Métodos para comparar Nutrientes na beebread Feito por africanizadas e mel europeu abelhas e os efeitos sobre Títulos Hemolinfa Proteína

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Degrandi-Hoffman, G., Eckholm, B., Huang, M. Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers. J. Vis. Exp. (97), e52448, doi:10.3791/52448 (2015).

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Abstract

As abelhas do mel obter nutrientes do pólen que coletar e armazenar na colméia como beebread. Nós desenvolvemos métodos para o controle da fonte de pólen que as abelhas coletam e converter para beebread colocando colônias em uma área de vôo fechado especialmente construído. Os métodos foram desenvolvidos para analisar a composição dos ácidos da proteína e de aminoácidos do pólen e beebread. Nós também descrevem como consumo do beebread foi medida e os métodos utilizados para determinar trabalhador adulto títulos proteína abelha hemolinfa após a alimentação em beebread para 4, 7 e 11 dias após a emergência. Os métodos foram aplicados para determinar se o genótipo afecta a conversão do pólen para beebread e que a taxa de abelhas consumir e adquirir proteína a partir dele. Duas subespécies (abelhas africanizadas europeus e mel; EHB e AHB respectivamente) foram fornecidos com a mesma fonte de pólen. Com base nos métodos desenvolvidos, beebread feito por ambas as subespécies tinham concentrações de proteína mais baixos e valores de pH do que o pólen. Em geral, con amino ácidocentrações em beebread feitas por qualquer EHB ou AHB foram semelhantes e ocorreu em níveis mais elevados em beebread do que no pólen. Ambos AHB e EHB consumiram significativamente mais do beebread feita por AHB que por EHB. Embora EHB e AHB consumiram quantidades semelhantes de cada tipo de beebread, concentrações de proteína hemolinfa em AHB foram maiores do que em EHB. As diferenças na aquisição de proteína entre AHB e EHB pode refletir adaptações ambientais relacionados com a região geográfica onde cada subespécie evoluiu. Estas diferenças podem contribuir para o sucesso da criação populações AHB no Novo Mundo por causa dos efeitos sobre a criação de ninhada e o crescimento da colônia.

Introduction

A nutrição desempenha um papel fundamental na saúde e vigor de colônias de abelhas produtoras de mel e em seu estabelecimento como populações. Nutrientes dos alimentos fornecem energia e os componentes bioquímicos necessários para a criação ninhada, termorregulação, forragem e resposta imune. Para colônias de abelhas produtoras de mel, os nutrientes necessários para crescer populações colônia e manter a sua saúde vêm de néctar e pólen. Nectar fornece carboidratos e pólen abastece as restantes necessidades dietéticas, tais como proteínas, lipídios, vitaminas e minerais 1.

Subespécies de abelhas podem diferir em parâmetros de nível de colônia com base nutricionalmente como longevidade trabalhador, criação de larvas, e mecanismos de imunidade sociais 2-6. Estas diferenças podem ser ligados a forma como os alimentos, especialmente pólen é processado pela colónia e digeriu-se em indivíduos. O pólen é armazenado nas células de pente e através da fermentação microbiana de ácido láctico é alterada quimicamente mediada 11-14.

