Сравнительный анализ рекомбинантного белка слова в разных биофабрик: бактерии, клетках насекомых и растительных систем

* These authors contributed equally
Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. J. Vis. Exp. (97), e52459, doi:10.3791/52459 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Системы на основе растений, которые считаются важной платформой для получения рекомбинантных белков в результате их хорошо документированный потенциала для производства гибкой и недорогой качественной, биологически активных продуктов.

В этом исследовании мы сравнили экспрессию целевого рекомбинантного белка в традиционных ферментере на основе клеточных культур (бактериальных и насекомых) с системами экспрессии на основе растений, как переходных и стабильных.

Для каждой платформы мы описали создание, оптимизацию и длительность процесса производства, качество конечного продукта и урожайности и мы оценили предварительные производственные затраты, определенные для рекомбинантного белка выбранной цели.

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что бактерии являются непригодными для производства белка-мишени из-за его накопление в нерастворимых телец включения. С другой стороны, системы на основе растительных универсальные платформы тшлем позволяют производить выбранного белка при более низких затратах, чем-бакуловируса / системы клеток насекомых. В частности, стабильные линии трансгенных отображается самый высокий-выход конечного продукта и переходные выражающие растения быстро процесс развития. Однако, не все рекомбинантные белки могут извлечь выгоду из растительных систем на основе, но лучшая продукция платформа должна быть определена эмпирически случая к случаю подход, как описано здесь.

Protocol

1. Конструирование векторов экспрессии,

  1. Коммерческая система рекомбинации клонирование:
    1. Амплификации последовательности полной длины гена-мишени (hGAD65mut) с соответствующими праймерами позволяет добавление CACC зажима на 5'-конце гена, как описано выше 2.
    2. Клон гель-очистке продукта амплификации, в зависимости от направления характеристики набора для клонирования в векторе ввода (топоизомеразы связан), собирая реакцию в общем объеме 6 мкл, с использованием 1,5 в: 1 мольное отношение вставки: вектор и 1 мкл солевой раствор (0,2 М NaCl и 0,01 MgCl 2). Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре (RT).
    3. Преобразование всей реакции в химически компетентную E. палочки клетки в соответствии с характеристиками направленности Cloning Kit и экраном, полученных колоний ПЦР колоний 3, с использованием M13 прямого и обратного праймеров, включенных в набор направленного клонировани. Изолировать плазмиды из роsitive колония в соответствии с плазмиды препарата ДНК спецификации комплекта и последовательность вставки диска с помощью M13 прямого и обратного праймеров, чтобы гарантировать отсутствие мутаций 3.
    4. С помощью полученного клона входа проводить реакцию рекомбинации с помощью лямбда рекомбиназу Clonase II фермента (LR) с конкретными векторами назначения: для экспрессии рекомбинантного белка в бактериальных клетках с получением pDEST17 (pDEST17.G65mut), в растениях (временной или стабильной) с pK7WG2 (уступая pK7WG2.G65mut), в Baculovirus / системы клеток насекомых с линеаризованной вирусной ДНК (уступая Baculo.G65mut) 4. Сборка реакции, в соответствии с техническими Clonase комплект, со 100 нг векторной записи, 150 нг вектора назначения и 2 мкл ферментной смеси в конечном объеме 10 мкл. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 1 часа.
    5. Преобразование рекомбинации продукт в химически компетентную E. палочки клетки в соответствии с Clonase спецификации комплекта. Экран полученные колонии с помощью ПЦР 3
    6. Изолировать плазмидной ДНК с использованием набора коммерческой minipreparation ДНК и подтвердить наличие последовательности-мишени с помощью ПЦР 3, с использованием тех же конкретных комбинаций праймеров, описанных в предыдущем шаге.
    7. С помощью полученных ПЦР-позитивные плазмиды для трансформации различных целевых организмов, в зависимости от платформы, выбранной для экспрессии рекомбинантного белка, как описано в следующих шагах.
  2. Система MagnICON 5-7:
    1. Клонирование гена-мишени в 3'-модуля pICH31070, как ранее описано подробно 7, с получением pICH31070.G65mut. ИспользуйтеСледующие конкретные реакционного цикла: 30 мин инкубации при 37 ° С, 5 мин при 50 ° С, а затем 5 мин при 80 ° С.

