl von Zellinien. Es ermöglicht die rechtzeitige Identifikation von Bedingungen, die für eine TIC und / oder tumorerzeugenden Phänotyp zu bereichern, ohne die Zeit nehmen, körperlich sortieren die TICs aus Nicht-TICs in der Bevölkerung. Auf diese Weise kann eine relative Niveaus verschiedener Signalwege für ihren Beitrag zu dem TIC Phänotyp durch Vergleichen traditionellen adhärenten Kulturen Kulturen mit einer Vielzahl von funktionellen Tests TIC beurteilen. Wenn ein reines TIC Population gewünscht ist, kann Isolierung leicht durch Einbau eines Fluoreszenz-unterstützte oder magnetischen Sortierschritt in der Durchflusszytometrie-Protokoll erreicht werden.

Es ist wichtig zu beachten Sie jedoch, dass der Ausdruck der TIC-Markers wie CD133, CD44 oder ALDH kann unter Zelllinien oder Patientenproben sogar aus dem gleichen Tumor-Typ variieren. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass die OVCAR-5-Zellen haben eine höhere Expression von CD44 in Bezug auf CD133, während der umgekehrte gilt für ACI-23. Insofern ist konkret auf Tumorinitiation bei Mäusen verlassen und Durchflusszytometrie-Analyse als endgültig von TIC Präsenz. Nach diesem Protokoll wurde Hoch ALDH Aktivität konsequent beobachtet, wenn Eierstockkrebszellen wurden in der Stammzellbedingungen angezogen. Interessant ist, dass CD133-Expression in ACI-23-Zellen in der traditionellen TIC Kulturbedingungen gewachsen durchweg höher, während ALDH ist am höchsten in Floater TIC Bedingungen. Im Gegensatz dazu die TGS-3 primären Aszites-Zellen zeigen einen geringen Anstieg der CD133 Positivität unter Floater TIC Bedingungen, aber eine bemerkenswerte Zunahme ALDH Aktivität unter traditionellen Bedingungen TIC. Diese Ergebnisse unterstreichen die Heterogenität der Eierstockkrebszellen und die Plastizität häufig mit TICs verbunden. Zur weiteren Unterstützung der claim, die diese Methoden verbessern TICs wurde die Anreicherung von TRA-1-60-positiven Zellen beobachtet. TRA-1-60 ist eine Pluripotenz Marker und verwendet wurde, um die embryonale Karzinome der Eierstöcke und Hoden identifizieren sowie Prostatakrebs TICS 30-32. Obwohl unsere Methoden sind erfolgreich mit zahlreichen Zelllinien ist es möglich, dass die Standard-TIC Bedingungen möglicherweise besser zu einigen Eierstockkrebszellen geeignet sein, während die modifizierten Schwimmer Bedingungen besser für TIC in anderen Eierstockkrebszellpopulationen anzureichern. Dies unterstreicht erneut die erwartete Heterogenität innerhalb der beiden Patienten stammende und etablierte Eierstockkrebszelllinien.

Zusätzlich zu Zelloberflächenmarker sind mehrere Transkriptionsfaktoren, die gezeigt haben, Ovarialkarzinom TIC einschließlich Nanog Sox2, Oct-4 11 zu charakterisieren, wobei diese Marker sind nicht spezifisch für Ovarialkrebs Tics und eher Faktoren, die für die embryonale Stammzelle Pluripotenz darstellen und difzierung 33,34. Wir untersuchten die Veränderungen in der Protein-Ebene dieser Faktoren und festgestellt, dass Nanog Spiegel erhöhen in TIC Kulturbedingungen im Einvernehmen mit anderen 13,35 sowie CD133, TRA-1-60 und CD117. Ein menschlicher Stammzellmarker cDNA-Array gezeigt weiter eine Erhöhung der CD133, Nanog, Melk und PODXL Gene in den TIC Bedingungen im Vergleich zu herkömmlichen haftenden Bedingungen. Wichtig ist, darauf hinzuweisen, daß, wie mit Zelloberflächenmarkern, Transkriptionsfaktoren mit Eierstock TIC verbunden kann unter Zelllinien und Patientenproben variieren.

Wir haben beobachtet, dass Zellen können tumorigener sein und Express höhere Stammzellmarker, wenn sie von Natur aus nicht haft in vitro (dh, schwimmende Zellen, die nicht leicht zu befestigen, um eine haftende Platte). In Kultur, Zelllinien, wie ACI-23 haben in der Regel viele lebensfähige Schwimmzellen und / oder Zellen, die vertikal in einer Stapel Mode unter traditionellen Kultur condit wachsenIonen. Obwohl erfolgreiche Anreicherung von TICs von schwimmenden Zellen und Aggregate können für relativ wenige Zelllinien sein, einschließlich der in der vorliegenden Studie und OVCAR-3-12, unsere Ergebnisse deuten darauf könnte dies eine tumorigene Bevölkerung. Daher Ernte der "schwebenden" Population von Zellen in Standardgewebekulturplatten und Medien gezüchtet kann als alternative Methode zur TIC Bereicherung für Zellen, die schlecht zu kommerziellen Stammzellmedien anzupassen dienen.

Die Nutzung der verschiedenen Kulturmethoden in dieser Handschrift vorgestellt wird ermöglichen eine schnelle Bereicherung der TIC Bevölkerung und ein besseres Verständnis für welche Faktoren unterstützen diese Phänotyp in verschiedenen Zellen. Gegenwärtige Anwendungen dieser Methode sind kennSignalWege sind entscheidend, um die Ausbreitung dieser einzigartigen Zellpopulation zu unterstützen. Die Ergebnisse dieser Studien werden dazu beitragen, zu klären Mechanismen der Tumorprogression und Rückfall.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask Corning 3814
75 cm2 Tissue Culture Flask Sarstedt 83.1813.002
Aldefluor Kit Stemcell Technologies 1700
CD133-APC Miltenyi Biotec Inc. 130-090-826
Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant Sigma-Aldrich F0291 Prepared according to manufacturer's instructions
Epidermal Growth Factor - human recombinant Sigma-Aldrich E9644 Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS
DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) Gibco 11330-032
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning cellgro 21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution Corning Cellgro 25-056-CI
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-10G
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 51500-056
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Fetal Bovine Serum (heat inactivated) Gemini 100-106
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) Nalgene 450-0045
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430052
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl Lonza 17-942E

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References

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