Aqui, descrevemos métodos utilizados para comparar a composição e o consumo de beebread feita por diferentes subespécies de abelhas. Métodos para medir os títulos de proteína hemolinfa resultantes em abelhas operárias são também descritos. Estudos anteriores sobre a composição nutricional do beebread foram feitos com as abelhas européias (EHB) 10,15,16. No entanto, pode haver diferenças na beebread feita por abelhas de diferentes subespécies, mesmo quando eles se alimentam no mesmo pólen. EHB e AHB foram comparados porque esses subspecies têm diferenças comportamentais e fisiológicos distintos que podem estar relacionados ao processamento de alimentos e nutrientes aquisição 17. Algumas das diferenças mais notáveis ​​são que AHB recolher e consumir mais do que o pólen EHB e parecem convertê-lo mais facilmente em ninhada 18. Colónias AHB têm taxas mais elevadas do que pululantes EHB e fugir quando os recursos alimentares tornam-se limitadas 19-23. Fuga é rara em EHB. AHB também têm taxas metabólicas mais elevadas do que EHB 24. A base nutricional para as diferenças de nível entre colônia EHB e AHB pode estar relacionado com a taxa de coleta de pólen e também ao seu conteúdo de nutrientes (por exemplo, aminoácidos e proteínas), depois ele é convertido para beebread. Beebread consumo e aquisição de proteína resultante também pode desempenhar um papel nas diferenças de nível entre colônia EHB e AHB. Usando os métodos desenvolvidos, EHB e AHB fez beebread da mesma fonte de pólen. O beebread foi então alimentado de volta para as abelhas de each subespécies e pode determinar se a proteína de abelhas adquirir beebread de um modo distinto para seus subespécie ou à fonte do beebread.

Protocol

1. Obtenção de beebread AHB e EHB Colonies

  1. Coloque coletores de pólen em colônias de abelhas produtoras de mel e coletar pólen. Bata no liquidificador o pólen em um pó fino (similar ao pólen galpão de anteras) usando um moedor de café.
  2. Estabelecer 5 colónias de cada AHB e EHB em uma área fechada voo (EFA) de modo a que as abelhas forragear apenas no pólen fornecida. Para evitar que os trabalhadores à deriva entre EHB e colônias AHB, divida o EFA em seções separadas para que as abelhas não podem cruzar entre si. Coloque EHB indivíduo ou colônias AHB com 3.500-4.000 abelhas operárias, pente de cera com néctar, mel, ninhada imaturo e pente vazio em cada seção da EFA.
    NOTA: As colônias não ter armazenado pólen quando estabelecidas. A taxa que o pólen é armazenado pode ser aumentada por não incluir uma rainha, que nas colônias.
  3. Alimente pólen chão para colônias, colocando uma bandeja com o pólen em cada seção da EFA. Espalhando cerca de 60 g de pólen em cada bandeja para que foraginabelhas g pode cobrá-lo cargas como corbicular e armazenar o pólen em suas colônias como beebread. Continuar a prestar pólen fresco em cada bandeja por dia durante 3 semanas.
  4. Consulte beebread das colônias européias como beebread Europeu (EBB), e de colônias africanizadas como beebread africanizada (ABB).

2. As abelhas que Alimenta em Gaiolas

  1. Coloque quadros de selado operárias da AHB e EHB colônias em gaiolas de emergência separados em uma sala ambiental fixado em 32-34 ° C e 40% de umidade relativa do ar ..
  2. Quando os trabalhadores surgem e são cerca de 24 horas de idade, estabelecer 12 Plexiglas bioensaios gaiolas (dimensões = 11,5 x 7,5 x 16,5 centímetros 3) e adicione 100 EHB recém-surgido ou 100 recém-emergidas abelhas operárias AHB para cada gaiola. Coloque uma seção de pente com um número conhecido de células ou EBB ou ABB (24-30 células por gaiola) em cada gaiola para gerar as seguintes combinações de tratamento: AHB fed ABB, EHB fed ABB, AHB fed EBB e EHB fed EBB. 4 (6 tratamentos;gaiolas por tratamento; 24 gaiolas no total).
  3. Adicionar frascos de água e uma de mel a 50% e solução de água formuladas por volume para cada gaiola. Reabastecer os frascos de mel e água por dia, durante o período do estudo 11 dias.