2. рекомбинантный белок экспрессия

  1. Бактериальный клеточная система:
    1. Преобразование pDEST17.G65mut в E. палочка BL21 (DE3) Электрокомпетентные клетки с использованием стандартных методов и экран колоний, выращенных на ампициллин-содержащие (100 мкг / мл) LB-среды, от ПЦР колоний с использованием следующих трансгенных-специфических праймеров: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'и 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', при температуре отжига 58 & deg; С и ​​времени элонгации 20 сек. Проведение реакции ПЦР в общем объеме 20 мкл после растворения бактериальных клеток с пластмассовым наконечником в трубке.
    2. Посев одну колонию в течение ночи при 37 ° С в 3 мл ампициллина, содержащего (100 мкг / мл) LB-среде.
    3. Развести бактериальной культуры 1: 100 в 100 мл свежего LB среды (в том числе ampicillв) и не инкубировать при 37 ° С в течение 1-6 ч до конечной OD 600 0,8.
    4. Индуцируют экспрессию рекомбинантного белка путем добавлени isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) в конечной концентрации 1 мМ и инкубируют культуры при интенсивном встр хивании в течение 3 ч при 37 ° С.
    5. Собирают клетки центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин и использовать бактериальный осадок для экстракции белка (шаг 3.1.1.1).
  2. Baculovirus система / клетка насекомого:
    1. Семенной Spodoptera frugiperda (Sf9) клеток в 6-луночных планшетах (8 х 10 5 клеток на лунку) и дважды промывали 2 мл, не дополненной Грейс насекомых среды.
    2. Снять и заменить среднего по каплям трансфекции смеси (5 мкл LR рекомбинантного реакции, 6 мкл раствора Celfectin и 200 мкл без дополненной Грейс насекомых среды).
    3. Планшеты инкубируют при 27 ° С в течение 5 часов.
    4. Снять и заменить трансфекции смесь с 2 мл свежей SF-900 средних, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг / мл гентамицина и 100 мкМ ганцикловир, чтобы выбрать рекомбинантных клонов бакуловирус.
    5. После инкубации в течение 96 ч при 27 ° С, собирать среды (V1 вирусный штамм), центрифуги в 4000 мкг, для удаления клеток и крупного мусора и в магазине в темноте при 4 ° С.
    6. Семена 1 × 10 6 Sf9 клеток на лунку в 2,5 мл Sf-900, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг / мл гентамицина и 100 мкМ ганцикловир и заражают 100 мкл V1 наличии в каждую лунку.
    7. Инкубируйте клетки в течение 3 дней при 27 ° С.
    8. Сбор и центрифуги среда в 4000g в.
    9. Храните супернатант (V2 с высоким титром акций) при 4 ° С.
    10. Семена 1 × 10 6 Sf9 клеток на лунку в 2,5 мл Sf-900, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мкг / мл гентамицина и 100 мкМ ганцикловир и заражают 25 мкл V2 наличии в каждую лунку.
    11. Инкубируйте клетки в течение 3 дней при 27 ° С.
    12. Сбор клеток от центрифуге при 4000 мкг в и использовать осадок клеток насекомых для извлечения белка (шаг 3.1.2. 1).
  3. Nicotiana benthamiana временной экспрессии системы:
    1. Расти Н. benthamiana растения в теплице, при естественном свете в диапазоне температур 18-23 ° C. Для agroinfection использовать 4-5-недельных растений.
    2. Держите agroinfected растения в климатической камере при 22 ° С с 13 ч дня / 11 ч ночь светового дня.
    3. Коммерческая система рекомбинации клонирование:
      1. Представьте pK7WG2.G65mut в Agrobacterium tumefaciens штамма EHA105 Электрокомпетентные клетки, как описано выше, и экран 8 колоний, выращенных на LB среде, содержащей рифампицин (50 мкг / мл), стрептомицина (300 мкг / мл) и спектиномицином (100 мкг / мл) после того, как две дней инкубации при 28 ° С, ПЦР колоний 8 с использованием следующих трансгенных-специфических праймеров: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; и 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', при температуре отжига 58 & deg; С и ​​времени элонгации 50 сек. Проведение реакции ПЦР в общем объеме 20 мкл.
      2. Посев бактерий в 30 мл LB среды, содержащей рифампицин (50 мкг / мл), стрептомицина (300 мкг / мл) и спектиномицином (100 мкг / мл) в течение двух дней при 28 ° С.
      3. Сбор бактерий центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин и ресуспендируют осадок в 10 мл инфильтрации буфера (10 мМ MES, 10 мМ MgCl 2, 100 мкМ ацетосирингона, рН 5,6). Измерить значение OD 600, а затем отрегулировать его в 0,9 путем разбавления в том же буфере.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем необходим для проникновения в три N. benthamiana растения составляет 30 мл.
      4. Используйте 2,5 мл безыгольного шприца проникнуть в Agrobacterium суспензии в N. benthamiana уходит. Осторожно и медленно вводят листа панели с суспензией из шприца. Проникнуть три расширенный лкарнизы на заводе и использовать три растения, как трижды.
        Примечание: В целях охраны здоровья и безопасности надевайте защитные очки во время процесса инфильтрации.
      5. Сбор агроинфильтрации листья 2 дня после заражения (точек на дюйм) и замораживание в жидком азоте. Магазин тканей растений при -80 ° С.
    4. MagnICON система:
      1. Введем MagnICON векторы - 'модуль (pICH20111), 3' 5 модуль (pICH31070.G65mut), а модуль интегразу (pICH14011) - в А. tumefaciens GV3101 напряжение с помощью стандартных методик. Экран колоний, выращенных на LB среде, содержащей 50 мкг / мл рифампицина и соответствующего вектора конкретного антибиотика (50 мкг / мл карбенициллина для pICH20111 и pICH14011, 50 мкг / мл канамицина для pICH31070), ПЦР колоний с использованием специфических праймеров для каждого вектора.
      2. Привить отдельно три А. tumefaciens штаммы в 5 мл LB среды, содержащей 50 мкг / мл рифампицина и соответствующий вектор конкретным антибиотики встряхивали в течение ночи при 28 ° С.
      3. Гранул ночной бактериальной культуры центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин и ресуспендируют их в двух объемах исходного бактериальной культуры из 10 мМ MES (рН 5,5) и 10 мМ MgSO 4.
      4. Смешайте равные объемы бактериальной суспензии, содержащие три вектора и использовать для подвешивания смесь для шприца инфильтрации N. benthamiana уходит. Проникнуть три расширенные листья с растения.
      5. Сбор агроинфильтрации листья на 4 точек на дюйм и заморозить в жидком азоте.
      6. Магазин тканей растений при -80 ° С.
  4. Табак обыкновенный система стабильная экспрессия:
    1. Вырастить и сохранить ростки в пробирке N. аЬасит (вар Sr1.) на твердой питательной среде растений (4,4 г / л Мурасиге и Скуга - МС - средний в том числе витаминов, 30 г / л сахарозы, рН 5,8, 7 г / л агара) растений в контролируемых условиях в климатической камере при 25 ° С 16 ч / 8 ч день / Niнравом режим.
    2. Начать подготовительный культуры А. tumefaciens EHA105, несущие вектор экспрессии pK7WG2.G65mut в 5 мл жидкого YEB среде с соответствующими антибиотиками (рифампицин 50 мкг / мл, стрептомицин 300 мкг / мл, спектиномицин 100 мкг / мл) и расти в течение ночи при 28 ° С в орбитальном шейкере набора при 200 оборотах в минуту.
    3. Использование 1 мл предварительной культуры для инокуляции культуры 50 мл Agrobacterium в Yeb среде плюс антибиотики (рифампицин 50 мкг / мл, стрептомицин 300 мкг / мл, спектиномицин 100 мкг / мл) и расти в течение 24 ч, до тех пор, бактериальная культура не является насыщенный (OD 600 Значение 0,5-1,0).
    4. Сбор бактерий центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин и ресуспендируют осадок в 50 мл жидкой культуральной среды растений. Повторите этот шаг дважды, чтобы полностью удалить антибиотики.
    5. Взять первые здоровых Полностью укомплектованная листья с в пробирке растений табака и порежьте их на примерно 1 см квадраты.
    6. Передача кусочки листьевв глубоких чашках Петри, содержащие бактериальную суспензию и оставить в темноте в течение 20 мин.
    7. Удалить кусочков листьев с подвеской и промокнуть сухой стерильной фильтровальной бумаги.
    8. Поместите кусочков листьев с адаксиальной стороны (верхнюю поверхность листьев) на твердой растительной культуральной среде, содержащей 1,0 мкг / мл 6-бензоаминопурином (БАТ), в 0,1 мкг / мл нафталин уксусную кислоту (НАА), и инкубировать пластин в течение двух дней в климатической камере при контролируемой условия (25 ° С, 16 ч день / 8 ч ночь).
    9. Передача кусочки листьев на твердую культуральную среду (в том числе 1,0 мкг / мл BAP, 0,1 мкг / мл NAA, 500 мкг / мл цефотаксима, 100 мкг / мл канамицина) с абаксиальной поверхности (нижней поверхности листа) в контакте со средой.
    10. Планшеты инкубируют в течение 2-3 недель в климатической камере при 25 ° С с 16 ч / 8 ч день / ночь режим, чтобы вызвать образование отростков. Субкультура каждые 2 недели по передаче листовых эксплантов на свежий твердое культивировани растений среде, содержащей 1,0 мкг / мл BAP, 0,1 мкг / мл NAA, 500мкг / мл цефотаксима и 100 мкг / мл канамицина.
    11. При всходы появляются передавать их на Magenta коробки, содержащих твердую культуральную среду, включая 500 мкг / мл цефотаксима и 100 мкг / мл канамицина, чтобы вызвать образование корней. Выдержите ростки с 16 ч дня / 8 часов ночного светового дня при 25 ° С в течение 1-2 недель.
    12. Когда корни форма, передавать растения в почву в теплице.
    13. Сбор листьев кусок для каждого завода и изолировать геномной ДНК с коммерческого набора.
    14. Обнаружить присутствие трансгена по конкретной ПЦР. Использование 30 нг геномной ДНК в качестве матрицы для ПЦР-амплификации с использованием следующих трансгенных-специфических праймеров: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'и 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', при температуре отжига 58 & deg; С и ​​времени элонгации 20 сек , Проведение реакции ПЦР в общем объеме 50 мкл.
    15. Анализ 220 п.о. продукт с помощью электрофореза в 1% агарозном геле в трис-ацетатном-ЭДТА (ТАЕ) буфере (40 мМ Trэто, 20 мМ уксусной кислоты и 1 мМ ЭДТА).
    16. Выбор трансгенных растений, содержащих ген-мишень.
    17. Сбор кусок листа с каждой из выбранного трансгенного растения и заморозить в жидком азоте немедленно.
    18. Подготовка общего белка экстракты из растений листовой ткани (этап 3.1.3) и проверить каждый образец с помощью вестерн-блот анализа, как описано выше 2, чтобы выбрать лучший рекомбинантного белка, экспрессирующих растений табака.
    19. Сумка цветы выбранного самые эффективные растения перед цветением, чтобы предотвратить перекрестное опыление.
    20. После цветения, созревания плодов и семян сушки, собирать чемоданы.
    21. Отдельные семена от плевел и хранить их в сухом помещении при контролируемой температуре (20-24 ° C).
    22. Сейте Высушенные семена для получения поколение трансгенных растений второго и последующего выбора самых эффективных завод будет самоопыляемыми.
    23. Повторите ту же процедуру, описанную в шагах 2.4.19-2.4.21 для последующих поколений.

    3. Рекомбинантные Анализ экспрессии белка

    1. Всего экстракции белка:
      1. Бактериальные клетки:
        1. Ресуспендируют осадок клеток бактерий, собранных как описано в стадии 2.1.5, в два раза объема культуры в Трис-буферном солевом растворе (TBS - 2 мМ Трис / HCl, 500 мМ NaCl), pH 7,4 с добавлением 1 мМ PMSF (phenylmethanesulfonylfluoride).
        2. Ультразвук клеточный осадок ресуспендировали в три раза по 40 секунд при половинной мощности, сохраняя при этом образец на льду.
        3. Уточнить лизата центрифугированием при 14000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
        4. Передача супернатант в чистую пробирку и хранить как супернатант и осадок отдельно при -80 ° С.
        5. Солюбилизации тел включения, собранные в осадке, в половины объема сотовой лизата TBS рН 8,0 с добавлением 6 М мочевины путем энергичного встряхивания в течение ночи при комнатной температуре.
        6. Центрифуга при 10000 х г в течение 25 мин при комнатной температуре и собирают супернатант в чистомтруба.
        7. Хранить как супернатант и осадок при -80 ° С.
      2. Клетки насекомых:
        1. Промыть гранулу инфицированных клеток насекомых, собранных как описано в стадии 2.2.12, 1 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS - 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 1,8 мМ KH 2 PO 4 рН 7,4).
        2. Ресуспендируют клеток в 200 мкл буфера для лизиса (20 мМ Трис / HCl рН 8,0, 0,5 М NaCl, 3 мМ β-меркаптоэтанол и 1% Твин-20) и инкубировали на льду в течение 30 мин.
        3. Центрифуга клетки солюбилизировали при 14000 х г в течение 20 мин при 4 ° С.
        4. Собирают фракции растворимых и хранить при -80 ° С и отбросить гранул.
      3. Лист растительной ткани:
        1. Измельчить Н. benthamiana или N. аЬасит ткани в тонкий порошок в жидком азоте с использованием ступки и пестика.
        2. Однородный 100 мг наземной ткани в 300 мкл буфера для экстракции (40 мМ Hepes рН 7,9, 5 мМ ДТТ, 1,5% CHAPS), Supplemented с 3 мкл ингибитора протеазы коктейль и оттепель на льду.
          ПРИМЕЧАНИЕ: выбирается соотношение между весом тканей растений (г) в буфер объем (мл) 1: 3.
        3. Экстракт Центрифуга при 30000 х г в течение 30 мин при 4 ° С.
        4. Собирают супернатант в чистую пробирку и хранить при -80 ° С.
    2. Coomassie гель окрашивание:
      1. Подготовка соответствующего разбавления общих белковых экстрактов (например, 2 мкл растительного экстракта, 5 мкл бактериальных экстрактов и насекомых) в конечном объеме 10 мкл буфера для экстракции и добавить 5 мкл буфера для образцов 3x (1,5 М Трис / HCl, рН 6,8, 3% SDS, 15% глицерина, 4% β-меркаптоэтанола) до конечной концентрации 1х.
      2. Образцы кипятить в течение 10 мин.
      3. Отдельные белки на 10% SDS-PAGE.
      4. После электрофореза гель тепла в присутствии Кумасси раствора А (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% изопропанола, 10% уксусная кислота) в микроволновой печи в течение примерно двух минутс до температуры кипения.
      5. Охладить гель комнатной температуре и осторожном встряхивании.
      6. Отменить Coomassie окрашивание раствора А.
      7. Destain гель при нагревании в присутствии Кумасси раствора В (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% изопропанол), С (0,002% Brilliant Blue R-250, 10% уксусная кислота) и D (10% уксусной кислоты) каждый раз следуя той же протокол для окрашивания.
      8. После последнего стадии нагревания раствора Г, оставьте гель Обесцвечивание до фон прозрачный 9.
    3. Вестерн-блот-анализ:
      1. После электрофореза выделенные белки переноса на нитроцеллюлозную мембрану с использованием стандартных методов и блок с 4% молока в PBS, рН 7,4 при комнатной температуре в течение 1 часа.
      2. Инкубируйте блот в течение ночи при 4 ° С или в течение 4 ч при комнатной температуре в блокирующем растворе, содержащем первичное антитело кролика, поднятые против белка-мишени в 1: 10000 и с добавлением 0,1% Твин-20.
      3. После этикетке первичных антителING, мыть мембраны 3 раза по 5 мин в каждом блокирующим раствором, содержащим 0,1% Твин-20.
      4. Инкубируйте с пероксидазой хрена (HRP) -сопряженных анти-кроличьими антителами в 1: 10000 в течение 1,5 ч.
      5. Промыть мембраны в 5 раз по 5 мин каждый с PBS-T (PBS с добавлением 0,1% Твин-20).
      6. Процесс вестерн-блот с использованием хемилюминесцентного субстрата пероксидазы.
    4. Radioimmuno анализ (РИА):
      1. Разрешить реагенты (антисыворотка, Tracer и белка сефароза), чтобы достичь комнатной температуры и пипетки 20 мкл белка образцов экстракта и стандартов в различных концентрациях (от 300-2,400 нг / мл рекомбинантного коммерческой hGAD65) в 12 х 75 мм полистирольные пробирки.
      2. Добавить 20 мкл антисыворотки, подготовленный разбавления 1:30 сыворотки от плазмафереза ​​о T1D пациента.
      3. Добавить 50 мкл метки (125-я-GAD65) и инкубируют в течение 2 ч при комнатной температуре. Установите трубку с трассирующими только оценить общую активность.
      4. Добавить 50 мклбелка A Sepharose и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре.
      5. Не включать 1 мл холодного PBS буфера в каждую пробирку и центрифугируют при 1500 х г при 4 ° С в течение 30 мин.
      6. Слейте трубы для удаления надосадочной жидкости и поглощать остаточную жидкость на промокательную бумагу, осторожно нажав трубку.
      7. Мера иммунопреципитировали радиоактивность во всех трубок путем подсчета в течение 1 мин в гамма-счетчике.
      8. Земельный участок в логарифмической шкале обязательные ставки (B / T%) калибраторов, связанных с общей активностью, чтобы установить стандартную кривую, и читать концентрации ГТР образцов с калибровочной кривой 10.
        ПРИМЕЧАНИЕ: закрытых районов должны быть разработаны для хранения, обработки и утилизации радиоактивных материалов.

Representative Results

Опытно-конструкторских для гетерологичной экспрессии рекомбинантного белка-мишени в различных производственных систем описана здесь. Первый фокус был настройка различных платформ путем создания оптимальных условий для экспрессии целевого белка в каждой системе.

Выражение белка-мишени, hGAD65mut, индуцировали в трех экземплярах Е. палочки культуры. После 3 ч экспрессии при 37 ° С, бактериальные клетки собирали центрифугированием и лизировали с помощью ультразвука. После стадии центрифугирования, растворимые белки были отделены от нерастворимых телец включения и начальные анализы показали, что hGAD65mut накапливается преимущественно в нерастворимых телец включения (данные не показаны). Рекомбинантный растворение белка требует использования мочевины 6 м, что, по его сильных свойств денатурации, препятствует анализа RIA, делая невозможным надлежащее количественное hGAD65mut. Некоторые стратегии будетан сообщалось ограничивая образование телец включения, включающий выращивание клеток микроорганизмов при низкой температуре 11. Культуры выращивали при 15 ° С и 20 ° С, и экспрессия рекомбинантного белка индуцировали при тех же температурах. Как показано на фиг.1А, солюбилизации hGAD65mut производится при обеих температурах, снова требуется мочевина (полосы S2). Таким образом, низкие температуры в этом эксперименте не мешают hGAD65mut от образования нерастворимых агрегатов.

Было высказано Бакуловирусные векторы, содержащие последовательность hGAD65mut (Baculo.G65mut) в прикрепленных клеточных культур Sf9. V1 и V2 акции с высоким титром были подготовлены и наиболее эффективные условия инфекция были созданы оценке различных вирусных объемы запасов от 5-50 мкл. Как показано на фиг.1В, оптимальный объем вирусного сток был идентифицирован как 25 мкл, получая 11,8 ± 0,8 мкг рекомбинантного белка на мл культуральной среды, как оценивали с помощью RIAАнализ (Таблица 1).

После инфильтрации, анализ временной ход agroinfected N. benthamiana листья проводили в двух переходных систем экспрессии. Для системы на основе pK7WG2, образцы листьев были объединены в день в диапазоне 1-5 точек на дюйм, всего растворимые белки (TSP) были извлечены и равные количества TSP анализировали с помощью вестерн-блоттинга (фиг 1С). Этот анализ выделенный что максимальное накопление целевого рекомбинантного белка достигается 2 точек на дюйм. Таким образом, листья собирали 2 точек на дюйм и белковые экстракты анализируют с помощью RIA для измерения рекомбинантный накопление белка, который показывает в среднем 67,8 мкг / г ФНЧ (сырого веса листьев, таблица 1). Рекомбинантные уровни экспрессии белка, используя эту систему, может быть улучшена, путем совместного проникновения листья с подавитель посттранскрипционных сайленсинга (PTGS) как P19 или НС Pro 12.

же определение времени курс был проведен с N. benthamiana листья agroinfected с MagnICON векторов: инфицированные листья были собраны 1-8 точек на дюйм и равные количества TSP были проанализированы с помощью вестерн-блоттинга. Этот анализ показал, что максимальное накопление рекомбинантный белок, полученный 4 точек на дюйм (рис 1D), со средним накопления рекомбинантного белка 78,8 мкг / г ФНЧ (таблица 1), как оценивают с помощью РИА.

Выражение hGAD65mut в трансгенных растениях табака уже сообщалось ранее 12, показывают, что уровни белка рекомбинантные варьировать в значительной среди независимо трансформированных линий. Наиболее эффективные hGAD65mut T1 трансгенного растения была самостоятельной перешли и производные растения (T2) были проанализированы, чтобы снова выбрать лучший выполнив одно. Эту процедуру повторяли в течение нескольких поколений, чтобы разработать гомогенный производства платформу, проверяя производительность в каждом поколении РИА до прекращенияДальнейшее усовершенствование было достигнуто (данные не показаны). В фиг.1Е, представитель вестерн-блот Т5 трансгенных растений сообщается, где однородность рекомбинантных доходности белка очевидна. Как показано на фиг 1F, средний выход hGAD65mut увеличилась с T2 до Т6, достигнув уровня 99,1 мкг / г ФНЧ (таблица 1) и, в процессе отбора, стандартное отклонение уровня экспрессии снизилась.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Платформа настройки Настройка лучших условий для hGAD65mut выражения в каждой платформы. (А) Е. палочка индуцируемой экспрессии платформа. Бактериальные клетки выращивали при 15 ° С или 20 ° С. Верхняя панель, Вестерн-блоттинга hGAD65mut в клеточных экстрактах (2 мкг на полосу TSP). Нижняя панель, загрузка контроль окрашивали кумасси. N.c. = Отрицательный контроль, бактериальные клетки, трансформированные вектором pDEST17, содержащей ген хлорамфеникол-сопротивления; Т: Всего образцы; S1: Супернатант после обработки ультразвуком и центрифугирование; S2 и Р: супернатант (1) и осадок (2) после центрифугирования образца солюбилизированного в мочевины, содержащий буфер. (В) бакуловирусом / платформа клеток насекомых. Следующие вирусные объемы были испытаны в наличии: 5, 25 и 50 мкл Верхний панель, Вестерн-блоттинга hGAD65mut в клеточных экстрактах (5 мкг на дорожку TSP) нижней панели, загружаются контроль окрашивали кумасси... NC = отрицательный контроль, экстракт нетрансформированными клеток насекомых. (C) Кратковременная экспрессия в N. benthamiana предприятия, использующие вектор pK7WG2. Образцы были собраны в день, 1-5 точек на дюйм (полосы 1-5). Верхняя панель, Вестерн-блоттинга hGAD65mut в экстракты листьев (2,5 мкг TSP на полосу). Нижняя панель, загрузка контроль окрашивали кумасси, где большой субъединицыиз Rubisco очевидна. NC = отрицательный контроль, растения проникли с вектором pK7WG2 несущей ген GFP в качестве маркера. (D) Кратковременная экспрессия в N. benthamiana предприятия, использующие MagnICON векторов. Образцы собирали в день, 1-8 точек на дюйм (полосы 1-8). Верхняя панель, Вестерн-блоттинга hGAD65mut в листовых экстрактов (5 мкг на дорожку TSP). Нижней панели, загружаются контроль окрашивали кумасси где большая субъединица Rubisco видно , NC = отрицательный контроль, растения проникли только с pICH20111 5'-модулем и pICH14011 интегразы-модуля. Цифры показывают, молекулярная масса маркер в кДа. PC = положительный контроль, 15 нг коммерческих hGAD65, произведенных в Baculovirus / системы клеток насекомых. (E) Стабильный выражение в N. Tabacum растения. Пробы листьев были собраны из различных растений T5 (дорожки 1-11). Верхняя панель, вестерн-блот из hGAD65mut в экстракты листьев (5 мкг TSP на полосу). Нижняя панель, контроль загрузки окрашенных WIth Coomassie. NC = отрицательный контроль, растений дикого типа. Цифры показывают, молекулярная масса маркер в кДа. PC = положительный контроль, 15 нг коммерческих hGAD65, произведенных в Baculovirus / системы клеток насекомых. (F) Стабильный выражение в N. Tabacum растения. Boxplot представление накопления hGAD65mut в течение нескольких поколений, полученных из наиболее эффективные hGAD65mut T1 трансгенных растений табака сообщили в мкг / г ФНЧ, рассчитанная по данным РИА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Система [HGAD65mut] (мкг / мл) [HGAD65mut]
Baculo / насекомых 117,5 ± 7,7 11,8 ± 0,8 мкг / мл культуральной среды
TransienT 22,6 ± 0,9 67,8 ± 2,7 мкг / г ВПТ
MagnICON 26,3 ± 5,9 78,8 ± 17,8 мкг / г ВПТ
Elite T6 33,0 ± 3,8 99,1 ± 11,3 мкг / г ВПТ

Таблица 1: hGAD65mut дает урожаи hGAD65mut в различных платформ - ферментере на основе (Baculo / насекомых) и растений на основе (pK7WG2- и MagnICON в Н. benthamiana и элита T6 в Н. аЬасит). Второй столбец - концентрация hGAD65mut в белковых экстрактах (мкг / мл). Третья колонка - содержание hGAD65mut в сырой массе листьев (мкг / г FLW) для платформ на растительной основе, так и в среде для культивирования клеток (мкг / мл) в течение ферментера-платформе.

Discussion

В этом исследовании сравнивали три различные платформы для экспрессии рекомбинантного человеческого белка: бактериальных клеток бакуловируса / клеток насекомых и растений. Платформа на растительной основе было продолжено за счет использования трех широко используемых технологий экспрессии (т.е., преходящей - MagnICON и pK7WG2 основе - и стабильные). Целевой белок выбран для этого эксперимента, hGAD65mut, ранее выражено в различных системах 13, и его производство и функциональность можно было легко обнаружить и измеримыми 14.

Бактериальные клетки не были эффективными производственной площадкой, потому что hGAD65mut формируется телец включения, даже при низких температурах условий выращивания, таким образом, требует кропотливой растворения и повторной укладки для достижения своей нативной конформации. Действительно, основной провал этой платформы для выражения сложных рекомбинантных белков является правильным конформация конечного продукта.

Бакуловирусом платформой / клетка насекомого опосредованного высокую экспрессию иммунореактивного рекомбинантного белка, но главным ограничением этого системы экспрессии является высокая стоимость культуральной среде, должны расти клетки насекомых. Было подсчитано, что общие затраты производства на 1 г hGAD65mut может достичь 700 евро в этом производстве платформы (с учетом 9 л насекомых среды для культивирования клеток требуется). Еще одно ограничение этого выражения платформы необходимость стерильного культивирования клеток насекомых, которая требует персонала с асептических навыков манипуляции. Для обеспечения эффективного рекомбинантного накоплению белка в два критических параметра необходимо тщательно контролировать в этой системе выражение: вирусные объемы древесины, используемой для заражения клеток и сроки вирусной инфекции. Кроме того, моющее средство, используется для извлечения общей растворимого белка из клеток насекомых Sf9, резко влияет рекомбинантный солюбилизации белка.

Системы на основе растений, были наиболее полезными platfoRM, чтобы выразить hGAD65mut: рекомбинантный белок растительного сделано было иммунореактивный и накапливается на высоком уровне в тканях листа. Сравнение различных систем экспрессии растительной основе, самые высокие урожаи были достигнуты в стабильных трансформированных растений табака (таблица 1) и, если с учетом общей биомассы табака по сравнению с N. benthamiana, используемый для временной экспрессии, в целом более высокую производительность табака очевидна. Тем не менее, основным ограничением стабильного превращается табака платформы на растительной основе является время, необходимое для настройки системы, которая в нашем исследовании приняли 20 месяцев. В самом деле, гомозиготные линии должны быть выбраны для экспрессии рекомбинантного белка однородности и это может потребовать повторяется самостоятельной поперечного циклов, начиная с самой высокой T1, экспрессирующих линий. В частности, при выборе T1 имеет больше, чем одну копию трансгенных признака, программа разведения может занять до 3 лет.

Переходные системы экспрессии предложилПреимущество быстрого увеличения масштабов из-за короткого интервала между трансформации и выражения и настройки платформы выражения требуется 4 дней. Тем не менее, ограничение на растительной основе переходных систем является то, что автоматизация вряд ли реализуемо на лабораторном масштабе, если не используется, посвященный высокого класса оборудование для агропромышленного инфильтрации. Таким образом, собственно расчет для крупномасштабного производства hGAD65 с использованием систем переходных основе не может быть выполнена здесь. С другой стороны, мы полагаем, что общие затраты производства на 1 г рекомбинантного белка с использованием T6 стабильную линию табака может быть рассчитана на уровне менее 5 евро (с учетом почву для выращивания растений табака 60). Для обеспечения эффективного агроинфильтрации и биосинтеза белка несколько критических параметров должны быть тщательно контролируемого (завод стадию развития, роста и инфильтрация состояние Agrobacterium), как сообщалось ранее 15. Кроме того, для каждого выражения экспериментировать конкретный анализ времени курс должен бытьвыполняется для выбора точек на дюйм, что позволяет наибольшее накопление рекомбинантного белка.

Пример, который обсуждался здесь можно считать доказательством правильности принципа социологическое исследование, что выдвигает на первый план некоторые из конкретных преимуществ производства растительной основе по сравнению с традиционными системами. В частности, табачные трансгенных линий однородно, экспрессирующие рекомбинантный белок можно считать ценным платформа для массового производства рекомбинантных белков, которые необходимы в больших количествах-.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract Sigma Y1333
Tryptone Formedium TRP03
Agar Bacteriological Grade Applichem A0949
Sf-900 II SFM medium Gibco 10902-088
Grace’s Insect Medium, unsupplemented Gibco 11595-030
Cellfectin II Reagent Invitrogen 10362-100
MS medium including vitamins Duchefa Biochemie M0222
Sucrose Duchefa Biochemie S0809
Plant agar Duchefa Biochemie P1001
Ampicillin sodium Duchefa Biochemie A0104 Toxic
Gentamycin sulphate Duchefa Biochemie G0124 Toxic
Ganciclovir Invitrogen I2562-023
Carbenicillin disodium Duchefa Biochemie C0109 Toxic
Kanamycin sulfate Sigma K4000 Toxic
Rifampicin Duchefa Biochemie R0146 Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO
Streptomycin sulfate Duchefa Biochemie S0148 Toxic
Spectinomycin dihydrochloride Duchefa Biochemie S0188
IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside) Sigma I5502 Toxic
MES hydrate Sigma M8250
MgCl2 Biochemical 436994U
Acetosyringone Sigma D134406 Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Syringe (1 ml) Terumo
MgSO4 Fluka 63136
BAP (6-Benzylaminopurine) Sigma B3408 Toxic
NAA (Naphtalene acetic acid) Duchefa Biochemie N0903 Irritant
Cefotaxime Mylan Generics
Trizma base Sigma T1503 Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer
HCl Sigma H1758 Corrosive
NaCl Sigma S3014 1 M stock
KCl Sigma P9541
Na2HPO4 Sigma S7907
KH2PO4 Sigma P9791
PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride) Sigma P7626 Corrosive, toxic
Urea Sigma U5378
β-mercaptoethanol Sigma M3148 Toxic
Tween-20 Sigma P5927
Hepes Sigma H3375
DTT (Dithiothreitol) Sigma D0632 Toxic – 1 M stock, store at -20 °C
CHAPS Duchefa Biochemie C1374 Toxic
Plant protease inhibitor cocktail Sigma P9599 Do not freeze/thaw too many times
SDS (Sodium dodecyl sulphate) Sigma L3771 Flammable, toxic, corrosive – 10% stock
Glycerol Sigma G5516
Brilliant Blue R-250 Sigma B7920
Isopropanol Sigma 24137 Flammable
Acetic acid Sigma 27221 Corrosive
Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67 Sigma G5163 Do not freeze/thaw too many times
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody Sigma A6154 Do not freeze/thaw too many times
Sf9 Cells Life Technologies 11496
BL21 Competent E. coli New England Biolabs C2530H
Protein A Sepharose Sigma P2545
Cell culture plates Sigma CLS3516
Radio Immuno Assay kit Techno Genetics 12650805 Radioactive material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488, (3), 185-189 (2001).
  2. Avesani, L., et al. Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant. Plant Biotechnol. J. 9, (8), 862-872 (2010).
  3. Sambrook, J., et al. Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
  4. Avesani, L., et al. Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen. Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).
  5. Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101, (18), 6852-6857 (2004).
  6. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants). Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).
  7. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3, (11), (2008).
  8. Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system. Plant Methods. 4, (4), 1-7 (2008).
  9. Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10, (13), 2606-2617 (1971).
  10. Falorni, A., et al. Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes. Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).
  11. Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expr. Purif. 40, (1), 1-22 (2005).
  12. Arzola, L., et al. Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein. Int. J. Mol. Sci. 12, (8), 4975-4990 (2011).
  13. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective. Biomed. Res. Int. 2014, 136419 (2014).
  14. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Res. 12, (2), 203-212 (2003).
  15. Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins. J Vis Exp. (77), (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics