Yumurtalık Kanseri Tümör başlatan Hücrelerinin in vitro Zenginleşmeden içinde

Medicine
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells. J. Vis. Exp. (96), e52446, doi:10.3791/52446 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Yumurtalık kanseri morbidite ve mortalite bu hastalığın son derece tekrarlayan, Kemoterapiye dirençli özellikleri olmanın en önemli nedeni ile ABD'de en ölümcül jinekolojik malignitedir. Bazı durumlarda 1 yararlı olabilir neoadjuvan tedavi önermek için bazı kanıtlar olmasına rağmen, birincil tedavi genellikle, maksimal sitoredüktif cerrahi ve sonraki platin bazlı tedavi içermektedir. Hastaların çoğunluğu birincil tedaviye olumlu yanıt, ama ne yazık ki yarım 18 ay 2 içinde nüks edecektir.

En over maligniteler epitel karsinomlar ve yumurtalık veya fallop tüpü 3,4 yüzey epitel kaynaklanabilir. Çeşitli çalışmalar muhtemelen yumurtlama 5,6 aşağıdaki gerekli doku tamirinde yardımcı kadın üreme sistemindeki somatik kök hücrelerin varlığını desteklemektedir. ovul sırasında yumurtalık ve fallop tüpü hem de yüksek proliferatif aktivitetirme (. Gharwan, vd gönderilen yazının) yumurtalık kanseri gelişiminde önemli bir faktör olabilir. tümör oluşturucu hücre türetme belirsizdir fakat bölme kaderlerini veya düzenlemek için mümkün hale getirilmek mutasyonlar yoluyla normal kök hücreleri, projenitör hücreler ya da farklılaşmış hücrelerden ortaya çıkabilir. Bu hücreler aynı zamanda, "kanser hücrelerini başlatan" "kanser kök hücrelerini," ya adlandırılır ve düşük bağlanma koşullarında tümörijenik, çok hücreli sferoitler dönüşebilir. TIC gelişme hiyerarşik modeli dinamik olabilir, ancak TIC kemoterapi, uzun vadeli kendini yenileme ve çeşitli hücre soyları 7,8 içine ayırt yeteneği sükunet, direniş de dahil olmak üzere, normal kök hücrelerin aynı özellikleri birçok paylaşmak yoktur.

Çeşitli çalışmalar, yumurtalık kanserinde tikler varlığını destekleyen ve mevcut çabaları bu hücreler tümör oluşumu 9-11 destekleyen hangi mekanizma (lar) netleştirmek için çalışmalar devam etmektedir. Her bir belirtecin tam katkı belirsizdir ve 11-16 belirli bir hücre tipi olabilir, ancak bazı belirteçler, CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, ve MyD88 dahil olmak üzere gelişmiş tümöre neden olan yumurtalık tikler tanımlamak için önerilmiştir. Evrensel işaretleyici veya belirteçlerin set tümden yumurtalık tikler için kurulmuş olsa da, farklı gruplar yüksek aldehit dehidrogenaz (ALDH) aktivite 13,17-21 ile CD44 +, için CD133 + ve / veya hücreleri seçerek daha sık yumurtalık tikler izole var. CD44 hiyalüronik asit için bir reseptör olarak görev yapar ve yapışma, çoğalma, göç, anjiyojenez ve farklılaşma 22 de dahil olmak üzere tümör ilerlemesi için önemli olan pek çok işlemleri düzenleyen bir zar glikoproteinidir. CD133 olan işlevi henüz belli değil, ancak çalışmalar plazma zarı topoloji 23 organize önermek bir transmembran glikoproteindir. ALDH, aldehitlerin oksidasyonu kataliz eden bir hücre içi enzim, en univers olabiliryüksek etkinlik olarak tikler el işareti, normal kök hücrelerinin ve tiklerin 24 desteklemede ALDH atfedilen doku ve çoklu rolleri çeşitli izole kök hücre tespit edilmiştir. Şu an itibariyle, CD133 ve ALDH1 over tikler 13,21 en tekrarlanabilir belirteçleri olarak görünür.

Tikler özelliklerini anlamak için ek olarak, özellikle bu alt popülasyonunu hedef ilaçların belirlenmesi için büyük bir çaba vardır. yumurtalık kanseri ile ilişkili yüksek nüks oranı başarıyla tikleri ortadan kaldırmak için mevcut kemoterapi yetmezliğine bağlı olabilir. Tümör kitlesinin mevcut tedavilere karşı duyarlı olmakla birlikte, TIC dayanıklı ve standart metodları ile tespit edilemez bir yoğunlukta olduğu düşünülmektedir. Terapi direnci ve tümör nüks açıklık mekanizmaları yanıtı ve yumurtalık kanseri olan hastalarda genel sağkalım oranlarını artırmak için hayati öneme sahiptir.