3. Bees Sampling Trabalhador e beebread e estimar o consumo

  1. Amostra 10 recém-surgido EHB e AHB trabalhadores antes de colocá-los em gaiolas. Referimos a elas como dia 0 abelhas e tê-los servir como base para as concentrações de proteína hemolinfa.
  2. Retirar 10 abelhas de cada gaiola depois que eles alimentados com EBB ou ABB para 4, 7 e 11 dias.
  3. Coloque as abelhas vivas em microtubos individuais e definir em blocos de gelo. Selecione uma sub-amostra de quatro abelhas para análise da concentração de proteína hemolinfa.
  4. Depois de provar abelhas no dia-11, contar o número de células de favos que contenham ainda beebread. Esta é uma medida relativa do consumo beebread.
  5. Remover o beebread restante das células em cada gaiola e armazenar em separComeram tubos de microcentrífuga de acordo com a gaiola. Manter as amostras beebread a -80 ° C até serem analisadas quanto ao pH, concentração de proteína solúvel, e teor de aminoácidos.

4. Estimativa de pH de Pólen e beebread

  1. Tome seis amostras aleatórias 0,3 g de pólen para as abelhas alimentadas na EFA e dissolvê-lo em 300 mL de água destilada. Medir o pH utilizando uma dupla lança junção pH à prova d'água com uma precisão de 0,01.
  2. Tomar 0,3 g de amostra de beebread que permaneceu após o período de alimentação de 11 dias em cada gaiola. Dissolve-se o beebread em 300 ul de água destilada e medida do pH, tal como descrito para o pólen (4.1).

Análise 5. Protein

  1. Tome seis amostras do pólen e uma amostra de EBB e ABB de cada gaiola. Armazenar as amostras a -20 ° C até serem analisadas para a concentração de proteína solúvel.
  2. Misturar 20 mg de pólen ou beebread quer com 1000 ml de solução de 0,1 M de tampão fosfato (PBS).
  3. VoRTEx a mistura durante 10 segundos e centrifugar a 571,2 xg durante 1 min.
  4. Retirar uma amostra de 10 ul do sobrenadante e lugar em cavidades de uma placa de poliestireno de fundo plano de 96 EIA / RIA. Replicar cada amostra em três poços.
  5. Desenhar hemolinfa de abelhas recolhidas a partir de cada gaiola através da inserção de um tubo capilar 20 ul (que tinha sido aquecido e puxado para um ponto de agulha afiada) na porção lateral direita do tórax perto do ponto de fixação das asas. Recolhe hemolinfa adicional, se necessário, através da inserção do mesmo tubo da membrana entre os tergites abdominais.
  6. Adicionar 1 ml de hemolinfa de 9 ul de 0,1 M de PBS. Guardar a solução hemolinfa a -20 ° C até análise para a proteína solúvel.
  7. Determinar as concentrações de proteína total solúvel em pólen, beebread e amostras de hemolinfa usando um kit de teste de proteínas de Bradford comercial. Siga as instruções do fabricante.
  8. Estabelecer uma curva padrão para estimar a proteína solúvel concentration nas amostras de proteína medindo a absorvância com concentrações proteicas conhecidas em albumina de soro bovino (BSA). Medir a absorvância da proteína a 595 nm usando um espectrofotómetro.

6. Análise de Aminoácidos

  1. Piscina amostras individuais a partir de células de pente de cada colônia para criar uma amostra representativa de EBB e ABB para análise.
  2. Tomar um 50 mg de pólen ou amostra beebread pesado para dentro de frascos de auto-amostragem, e adicionar 1 ml de água destilada ao frasco, juntamente com 100 ul de uma solução a 50 ng / uL do padrão interno que consiste em d-alanina 4, 23 d -lauric ácido, 13 C 6 39 d -glucose e ácido -arachidiac.
  3. Tapar a amostra e sonicado durante 5 minutos.
  4. Condiciona-se um cartucho de HLB por adição de 1 ml de metanol, equilibrada pela adição de 1 ml de água destilada, seguido pela adição de 1 ml da amostra beebread ou pólen. Lavar o cartucho com 1 ml de 5,0% de MeOH / H 2 O e elute com 1 ml de 80% MeOH / H 2 O.
  5. Evapora-se a amostra até à secura sob uma corrente de azoto. Reconstituir a amostra com 50 ul de piridina e 100 ul de N, O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida + trimetilclorosilano (TMCS BSTFA +).
  6. Cap e incubar a amostra a 70 ° C durante 30 min.
  7. Permitir que a amostra para esfriar e transferir para um frasco autosampler limpo.
  8. Cap e colocar a amostra em um Detector Selectivo de Massa com interface para um cromatógrafo de fase gasosa para analisar as amostras, tanto para os compostos voláteis e ácidos orgânicos. Separa-se os ácidos de açúcares e orgânicos depois de TMS derivatização com BSTFA + TMCS usando uma coluna (30 mx 0,25 milímetros ID) com uma espessura de película de 1,0 um.
  9. Definir o forno de coluna a 50 ° C durante 2 min, em seguida, aumentar a temperatura de forma linear até 290 ° C a 5 ° C / min. e segure por 7 min. Definir o injector de GC e GC interface de E / MS a 250 ° C e 290 ° C, respectivamente.
    1. Use o Hélio como uma transportadora em um flow taxa de 1,0 ml / min. Regule a temperatura fonte MS a 230 ° C.
  10. Tune e calibrar o espectrômetro de massa por dia com perfluorotributilamina (PFTBA). Utilize uma injecção de 1 uL de PFTBA na verificação completa (35-700 amu) Modo de ião positivo para obter dados sobre a presença e as concentrações de aminoácidos.

Representative Results

Beebread foi armazenado em -80 ° C durante menos de um mês antes de serem analisadas quanto ao pH e concentração de proteína, e durante cerca de 4 meses antes da análise de aminoácidos. Beebread diferia do pólen no pH e na concentração da proteína (Figura 1). O pH da beebread foi menor do que o pólen era como a concentração de proteína. Ambos EHB e AHB consumiram mais do que ABB EBB (Figura 2).

Os níveis de proteína solúvel na hemolinfa de AHB foram significativamente maiores do que EHB independentemente do tipo de beebread eles consumido (Figura 3). Estas diferenças nos níveis de proteína hemolinfa ocorreu mesmo EHB e AHB consumiram quantidades semelhantes de cada tipo de beebread. A idade das abelhas no momento da amostragem afetou significativamente as concentrações de proteínas solúveis na hemolinfa. As concentrações de proteína foram significativamente menores no dia-4 abelhas em comparação com o dia-7 ou 11 que não diferiram.

_content "> Dos 10 aminoácidos que são essenciais para as abelhas, mas todos histidina foram detectados no pólen. Na maioria dos casos, as concentrações de aminoácidos medidos em beebread foram maiores do que no pólen (Figura 4). Por exemplo, as concentrações de leucina e treonina foram cerca de 60% maior em comparação com beebread pólen, concentrações e valina foram cerca de 25% maior. alanina, os níveis de ácido, glutamina, e metionina aspártico também foram maiores no beebread do que no pólen. As concentrações dos aminoácidos não diferem muito entre ABB e EBB com a excepção de fenilalanina e cisteína. Os níveis de fenilalanina foram cerca de duas vezes mais alta em comparação com qualquer um ABB EBB ou pólen. concentrações de cisteína foram menores em comparação com EBB ABB ou pólen. O triptofano foi o único aminoácido que está presente em concentrações mais elevadas em pólen do que em EBB ou ABB. As concentrações de prolina no pólen e ABB foram maiores do que em EBB.


Figura 1: Comparações de pH (A) e concentrações de proteína (B) solúvel em pólen e do beebread feita por Europeia (EHB) ou africanizada (AHB) abelhas. O pH de pólen foi significativamente maior do que o beebread como determinado por análise de variância (F 2,12 = 3,725, p <0,0001) seguido de um teste de comparação múltipla de Tukey W-. A concentração de proteína no pólen foi significativamente maior do que em beebread feita por EHB (EBB) ou AHB (ABB) (F 2,27 = 16,49; p <0,0001). Médias seguidas pela mesma letra não são significativamente diferentes ao nível de 0,05.

Figura 2
Figura 2: O percentual médio de cells contendo beebread que foram completamente consumida durante um intervalo 11 dias por abelhas enjaulado. O beebread foi feito por qualquer Europeia (EHB) ou africanizada (AHB) abelhas utilizam a mesma fonte de pólen. As médias foram estimadas em cinco gaiolas de cada tratamento; aqueles com a mesma letra não são significativamente diferentes ao nível de 0,05, conforme determinado por uma análise de variância unidireccional (F 3,16 = 7,3; p = 0,003) e pelo teste de Tukey W. Esta figura foi modificada a partir de 25.

Figura 3
Figura 3: A concentração média de proteína na hemolinfa do Europeu (EHB) ou africanizada (AHB) abelhas beebread alimentado feita por africanizadas (OPA) das abelhas Europeu (EBB) ou para 4, 7 e 11 dias Uma análise de medidas repetidas. variância indicou diferenças significativas entre os 4 treatamento grupos (F 3,20 = 19,7, p <0,001). Os níveis de proteína solúvel em AHB alimentados ABB foram significativamente maiores do que EHB alimentados ABB (p = 0,008) ou EBB (p = 0,018). A idade das abelhas no momento da amostragem afetou significativamente as concentrações de proteínas solúveis na hemolinfa. Níveis foram significativamente menores no dia-4 abelhas em comparação com o dia-7 (p <0,0001) ou 11 (p = 0,001). Dia 7 e day11 abelhas não diferiu (p = 0,149). Esta figura foi modificada a partir de 25.

Figura 4
Figura 4:. As concentrações de aminoácidos (ug por grama de pólen ou beebread) no pólen ou a beebread feitas a partir dele EBB é beebread feita por abelhas européias e ABB foi feita por abelhas africanizadas. Triptofano, cisteína, fenilalanina e prolina foram representados separadamente para efeitos de clareza na prétando os seus montantes. Esta figura foi modificada a partir de 25.

Discussion

Utilizando os métodos descritos acima, verificou-se que o beebread feita por AHB foi consumido em maiores quantidades por ambos AHB e EHB. Embora EHB e AHB consumiram quantidades semelhantes de cada tipo de beebread, AHB teve maiores títulos de proteínas da hemolinfa. Apreciação com base em nossos métodos foram semelhantes aos relatórios anteriores, onde os níveis de proteína na hemolinfa AHB foram maiores do que em EHB embora ambos foram alimentados com as mesmas rações 26. Por medição do consumo de EBB e ABB que foram consumidas em taxas diferentes, tanto de EHB e AHB, determinou-se que a concentração de proteína na hemolinfa cada subespécie não poderia ser elevada pelo aumento do consumo de alimentos. Parece haver um platô para concentração de proteína hemolinfa em trabalhadores de idade enfermeira abelha e que o ponto de ajuste para o patamar é mais elevado do que em AHB EHB.

Existem várias condições importantes para o estabelecimento de colônias para a produção beebread que irão otimizar a taxa de armazenamento de pólen. Primeiro, a colonies precisa quadros com ninhada aberto. Sem ninhada aberto para alimentar, os trabalhadores não coletará muito pólen. Em segundo lugar, a colônia deve ser colmeia sem rainha de modo nenhum ninhada adicional é produzido. Brood criação requer grandes quantidades de pólen, e apenas o excesso de pólen é armazenado. Nas pequenas colônias estabelecidas em EFA, haveria pouco pólen para ser armazenado como beebread se as áreas de cria foram se expandindo tão colônias precisam ser colmeia sem rainha. Finalmente, para beebread para ser feita, pólen deve ser recolhido como cargas corbicular e armazenado em células dos favos. Se o pólen é coletado em coletores de pólen, deve ser motivo para um pó fino antes de apresentá-lo para as abelhas, para que possam recolher-lo como cargas corbicular.

Os métodos para medir o consumo de beebread gerado mais qualitativo do que as estimativas absolutos. A única consumo que foi contado era quando as células foram completamente esvaziados de pão de abelha. Uma estimativa mais precisa do consumo total de pão de abelha pode ser obtido por remoção do largo abelhaead a partir das células e transformá-la numa empada que poderia ser pesado antes e após o período de estudo. No entanto, queríamos manter o pão de abelha nas células para que as abelhas poderiam alimentar sobre ele como se estivessem em uma colônia e, talvez, continuar a processar-lo durante o período de estudo. A diferença de peso das secções de pente antes e depois de o estudo não foi utilizado como uma estimativa do consumo, pois o peso pode ter aumentado porque a colocar abelhas mel diluído alimentado a eles em algumas células.

Os trabalhadores também poderia ter acrescentado alguns dos mel diluído ao pão de abelha. Por estas razões, as células que contêm quantidades aproximadamente iguais de pão de abelha antes e após o período de alimentação foram contadas e gerou uma medida qualitativa. Ainda, houve uma diferença notável entre os dois tipos de beebread no número de células vazias ABB contados em comparação com EBB após 11 dias.

Determinar quando pólen armazenado fica beebread pode ser difficult porque as abelhas adicionar continuamente pólen para as células. As colónias usadas para beebread produtoras foram estabelecidos com quadros de ninhada aberta para que as abelhas coletavam pólen. No entanto, as colônias foram colmeia sem rainha assim havia larvas para alimentar-se apenas cerca de 9 dias após a colônia foi estabelecida. Para o restante do período de 3 semanas quando as colónias foram em EFA, o pólen que as abelhas recolhidas e foi armazenado a ser convertido em beebread. Mantendo o pólen armazenado nas células de pente para mais 11 dias, quando o alimentam de abelhas em gaiolas também pode ter continuado a transformação do pólen para beebread. A conversão de pólen para pão de abelha leva cerca de 7 dias 8. O beebread alimentado para EHB e AHB apresentaram menor pH e concentrações de proteína reduzida em comparação com o Fed pólen. Achados semelhantes de mudanças no pólen após beebread conversão foram relatados por outros 7,10,27. Nossos resultados diferem dos relatórios anteriores no entanto, em que houve diferenças nas concentrações de of certos aminoácidos entre beebread e pólen. As alterações em ambas as concentrações de proteína e de ácidos aminados pode ser devido à actividade de enzimas proteolíticas, a origem dos quais podem ser os mesmos ou as comunidades microbianas estabelecidos no beebread 7,8,28,29 abelhas.

Os métodos usados ​​para medir a concentração de proteína foram semelhantes aos descritos anteriormente para determinar os efeitos da proteína dietética sobre africanizadas e as abelhas europeias 26. Como uma extensão dos métodos, que foram capazes de estimar proteína solúvel no pólen e beebread. Esses métodos gerado resultados semelhantes aos relatórios anteriores 7,10,27. Nossos resultados fornecem evidências adicionais de que AHB assimilar de forma mais eficiente de proteínas na dieta de EHB, e que este poderia ser um fator-chave no domínio ecológico da AHB na maioria das regiões onde ele emigrou e se estabelecer 30-32.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
waterproof double junction pH spear  Thermo Fisher
Coffee Grinder Mr. Coffee  model 1DS77
Dulbecco's phosphate buffer solution Emd-millipore BSS-1005-B
EIA/RIA polystyrene plate Sigma-Aldrich-Corning CLS3590-100EA
microcapillary pipets Kimble Glass Inc.
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2  Bio-Rad #500-0202
Spectrophotometer Biotek Synergy HT 
Mass Selective Detector  Agilent 5973N
HLB cartridge
gas chromatograph  Agilent 6930
 gas chromatography column  A J&W Scientific  DB-1701
d4-alanine  Sigma-Aldrich 488917
d23-lauric acid Sigma-Aldrich 451401
13C6-glucose Sigma-Aldrich 389374
Pyridine  Sigma-Aldrich 270970
N,O-Bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide +  
Trimethylchlorosilane (BSTFA + TMCS) Sigma-Aldrich 33148
Perfluorotributylamine (PFTBA) Sigma-Aldrich 442747-U
d39-arachidiac acid Cambridge Isotope 

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References

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