Los métodos para la comparación de Nutrientes en jalea real Realizado por africanizadas y europeas Honey Bees y los efectos sobre títulos hemolinfa de proteínas

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Degrandi-Hoffman, G., Eckholm, B., Huang, M. Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers. J. Vis. Exp. (97), e52448, doi:10.3791/52448 (2015).

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Abstract

Las abejas obtienen nutrientes de polen que recogen y almacenan en la colmena como jalea real. Hemos desarrollado métodos para controlar la fuente de polen que las abejas recolectan y se convierten en jalea real mediante la colocación de colonias en un área cerrada de vuelo especialmente construido. Se desarrollaron métodos para analizar la composición de ácido proteínas y amino del polen y jalea real. También describe cómo se midió el consumo de la jalea real y los métodos utilizados para determinar los trabajadores adultos títulos proteínas hemolinfa de la abeja después de alimentarse de jalea real para 4, 7 y 11 días después de la emergencia. Los métodos se aplican para determinar si el genotipo afecta a la conversión de polen para jalea real y la tasa de que las abejas consumen y adquieren la proteína de ella. Dos subespecies (las abejas europeas y africanizadas; EHB y AHB, respectivamente) fueron proporcionados con la misma fuente de polen. Sobre la base de los métodos desarrollados, jalea real hecha por ambas subespecies tenía concentraciones de proteína más bajos y valores de pH que el polen. En general, los amino con ácidoconcentraciones en jalea real realizadas bien por EHB o AHB fueron similares y se produjeron en los niveles más altos en jalea real que en el polen. Tanto AHB y EHB consumen significativamente más de la jalea real hecha por AHB que por EHB. Aunque EHB y AHB consumieron cantidades similares de cada tipo de jalea real, las concentraciones de proteína hemolinfa en AHB fueron mayores que en EHB. Las diferencias en la adquisición de proteína entre AHB y EHB podrían reflejar adaptaciones ambientales relacionados con la región geográfica en la que se desarrollaron cada subespecie. Estas diferencias podrían contribuir al establecimiento exitoso de las poblaciones AHB en el Nuevo Mundo a causa de los efectos sobre la crianza de la cría y crecimiento de la colonia.

Introduction

La nutrición juega un papel fundamental en la salud y el vigor de las colonias de abejas de miel y en su establecimiento como poblaciones. Los nutrientes de los alimentos proporcionan la energía y los componentes bioquímicos necesarios para la cría de cría, la termorregulación, forrajeo y la respuesta inmune. Para las colonias de abejas de miel, los nutrientes necesarios para crecer poblaciones de las colonias y mantener su salud provienen de néctar y polen. Néctar proporciona hidratos de carbono y el polen suministra los requerimientos dietéticos restantes tales como proteínas, lípidos, vitaminas y minerales 1.

Subespecies de abejas pueden diferir en los parámetros de nivel de colonia basados ​​nutricionalmente como la longevidad de los trabajadores, la cría de cría, y los mecanismos de inmunidad sociales 6.2. Estas diferencias podrían estar vinculados a la forma de alimentos, en particular el polen es procesada por la colonia y se digirió en los individuos. El polen se almacena en las células de peine y por medio de microbios mediada por la fermentación del ácido láctico se cambia químicamente 11-14.

Aquí se describen los métodos utilizados para comparar la composición y el consumo de jalea real hecha por diferentes subespecies de abejas de miel. Los métodos para medir las concentraciones de proteína hemolinfa resultantes en las abejas obreras también se describen. Estudios anteriores sobre la composición nutricional de jalea real se realizaron con las abejas europeas (EHB) 10,15,16. Sin embargo, puede haber diferencias en la jalea real elaborado por las abejas de diferentes subespecies, incluso cuando se alimentan de la misma polen. EHB y AHB se compararon porque estos subspecies tienen diferencias fisiológicas y de comportamiento diferentes que podrían estar relacionados con la elaboración de alimentos y nutrientes adquisición 17. Algunas de las diferencias más notables son que AHB recolectar y consumir más polen que EHB y parecen convertir más fácilmente en la cría 18. Colonias AHB tienen mayores tasas de enjambre que EHB y fugan cuando los recursos alimenticios convierten limitada 19-23. La emigración es raro en EHB. AHB también tienen mayores tasas metabólicas que EHB 24. La base nutricional para las diferencias de nivel entre colonia EHB y AHB podría estar relacionado con la tasa de recogida de polen y también a su contenido de nutrientes (por ejemplo, aminoácidos y proteínas) después de que se convierte en jalea real. El consumo de jalea real y la adquisición proteína resultante también podrían desempeñar un papel en las diferencias de nivel de colonia entre EHB y AHB. Utilizando los métodos desarrollados, EHB y AHB hicieron jalea real de la misma fuente de polen. A continuación, la jalea real se alimenta de nuevo a las abejas de each subespecies y podría determinar si las abejas adquieren proteína a partir de jalea real de una manera distintiva a sus subespecies o a la fuente de la jalea real.

Protocol

1. Obtención de jalea real de AHB y EHB Colonias

  1. Coloca trampas de polen en las colonias de abejas de miel y recoger el polen. Moler el polen en un polvo fino (similar a la liberación de polen de las anteras) usando un molinillo de café.
  2. Establecer 5 colonias cada una de AHB y EHB en una zona de vuelo cerrado (EPT), de modo que las abejas se alimentan sólo en el polen proporcionado. Para evitar que los trabajadores a la deriva entre EHB y colonias AHB, divida la EPT en secciones separadas para que las abejas no pueden cruzar entre ellos. Coloque EHB individuo o colonias AHB con 3.500-4.000 abejas obreras, peine de cera con néctar, la miel, la cría inmadura y peine vacío en cada sección de la EPT.
    NOTA: Las colonias no han almacenado polen cuando se ha establecido. La tasa que el polen se almacena se puede aumentar al no incluir una reina que pone en las colonias.
  3. Alimentar el polen suelo para colonias mediante la colocación de una bandeja con el polen en cada sección de la EFA. Difusión sobre 60 g de polen en cada bandeja de modo que foraging abejas pueden recoger cargas como corbicular y almacenar el polen en sus colonias como jalea real. Continuar proporcionando polen fresco en cada bandeja al día durante 3 semanas.
  4. Consulte la jalea real de las colonias europeas como jalea real Europea (EBB), y de las colonias africanizadas como jalea real africanizada (ABB).

2. Las abejas que se alimentan en jaulas

  1. Marcos Lugar de sellado cría de obreras de las colonias AHB y EHB en jaulas de emergencia separadas en una habitación ambiental fijados en 32-34 ° C y una humedad relativa del 40% ..
  2. Cuando los trabajadores surgen y son alrededor de 24 horas de edad, establecer 12 Plexiglas jaulas de bioensayo (dimensiones = 11,5 x 7,5 x 16,5 cm 3) y añadir ya sea 100 EHB recién surgido o 100 recién emergidas AHB abejas obreras a cada jaula. Colocar una porción de paneles con un número conocido de células ya sea EBB o ABB (24-30 células por jaula) en cada jaula para generar las siguientes combinaciones de tratamientos: AHB alimentado ABB, EHB alimentado ABB, AHB alimentado EBB y EHB alimentado EBB. (4; 6 tratamientosjaulas por tratamiento; 24 jaulas en total).
  3. Añadir viales de agua y una miel 50% y solución de agua formulados en volumen a cada jaula. Vuelva a llenar los frascos de miel y agua al día durante el período de estudio de 11 días.

3. Abejas de trabajador de muestreo y jalea real y Consumo Estimación

  1. Muestra 10 recién surgió trabajadores EHB y AHB antes de colocarlos en las jaulas. Consulte estos como Día 0 abejas y hacer que sirven como base para las concentraciones de proteína hemolinfa.
  2. Retire 10 abejas de cada jaula después de que se alimentaban de EBB o ABB para 4, 7 y 11 días.
  3. Coloque las abejas vivas en tubos de microcentrífuga individuales y establecer en bolsas de hielo. Seleccione una submuestra de cuatro abejas para el análisis de la concentración de proteínas hemolinfa.
  4. Después de probar las abejas en el Día-11, cuente el número de células de peine que aún contienen jalea real. Esta es una medida relativa del consumo de jalea real.
  5. Retire la jalea real restante de las células en cada jaula y almacenar en separcomió tubos de microcentrífuga de acuerdo a la jaula. Mantener las muestras jalea real a -80 ° C hasta que se analizaron para el pH, la concentración de proteína soluble, y el contenido de aminoácidos.

4. Estimación de pH de polen y jalea real

  1. Tome seis muestras aleatorias 0,3 g de polen alimenta a las abejas en la EPT y disolverlo en 300 l de agua destilada. Mida el pH utilizando un impermeable doble lanza pH cruce con una precisión de 0,01.
  2. Tomar 0,3 g de muestra de jalea real que quedó después del período de alimentación de 11 días en cada jaula. Disolver la jalea real en 300 l de agua destilada y medida de pH como se describe para el polen (4.1).

Análisis 5. Proteína

  1. Tome seis muestras de polen y una muestra de EBB y ABB de cada jaula. Almacene las muestras a -20 ° C hasta el análisis de la concentración de proteína soluble.
  2. Mezclar 20 mg de cualquiera de polen o jalea real con 1000 l de solución de tampón fosfato 0,1 M (PBS).
  3. VoRTEX la mezcla durante 10 segundos y centrifugar a 571,2 xg durante 1 min.
  4. Retire una muestra de 10 l del sobrenadante y lugar en pocillos de una placa de poliestireno plana EIA / RIA inferior 96. Replicar cada muestra en tres pozos.
  5. Dibuje hemolinfa de las abejas recogidos de cada jaula mediante la inserción de un tubo capilar 20 l (que se había calentado y tirado a un punto-aguja) en la parte lateral derecha del tórax cerca del punto de unión de las alas. Recoger hemolinfa adicional, si es necesario, mediante la inserción del mismo tubo en la membrana entre los tergitos abdominales.
  6. Añadir 1 l de hemolinfa a 9 l de 0,1 M PBS. Guarde la solución hemolinfa a -20 ° C hasta el análisis de la proteína soluble.
  7. Determinar las concentraciones de proteína total soluble en el polen, jalea real, y muestras de hemolinfa utilizando un kit comercial de ensayo de proteínas Bradford. Siga las instrucciones del fabricante.
  8. Se establecerá una curva estándar para estimar proteína soluble concentración en las muestras midiendo la absorbancia de proteína con concentraciones de proteínas conocidas en la albúmina de suero bovino (BSA). Medir la absorbancia de proteínas a 595 nm usando un espectrofotómetro.

6. Análisis de Aminoácidos

  1. Piscina muestras individuales de células peine de cada colonia para crear una muestra representativa de EBB y ABB para su análisis.
  2. Tome una 50 mg de polen o jalea real de la muestra se pesa en viales de muestreador automático, y añadir 1 ml de agua destilada al vial, junto con 100 l de una solución 50 ng / l de patrón interno que consiste en d 4 alanina, ácido d 23 -lauric, 13 C 6-glucosa y ácido d 39 -arachidiac.
  3. Tapar la muestra y sonicar durante 5 min.
  4. Condición un cartucho de HLB mediante la adición de 1 ml de metanol, equilibrada mediante la adición de 1 ml de agua destilada seguido por la adición de 1 ml de la muestra de jalea real o el polen. Lavar el cartucho con 1 ml de 5,0% de MeOH / H 2 O y elude TE con 1 ml de 80% de MeOH / H 2 O.
  5. Evaporar la muestra a sequedad bajo una corriente de nitrógeno. Reconstituir la muestra con 50 l de piridina y 100 l de N, O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida + trimetilclorosilano (TMCS BSTFA +).
  6. Cap e incubar la muestra a 70 ° C durante 30 minutos.
  7. Deje enfriar la muestra y la transfiere a un vial automuestreador limpio.
  8. Cap y colocar la muestra en un detector selectivo de masas interfaz con un cromatógrafo de gases para analizar las muestras, tanto para los compuestos volátiles y ácidos orgánicos. Separar los ácidos de azúcar y orgánicos siguientes derivatización TMS con BSTFA + TMCS usando una columna (id 30 mx 0,25 mm) con un espesor de 1,0 micras película.
  9. Ajuste el horno de columna a 50ºC durante 2 min, a continuación, aumentar la temperatura de forma lineal hasta 290 ° C en 5 C / min. y mantener durante 7 min. Ajuste el inyector de GC y GC / interfaz de MS a 250 ° C y 290 ° C, respectivamente.
    1. El uso de helio como portador en un flow tasa de 1,0 ml / min. Ajuste la temperatura de la fuente MS a 230 ° C.
  10. Tune y calibrar el espectrómetro de masas de todos los días con perfluorotributilamina (PFTBA). Utilice una inyección de 1 l de PFTBA en el análisis completo (35-700 amu) modo de iones positivos para obtener datos sobre la presencia y concentraciones de aminoácidos.

Representative Results

Jalea real se almacena en -80 ° C durante menos de un mes antes de ser analizadas para pH y la concentración de proteínas, y durante aproximadamente 4 meses antes de análisis de aminoácidos. Jalea real difiere del polen en el pH y la concentración de proteína (Figura 1). El pH de jalea real fue menor que el polen así como la concentración de proteína. Tanto EHB y AHB consumieron más de ABB EBB (Figura 2).

Los niveles de proteína soluble en la hemolinfa de AHB fueron significativamente mayores que EHB independientemente del tipo de jalea real que consumían (Figura 3). Estas diferencias en los niveles de proteína hemolinfa se produjeron a pesar de EHB y AHB consumieron cantidades similares de cada tipo de jalea real. La edad de las abejas en el momento del muestreo afectó significativamente las concentraciones de proteínas solubles en la hemolinfa. Las concentraciones de proteína fueron significativamente inferiores en días-4 abejas en comparación con el día-7 o 11 que no difirieron.

_content "> De los 10 aminoácidos que son esenciales para las abejas de la miel, pero histidina se detectaron en el polen. En la mayoría de los casos, las concentraciones de aminoácidos medidos en jalea real fueron más altos que en el polen (Figura 4). Por ejemplo, las concentraciones de leucina y treonina fueron aproximadamente 60% más alta en comparación con jalea real polen, y las concentraciones de valina fueron aproximadamente 25% más alto. Alanina, los niveles de ácido, glutamina y metionina aspártico también fueron mayores en jalea real que en el polen. concentraciones Aminoácidos no difieren mucho entre ABB y EBB, con la excepción de la fenilalanina y cisteína. niveles de fenilalanina eran dos veces más alta en comparación con cualquiera de ABB EBB o el polen. concentraciones de cisteína fueron menores en comparación con ABB EBB o el polen. El triptófano es el único aminoácido presente en concentraciones más altas en polen que en EBB o ABB. Las concentraciones de prolina en el polen y ABB fueron más altos que en EBB.


Figura 1: Las comparaciones de pH (A) y las concentraciones de proteínas solubles (B) en el polen y la jalea real hecha por Europea (EHB) o africanizada (AHB) abejas. El pH de polen fue significativamente más alta que la jalea real tal como se determina por análisis de varianza (F 2,12 = 3,725, p <0,0001) seguido de una prueba de comparación múltiple de Tukey W-. La concentración de proteínas en el polen fue significativamente mayor que en jalea real hecha por EHB (EBB) o AHB (ABB) (F 2,27 = 16,49; p <0,0001). Los promedios seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes al nivel de 0,05.

Figura 2
Figura 2: El porcentaje medio de cells contienen jalea real que se consume por completo durante un intervalo de 11 días abejas enjaulados. La jalea real se hizo por tanto europea (EHB) o africanizada (AHB) abejas utilizando la misma fuente de polen. Las medias se estiman a partir de cinco jaulas de cada tratamiento; aquellos con la misma letra no son significativamente diferentes en el nivel 0,05 según lo determinado por un análisis de varianza de una forma (F 3,16 = 7,3, p = 0,003) y la prueba de Tukey W. Esta figura ha sido modificado desde 25.

Figura 3
Figura 3: La concentración promedio de proteína en la hemolinfa de Europea (EHB) o africanizada (AHB) abejas jalea real alimentado hecha por africanizadas (ABB) abejas Europea (EBB) o de 4, 7, y 11 días Un análisis de medidas repetidas de. varianza indicó diferencias significativas entre el 4 treagrupos tamento (F 3,20 = 19,7, p <0,001). Los niveles de proteína soluble en AHB Fed ABB fueron significativamente mayores que EHB Fed ABB (p = 0,008) o EBB (p = 0,018). La edad de las abejas en el momento del muestreo afectó significativamente las concentraciones de proteínas solubles en la hemolinfa. Los niveles fueron significativamente inferiores en las abejas 4 días en comparación con el día-7 (p <0,0001) o 11 (p = 0,001). Día 7 y Día 11 abejas no difirieron (p = 0,149). Esta cifra se ha modificado desde el 25.

Figura 4
Figura 4:. Las concentraciones de aminoácidos (microgramos por gramo de polen o jalea real) en el polen o la jalea real hecho de él EBB se jalea real hecha por las abejas europeas y ABB fue hecha por las abejas africanizadas. El triptófano, cisteína, fenilalanina y prolina se representaron gráficamente por separado para fines de claridad en pretando sus cantidades. Esta cifra se ha modificado desde el 25.

Discussion

Usando los métodos descritos anteriormente, se encontró que la jalea real hecha por AHB se consume en mayores cantidades por tanto AHB y EHB. Aunque EHB y AHB consumieron cantidades similares de cada tipo de jalea real, AHB tenía mayores títulos de proteínas hemolinfa. Los resultados basados ​​en nuestros métodos fueron similares a los anteriores informes donde los niveles de proteína en la hemolinfa AHB fueron mayores que en EHB aunque ambos fueron alimentados con la misma dieta 26. Mediante la medición de consumo de EBB y ABB que se consume en diferentes tasas por tanto EHB y AHB, se determinó que la concentración de proteína en la hemolinfa cada subespecie no podría elevarse mediante el aumento de consumo de alimentos. Parece que hay una meseta de concentración de proteína en la hemolinfa trabajadores de edad abeja enfermera y que el punto de ajuste para la meseta es mayor en AHB de EHB.

Hay varias condiciones importantes para el establecimiento de colonias para la producción de jalea real que optimizarán la tasa de almacenamiento de polen. En primer lugar, la colonies necesitan marcos con cría abierta. Sin cría abierta para alimentar, los trabajadores no acumulen mucho polen. En segundo lugar, la colonia debe ser huérfana de modo que no se produce la cría adicional. Cría de cría requiere grandes cantidades de polen, y sólo exceso de polen se almacena. En las pequeñas colonias establecidas en la EPT, habría poco polen para ser almacenados como jalea real si las áreas de cría se estaban expandiendo así las colonias deben ser huérfana. Por último, para jalea real que se hizo, el polen debe recogerse como cargas corbicular y se almacena en las células de peine. Si el polen se recoge en trampas de polen, debe ser triturada en polvo fino antes de presentarlo a las abejas para que puedan recoger como cargas corbicular.

Los métodos para medir el consumo de jalea real genera cualitativo más que las estimaciones absolutas. El único consumo que se contaba era cuando las células se vacían completamente de pan de abejas. Una estimación más precisa del consumo total de pan de abeja podría ser obtenida mediante la eliminación de la br abejaead de las células y por lo que es en una empanada que podrían pesa antes y después del período de estudio. Sin embargo, hemos querido mantener el pan de abejas en las células para que las abejas podían alimentarse de lo que lo harían en una colonia y quizás continuar con la tramitación que durante el período de estudio. La diferencia de peso de las secciones de peine antes y después del estudio no se utilizó como una estimación del consumo ya que el peso podría haber aumentado porque las abejas ponen la miel diluida alimentado a ellos en algunas células.

Los trabajadores también podrían haber añadido algo de la miel diluida para el pan de abejas. Por estas razones, las células que contienen cantidades aproximadamente iguales de pan de abeja antes y después del período de alimentación se contaron y generaron una medición cualitativa. Sin embargo, hubo una diferencia notable entre los dos tipos de jalea real en el número de células contadas ABB vacíos en comparación con EBB después de 11 días.

Determinar cuándo polen almacenado queda jalea real puede ser difficult porque las abejas agregan continuamente el polen a las células. Las colonias de donde jalea real que producen se establecieron con los marcos de cría abierta para que las abejas podrían recoger el polen. Sin embargo, las colonias eran sin reina, así que había larvas para alimentarse sólo unos 9 días después de que se estableció la colonia. Para el resto del período de 3 semanas cuando las colonias estaban en el EPT, el polen que las abejas recogidos se almacenan y se están convirtiendo en jalea real. Mantener el polen almacenado en las células peine por 11 días en los que alimentan a las abejas en las jaulas también pueden haber continuado la tramitación de polen de jalea real. La conversión de polen para el pan de abejas toma aproximadamente 7 días 8. La jalea real se alimenta a EHB y AHB tenía concentraciones de proteína reducida en comparación con la Fed polen menor pH y. Similares resultados de los cambios en el polen después de jalea real conversión han sido reportados por otros 7,10,27. Nuestros resultados difieren de los anteriores informes, sin embargo, en que no había diferencias en las concentraciones of ciertos aminoácidos entre jalea real y polen. Los cambios en ambas concentraciones de proteínas y aminoácidos podrían ser debido a la actividad de las enzimas proteolíticas, la fuente de la que podría ser los mismos o de las comunidades microbianas establecidos en la jalea real 7,8,28,29 abejas.

Los métodos utilizados para medir la concentración de proteína fueron similares a los descritos anteriormente para determinar los efectos de la proteína de la dieta sobre Africanized y las abejas europeas 26. Como una extensión de los métodos, hemos sido capaces de estimar la proteína soluble en el polen y jalea real. Estos métodos generan resultados similares a los informes anteriores 7,10,27. Nuestros resultados proporcionan evidencia adicional de que AHB asimile de manera más eficiente la proteína dietética que EHB, y que esto podría ser un factor clave en el dominio ecológico de AHB en la mayoría de las regiones donde ha emigrado y establecerse 30-32.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
waterproof double junction pH spear  Thermo Fisher
Coffee Grinder Mr. Coffee  model 1DS77
Dulbecco's phosphate buffer solution Emd-millipore BSS-1005-B
EIA/RIA polystyrene plate Sigma-Aldrich-Corning CLS3590-100EA
microcapillary pipets Kimble Glass Inc.
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2  Bio-Rad #500-0202
Spectrophotometer Biotek Synergy HT 
Mass Selective Detector  Agilent 5973N
HLB cartridge
gas chromatograph  Agilent 6930
 gas chromatography column  A J&W Scientific  DB-1701
d4-alanine  Sigma-Aldrich 488917
d23-lauric acid Sigma-Aldrich 451401
13C6-glucose Sigma-Aldrich 389374
Pyridine  Sigma-Aldrich 270970
N,O-Bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide +  
Trimethylchlorosilane (BSTFA + TMCS) Sigma-Aldrich 33148
Perfluorotributylamine (PFTBA) Sigma-Aldrich 442747-U
d39-arachidiac acid Cambridge Isotope 

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References

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