Burada, kültür teknikleri inci açıklanmıştırkurulan ve primer over kanseri hücre hatları tikler için zenginleştirmek. Burada tarif edilen kültür koşulları kök hücre nitelikleri 11,12,14,16,20 tik veya küremsi hücrelerinin çoğalmasını uyarmak için birden fazla grup ile kullanılmıştır. Yaygın Tikler zenginleştirilmesi için kullanılan birçok kök hücre kültürü ortamlarının ve ek olmasına rağmen / sferoidler biz EGF ve FGF ile bir serumsuz ortam formül kullanılır, ancak B27 ya da N-2 ek eklenmeden. Yaygın nöronal hücre kültürü ve kök hücreleri için zenginleştirici için kullanılan bu takviyeleri, bir mezenkimal fenotip 25,26 teşvik gösterilen ve bir mezenkimal veya epitel fenotipe sahip TIC daha tümörijenik olup olmadığı konusunda bazı belirsizlik kalır edilmiş 27-29 . Belirsizlikleri ve değişkenleri en aza indirmek için biz epitel yumurtalık kanseri hücreleri ile ilgileniyor çünkü, en yaygın formülü kullanmak için seçti.

Düşük bağlanma şişede serumsuz ortam içinde hücrelerin bakımıküremsi oluşumunu kolaylaştıran ve CD133 ekspresyon ve yüksek ALDH aktivitesinin hücrelerin yayılmasını destekler. Çalışmalarımız ayrıca normal yapışık şartlar altında yüzen hücreler de daha tümörijenik TIC nüfusu temsil edebilir olduğunu gösterdi. Atimik çıplak farelere, bu koşullarda çoğalan hücreler tarafından enjeksiyon serumu varlığında bağlı koşullarda yetiştirilen hücreler ile karşılaştırıldığında daha yüksek bir tümörijenik potansiyeline yol açar. Yumurtalık kanseri başlaması, ilerlemesi, terapötik yanıt ve hastalık nüks içinde tikler rolü ile ilgili çok fazla bilgi bu tekniklerin kullanımı yoluyla elde edilebilir.

Protocol

Yumurtalık Kanseri Hücre Hatları 1. Geleneksel Kültür (Yapışık Koşullar)

NOT: hücrelerin ve medyanın tüm taşıma steril doku kültürü kaputu yer almalıdır

  1. Geleneksel hücre kültürü ortamı hazırlayın. 1 DMEM: 1 kullanarak F12 (+ L-glutamin + 15 mM HEPES), ve% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye. 0.45 um vakum filtresi kullanılarak filtre solüsyonu.
  2. Interest.Remove hücre hattı ultra düşük dondurucu veya sıvı azot hücrelerin flakon geleneksel isim, tarih ile etiketlenmiş polistiren 75cm 2 doku kültürü şişesi ve geçiş numarasını hazırlayın. 5 dakika için 37 ° C su banyosu içine yerleştirmek suretiyle defrost.
  3. 3 mL (yukarıda hazırlanmıştır), geleneksel, hücre kültür ortamı ihtiva eden 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine şişe transfer süspansiyon. 400 x g hızında 5 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüj süspansiyon. Bu arada, şişeye 16 ml geleneksel hücre kültür ortamı ekleyin.
  4. Süpernatant aspire. Pelet ve transfer süspansiyon şişeye gevşetmek için yukarı ve aşağı 2 ml geleneksel hücre kültür ortamı pipetlemeyin hücreleri kullanarak. Yavaşça kaya şişeye eşit olarak 37 ° C ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş ayarlanmış hücre kültürü kuluçka makinesi içinde cells.Place balon dağıtmak. % 80 izdiham ulaşılana kadar günlük hücreleri izleyin.
  5. 2 hücre kültürü kaputu: hücreler bir kez% 80 birleşen kültürünü 1 bölün. Süpernatant aspire ve (kalsiyum ve magnezyum olmadan) sıcak fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkama (PBS). 1.5 mi tripsin,% 0.25 -EDTA ekleyin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edilir.
  6. 2 yeni polistiren 75cm 2 şişeler hazırlayın ve her şişeye 16 ml geleneksel hücre kültür ortamı ekleyin. Yeni şişelere her bir 4 ml geleneksel hücre kültür ortamı ve kısım eşit hacimleri içinde tripsinize tekrar süspansiyon hücreleri.
  7. Nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka makinesi içinde yer şişeler 37 ° C'de ve% 5 CO2 ayarlanır. % 80 izdiham ulaşılana kadar günlük hücreleri izleyin. Hücreleri bölmek devam ve-80 veya sıvı azot içinde kültür veya dondurma ve mağaza.

Yüzer veya Yapışık hücreleri kullanarak Yumurtalık Kanseri Hücre Hatları gelen çok hücreli küreler 2. Nesil

NOT: hücrelerin ve medyanın tüm taşıma steril doku kültürü kaputu yer almalıdır. 2 geleneksel kültür yöntemleri altında hücre hatları kültürleme sonra - 3 pasajlar (bölüm 1) Aşağıdaki adımlarla devam edin.

  1. Kök hücre ortamını hazırlayın. 1 DMEM: F12 (+ L-glutamin + 15 mM HEPES), ve% 1 nakavt, serum yerine (100 U bir son konsantrasyon / ml penisilin ve 100 ug / ml streptomisin),% 1 penisilin / streptomisin ile takviye 1 kullanın % 0.4 sığır serum albümini ve% 0.1 ensülin transferin selenyum. 0.45 um vakum filtresi kullanılarak filtre solüsyonu.
  2. 20 ng / ml, 10: n, nihai konsantrasyon, insan rekombinan epidermal büyüme faktörü (EGF) ve insan rekombinant temel fibroblast büyüme faktörü (FGF) ile Ek kök hücre ortamıg / ml idi.
    NOT: Büyüme faktörleri doğru kullanımdan önce kök hücre ortama taze eklenmelidir.
  3. Şamandıra TIC kültürü oluşturun. Geleneksel yapışkan kültür koşullarında yetiştirilen% 80 konfluent hücreler balon çıkarın. Geride yapışkan nüfus bırakarak ortamı ve yüzen hücreleri (tek ve agregalar) toplamak ve 50 ml polipropilen santrifüj tüpüne aktarılır. 400 x g hızında 5 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüj süspansiyon.
    NOT: Yüzen hücreler ve agrega belirgindir 24-72 saat yapışan hücreler, geleneksel kültür altında şişeye bağlanmıştır sonra. Yaklaşık olarak 1.0,% 80 konfluent plaka alma kaynaktan - 5.0 x 10 5 canlı yüzen hücreler, hücre hattı ile ilgili olarak, tahmin edilebilir. Bu çalışmada, bir% 80 konfluent yapışkan kültürden toplanan yüzen hücrelerin ortalama sayısı olduğu: OVCAR5 5.0 ACI-23, 4.8 x 10 5 x 10 5, CAOV3 3.5 X 10 5 ve TGS- 1.0 x 10 5 3. Transferi üzerine, çok hücreliBu biraz hücre hattı bağımlı olmasına rağmen, geleneksel ve Flatör TIC kültüründe ular sfero oluşumu bir kaç gün içinde ortaya çıkar. Örneğin, ACI-23 hücre agrega daha çabuk CAOV3 hücrelerini oluştururlar.
  4. Bununla birlikte, adı, tarih ve hücre çizgisinin kanal adedi ile etiketlenmiş bir ultra düşük bağlantı yüzeyi polistiren 75 cm2'lik doku kültür şişesi hazırlayın. Şişeye büyüme faktörleri ile takviye edilmiş hücre ortamı kök ml 10 ekleyin.
  5. Santrifüj pelet gevşetmek için aşağı hücre ortamı kök ml 6 ekleme ve yukarı pipetleme ve düşük bağlanma şişeye tam, aspire medya ve transfer pelet bir kez. Nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka makinesi içinde yer şişeler 37 ° C'de ve% 5 CO2 ayarlanır. Sfero oluşumunu gözlemlemek için 3 gün - her 2 hücreleri izleyin.
  6. Geleneksel TIC kültürü oluşturun. Geleneksel yapışkan kültür koşullarında yetiştirilen% 80 konfluent hücreler balon çıkarın. Aspire medya ve sıcak PBS ile yıkayın. 1.5 ml tripsin% 0.25 EDTA ekleyin ve inkübe 3-5oda sıcaklığında Min.
  7. Adı, tarih ve hücre çizgisinin kanal adedi ile etiketlenmiş bir ultra düşük bağlantı yüzeyi polistiren 75 cm2'lik doku kültür şişesi hazırlayın. Şişeye, tarif edildiği gibi, EGF ve FGF ile desteklenmiş hücre ortamı, sap ml 10 ekleyin.
  8. Tripsin ile şişeye hücre ortamı kök ml 6 ekleyin. Pipetleyin hücre çözümü yukarı ve aşağı ve kap yüzeyinden hücreleri gevşetmek için çalışmayın. Hücrelerinin tüm hacmi aktarın 10 hücre ortamı kök ml içeren ultra düşük bağlanma şişesi için. Nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka makinesi içinde yer şişe 37 ° C ve% 5 CO2 ayarlanır.
  9. Ml, 20 ng / nihai konsantrasyonlar, 10 ng / ml hücre ortamı ve taze EGF ve FGF kök ml ilave 2 ile 72 saat - TIC kültürler, 48 ek.
  10. % 80 izdiham ulaşana - 60 kadar hücreleri izleyin. 2 yeni ultra düşük bağlanma şişelere eşit hacimlerde yerleştirerek ve 18 ml'lik son bir hacim elde etmek için taze kök hücre ortamı ekleyerek Bölünmüş kültürleri. Alternatifly santrifüj 400 x g'de 5 dakika boyunca 4 ° C 'de, tüm süspansiyon. Kök hücre medyada tekrar süspansiyon hücreleri EGF ve FGF ile desteklenmiş ve yeni ultra-düşük bağlanma şişeler içine eşit dağıtmak. Hücreler, geçiş için tek hücre süspansiyonları ayrışması gerekir gerekmez.
    NOT: Bu noktada kültürler bölünmüş ve kültüre, dondurulmuş ya da deneysel olarak analiz için manipüle edilebilir devam edebilir. 60 -% 80 izdiham hücreleri aşağıdaki konsantrasyonlar ACI-23 için elde edildi: 8.0 Geleneksel Yapışkan x 10 6, Geleneksel TIC için 4,0 x 10 6, ve Floater TIC kültürleri için 5.0 x 10 6. Bu hücre çizgisi bağlı olabilir, ancak biz 5 - ki bu kültür 10 gün CD133 + ALDH + hücrelerinin yüzdesi olarak TIC zenginleştirme için en uygun ilk 3 günü içinde düşük, 5 tepe - 10 gün ve yine azalır 14 gün.

İlköğretim Epitel Yumurtalık Kanseri Hücre Hatları ve çok hücreli küreler 3. NesilKemorezistans Hasta ASSİT gelen

NOT: Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı bu protokol için elde edilmiştir. Hücrelerin ve medyanın tüm taşıma steril doku kültürü kaputu yer almalıdır.

  1. Geleneksel hücre kültür ortamı ile 1: 1 sıvı plaka asit. Bölüm 1 'de tarif edildiği gibi ortam hazırlamak ve çeşitli geleneksel polistiren 75 cm2 doku kültürü şişeleri 10 ilave edin.
  2. Asit sıvısı genellikle 1 L steril vakumlu şişelerde sağlanır; Vakum kapağını çıkarın. Dikkatlice 37 ° C ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş ayarlanmış hücre kültürü kuluçka makinesi içinde 10 mi, geleneksel araçları ve yer ihtiva eden şişeye sıvı 10 mi Ascites ekleyin. Tam bir medya değişikliği yapmadan önce, 96 saat - 72 rahatsız bırakın. % 80 izdiham - hücreler 60 ulaşana kadar 3 gün - her 2 ortamı değiştirmek
  3. Bölüm 2'de tarif edildiği gibi bölüm 1. Başlangıç ​​TIC kültürlerinde tarif edildiği gibi 2 - hücreleri 60 ulaştıklarında% 80 izdiham, 1 ayrıldı.
    NOT: ascit mevcut eritrositlerbunlar yapışkan olmayan olarak es birinci medya değişiminden sonra kaldırılır. Daha hassastır ve tripsin çok az maruz kalma ile asansör gibi mevcut olan herhangi bir fibroblast büyük ölçüde tripsin ile muamele edildikten sonra kaldırılır. Yumurtalık kanseri hücrelerinin arılığı, CA-125 (MUC16) için bir antikor kullanarak akış sitometri analizi ile tespit edilmiştir.

TIC İşaretlerinin Sitometrisi Onay için Hücreleri 4. boyanması

  1. TIC kültürleri toplayın. 50 ml polipropilen santrifüj tüpü içine şişenin içeriğini aktarın. 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje süspansiyonlar yer alır. Aspire medya ve sıcak PBS ile yıkayın. Yığınları parçalamak ve tek tek hücreler içine ayrışmasına kadar 37 ° C de 5 dakika ve en fazla pipetleme ve - 2 ml Enzimatik olmayan ayrıştırma çözeltisi ekleyin 3 inkübe edin. Hücre ortamı kök ml 4 ekleyin.
  2. Yapışkan kültürler toplayın. Aspire medya ve sıcak PBS ile yıkayın. 3 mi Enzimatik olmayan ayrıştırma çözeltisi ilave edin ve 3 inkübe - 37 ° C 'de 5 dak. Geleneksel hücre 3 ml eklekültür ortamı pipetlemeyin yukarı ve aşağı defalarca şişeden hücreleri ayırmak için santrifüj tüpüne toplamak ve.
  3. Santrifüj TIC ve 400 x g'de 5 dakika boyunca yapışkan süspansiyonlar hem. Süpernatant atılır ve% 3 fetal sığır serumu içeren 1 ml PBS içinde, her pelletini. RT 30 dakika inkübe edin. Bu arada, tripan mavisi kullanarak canlı hücre sayısı. Sferoidler tek hücre içine ayrışmış doğrulamak için mikroskop altında hücrelerin uyun.
  4. Tazminat 1) boyanmamış (boyanmamış kontrol) tazminat, 2) ALDH (tek leke pozitif kontrol) tazminat, 3) CD133 (tek leke pozitif kontrol), 4: Aşağıdaki kültür koşulları her biri için Etiket 5 x 1,5 ml Eppendorf tüpleri ) ALDH + CD133 (deneysel test örneği), ve 5) FL-1 ve FL-4 kanalları, sırasıyla) içinde DEAB + ALDH (eşiğe için negatif kontroller.
  5. 400 x g hızında 5 dakika süreyle 4 Santrifüj süspansiyonlar - tüplere 1. yaklaşık 5 x 10 5 hücre her dağıtın. Aspire supernata500 ul Aldefluor Deney Tamponu nt ve tekrar süspansiyon peletler. Deneysel negatif kontrol için tüp # 5 10 ul DEAB (ALDH inhibitörü) ekleyin.
  6. Tazminat pozitif kontrol ve karıştırmak için fiske için tüp # 2 Aldefluor reaktif aktif 5 ul ekleyin. Deneysel analiz için tüp # 4 Aldefluor reaktif aktif 5 ul ekleyin. Flick tüpü karıştırın ve hemen DEAB içeren tüp # 5 (250 ul) içine tüp içerisinde 4. hücrelerin yarısı hacmi aktarmak için.
  7. Flick tüpler iyice karıştırın. Işıksız bir ortamda 37 ° C 'de, 45 dakika - 30 seyahati inkübe edin. Flick tüpler yarıya kuluçka dönemi boyunca hücreler dibe gibi. Santrifüj 400 x g'de 5 dakika boyunca bütün tüpler. 500 ul Aldefluor Testi Tampon aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri.
  8. CD133 boyama ile borular için (# 3 ve # 4), doğrudan Aldefluor deney tamponu içine CD133-APC 01:11 ekleyin. Işıksız bir buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. 400 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje CD133 tüpleri. Ile bir kez yıkayınDeney tamponu Aldefluor 500 ul. Sırasıyla 500 ul Aldefluor deney tamponu içinde yeniden süspanse hücreleri.
  9. Hücre süzgeç kapağı ile bireysel polistiren yuvarlak dipli tüpler içine filtre süspansiyonları. Tüm hacim kapağı içinden süzülmüş emin olun.
  10. Hücre popülasyonu analiz etmek sitometrede bir akış yararlanın. Tazminat kontrolleri ayarlama boruları # 1-3 kullanın. Hücresel enkaz dışlamak için emin olmak, hücrelerin ileri kullanarak ve yan dağılım parametreleri, kapı. ALDH + ve CD133 + sırasıyla, FL-1 ve FL-4 kanallarını kullanarak çift hücreleri oluşturulması.
  11. Bir sitometrik analiz programını kullanarak, kültür koşulları bu iki marker için yüksek boyama olmalıdır EFT-zengin kültürler gibi EFT hücrelerin yüzdesini gelişmiş onaylayın.
    Not: CD133 ve ALDH ek olarak, diğer markersof yumurtalık kanseri TIC akış sitometresi yeteneklerine bağlıdır herhangi bir örnekte kullanılan işaretlerin sayısı ile analiz edilebilir.

5. İn vivo

NOT: Kurumsal Değerlendirme Kurulu onayı bu protokol için elde edilmiştir. 3 kafeslerde deneysel gruba yaş 8 hafta ve enjeksiyon öncesinde bir kaç gün için gelmesini bekleyin - atimik kadın çıplak farelere 6 dağıtın. NIH Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi göre insani deneysel kurallar altında fareler izleyin; kilo kaybı veya fazla% 20 kazanç, bir deri bir kemik görünüm, ishal ya da dermatit dahil olmak üzere vücut ağırlığı, fiziksel görünümünü izlemek ve CO 2 asfiksi bu kriterlere uyan fareler euthanize.

  1. 1 ml PBS içinde Bölüm 2. Hücreleri, her bir hücre popülasyonu içinde tarif edildiği gibi kültür toplayın. Tripan mavisi testi kullanılarak canlı hücreleri saymak.
  2. 15 ml santrifüj tüpleri hazırlayın. Üç kez için tedbirler, her bir tüp içine 2 ml PBS içerisinde seyreltilmiş 1.5 x 10 6 canlı hücreleri eklemek (0.5 ml bir hacimde 5 x 10 5 hücre deri altından f doğru enjekte edilecektirHer bir farenin sıska). Sadece kontrol fareleri için 0.5 ml PBS hazırlayın.
  3. 27 G iğne kullanılarak, grup başına 3 Farelerin oluşturduğu her bir sağ böğrüne TIC kültürleri Şamandıra, ya da PBS, geleneksel yapışkan kültürler, geleneksel TIC kültürlerden 0.5 ml'lik hücre süspansiyonu subcutaneouslyinject. Orijinal kafesleri sonrası enjeksiyon fareler dönün.
  4. Fareler tartılır ve uzunluğunu ve genişliğini kurulması, Vernier kumpas weeklyby kez iki boyutta herhangi bir aşikar tümörleri ölçmek.
    NOT: Tümör gecikme süresi genellikle 20 - hücre hattı bağlı 50 gün.
  5. Standart yöntemlerle (V = (genişlik) 2 x uzunluk / 2) tümör ıslak hacim hesaplayın.
    NOT: Bu çalışma, sadece, benzer koşullar altında yetiştirilen tikler in vivo seri Pasajlanması başkaları 11,20 tarafından tamamlanmıştır ilk nesil için yapışık hücrelere karşı tikler tümörigenikliğini karşılaştırıldı rağmen.

Representative Results

TIC kültür koşullarında yetiştirilen aynı hücreler TIC toplumlarda ortak sfero morfolojisi, yüzen görüntüleyebilen ise, yumurtalık kanseri hücre hatları ve bağlı serum gösterisi, arnavut kaldırımlı morfolojisi varlığında geleneksel yapışık kültür koşullarında yetiştirilen birincil asit hücre hattı kurdu. Şekil 1 A görüntülenen aydınlık görüntüler açıkça kültür koşullarında morfolojik farklılıklar göstermektedir. Şekil 1B geleneksel yapışık koşullarında ACI-23 ve TGS-3 EFT kültürleri şarjı sonra elde farklılaştırılmış morfolojileri gösterir. Tipik yapışık hücreleri benzeyen, sadece 24 saat yapışık koşullarda geri tohumlama sonra, çok hücreli parçacıklarının büyük çoğunluğu ayrıştırmak ve yüzeye takmak.

Analiz over tikler iki ortak belirteçleri kullanılarak gerçekleştirildi sitometri TIC koşullar akış kök hücre belirteçleri ile hücreler için zenginleştirmek olduğunu doğrulamak için - CD133 expression, ve ALDH aktivitesi. Şekil 2'de gösterilen nokta araziler düşük bağlanma, serumsuz koşullarda CD133 + hücrelerinin artan oranda dikkat çekmektedir. Benzer şekilde, ALDH enzimin aktivitesi, geleneksel yapışkan kültür koşullarına göre, bu koşullar altında daha yüksektir. Geleneksel yapışık kültürler CD133 + hücreleri, sfero oluşumunu geliştirmek koşullar altında yüzde artar içermesine rağmen. Bir pluripotency işaretleyici analizi, TRA-1-60, EFT koşullar tikler, Şekil 2 B için zenginleştirmek olduğunu ileri destek vermektedir. Şekil 2 C Niceliklendirilmesi çift pozitif (CD133 + ALDH +) ACI-23 hücreleri büyük ölçüde TIC arttırıcı koşullar altında yetiştirilen kültürler sınırlı olduğunu göstermektedir. TIC koşullarda kültür içinde beş gün sonra, ACI-23 hücrelerinde cereyan eden farklı transkripsiyon faktörleri, protein düzeylerindeki değişiklikler incelenmiştir. Işaretleyici her bir progresif artışs yapışık kültüründe görülen nispeten düşük seviyelerde, Şekil 2 D kıyasla TIC koşulları şamandıraya geleneksel görülmektedir. İlginç çeşitli koşullarda yetiştirilen bir insan asit hücre çizgisi şamandıra TIC koşullarda hiçbir boyama mevcut, Şekil 2 E az geleneksel TIC koşullarında en yüksek işaretleyici fenotip görüntüler.

TIC kültür koşulları tümör gelişimini atimik çıplak farelerin kohortlarda her koşulda elde edilen canlı hücrelerin eşit sayıda subkütan enjeksiyonlar yoluyla doğrulanmıştır. 3 gösteren Şekil ki ACI-23 (A, B) ve OVCAR-5 (C) hücreleri ile ilgili geleneksel yapışkan kültürler TIC kültürlerden daha az tümör oluşturucu edildi. Şamandıra TIC kültürler geleneksel yapışık veya geleneksel TIC kültürlerin daha zaman kısa bir süre içinde büyük tümörler ürettiği unutmayın. Bunlar data bile yumurtalık TIC belirteçleri mütevazı bir artış, dramatik bir fenotipik değişiklik olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, diğer hücre hatları (gösterilmemiştir) geleneksel bir EFT kültürleri, geleneksel yapışkan ve bir şamandıra TIC kültür hücreleri daha tümörijenik idi.

Şekil 1,
Farklı kültür koşulları Şekil 1. Sferoid gelişme. (A) kurulan yumurtalık kanseri hücre hatları (ACI-23, OVCAR-5 ve CAOV3) ve serum içermeyen düşük bağlanma şişelerinde büyütülmüştür primer bir hastada elde edilen asit hücreleri (TGS-3) kök hücre ortamı hali hazırda çok-hücreli küreler oluşturur. Görüntüler TIC koşullarda 96 saat içinde sferoitleri oluşan aynı hücreler ise, geleneksel yapışık kültür koşulları ACI-23 epitel arnavut morfolojisi korumak OVCAR-5, CAOV3 ve TGS-3 hücreleri göstermektedir. Ölçek çubuğu 100 um. 24 saat maruz kaldıktan sonra (B)Geleneksel yapışık kültür koşullarına, TIC kültür morfolojisi, orijinal yapışık morfoloji benzeyen bir farklılaşmış fenotip görüntüler. Ölçek çubuğu 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. Düşük bağlanma, serumsuz koşullar EFT işaretleri ile hücreleri zenginleştirmek. (A), CD133 antikoru konjüge APC ile ACI-23 hücre analizi Akış sitometrisi serumsuz kök düşük bağlanma şişelerinde CD133 + hücrelerinin, artan bir yüzdesini gösterir Hücre ortamı. Aldefluor deney gösterir kullanarak akış sitometri analizine serumsuz kök hücre ortamı düşük bağlanma şişelerinde kültürlenmiş hücrelerde ALDH aktivitesini arttırdı. CD133 negatif kontrol hiçbir antikor ve ALDH negatif con içeriyorkumanda ALDH inhibitörü (DEAB) mevcudiyetinde aktif alt-tabaka olup. FITC konjuge TRA-1-60 antikoru kullanılarak (B) Analiz ACI-23 hücrelerinde şamandıra TIC koşullarda TRA-1-60 + hücrelerinin en yüksek yüzdesini göstermektedir. Negatif kontrol, hiç antikor içerir. (C) CD133 + ALDH + hücreleri, geleneksel TIC en yüksek ve ACI-23 hücre hattında TİC koşulları Şamandıra. Hata çubukları: ± SEM, N = 6, * p <0.05. (D), Western blot analizi, 5 gün boyunca EFT koşullarında kültürlenmiş ACI-23 hücrelerinde kök hücrelerin transkripsiyonel belirteçleri protein seviyelerinde artış gösteren. Tüm hücre lisatları, (50 ug), bir yükleme kontrolü olarak GAPDH ile analiz edildi. (E) A gibi analiz TGS-3 ilköğretim asit hücrelerinin Temsilcisi nokta araziler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 3. Düşük bağlanma, serumsuz koşullar artan tümöre neden olan hücreleri zenginleştirmek. (A), 5 x 10 5 canlı ACI-23 hücreleri, deri altından üç kopya halinde atimik çıplak farelere enjekte edilmiştir. Fareler tartılmış ve haftada iki kez tümörler çap pergeli ile ölçülür. A = Geleneksel yapışık kültür, F = Floater TIC kültürü, S = Geleneksel TIC kültürü. * P <0.05. (B), farklı kültür koşullarında yetiştirilen hücreler kullanılarak, 25 gün sonra, ACI-23 den oluşturulmuş tümörlerin Örnek görüntüler. (C) 5 x 10 5 canlı OVCAR-5 hücreleri deri üçlü olarak atimik çıplak farelere enjekte ve A gibi izlendi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Burada açıklanan protokol kurulan yumurtalık kanseri hücre çizgileri ile ilgili kök hücre özellikleri olan hücreler için kültür zenginleştirmek için etkin ve tutarlı bir yöntem sunulur ve birinci hasta numuneleri için de geçerlidir. Bu yöntem, başarılı bir şekilde hücre çizgileri, çeşitli boyunca tikler için zenginleştirir. Bu fiziksel nüfus içinde olmayan tikler gelen tikleri sıralamak için zaman ayırdığınız olmadan TIC ve / veya tümörijenik fenotip zenginleştirmek koşulları zamanında tanımlanması için izin verir. Bu şekilde, farklı sinyal yollarının nispi seviyeleri, fonksiyonel analizlerin kullanarak çeşitli kültürler tlc geleneksel yapışkan kültürler karşılaştırarak TIC fenotipe katkıları için değerlendirilebilir. Saf TIC nüfus isteniyorsa, izolasyon kolaylıkla protokol akış sitometrisi bir floresan yardımlı veya manyetik ayırma adımı dahil edilmesi ile elde edilebilir.

Ancak, akılda tutmak önemlidir TIC marker ifadesiBöyle CD133, CD44, ya da ALDH gibi s, hücre hatları ve hatta aynı tümör Çeşidi hasta numuneleri arasında değişebilir. Örneğin biz ters ACI-23 için geçerlidir ise OVCAR-5 hücreleri, CD44 CD133 için göreceli yüksek ifadesini sahip olduğu bulundu. Bu farelerde tümör başlatılması güveniyor ve TIC varlığı kesin olarak akış sitometri analizine nedenle ilgili olduğunu. Yumurtalık kanseri hücreleri, kök hücre şartlarda yetiştirildiği zaman bu protokol izlenerek, yüksek ALDH aktivitesinin sürekli gözlenmiştir. ALDH Şamandıra TIC koşullarda en yüksek ise İlginçtir, CD133 ifadesi, geleneksel TIC kültür koşullarında yetiştirilen ACI-23 hücrelerinde sürekli yüksektir. Buna TGS-3 ilköğretim asit hücreleri şamandıra TIC koşullar altında CD133 pozitifliği küçük bir artış, ama geleneksel TIC koşullarında ALDH aktivite belirgin bir artış gösterir. Bu bulgular yumurtalık kanseri hücrelerinin heterojenitesini ve yaygın tikler ile ilişkili plastisite vurgulayın. Ayrıca CLA desteğinebu yöntemler, tikler geliştirmek im, TRA-1-60 pozitif hücrelerin zenginleştirilmesi de gözlenmiştir. TRA-1-60 bir Pluripotency belirtecidir ve prostat kanseri TICS 30-32 gibi embriyonal yumurtalık karsinom ve testisler tanımlamak için kullanılmıştır. Bizim yöntem çok sayıda hücre hatları ile başarılı olmuş olmasına rağmen, bu buluşun tadil edilmiş şamandıra koşullarına daha iyi Diğer yumurtalık kanseri hücre popülasyonlarında tikler zenginleştirmek ise standart TIC koşulları, bazı yumurtalık kanseri hücreleri için daha uygun olabilir mümkündür. Bu da yine, hem hasta türetilmiş ve kurulan yumurtalık kanseri hücre hatları içinde beklenen heterojenliğini altını çiziyor.

Bu belirteçler yumurtalık kanseri tikler özgü değildir ve oldukça embriyonik kök hücre pluripotensin için önemli faktörleri temsil rağmen hücre yüzey belirteçleri ek olarak Nanog, Sox2, Ekim-4 11 olmak üzere yumurtalık kanseri tikleri karakterize gösterilmiştir çeşitli transkripsiyon faktör vardır ve differentiation 33,34. Biz bu faktörlerin protein düzeylerinde değişiklikler incelenmiş ve Nanog düzeyleri diğerlerine 13,35 yanı sıra CD133, TRA-1-60 ve CD117 ile anlaşarak, TIC kültür koşullarında arttığı bulundu. Bir insan kök hücre işaretleyici cDNA dizisi bundan başka, geleneksel yapışkan koşulları ile karşılaştırıldığında TIC koşullarda CD133, Nanog, Melk ve PODXL genlerinde bir artış göstermiştir. Önemli bir şekilde, hücre yüzey belirteçleri ile olduğu gibi, yumurtalık tikler ilişkili transkripsiyon faktörleri, hücre çizgileri ve hasta örnekleri arasında değişebilir, dikkat edilmelidir.

Biz, in vitro olarak doğal olarak yapışkan olmayan ise hücreleri daha tümörijenik olduğu ve kök hücre belirteçlerin daha yüksek seviyelerde olduğunu gözledik (yani, hali hazırda bir yapışkan levha eklemek olmayan hücrelerin yüzer). Kültür, bu tür ACI-23 gibi hücre hatları, genellikle, geleneksel kültür iklimlendirme altında bir istifleme şekilde dikey olarak büyümesi çok uygulanabilir yüzen hücreler ve / veya hücre bilgisiiyonları. Yüzen hücreleri ve agrega gelen tikler başarılı zenginleştirme Bu çalışmada ve OVCAR-3 12 olanlar da dahil olmak üzere oldukça az için geçerli hücre hatları olabilir, ancak bizim bulgular bu daha tümörijenik nüfusu temsil düşündürmektedir. Bu nedenle, ticari bir kök hücre ortamına uyum sağlayamamaktadır hücreleri için, TIC zenginleştirme alternatif bir yöntem olarak hizmet edebilir, standart doku kültür plakaları ve ortam içinde yetiştirilen hücreler "yüzen" nüfus toplanması.

Bu yazıda sunulan farklı kültür yöntemlerinin kullanılması TİC nüfus hızlı zenginleşme ve farklı hücreler bu fenotip destek faktörleri ne daha iyi bir anlayış sağlayacaktır. Bu yöntemin Mevcut uygulamalar sinyal yolları hücre bu eşsiz nüfusun yayılmasını desteklemek için çok önemlidir karakterize edici içerir. Bu çalışmaların sonuçları, tümör ilerlemesi ve nüks mekanizmalarını açıklamak için yardımcı olacaktır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask Corning 3814
75 cm2 Tissue Culture Flask Sarstedt 83.1813.002
Aldefluor Kit Stemcell Technologies 1700
CD133-APC Miltenyi Biotec Inc. 130-090-826
Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant Sigma-Aldrich F0291 Prepared according to manufacturer's instructions
Epidermal Growth Factor - human recombinant Sigma-Aldrich E9644 Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS
DMEM:F12 (+L-glutamine, +5 mM HEPES) Gibco 11330-032
1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (without calcium and magnesium) Corning cellgro 21-031-CV
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution Corning Cellgro 25-056-CI
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9418-10G
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco 51500-056
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828010
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Fetal Bovine Serum (heat inactivated) Gemini 100-106
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 μm) Nalgene 450-0045
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube Corning 430052
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl Lonza 17-942E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer. Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).
  2. Ushijima, K. Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse. J Oncol. 2010, 497429 (2010).
  3. Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer. Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).
  4. King, S. M., et al. The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer. Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).
  5. Flesken-Nikitin, A., et al. Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche. Nature. 495, 241-245 (2013).
  6. Paik, D. Y., et al. Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation. Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).
  7. Connor, M. L., et al. Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward. Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).
  8. Dean, M., Fojo, T., Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).
  9. Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer. Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).
  10. Szotek, P. P., et al. Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).
  11. Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
  12. Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line. Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).
  13. Kryczek, I., et al. Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells. Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).
  14. Meng, E., et al. CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival. Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).
  15. Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
  16. Chen, J., et al. Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures. BMC Cell Biol. 14, 7 (2013).
  17. Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3. Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).
  18. Curley, M. D., et al. CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer. Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).
  19. Baba, T., et al. Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells. Oncogene. 28, 209-218 (2009).
  20. Liao, J., et al. Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism. PLoS One. 9, e84941 (2014).
  21. Silva, I. A., et al. Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival. Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).
  22. Jaggupilli, A., Elkord, E. Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity. Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).
  23. Irollo, E., Pirozzi, G. CD133: to be or not to be, is this the real question. Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).
  24. Ma, I., Allan, A. L. The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells. Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).
  25. McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma–associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).
  26. Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors. Biochimie. (2014).
  27. Brabletz, T. EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells. Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).
  28. Latifi, A., et al. Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors. PLoS One. 7, e46858 (2012).
  29. Liu, S., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).
  30. Malecki, M., et al. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries. J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).
  31. Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).
  32. Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-κB signalling. Nat Commun. 2, 162 (2011).
  33. Loh, Y. H., et al. The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells. Nat Genet. 38, 431-440 (2006).
  34. Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation. Nature. 455, 1124-1128 (2008).
  35. Lee, M., et al. Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics