ניתוח השוואתי של ביטוי חלבון רקומביננטי בBiofactories שונה: חיידקים, תאי חרקים וצמחי מערכות

* These authors contributed equally
Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. J. Vis. Exp. (97), e52459, doi:10.3791/52459 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מערכות המבוסס על צמח נחשבות פלטפורמה חשובה לייצור חלבונים רקומביננטיים כתוצאה מהפוטנציאל המתועד היטב שלהם לייצור בעלות נמוכה הגמישה, באיכות גבוהה, מוצרים ביו-אקטיביים.

במחקר זה, השווינו את הביטוי של חלבון רקומביננטי אנושי יעד בתרבויות מסורתיות מבוסס פרמנטור תא (חיידקים וחרקים) עם מערכות ביטוי על בסיס צמחי, שני חולפות ויציבים.

עבור כל פלטפורמה, שתארנו את הסט-אפ, הייעול ואורכו של תהליך הייצור, איכות המוצר הסופית ותשואות והערכנו את עלויות ייצור זמניות, ספציפיות לחלבון רקומביננטי היעד שנבחר.

בסך הכל, התוצאות שלנו מצביעות על כך שחיידקים אינם מתאימים לייצור של חלבון המטרה בשל ההצטברות שלה בתוך גוף הכללה מסיס. מצד השני, מערכות המבוסס על צמח הם לא פלטפורמות רב-תכליתיותכובע מאפשר הייצור של החלבון שנבחר בעלויות נמוכות יותר מאשר baculovirus / מערכת תא חרק. בפרט, קווים מהונדסים יציבים מוצג הגבוהה ביותר התשואה של המוצר הסופי וצמחים להביע חולפים פיתוח התהליך המהיר ביותר. עם זאת, לא כל החלבונים רקומביננטי עשויים להפיק תועלת ממערכות המבוסס על צמח אבל פלטפורמת ההפקה הטובה ביותר צריכה להיקבע באופן אמפירי עם גישת מקרה ומקרה, כפי שמתוארת כאן.

Protocol

1. בנייה של וקטורי ביטוי

  1. מערכת שיבוט רקומבינציה מסחרית:
    1. להגביר את הרצף באורך המלא של גן המטרה (hGAD65mut) עם פריימרים מתאימים המאפשרים תוספת של מהדק CACC ב5'-end של הגן כפי שתואר קודם לכן 2.
    2. לשכפל את מוצר ההגברה מטוהר ג'ל, בהתאם למפרטי ערכת שיבוט כיוונית, בוקטור הכניסה (topoisomerase מחויב) על ידי הרכבת התגובה בהיקף כולל של 6 μl, באמצעות 1.5: הוספה טוחנת ליחס של 1: 1 ווקטור μl של תמיסת מלח (0.2 M NaCl ו0.01 MgCl 2). דגירה של 5 דקות בטמפרטורת חדר (RT).
    3. להפוך כל התגובה לE. כימי המוסמך תאי coli על פי מפרט כיוונית ערכת שיבוט ומושבות שהתקבלו על ידי מסך המושבה PCR 3, באמצעות M13 קדימה הפוך פריימרים כלולים בערכת השיבוט כיוונית. לבודד את הפלסמיד מpoמושבה sitive על פי מפרט פלסמיד דנ"א הכנת ערכה ורצף להוסיף באמצעות M13 קדימה ההפוך פריימרים על מנת להבטיח את היעדרן של מוטציות 3.
    4. השתמש בשיבוט הכניסה הושג לבצע את תגובת רקומבינציה ידי Lambda recombinase Clonase השני האנזים (LR) עם וקטורי יעד ספציפיים: לביטוי חלבון רקומביננטי בתאי חיידקים עם pDEST17 (מניב pDEST17.G65mut), בצמחים (זמניים או קבועים) עם pK7WG2 (מניב pK7WG2.G65mut), בbaculovirus / מערכת תא חרק עם DNA הנגיפי לינארית (מניב Baculo.G65mut) 4. להרכיב את התגובה, על פי מפרט ערכת clonase, עם כניסתו של וקטור 100 ng, 150 ננוגרם של וקטור יעד ו -2 μl של תערובת אנזים בנפח סופי של 10 μl. דגירה התמהיל ב RT עבור שעה 1.
    5. להפוך את המוצר לרקומבינציה E. כימי מוסמך תאי coli על פי מפרט ערכת clonase. מושבות שהושגו מסך על ידי PCR 3
    6. לבודד DNA פלסמיד באמצעות ערכת DNA minipreparation מסחרית ולאשר את קיומו של רצף היעד על ידי PCR 3, תוך שימוש באותה השילובים פריימר ספציפיים שתוארו בשלב הקודם.
    7. השתמש בפלסמידים PCR החיוביים שהושגו להפוך אורגניזמים יעד שונים, בהתאם לפלטפורמה שנבחרה לביטוי חלבון רקומביננטי כמתואר בשלבים הבאים.
  2. מערכת MagnICON 5-7:
    1. לשכפל את גן המטרה בpICH31070 3'-מודול, כפי שתואר לעיל בפירוט 7, מניב pICH31070.G65mut. השתמש בהבא מחזור תגובה ספציפי: 30 דקות דגירה על 37 מעלות צלזיוס, 5 דקות ב 50 מעלות צלזיוס ולאחר מכן 5 דקות על 80 מעלות צלזיוס.

2. ביטוי חלבון רקומביננטי

  1. מערכת תא חיידק:
    1. להפוך pDEST17.G65mut לE. coli BL21 (DE3) תאי electrocompetent תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית ומסך המושבות גדלו על המכיל אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מיליליטר) LB-בינוני, על ידי המושבה PCR באמצעות פריימרים transgene הספציפי הבא: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'ו 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ", עם טמפרטורת חישול של 58 מעלות צלזיוס וזמן התארכות של 20 שניות. לבצע את תגובת PCR בהיקף כולל של 20 μl לאחר המסת תאי חיידקים עם קצה פלסטיק בצינור.
    2. לחסן מושבה אחת הלילה בשעה 37 ° C ב 3 מיליליטר של (100 מיקרוגרם / מיליליטר) המכיל אמפיצילין LB-בינוני.
    3. לדלל את תרבות חיידקי 1: 100 ב 100 מיליליטר של מדיום LB הטרי (ampicill כוללב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-6 שעות עד OD סופי 600 של 0.8.
    4. לגרום לביטוי חלבון רקומביננטי על ידי תוספת של isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) בריכוז סופי של 1 מ"מ ודגירת תרבות עם נמרץ רעד במשך 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
    5. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 20 דקות ולהשתמש בגלולת חיידקים להפקת חלבון (שלב 3.1.1.1).
  2. מערכת / תא חרק baculovirus:
    1. זרע תאי frugiperda Spodoptera (SF9) ל6-גם צלחות (8 x 10 5 תאים לכל טוב) ולשטוף פעמיים עם 2 מיליליטר של אי-השלים החרקים בינוניים של גרייס.
    2. להסיר ולהחליף את מדיום ירידה מבחינת עם תערובת transfection (תגובת רקומביננטי LR 5 μl, פתרון Celfectin 6 μl ו -200 μl שאינה בתוספת החרקים בינוני של גרייס).
    3. דגירה צלחות על 27 מעלות צלזיוס למשך 5 שעות.
    4. להסיר ולהחליף תערובת transfection עם 2 מיליליטר של SF-9 הטרי00 בינוניים, בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 10 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin ו -100 מיקרומטר Ganciclovir כדי לבחור שיבוטים baculovirus רקומביננטי.
    5. לאחר הדגירה של 96 שעות ב 27 ° C, לאסוף בינונית (מניית ויראלי V1), צנטריפוגות ב 4000 XG כדי להסיר תאים ופסולת גדולה וחנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס.
    6. זרעים 1 x 10 6 תאים לכל גם בSF9 2.5 מיליליטר SF-900 בינוני מכיל 10% בסרום שור עוברי, 10 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin ו -100 מיקרומטר Ganciclovir ולהדביק עם מלאי V1 100 μl היטב בכל.
    7. דגירה תאים במשך 3 ימים ב 27 מעלות צלזיוס.
    8. לאסוף ובינוני צנטריפוגות ב 4000 x גרם.
    9. אחסן את supernatant (המניות גבוהה כייל V2) בשעה 4 ° C.
    10. זרעים 1 x 10 6 תאים לכל גם בSF9 2.5 מיליליטר SF-900 בינוני מכיל 10% בסרום שור עוברי, 10 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin ו -100 מיקרומטר Ganciclovir ולהדביק עם 25 μl של מניית V2 בכל היטב.
    11. דגירה תאים במשך 3 ימים ב 27 מעלות צלזיוס.
    12. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 4000 XG ולהשתמש תא גלולה חרקים להפקת חלבון (שלב 3.1.2. 1).
  3. מערכות ביטוי חולף Nicotiana benthamiana:
    1. לגדול נ ' צמחי benthamiana בחממה, תחת אור הטבעי בתוך C ° טווח טמפרטורות 18-23. לagroinfection להשתמש בצמחים 4-5 בן שבוע.
    2. שמור צמחי agroinfected בתא אקלים על 22 מעלות צלזיוס עם / 11 יום photoperiod לילה hr 13 שעות.
    3. מערכת שיבוט רקומבינציה מסחרית:
      1. להציג pK7WG2.G65mut בAgrobacterium tumefaciens מתח EHA105 תאי electrocompetent כפי שתואר בעבר 8 ומסך המושבות, גדלו על ריפאמפיצין LB בינוני המכיל (50 מיקרוגרם / מיליליטר), סטרפטומיצין (300 מיקרוגרם / מיליליטר) וspectinomycin (100 מיקרוגרם / מיליליטר) לאחר 2 ימים של דגירה על 28 מעלות צלזיוס, במושבת PCR 8 באמצעות פריימרים transgene הספציפי הבאים: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; ו5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ", עם טמפרטורת חישול של 58 מעלות צלזיוס וזמן התארכות של 50 שניות. לבצע את תגובת PCR בהיקף כולל של 20 μl.
      2. לחסן חיידקים ב -30 מיליליטר של ריפאמפיצין LB ​​בינוני המכיל (50 מיקרוגרם / מיליליטר), סטרפטומיצין (300 מיקרוגרם / מיליליטר) וspectinomycin (100 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך יומיים על 28 מעלות צלזיוס.
      3. לאסוף חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 20 דקות גלולה וגלול ב 10 מיליליטר של חיץ חדירה (10 MES מ"מ, 10 מ"מ MgCl 2, 100 acetosyringone מיקרומטר, pH 5.6). מדוד את ערך OD 600 ולאחר מכן להתאים אותו ל -0.9 על ידי דילול באותו המאגר.
        הערה: הנפח הכולל דרוש לחדירת שלושה נ ' צמחי benthamiana הוא 30 מיליליטר.
      4. השתמש במזרק 2.5 מיליליטר ללא מחטים לחדור ההשעיה Agrobacterium בנ benthamiana משאיר. לאט ובזהירות להזריק לוחות עלה עם ההשעיה מהמזרק. לחדור שלושה l מורחבמרזבים לכל צמח ולהשתמש בשלושה צמחים כtriplicates.
        הערה: מטעמי בריאות ובטיחות משקפי מגן במהלך תהליך חדירה.
      5. לאסוף עלים 2 ימים לאחר פגיעת agroinfiltrated (dpi) והקפאה בחנקן נוזלי. רקמות צמח חנות ב -80 ° C.
    4. מערכת MagnICON:
      1. להציג וקטורי MagnICON - "מודול (pICH20111), 3 '5 מודול (pICH31070.G65mut), ואת מודול אינטגראז (pICH14011) - בא tumefaciens מתח GV3101 תוך שימוש בטכניקות סטנדרטית. מסך המושבות, גדלו על מדיום LB המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר ריפאמפיצין ואנטיביוטיקה מתאימה וקטור ספציפי (50 מיקרוגרם / מיליליטר carbenicillin לpICH20111 וpICH14011, 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin לpICH31070), על ידי המושבה PCR באמצעות פריימרים ספציפיים עבור כל וקטור.
      2. לחסן בנפרד א שלוש tumefaciens הזנים ב 5 מיליליטר של מדיום LB המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר ריפאמפיצין ואנטיביוטיקת וקטור ספציפי מתאימהולנער לילה בשעה 28 ° C.
      3. תרבויות גלולה לילה חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 20 דקות ו resuspend אותם בשני כרכים של תרבות חיידקים הראשונית של 10 מ"מ MES (pH 5.5) ו -10 מ"מ 4 MgSO.
      4. לערבב כמויות שווה של השעיות חיידקים המכילות את שלושת וקטורים ולהשתמש בתערובת ההשעיה לחדירת מזרק של נ ' benthamiana משאיר. לחדור שלושה עלים מורחבים לכל צמח.
      5. לאסוף עלים agroinfiltrated ב 4 dpi ולהקפיא בחנקן נוזלי.
      6. רקמות צמח חנות ב -80 ° C.
  4. מערכת ביטוי יציב טבק:
    1. לגדול ולשמור במבחנה שתילים של נ ' tabacum (var SR1.) על מדיום תרבות צמח מוצק (4.4 g / L Murashige וSkoog - MS - בינוני כולל ויטמינים, 30 גר '/ סוכרוז L, pH 5.8, 7 גרם / אגר מפעל L) בתנאים מבוקרים בתא האקלים ב 25 מעלות צלזיוס עם 16 שעות יום / 8 שעות / נימשטר להילחם.
    2. התחל מראש תרבות של א ' tumefaciens EHA105 מחסה pK7WG2.G65mut וקטור הביטוי ב 5 מיליליטר של מדיום ייב נוזלי עם אנטיביוטיקה מתאימה (ריפאמפיצין 50 מיקרוגרם / מיליליטר, סטרפטומיצין 300 מיקרוגרם / מיליליטר, spectinomycin 100 מיקרוגרם / מיליליטר) ולגדול לילה בשעה 28 ° C בסט שייקר מסלולית ב 200 סל"ד.
    3. השתמש 1 מיליליטר של טרום-התרבות לחסן תרבות 50 מיליליטר Agrobacterium במדיום ייב בתוספת אנטיביוטיקה (ריפאמפיצין 50 מיקרוגרם / מיליליטר, סטרפטומיצין 300 מיקרוגרם / מיליליטר, spectinomycin 100 מיקרוגרם / מיליליטר) ולגדול למשך 24 שעות, עד שתרבות החיידקים היא הרווי (OD 600 ערך של 0.5-1.0).
    4. לאסוף חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 20 דקות גלולה וגלול ב 50 מיליליטר של מדיום תרבות צמח נוזלי. חזור על פעולה זו פעמיים כדי להסיר לחלוטין אנטיביוטיקה.
    5. קח עלים הרחיבו באופן מלא בריאים הראשונים במבחנת צמחי טבק ולחתוך אותם לריבועים כ 1 סנטימטר.
    6. חתיכות העברת עלהלצלחות פטרי עמוקות המכיל השעיה חיידקים ולהשאיר בחושך במשך 20 דקות.
    7. הסר פיסות עלים מהשעיה ולמחוק יבש על נייר סינון סטרילי.
    8. להניח את חלקי דף עם צד adaxial (פני עלה עליון) על מדיום תרבות צמח מוצק המכילים 1.0 מיקרוגרם / מיליליטר 6-benzylaminopurine (BAP) ו -0.1 מיקרוגרם / מיליליטר חומצה אצטית נפטלין (NAA) ודגירת צלחות במשך יומיים בתא אקלים מבוקר ב תנאים (25 ° C, / 8 שעות בלילה יום 16 שעות).
    9. חתיכות העברת עלה על מדיום תרבות המוצק (לרבות 1.0 מיקרוגרם / מיליליטר BAP, 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר NAA, 500 מיקרוגרם / מיליליטר cefotaxime, 100 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin) עם משטח abaxial (משטח תחתון של עלה) במגע עם מדיום.
    10. דגירה צלחות במשך 2-3 שבועות בתא האקלים של 25 מעלות צלזיוס עם משטר היום / לילה / 8 שעות 16 שעות כדי לגרום להיווצרות לירות. תת-תרבות כל 2 שבועות על ידי העברת explants עלה למדיום תרבות צמח המוצק טרי המכילה 1.0 מיקרוגרם / מיליליטר BAP, 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר NAA, 500מיקרוגרם / מיליליטר וcefotaxime 100 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin.
    11. כאשר יורה מופיע להעביר אותם לתיבות מגנטה המכילות מדיום תרבות מוצק כולל 500 מיקרוגרם / מיליליטר וcefotaxime 100 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin לגרום להיווצרות שורש. דגירה שתילים עם photoperiod לילה hr / 8 יום 16 שעות של 25 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות.
    12. כאשר צורת שורשים, להעביר את הצמחים לאדמה בחממה.
    13. לאסוף חתיכת עלה לכל מפעל ולבודד DNA הגנומי עם ערכה מסחרית.
    14. לזהות הנוכחות של transgene על ידי PCR הספציפי. השתמש 30 ng של DNA גנומי כתבנית להגברת PCR באמצעות פריימרים transgene הספציפי הבא: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'ו5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ", עם טמפרטורת חישול של 58 מעלות צלזיוס וזמן התארכות של 20 שניות . לבצע את תגובת PCR בהיקף כולל של 50 μl.
    15. נתח את מוצר 220 נ"ב על ידי אלקטרופורזה על 1% ג'ל agarose בטריס-אצטט EDTA חיץ (טה) (40 מ"מ Trהוא, חומצה אצטית 20 מ"מ, ו1 mM EDTA).
    16. בחר צמחים מהונדסים המכילים את גן המטרה.
    17. לאסוף חתיכת עלה מכל אחד מהצמחים מהונדסים שנבחרו ולהקפיא בחנקן נוזלי באופן מיידי.
    18. הכן תמציות חלבון הכוללת מרקמת עלה צמח (שלב 3.1.3) ולבדוק כל דגימה על ידי ניתוח כתם מערבי כפי שתואר לעיל 2 כדי לבחור את צמח הטבק להביע הטוב ביותר חלבון רקומביננטי.
    19. פרחי שקית של צמח הביצועים הטוב ביותר שנבחר לפני פורח כדי למנוע הפריה הדדית.
    20. לאחר הפריחה, הבשלת פרי וייבוש זרעים, לאסוף שקיות.
    21. זרעים נפרדים מן התבן ולאחסן אותם בחדר יבש בטמפרטורה מבוקרת (20-24 מעלות צלזיוס).
    22. לזרוע את הזרעים המיובשים לייצר צמחים מהונדסים דור השני ולאחר מכן לבחור את צמח הביצועים הטוב ביותר להיות האבקה עצמית.
    23. חזור על אותו התהליך מתואר בצעדי 2.4.19-2.4.21 לדורות הבאים.

    3. ניתוח ביטוי חלבון רקומביננטי

    1. הפקת חלבון כולל:
      1. תאי חיידקים:
        1. Resuspend גלולה תא החיידק, שנאספו כמתואר בשלב 2.1.5, במחצית נפח התרבות של נאגר מלוח טריס (TBS - 2 מ"מ טריס / HCl, 500 מ"מ NaCl) pH 7.4 בתוספת phenylmethanesulfonylfluoride 1 מ"מ (PMSF).
        2. Sonicate resuspended תא גלולה שלוש פעמים במשך 40 שניות במחצית כוח, תוך שמירה על מדגם על קרח.
        3. להבהיר lysate ידי צנטריפוגה XG ב 14,000 במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
        4. העברת supernatant לצינור נקי ולאחסן supernatant וגלול בנפרד ב -80 ° C.
        5. Solubilize גופי ההכללה, שנאספו בגלולה, במחצית lysate הסלולרי נפח של pH 8.0 TBS בתוספת 6 M אוריאה על ידי נמרץ רועד הלילה בטמפרטורת חדר.
        6. צנטריפוגה XG ב 10,000 במשך 25 דקות בטמפרטורת חדר ולאסוף supernatant בנקיצינור.
        7. לאחסן supernatant וגלול ב -80 ° C.
      2. תאי חרקים:
        1. לשטוף גלולה נגועה חרקים תא, שנאסף כמתואר בשלב 2.2.12, עם 1 מיליליטר של בופר פוספט (PBS - 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na 2 4 HPO, 1.8 מ"מ KH 2 PO 4) pH 7.4.
        2. תאי Resuspend ב -200 μl של חיץ תמוגה (20 מ"מ טריס / HCl pH 8.0, 0.5 M NaCl, 3 מ"מ β-mercaptoethanol ו -1% Tween-20) ולדגור על קרח למשך 30 דקות.
        3. צנטריפוגה solubilized תאים 14,000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
        4. לאסוף שברים וחנות מסיסים ב -80 ° C וזורקים את הכדור.
      3. רקמת עלה צמח:
        1. נ 'Grind benthamiana או נ ' רקמת tabacum לאבקה דקה בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי.
        2. Homogenize של רקמת קרקע 100 מ"ג ב 300 μl של חיץ חילוץ (40 מ"מ Hepes pH 7.9, 5 מ"מ DTT, בחורים 1.5%), supplemented עם 3 μl של מעכבי פרוטאז קוקטייל ולהפשיר על קרח.
          הערה: היחס בין המשקל נבחר רקמות צמח (ז) למאגר נפח (מיליליטר) הוא 1: 3.
        3. תמצית צנטריפוגות ב 30,000 XG במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
        4. איסוף supernatant בצינור נקי ולאחסן ב -80 ° C.
    2. צביעת ג'ל Coomassie:
      1. הכן דילול מתאים של תמציות חלבון כוללת (לדוגמא, 2 μl של תמצית צמח, 5 μl של תמציות חיידקים וחרקים) לנפח סופי של 10 μl של חיץ חילוץ ולהוסיף 5 μl של חיץ מדגם 3x (1.5 מ 'טריס / HCl pH 6.8, 3% SDS, גליצרול 15%, 4% β-mercaptoethanol) לריכוז 1x סופי.
      2. דגימות רתיחה במשך 10 דקות.
      3. חלבונים נפרדים על ידי 10% SDS-PAGE.
      4. לאחר אלקטרופורזה, ג'ל חום בנוכחות פתרון Coomassie (הכחול R-250 0.05% מבריקים, isopropanol 25%, 10% חומצה אצטית) במיקרוגל במשך כשתי דקותים עד לנקודת רתיחה.
      5. להתקרר לטמפרטורת חדר ג'ל עם רעד עדין.
      6. א פתרון מכתים בטל Coomassie
      7. ג'ל destain על ידי חימום בנוכחות הפתרון B Coomassie (הכחול R-250 0.05% מבריקים, isopropanol 25%), C (הכחול R-250 0.002% מבריקים, 10% חומצה אצטית) ו- D (10% חומצה אצטית) בכל פעם הבא באותו הפרוטוקול מכתים.
      8. לאחר שלב החימום האחרון עם הפתרון D, לעזוב destaining ג'ל עד הרקע ברור 9.
    3. ניתוח כתם מערבי:
      1. לאחר אלקטרופורזה, העברה מופרדת חלבונים על קרום nitrocellulose תוך שימוש בטכניקות ובלוקים עם 4% חלב סטנדרטיים בPBS pH 7.4 בטמפרטורת חדר למשך שעה 1.
      2. דגירה כתם הלילה ב 4 ° C או ל4 שעות בטמפרטורת חדר בפתרון החסימה המכיל נוגדן ראשוני ארנב שהועלה נגד חלבון המטרה ב1: 10,000 והשלים עם Tween-20 0.1%.
      3. לאחר תווית נוגדן ראשוניתing, לשטוף את הממברנה 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם פתרון חסימה המכיל 0.1% Tween-20.
      4. דגירה עם peroxidase חזרת (HRP) נוגדן נגד ארנב -conjugate ב1: 10,000 תמורת 1.5 שעות.
      5. קרום לשטוף 5 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם PBS-T (PBS בתוספת 20-Tween 0.1%).
      6. לעבד כתם מערבי באמצעות מצע peroxidase chemiluminescent.
    4. assay Radioimmuno (RIA):
      1. לאפשר אספקת מים (antiserum, נותב וחלבון Sepharose) כדי להגיע לטמפרטורת חדר וpipet 20 μl של דגימות חלבון תמצית וסטנדרטים בריכוזים שונים (מ300-2,400 ng / ml של hGAD65 המסחרי רקומביננטי) לתוך צינורות פוליסטירן 12 x 75 מ"מ.
      2. הוסף 20 μl של antiserum, מוכן לדלל 1:30 הסרום מplasmapheresis של מטופל T1D.
      3. הוסף 50 μl של נותב (125-I-GAD65) ודגירה של 2 שעות בטמפרטורת חדר. הגדר צינור עם נותב רק להעריך את הפעילות הכוללת.
      4. הוסף 50 μlחלבון Sepharose דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
      5. לוותר על 1 מיליליטר של PBS הקר חיץ לתוך צינור אחד וצנטריפוגות ב 1500 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      6. למזוג את הצינורות כדי להסיר supernatant ולספוג נוזל שיורית על נייר סופג בעדינות על ידי הקשה על צינור.
      7. מדד immunoprecipitated רדיואקטיביות בכל הצינורות על ידי ספירת דקות 1 בgamma-counter.
      8. עלילה בקנה מידת יומן השיעורים המחייבים (B / T%) של כייל הקשורים לפעילות כוללת, להקים את העקומה סטנדרטית, ולקרוא ריכוז GAD של דגימות מהעקומות כיול 10.
        הערה: אזורים מוגבלים צריכים להיות מתוכננים לאחסון, טיפול וסילוק של חומר רדיואקטיבי.

Representative Results

עיצוב ניסיוני לביטוי Heterologous של חלבון רקומביננטי יעד במערכות ייצור שונים מתואר כאן. המוקד הראשון היה ההגדרה של הפלטפורמות השונות על ידי הקמת התנאים אופטימליים לביטוי של חלבון המטרה בכל מערכת.

הביטוי של חלבון המטרה, hGAD65mut, היה מושרה בE. השלושה עותקים תרבויות coli. בעקבות 3 שעות של ביטוי על 37 מעלות צלזיוס, תאי חיידקיים נאספו על ידי צנטריפוגה ו lysed ידי sonication. לאחר צעד צנטריפוגה, חלבונים מסיסים הופרדו מגופי הכללה מסיסים וניתוחים ראשוניים הראו כי hGAD65mut הצטברו אופן שכיח בגוף הכללה מסיס (מידע לא מוצג). solubilisation חלבון רקומביננטי נדרש השימוש של אוריאה 6 M, אשר, למאפייני denaturing החזק שלה, מפריעה לניתוח RIA, מה שהופך את הבלתי אפשרי כימות נכון של hGAD65mut. כמה אסטרטגיות שתהיינהen דיווח למגביל את היווצרותם של גופי הכללה, הכולל גידול תאי חיידקים בטמפרטורה נמוכה 11. התרבויות גדלו ב 15 ° C ו -20 ° C, וביטוי חלבון רקומביננטי היה מושרה באותו הטמפרטורות. כפי שניתן לראות באיור 1 א, solubilisation של hGAD65mut מיוצר בשתי הטמפרטורות, שוב דורש אוריאה (נתיבי S2). לפיכך, טמפרטורות נמוכות בניסוי זה אינן מונעות hGAD65mut מ טביעה אגרגטים מסיסים.

וקטורי baculovirus מכילים את רצף hGAD65mut (Baculo.G65mut) באו לידי ביטוי בתרביות תאי SF9 חסיד. מניות גבוהה כייל V1 ו- V2 הוכנו ותנאי זיהום ביצועים הטובים ביותר הוקמו הערכת כרכי מניית ויראלי שונים 5-50 μl. כפי שניתן לראות באיור 1, האופטימלי נגיפי מניית הנפח זוהה כμl 25, מניב 11.8 ± 0.8 מיקרוגרם של חלבון רקומביננטי לכל מיליליטר של מדיום התרבות, כפי שהוערך על ידי RIAניתוח (טבלה 1).

החדירה הבאה, ניתוח מהלך זמן של נ agroinfected העלים benthamiana בוצעו בשתי מערכות ביטוי חולפות. למערכת מבוססת pK7WG2, דגימות עלים היו נקוות יומי בdpi הטווח 1-5, חלבונים כולל מסיסים (TSP) הוצאו וכמויות שווים של TSP נותחו על ידי כתם המערבי (איור 1 ג). ניתוח זה הדגיש כי ההצטברות המרבית של חלבון רקומביננטי היעד תושג 2 dpi. לכן, העלים נקצרו 2 dpi ותמציות החלבון נותחו על ידי RIA למדידת הצטברות חלבון רקומביננטי, שמראה ממוצע של 67.8 מיקרוגרם FLW / g (משקל עלה טרי, טבלת 1). רמות ביטוי חלבון רקומביננטי, באמצעות מערכת זו, ניתן לשפר עוד יותר, על ידי שיתוף חדירת העלים עם משתיק של Post-תעתיק השתקת גנים (PTGS) כמו P19 או HC 12 Pro.

אותו גילוי בזמן קורס נערך עם נ ' benthamiana עלי agroinfected עם וקטורי MagnICON: עלים נגועים נאספו 1-8 כמויות dpi ושווים של TSP נותחו על ידי כתם מערבי. ניתוח זה הראה כי הצטברות חלבון רקומביננטי המרבית מתקבלת 4 dpi (1D איור), עם הצטברות ממוצעת של חלבון רקומביננטי של 78.8 מיקרוגרם / g FLW (טבלת 1), כפי שהוערך על ידי RIA.

הביטוי של hGAD65mut בצמחי טבק מהונדסים כבר דווח בעבר 12, שמראה כי רמות חלבון רקומביננטי הבדל משמעותית בין שורות הופכות באופן עצמאי. הצמח המהונדס hGAD65mut T1 ביצועים הטובים ביותר היה-חצה עצמי והצמחים נגזרו (T2) נותחו כדי לבחור שוב מבצע את הטוב ביותר. הליך זה חזר על עצמו במשך כמה דורות לפתח פלטפורמת הפקה הומוגנית, בדיקת ביצועים בכל דור ודור על ידי RIA עד שלאשיפור נוסף הושג (מידע לא מוצג). באיור 1E, כתם מערבי נציג של צמחים מהונדסים T5 מדווח, שבו ההומוגניות של תשואות חלבון רקומביננטי ניכרה. כפי שניתן לראות באיור 1F, התשואה הממוצעת hGAD65mut עלתה מ T2 לT6, והגיעה לרמה של 99.1 מיקרוגרם FLW / g (טבלת 1), ובמהלך תהליך הבחירה, סטיית התקן של רמת הביטוי סירבה.

איור 1
איור 1:. הגדרת פלטפורמת הגדרת התנאים הטובים ביותר של ביטוי hGAD65mut בכל פלטפורמה. () ה פלטפורמת ביטוי מושרה coli. תאי חיידקים גדלו ב 15 ° C או 20 ° C פנל עליון., כתם המערבי של hGAD65mut בתמציות תא (TSP 2 מיקרוגרם לכל נתיב). פנל תחתון, טעינת השליטה מוכתמת בCoomassie. n.ג. = ביקורת שלילית, תאי חיידקיים הפכו עם וקטור pDEST17 המכיל את גן כלורמפניקול-התנגדות; T: סה"כ דגימות; S1: Supernatant לאחר sonication וצנטריפוגה; S2 וP: Supernatant (1) ופלטות (2) לאחר צנטריפוגה של המדגם solubilized במאגר המכיל אוריאה. Baculovirus פלטפורמה (B) / חרקים תא. כרכי מניית ויראלי הבאים נבדקו: 5, 25 ו -50 μl פנל עליון, כתם המערבי של hGAD65mut בתמציות תא (TSP 5 מיקרוגרם לכל נתיב) פנל תחתון, טעינת השליטה מוכתמת בCoomassie... NC = ביקורת שלילית, תמצית של תאי חרקים הפכו ללא. (ג) חלוף ביטוי בנ צמחי benthamiana באמצעות וקטור pK7WG2. דגימות נאספו יומיות, 1-5 dpi (נתיבים 1-5). פנל עליון, כתם המערבי של hGAD65mut בתמציות עלה (TSP 2.5 מיקרוגרם לכל נתיב). פנל תחתון, טעינת השליטה מוכתמת בCoomassie, שבו למקטע הגדולשל Rubisco ניכר. NC = ביקורת שלילית, צמחים הסתננו עם וקטור pK7WG2 נושא את גן GFP הסמן. ביטוי חולף בנ (D) צמחי benthamiana באמצעות וקטורי MagnICON. דגימות נאספו יומיות, 1-8 dpi (נתיבים 1-8). פנל עליון, כתם המערבי של hGAD65mut בתמציות עלה (TSP 5 מיקרוגרם לכל נתיב). פנל תחתון, טעינת השליטה מוכתמת בCoomassie בי המקטע הגדול של Rubisco ניכרה . NC = ביקורת שלילית, צמחים הסתנן רק עם pICH20111 5'-מודול ואינטגראז מודול pICH14011. מספרים מצביעים על סמן מסה מולקולרי בkDa. מחשב = שליטה חיובית, 15 ng של hGAD65 המסחרי מיוצר ב/ מערכת תא חרק baculovirus. ביטוי יציב בנ (E) צמחי tabacum. דגימות עלים נאספו מצמחי T5 שונים (נתיבי 1-11). פנל עליון, כתם מערבי של hGAD65mut בתמציות עלה (5 TSP מיקרוגרם לכל נתיב). פנל תחתון, שליטת טעינה מוכתמת wה- i Coomassie. NC = ביקורת שלילית, צמחים בר-סוג. מספרים מצביעים על סמן מסה מולקולרי בkDa. מחשב = שליטה חיובית, 15 ng של hGAD65 המסחרי מיוצר ב/ מערכת תא חרק baculovirus. ביטוי יציב בנ (F) צמחי tabacum. ייצוג Boxplot של הצטברות hGAD65mut במשך כמה דורות נגזרו מביצועים הטובים ביותר צמח טבק מהונדס hGAD65mut T1 דווח כFLW מיקרוגרם / g מחושב מנתוני RIA. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מערכת [HGAD65mut] (מיקרוגרם / מיליליטר) [HGAD65mut]
Baculo / חרקים 117.5 ± 7.7 11.8 ± 0.8 מיקרוגרם מדיום תרבות / ml
Transient 22.6 ± 0.9 FLW / g 67.8 ± 2.7 מיקרוגרם
MagnICON 26.3 ± 5.9 FLW / g 78.8 ± 17.8 מיקרוגרם
T6 עלית 33.0 ± 3.8 FLW / g 99.1 ± 11.3 מיקרוגרם

טבלת 1: hGAD65mut מניבה תשואות hGAD65mut בפלטפורמות שונות - (Baculo / חרקים) מבוסס פרמנטור ועל בסיס צמחי (pK7WG2- וMagnICON בנ benthamiana וT6 העילית בtabacum נ '). טור שני - ריכוז hGAD65mut בתמציות חלבון (מיקרוגרם / מיליליטר). עמודה שלישית - תוכן hGAD65mut במשקל טרי עלה (מיקרוגרם / FLW g) לפלטפורמות המבוססים על צמחים ובמדיום סלולארי תרבות (מיקרוגרם / מיליליטר) לפלטפורמה מבוססת פרמנטור.

Discussion

במחקר זה שלוש פלטפורמות שונות הושוו לביטוי של חלבון אנושי רקומביננטי: תאי חיידקים, תאי baculovirus / חרקים וצמחים. הפלטפורמה הבוסס על הצמחים שנחקרה עוד יותר על ידי ניצול שלוש טכנולוגיות בשימוש נרחבת ביטוי (כלומר, חולף - MagnICON וpK7WG2 מבוססת - ויציב). חלבון המטרה שנבחר לניסוי זה, hGAD65mut, כבר הביע בעבר במערכות שונות 13, והייצור ואת הפונקציונליות שלו הם בקלות לזיהוי ומדידה 14.

תאי חיידקים לא היו פלטפורמת הפקה יעילה כי hGAD65mut יצר גופי הכללה, גם בתנאי גידול בטמפרטורה נמוכה, וכן הוא מחייב solubilization מייגע וקיפול מחדש כדי להשיג קונפורמציה האם שלה. ואכן, הכישלון העיקרי של פלטפורמה זו לביטוי של חלבונים רקומביננטי מורכבים היא קונפורמציה תקין של המוצר הסופי.

פלטפורמת תא / חרקים baculovirus תיווך ביטוי גבוה של חלבון רקומביננטי immunoreactive, אבל המגבלה העיקרית של מערכת בביטוי זה היא העלות הגבוהה של התקשורת והתרבות, הנדרשת לגידול תאי חרקים. הערכה הייתה שעלויות ייצור כוללת של 1 גרם של hGAD65mut יכולות להגיע € 700 בפלטפורמת הפקה זו (בהתחשב 9 L של תקשורת בתרבות תא חרק חובה). מגבלה נוספת של פלטפורמת ביטוי זה היא הצורך של טיפוח סטרילי של תאי חרקים, אשר דורש כוח אדם עם כישורי מניפולציה ספטית. כדי להבטיח הצטברות יעילה רקומביננטי חלבון שני פרמטרים קריטיים חייבים להיות מבוקרות בקפידה במערכת ביטוי זה: כרכי מניית ויראלי נהגו להדביק תאים והעיתוי של זיהום ויראלי. יתר על כן, חומר הניקוי, המשמש להפקת חלבון מסיס הכוללת מתאי החרקים SF9, באופן דרסטי משפיע solubilisation חלבון רקומביננטי.

מערכות המבוסס על צמח היו platfo מועיל ביותרrm להביע hGAD65mut: חלבון רקומביננטי מתוצרת המפעל היה immunoreactive ונצבר ברמות גבוהות ברקמות עלה. השוואה בין מערכות ביטוי על בסיס צמחי שונות, את התשואות הגבוהות ביותר שהושגו בצמחים יציבים הפכו טבק (טבלת 1), ואם בהתחשב ביומסה הכוללת של טבק בהשוואה לנ benthamiana, המשמש לביטוי חולף, התפוקה גבוהה יותר הכוללת של טבק ניכר. עם זאת, המגבלה העיקרית של פלטפורמה הבוסס על צמחי טבק הפך יציבה הוא הזמן הנדרש להקמתה של המערכת, אשר במחקר שלנו לקחה 20 חודשים. ואכן, קו הומוזיגוטים יש לבחור עבור הומוגניות ביטוי חלבון רקומביננטי והוא עשוי לדרוש חזר מחזורים עצמיים צולבת, החל מT1 הגבוה ביותר להביע קווים. בפרט, כאשר T1 נבחר נושא יותר מעותק אחד של התכונה המהונדס, תכנית הרבייה עשויה להימשך עד 3 שנים.

מערכות ביטוי חולפות הציעויתרון של upscaling המהיר בשל פרק זמן קצר שבין שינוי וביטוי וההגדרה של פלטפורמת הביטוי נדרש 4 ימים. עם זאת, מגבלה של המערכות חולפות על בסיס הצמחי היא שהאוטומציה שלהם היא כמעט לא ישימה על מעבדה בקנה מידה, אלא אם כן ציוד בדרגה גבוהה מוקדש לאגרה חדירה משמש. לפיכך, חישוב נכון לייצור בקנה מידה גדולה של hGAD65 באמצעות מערכות מבוססות חולפות לא ניתן לבצע כאן. מצד השני, אנו משערים כי עלויות ייצור כוללת של 1 גרם של חלבון רקומביננטי באמצעות קו טבק יציב T6 ניתן לחשב בפחות מ -5 יוריו (בהתחשב בקרקע לגידול צמחי טבק 60). כדי להבטיח הייצור יעיל agroinfiltration וחלבון צריכים להיות מבוקרים מספר פרמטרים קריטיים בזהירות (שלב התפתחות צמח, לגדול ומצב חדירת Agrobacterium), כפי שדווח בעבר 15. יתר על כן, לכל ביטוי להתנסות ניתוח בזמן קורס מסוים צריך להיותביצע כדי לבחור את dpi המאפשר הצבירה הגבוהה ביותר של חלבון רקומביננטי.

הדוגמא שנדונה כאן יכולה להיחשב מקרה מחקר proof-of-עיקרון, שמדגיש כמה יתרונות הספציפיים של ייצור המבוסס על צמחים על פני מערכות מסורתיות. בפרט, יכולים להיחשב קווים מהונדסים טבק הומוגנית המבטאים את חלבון רקומביננטי פלטפורמה חשובה לייצור ההמוני של חלבונים רקומביננטי הנדרשים בכמויות גדולות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract Sigma Y1333
Tryptone Formedium TRP03
Agar Bacteriological Grade Applichem A0949
Sf-900 II SFM medium Gibco 10902-088
Grace’s Insect Medium, unsupplemented Gibco 11595-030
Cellfectin II Reagent Invitrogen 10362-100
MS medium including vitamins Duchefa Biochemie M0222
Sucrose Duchefa Biochemie S0809
Plant agar Duchefa Biochemie P1001
Ampicillin sodium Duchefa Biochemie A0104 Toxic
Gentamycin sulphate Duchefa Biochemie G0124 Toxic
Ganciclovir Invitrogen I2562-023
Carbenicillin disodium Duchefa Biochemie C0109 Toxic
Kanamycin sulfate Sigma K4000 Toxic
Rifampicin Duchefa Biochemie R0146 Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO
Streptomycin sulfate Duchefa Biochemie S0148 Toxic
Spectinomycin dihydrochloride Duchefa Biochemie S0188
IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside) Sigma I5502 Toxic
MES hydrate Sigma M8250
MgCl2 Biochemical 436994U
Acetosyringone Sigma D134406 Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Syringe (1 ml) Terumo
MgSO4 Fluka 63136
BAP (6-Benzylaminopurine) Sigma B3408 Toxic
NAA (Naphtalene acetic acid) Duchefa Biochemie N0903 Irritant
Cefotaxime Mylan Generics
Trizma base Sigma T1503 Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer
HCl Sigma H1758 Corrosive
NaCl Sigma S3014 1 M stock
KCl Sigma P9541
Na2HPO4 Sigma S7907
KH2PO4 Sigma P9791
PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride) Sigma P7626 Corrosive, toxic
Urea Sigma U5378
β-mercaptoethanol Sigma M3148 Toxic
Tween-20 Sigma P5927
Hepes Sigma H3375
DTT (Dithiothreitol) Sigma D0632 Toxic – 1 M stock, store at -20 °C
CHAPS Duchefa Biochemie C1374 Toxic
Plant protease inhibitor cocktail Sigma P9599 Do not freeze/thaw too many times
SDS (Sodium dodecyl sulphate) Sigma L3771 Flammable, toxic, corrosive – 10% stock
Glycerol Sigma G5516
Brilliant Blue R-250 Sigma B7920
Isopropanol Sigma 24137 Flammable
Acetic acid Sigma 27221 Corrosive
Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67 Sigma G5163 Do not freeze/thaw too many times
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody Sigma A6154 Do not freeze/thaw too many times
Sf9 Cells Life Technologies 11496
BL21 Competent E. coli New England Biolabs C2530H
Protein A Sepharose Sigma P2545
Cell culture plates Sigma CLS3516
Radio Immuno Assay kit Techno Genetics 12650805 Radioactive material

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488, (3), 185-189 (2001).
  2. Avesani, L., et al. Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant. Plant Biotechnol. J. 9, (8), 862-872 (2010).
  3. Sambrook, J., et al. Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
  4. Avesani, L., et al. Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen. Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).
  5. Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101, (18), 6852-6857 (2004).
  6. Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants). Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).
  7. Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3, (11), (2008).
  8. Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system. Plant Methods. 4, (4), 1-7 (2008).
  9. Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10, (13), 2606-2617 (1971).
  10. Falorni, A., et al. Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes. Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).
  11. Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expr. Purif. 40, (1), 1-22 (2005).
  12. Arzola, L., et al. Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein. Int. J. Mol. Sci. 12, (8), 4975-4990 (2011).
  13. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective. Biomed. Res. Int. 2014, 136419 (2014).
  14. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Res. 12, (2), 203-212 (2003).
  15. Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins. J Vis Exp. (77), (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics