박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

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Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. J. Vis. Exp. (97), e52459, doi:10.3791/52459 (2015).

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Abstract

식물 - 기반 시스템은 높은 품질의 생체 활성 제품의가요 성, 저비용 생산을 위해 자신의 잘 문서화 전위의 결과로 재조합 단백질의 생산에 유용한 플랫폼 여겨진다.

본 연구에서 우리는 과도하고 안정적​​인 식물 기반 발현 시스템, 전통적인 발효기 계 세포 배양 (세균성 및 곤충)에서 표적 재조합 인간 단백질의 발현을 비교 하​​였다.

각 플랫폼을 위해, 우리는 셋업, 최적화 및 제조 공정의 길이, 최종 제품의 품질과 수율을 설명하고 우리는 선택된 대상 재조합 단백질에 특이 잠정 생산 비용을 평가 하였다.

전반적으로, 우리의 결과는 박테리아 인해 불용성 봉입체 내에서 축적 목적 단백질의 생산에 적합하지 않은 것을 나타낸다. 한편, 식물 기반 시스템은 다목적 플랫폼 t는모자 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템보다 낮은 비용으로 선택된 단백질의 생산을 허용한다. 특히, 안정된 형질 전환 라인은 최종 생성물의 높은 수율 및 과도 발현하는 식물 빠른 프로세스 개발을 표시. 그러나, 모든 재조합 단백질은 식물 기반 시스템의 혜택을 누릴 수 있지만, 여기에 설명 된대로 최고의 생산 플랫폼, 사례 별 접근 방식을 경험적으로 결정되어야한다.

Protocol

발현 벡터의 1. 건설

  1. 상용 재조합 클로닝 시스템 :
    1. 앞서 설명한 바와 같이 2 프라이머는 적절한 유전자의 5 '말단에서 CACC 클램프의 첨가를 허용와 표적 유전자 (hGAD65mut)의 전체 길이의 서열을 증폭.
    2. 1 몰비 인서트 : 벡터 및 1 μL의 1.5을 사용하여, 6 μL의 총 부피의 반응을 조합하여 엔트리 벡터 (토포 이소 머라 바운드)에서 지향성 클로닝 키트 규격에있어서, 겔 - 정제 된 증폭 산물을 복제 염 용액 (0.01 M의 MgCl 2의 NaCl 및 0.2). 실온 (RT)에서 5 분 동안 배양.
    3. 화학적으로 관할 E.으로 전체 반응을 변환 식민지 PCR (3)에 의한 방향 복제 키트 사양과 화면을 얻을 식민지, 앞으로 M13를 사용하여 역방향 프라이머에 따라 대장균 세포는 방향 복제 키트에 포함되어 있습니다. 포에서 플라스미드를 분리돌연변이 3의 부재를 보장하기 위해 프라이머를 앞으로 M13를 사용하여 역 플라스미드 DNA 준비 키트 사양 및 순서 삽입에 따라 sitive 식민지.
    4. 특정 대상 벡터와 람다 재조합 효소 Clonase II 효소 (LR)에 의해 재조합 반응을 수행 할 얻어진 항목 클론을 사용 pDEST17 (pDEST17.G65mut를 산출)와 박테리아 세포에서 재조합 단백질 발현을 위해, pK7WG2와 (일시적 또는 안정) 식물 4 (Baculo.G65mut 항복) 선형화 된 바이러스 DNA로 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템에서, (pK7WG2.G65mut 얻었다). 엔트리 벡터 100 ng의, 대상 벡터 150 ng의 10 μL의 최종 부피 효소 믹스 2㎕의 함께 clonase 키트 사양에 따라, 반응을 조립한다. 1 시간 동안 실온에서 믹스를 품어.
    5. 유능한 화학적으로 재결합 E. 제품 변형 clonase 키트 사양에 따라 대장균 세포. PCR (3)에 의한 화면을 얻을 식민지
    6. 상업용 minipreparation의 DNA 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 분리하고 이전 단계에서 설명한 것과 같은 특정 프라이머의 조합을 사용하여, PCR (3)에 의해 표적 서열의 존재를 확인한다.
    7. 다음 단계에 설명 된대로 재조합 단백질 발현을 위해 선택된 플랫폼에 따라 다른 대상 유기체를 변환 얻어진 PCR 양성 플라스미드를 사용합니다.
  2. MagnICON 시스템 5-7 :
    1. 이전 pICH31070.G65mut을 수득 상세히 7에 기재된 바와 같이, 3'- 모듈 pICH31070에서 표적 유전자를 복제. 사용특정 반응을 다음주기 : 80 ° C에서 37 ° C, 50 ° C에서 5 분에서 30 분 인큐베이션 한 후, 5 분.

2. 재조합 단백질 발현

  1. 세균 전지 시스템 :
    1. E.에 pDEST17.G65mut 변환 대장균 BL21 (DE3) 다음 유전자 특이 적 프라이머를 이용한 콜로니 PCR에 의해 암피실린 함유 (100 ㎍ / ㎖) 상에 성장 된 표준 기술 및 화면 콜로니를 LB-매체를 사용 electrocompetent 셀 : 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 '와 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', 58 ° C의 어닐링 온도에서 20 초간의 신장 시간. 플라스틱 튜브에서 끝 세균 세포를 용해시킨 후 20 ㎕의 총 부피에서 PCR 반응을 수행한다.
    2. 암피실린 함유 (100 ㎍ / mL)을 3 ㎖ LB 배지에서 - 37 ° C에서 밤새 단일 콜로니를 접종한다.
    3. 세균 배양 1을 희석 : 신선한 LB 배지 100 100 ㎖의를 (포함 ampicill등)에 최종 OD 0.8 600까지 1-6 시간 동안 37 ° C에서 품어.
    4. 최종 농도 1mM isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)를 첨가하여 재조합 단백질 발현을 유도하고 격렬하게 37 ° C에서 3 시간 동안 진탕 배양을 배양한다.
    5. 20 분 동안 4,000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집하고 단백질 추출 (단계 3.1.1.1)에 대한 세균 펠렛을 사용합니다.
  2. 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템 :
    1. 스포 도프 테라 프 루기 페르 (인 Sf9) 6 웰 플레이트에 세포 (물론 당 8 × 10 5 세포) 및 비 보충 그레이스의 곤충 중간의 2 ml로 두 번 씻는다.
    2. 매체 드롭 현명한 형질 전환 혼합물 (5 μL의 LR 재조합 반응, 6 μL의 Celfectin 용액 200 ㎕를 비 보충 그레이스의 곤충 중간)을 제거하고 교체합니다.
    3. 5 시간 동안 27 ° C에서 접시를 품어.
    4. 제거하고 신선한 SF-9 2 ㎖로 형질 전환 혼합물을 대체10 % 소 태아 혈청, 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신 및 100 μM 갠 시클로 비르로 보충 된 배지를 00, 재조합 바큘로 바이러스 클론을 선택한다.
    5. 27 ° C에서 96 시간 동안 배양 한 후, 4 ° C에서 어둠 속에서 세포와 큰 파편과 저장소를 제거하기 위해 4,000 XG에서 매체 (V1 바이러스 주), 원심 분리기를 수집합니다.
    6. 씨앗 당 1 × 106 개의 Sf9 세포에 2.5 ml의 웰 SF-900 배지, 10 % 소 태아 혈청, 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신 및 100 μM 갠 시클로 비르를 포함하고 각 웰에서 V1 스톡 100 ㎕로 감염시킨다.
    7. 27 ° C에서 3 일 동안 세포를 품어.
    8. 수집하고 원심 분리기 매체 4,000 x g에서.
    9. 4 ° C에서 상층 액 (V2 높은 역가 스톡)를 저장합니다.
    10. 씨앗 당 1 × 106 개의 Sf9 세포에 2.5 ml의 웰 SF-900 배지, 10 % 소 태아 혈청, 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신 및 100 μM 갠 시클로 비르를 포함하고 각 웰에서 V2 스톡 25㎕를 함께 감염.
    11. 27 ° C에서 3 일 동안 세포를 품어.
    12. 4000 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집하고 단백질 추출 (단계 3.1.2. 1)에 대한 곤충 세포 펠렛을 사용합니다.
  3. 담배 속 benthamiana 일시적 발현 시스템 :
    1. N. 성장 온도 범위 18 ~ 23 ° C의 내 자연 채광 아래 온실에서 benthamiana 식물. agroinfection 4-5 주 오래된 식물을 사용합니다.
    2. 13 시간 일 / 11 시간 밤 광주와 22 ° C에서 기후 챔버에서 agroinfected 식물을 유지합니다.
    3. 상용 재조합 클로닝 시스템 :
      1. 아그로 스트레인 EHA105 electrocompetent 세포 메파에 앞서 8 바와 같이 pK7WG2.G65mut 소개하고이 후 LB 배지 함유 리팜피신 (50 ㎍ / ㎖), 스트렙토 마이신 (300 ㎍ / ml) 및 스펙 티노 마이신 (100 ㎍ / ㎖)상에서 성장한 콜로니를 선별 다음 유전자 특이 적 프라이머를 사용하여 식민지 PCR (8) 28 ° C에서 배양 일 : 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; 58 ° C의 어닐링 온도에서 50 초간의 신장 시간 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 '. 20 ㎕의 총 부피에서 PCR 반응을 수행한다.
      2. 28 ℃에서 이틀 동안 LB 배지 함유 리팜피신 (50 ㎍ / ㎖), 스트렙토 마이신 (300 ㎍ / ml) 및 스펙 티노 마이신 (100 ㎍ / mL)을 30 ㎖의 박테리아를 접종한다.
      3. 침투 버퍼의 10ml에 20 분에 resuspend 펠렛 (10 MM의 MES, 10 mM의의 MgCl 2, 100 μM 시린 곤, pH를 5.6) 4,000 XG에서 원심 분리하여 박테리아를 수집합니다. 600 OD 값을 측정 한 후 동일한 완충액으로 희석하여 0.9로 조정.
        주 : 세 N. 침투에 필요한 총량 benthamiana 식물은 30 ㎖이다.
      4. N.에있는 아그로 박테 리움 현탁액에 침투 2.5 ml의 바늘 주사기를 사용하여 benthamiana 나뭇잎. 조심스럽게 천천히 주사기의 서스펜션 잎 패널을 주입. 세 확장 리터 침투공장 당 처마와 삼중으로 세 가지 식물을 사용합니다.
        참고 : 건강과 안전을 이유로 침투 과정에서 눈 보호구를 착용하십시오.
      5. 액체 질소에 agroinfiltrated 잎 이일 포스트 감염 (dpi)로 동결를 수집합니다. -80 ° C에서 보관 식물 조직.
    4. MagnICON 시스템 :
      1. 5 '모듈 (pICH20111), 3'모듈 (pICH31070.G65mut) 및 인테그라 모듈 (pICH14011) - - A.에서 MagnICON 벡터를 소개 표준 기술을 이용하여 변형을 GV3101 메파. 포함 된 LB 배지에서 재배 식민지를, 화면 50 ㎍ / ml의 리팜피신 각 벡터에 대한 특정 프라이머를 이용하여 식민지 PCR이 적절 벡터 별 항생제 (pICH20111 및 pICH14011, 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신 pICH31070에 대한 50 ㎍ / ml의 카르 베니 실린).
      2. 개별적으로 세 A. 접종 튜메 파시 엔스 함유 LB 배지 5ml에 균주를 50 ㎍ / ㎖의 적절한 벡터 및 리팜피신 특정 항생제28 ° C에서 하룻밤 흔들.
      3. 펠렛은 하룻밤 세균 20 분 동안 4,000 XG에 원심 분리하여 문화와 10 밀리미터 MES (PH 5.5), 10 mM의 황산의 초기 세균 배양의 두 권을 재현 탁.
      4. 세 벡터를 포함하는 박테리아 현탁액의 동일한 볼륨을 혼합하고 N.의 주사기 침투에 대한 서스펜션 믹스를 사용 benthamiana 나뭇잎. 공장 당 세 확장 잎을 침투.
      5. 4 dpi로 agroinfiltrated 잎을 수집하고 액체 질소에 동결.
      6. -80 ° C에서 보관 식물 조직.
  4. 된 담배 안정적으로 발현 시스템 :
    1. 성장과 N의 체외 묘목을 유지 고체 식물 배양 배지에 tabacum (VAR SR1.) (4.4 g / L 무라 시게과 스쿡 - MS - 매체 비타민, 30g / L 자당, 산도 5.8, 7g / L 공장 한천 포함) 25 기후 실에서 통제 된 조건 하에서 16 시간 / 8 시간 일 / NI와 ° CGHT 정권.
    2. A.의 예비 - 배양을 시작 박테 리움 EHA105는 (100 ㎍ / ㎖의 스펙 티노 마이신, 300 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 리팜피신 50 ㎍ / ml)에 적절한 항생제 액체 YEB 매체의 5ml에 발현 벡터 pK7WG2.G65mut을 은닉하고 진탕 세트에 28 ° C에서 하룻밤 성장 200 rpm에서.
    3. 세균 배양이 될 때까지 (100 ㎍ / ㎖의 스펙 티노 마이신, 300 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신, 리팜피신, 50 ㎍ / ㎖) YEB 배지 플러스 항생제에 50 ml의 아그로 배양에 접종하고 24 시간 동안 성장 전 배양액 1mL를 사용 포화 (OD 0.5 ~ 1.0의 600 값).
    4. 식물 액체 배지 50ml에 재현 탁하고, 20 분 펠릿 4000 XG에서 원심 분리하여 박테리아 수집. 완전히 항생제를 제거하기 위해 두 번이 단계를 반복합니다.
    5. 체외 담배 식물에서 처음 건강한 완전히 확장 잎을 가지고 약 1cm 사각형로 잘라.
    6. 전송 잎 조각깊은 배양 접시에 세균 현탁액을 포함하는 20 분 동안 어둠 속에서 떠나.
    7. 서스펜션에서 잎 조각을 제거하고 살균 필터 종이에 건조시킨다.
    8. 1.0 ㎍ / ㎖의 6 benzylaminopu​​rine (BAP) 0.1 ㎍ / ㎖의 나프탈렌 초산 (NAA)를 포함하는 고체 식물 배양 배지에 향축면 잎 조각 (위쪽 잎 표면)를 놓고 통제 된에서 기후 챔버에서 이틀 동안 판을 품다 조건 (25 ° C, 16 시간 일 / 8 시간 밤).
    9. 매체와 접촉 배축 표면 (잎의 하부면)과 (1.0 ㎍ / ml의 BAP, 0.1 ㎍ / ㎖의 NAA, 500 ㎍ / ㎖의 세포 탁심, 100 ㎍ / ㎖의 카나마이신 포함) 우수 문화 매체에 전송 잎 조각.
    10. 촬영 형성을 유도하기 위해 16 시간 / 8 시간 주간 / 야간 정권 25 ° C에서 기후 챔버 2 ~ 3 주 동안 번호판을 품어. 계대 1.0 ㎍ / ml의 BAP, 0.1 ㎍ / ㎖의 NAA, 500을 함유하는 신선한 식물 고체 배지에 잎 절편을 전송하여 모든 이주㎍ / ml의 세포 탁심, 100 ㎍ / ㎖의 카나마이신.
    11. 촬영은 500 ㎍ / ㎖의 세포 탁심과 루트 형성을 유도하는 100 ㎍ / ㎖의 카나마이신을 포함한 고체 배지를 포함 마젠타 색 박스로 전송 나타나면. 1~2주 25 ° C에서 16 시간 일 / 8 시간 밤 광주와 묘목을 품어.
    12. 때 뿌리의 형태, 온실에서 토양에 식물을 전송합니다.
    13. 각 공장의 잎 조각을 수집하고 상용 키트와 함께 게놈 DNA를 분리.
    14. PCR에 의해 특정 유전자의 존재를 검출. 다음 유전자 특이 적 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을위한 주형으로서 게놈 DNA 30 ng의 사용 : 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 '와 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', 58 ° C의 어닐링 온도에서 20 초간의 신장 시간 . 50 ㎕의 총 부피에서 PCR 반응을 수행한다.
    15. 트리스 - 아세테이트 - EDTA (TAE) 완충액 중 1 % 아가로 오스 겔 (40 mM의 TR 전기 영동에 의해 220 bp의 생성물을 분석), 20 mM의 아세트산 및 1 mM의 EDTA.
    16. 대상 유전자를 포함하는 형질 전환 식물을 선택합니다.
    17. 선택된 형질 전환 식물체의 각에서 잎 조각을 수집하고 즉시 액체 질소에 동결.
    18. 식물 잎 조직 (단계 3.1.3)에서 총 단백질 추출물을 준비하고 이전에 가장 재조합 단백질 발현 담배 공장을 선택하려면 2를 설명한대로 웨스턴 블롯 분석에 의해 각각의 샘플을 테스트합니다.
    19. 교차 수분을 방지하기 위해 개화하기 전에 선택한 최고의 성능 공장의 가방 꽃.
    20. 피는 과일 숙성 종자 건조 후, 가방을 수집합니다.
    21. 왕겨에서 분리 씨와 온도 조절 (20 ~ 24 ° C에서)에서 건조한 장소에 보관하십시오.
    22. 2 세대 형질 전환 식물을 생산하고 이후 자체 수분으로 최고 성능의 시스템을 선택하기 위해 건조 된 씨앗을 뿌리고.
    23. 후속 세대 2.4.19-2.4.21 단계에서 설명 된 것과 동일한 절차를 반복한다.

    3. 재조합 단백질 발현 분석

    1. 총 단백질 추출 :
      1. 세균 세포 :
        1. TBS 버퍼의 절반 배양 부피, 단계 2.1.5에서 설명 된 바와 같이 수집 된 박테리아 세포 펠렛을 재현 탁 (TBS - 2 mM 트리스 / 염산, 500 mM의 염화나트륨) 1 밀리미터 phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)로 보충하여 pH 7.4.
        2. 얼음에 샘플을 유지하면서 초음파 처리는, 반 전력에서 40 초 동안 세포 펠렛을 세 번 재현 탁.
        3. 4 ℃에서 20 분 동안 14,000 XG에서 원심 분리 해물을 명확히.
        4. 전송 깨끗한 튜브에 뜨는는 -80 ° C에서 별도로 뜨는 펠렛을 모두 저장합니다.
        5. 격렬한 실온에서 밤새 진탕하여 6 M 우레아로 보충 TBS 산도 8.0의 절반 세포 용해질 부피, 펠릿 수집 봉입체를 가용화.
        6. 실온에서 25 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기 깨끗한에서 상층 액을 수집튜브.
        7. -80 ° C에서 모두 뜨는 펠렛을 저장합니다.
      2. 곤충 세포 :
        1. (- 137 mM의 NaCl을, 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4 PBS)의 pH 7.4 인산염 완충 생리 식염수 1 ml로, 단계 2.2.12에 설명 된대로 수집에 감염된 곤충 세포 펠렛을 씻으십시오.
        2. 용해 완충액 200 μL에 재현 탁 셀 (20 mM 트리스 / 염산 pH를 8.0, 0.5 M의 NaCl, 3 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 1 % 트윈 -20) 30 분 동안 얼음 위에서 배양한다.
        3. 원심 분리기는 4 ° C에서 20 분 동안 14,000 XG에서 세포를 용해.
        4. -80 ° C에서 용해 분수와 저장소를 수집하고 펠렛을 폐기합니다.
      3. 식물 잎 조직 :
        1. 갈기 N. benthamiana 또는 N. 박격포와 유 봉 사용하여 액체 질소의 미세 분말에 tabacum 조직.
        2. 추출 버퍼 300 μL에 지상 조직 100 mg의 균질화 (40 mM의 헤 페스의 pH 7.9, 5 mM의 DTT, 1.5 %의 CHAPS), 석류프로테아제 억제제 칵테일의 3 μL와 emented과 얼음에 해동.
          주 : 식물 조직 무게 (g) 사이의 선택 비는 부피 (㎖)를 버퍼 1 : 3이다.
        3. 4 ℃에서 30 분 동안 30,000 XG에 원심 분리기 추출물.
        4. -80 ° C에서 깨끗한 튜브 및 저장소에 뜨는 수집합니다.
    2. 쿠마시 염색 겔 :
      1. 추출 완충액 10 μL의 최종 부피 전체 단백질 추출물 (예를 들면, 식물 추출액 2㎕의 세균 및 곤충 추출물 5 μL)의 적절한 희석액을 준비하고 3X 샘플 버퍼 5 μl를 추가 (1.5 M 트리스 / 염산 pH를 6.8, 1X 최종 농도 3 % SDS, 15 % 글리세롤, 4 % β 메르 캅토 에탄올).
      2. 10 분 동안 삶아 샘플.
      3. 10 % SDS-PAGE에 의해 분리 된 단백질.
      4. 전기 영동 한 후, 약 2 분 동안 전자 레인지에서 쿠마 용액 A (0.05 % 브릴리언트 블루 R-250, 25 % 이소프로판올, 10 % 아세트산)의 존재하에 가열 겔비등점까지의.
      5. 부드러운 흔들림 실온에 젤을 냉각.
      6. 폐기 쿠마시 염색 액 A.
      7. 쿠마 용액 B의 존재 하에서 가열에 의해 Destain 겔 (0.05 % 브릴리언트 블루 R-250, 25 % 이소프로판올), C (0.002 % 브릴리언트 블루 R-250, 10 % 아세트산) 및 D (10 % 아세트산)마다 염색 동일한 프로토콜에 따라.
      8. 배경 9 분명하다까지 솔루션 D와 마지막 가열 단계 후, 젤 탈색을 둡니다.
    3. 웨스턴 블롯 분석 :
      1. 전기 영동 후, 전송을 실온에서 1 시간 동안 PBS pH를 7.4에서 표준 기술 및 4 %의 우유를 사용하여 블록 한 다음, 니트로 셀루 로즈 막으로 단백질을 분리 하였다.
      2. 4 ℃에서 하룻밤 부화 블롯 또는 1 표적 단백질에 대해 발생 된 토끼 차 항체 함유 블로킹 용액에 실온에서 4 시간 동안 10,000 및 0.1 % 트윈 -20로 보충한다.
      3. 차 항체 라벨 후ING는 0.1 % 트윈 -20을 함유하는 차단 용액을 5 분마다 막 3 회 세척 하였다.
      4. 하나의 호스 래 디쉬 퍼 옥시 다제 (HRP) 공역 항 - 토끼 항체와 인큐베이션 : 10000 시간 1.5.
      5. 워시 막 5 분 PBS-T 각각 5 배 (PBS 0.1 %가 트윈 (20)와 보충).
      6. 화학 발광 퍼 옥시 다제 기판을 이용하여 웨스턴 블롯을 처리합니다.
    4. 방사선 면역 분석 (RIA)
      1. 시약 (항혈청, 추적 및 단백질 파로스)는 실내 온도와 피펫 12 X 75mm의 폴리스티렌 튜브에 (재조합 상업 hGAD65의 300-2,400 ng를 / ㎖에서) 서로 다른 농도의 단백질 추출물 시료와 표준의 20 μl를 도달 할 수 있습니다.
      2. 항혈청의 20 μl를 추가 1:30 T1D 환자의 혈장에서 혈청을 희석 준비했다.
      3. 추적자 (125-I-GAD65)의 50 μl를 추가하고, 실온에서 2 시간 동안 배양한다. 단지 전체 활동을 추정하기 위해 추적에 튜브를 설정합니다.
      4. 50 μl를 추가단백질 파로스 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
      5. 차가운 PBS 1 ml를 30 분 동안 4 ° C에서 1,500 XG에서 각 튜브와 원심 분리기로 버퍼 분배.
      6. 상층 액을 제거하고 부드럽게 튜브를 눌러 압지에 잔류 액체를 흡수하기 위해 튜브를 가만히 따르다.
      7. 측정은 감마 카운터에서 1 분간 계산하여 모든 튜브에 방사능 면역.
      8. 로그 스케일 플롯 활동과 관련된 총 교정기의 결합 비율 (B / T의 %)은, 표준 곡선을 설정하고, 검량선 10 GAD 오프 샘플의 농도를 판독한다.
        참고 : 제한된 영역은 저장, 처리 및 방사성 물질의 처리를 위해 설계되어야한다.

Representative Results

다른 생산 시스템의 목표 재조합 단백질의 이종 발현을위한 실험 설계는 여기에 설명되어 있습니다. 제 1 초점 각 시스템에서 목적 단백질의 발현을 위해 최적의 조건을 설정함으로써 다른 플랫폼의 셋업이다.

표적 단백질의 발현 hGAD65mut는 E. 중으로 유도 하였다 대장균 문화. 37 ° C에서 3 시간의 발현 후, 균체를 원심 분리에 의해 수집하고, 초음파 처리에 의해 용해. 원심 분리 단계 이후에, 수용성 단백질은 불용성 봉입체 분리 및 초기 분석 (데이타 미기재) hGAD65mut은 불용성 봉입체에서 축적 prevalently 것을 증명 하였다. 재조합 단백질 용액 화는 강한 변성 속성, hGAD65mut 불가 적절한 정량을, RIA 분석을 방해하는 요소 6 M의 사용이 필요합니다. 몇 가지 전략이 될 수있다EN은, 봉입체의 형성을 제한하는 낮은 온도에서 11 균체 성장하기위한보고. 배양 물은 15 ° C, 20 ° C에서 성장하고, 재조합 단백질의 발현이 동일한 온도에서 유도 하였다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, hGAD65mut의 용해 화 다시 우레아 (레인 S2)이 필요 양쪽 온도에서 제조. 따라서,이 실험에서 낮은 온도는 불용성 집계를 형성하는 hGAD65mut을 방지하지 않습니다.

hGAD65mut 서열 (Baculo.G65mut)을 함유하는 배큘로 바이러스 벡터를 부착하여 Sf9 세포 배양에서 발현시켰다. V1 및 V2 높은 역가의 주식을 제조하고 최고 성능의 감염 조건은 5 ~ 50 μL에서 다른 바이러스 성 재고 수량을 평가 설정했다. 도 1b에 도시 된 바와 같이 RIA에 의해 평가로서, 최적의 바이러스 스톡 량은, 배양 배지 1 ㎖ 당 재조합 단백질의 11.8 ± 0.8 μg의 산출 25 μL로 확인되었다분석 (표 1).

다음 침투, agroinfected N.의 시간 과정 분석 benthamiana 잎이 두 일시적 발현 시스템에서 수행 하였다. pK7WG2 기반 시스템의 경우, 잎 시료 1-5 범위 dpi로 매일 모으고, 총 가용성 단백질 (TSP)를 추출하고, 동일한 양의 TSP는 웨스턴 블롯 (도 1C)에 의해 분석 하였다. 이 분석은 표적 재조합 단백질의 최대 누적 2 dpi로 도달되는 것을 강조 하였다. 그러므로, 잎이 dpi로 수확하고, 단백질 추출물을 67.8 ㎍ / g의 FLW (신선한 잎 중량, 표 1)의 평균을 나타낸다 재조합 단백질의 축적을 측정하는 RIA 분석 하였다. 재조합 단백질의 발현 수준은, 본 시스템으로, 상기 (12) 또는 프로 P19 HC 같은 전사 후 유전자 음소거 (PTGS)의 억제와 잎을 공동 함침함으로써 개선 될 수있다.

동시에 코스 검출 N. 행했다 benthamiana는 MagnICON 벡터와 agroinfected 잎 : 감염된 잎은 웨스턴 블롯 분석 하였다 TSP의 1-8 dpi로와 같은 양을 수집 하였다. 이 분석에 의해 평가 RIA 최대로 재조합 단백질 축적, 78.8 ㎍ / g의 FLW (표 1) 재조합 단백질의 평균 축적으로 dpi의 4 (도 1D)을 수득 것을 보여 주었다.

형질 전환 담배 식물 hGAD65mut의 발현은 이전에 재조합 단백질 수준은 독립적 형질 전환 라인들 중에서 상당히 변화 보여주는 12보고되었다. 최고 성능의 hGAD65mut T1 유전자 변형 식물 자체 교차했다 및 파생 식물 (T2)가 다시 최고의 하나를 수행 선택을 분석 하였다. 이 절차는없는 때까지 RIA에 의해 각 세대의 성능을 확인, 균일 한 생산 플랫폼을 개발하기 위해 여러 세대에 걸쳐 반복했다더욱 개량 (데이터는 제시하지 않음)을 달성 하였다. 그림 1E에서, T5 형질 전환 식물의 대표 웨스턴 블롯은 재조합 단백질 수율의 동질성은 분명이고,보고됩니다. 도 1F에 도시 된 바와 같이, 평균 hGAD65mut 수율 선택 과정 99.1 ㎍ / g의 FLW (표 1)의 레벨에 도달 T6으로 T2에서 증가 된 발현 레벨의 표준 편차가 감소했다.

그림 1
그림 1 :. 플랫폼 설정까지 각 플랫폼에 hGAD65mut 발현을위한 최고의 조건을 설정합니다. (A) E. 대장균 유도 식 플랫폼입니다. 박테리아 세포는 쿠마시 염색 컨트롤을로드, 15 ° C, 20 ° C. 상단 패널, 세포 추출물에서 hGAD65mut의 웨스턴 블롯 (레인 당 2 μg의의 TSP). 낮은 패널에서 성장했다. N이 .c. = 음성 대조군, 클로람페니콜 내성 유전자를 함유하는 pDEST17 벡터로 형질 전환 된 세균 세포; T : 총 샘플; S1 : 뜨는 초음파 및 원심 분리 후; S2과 P : 상층 (1) 펠릿 (2) 우레아 - 함유 버퍼를 가용화 시료의 원심 분리 후. (B) 배큘로 바이러스는 / 곤충 세포 플랫폼. 다음 바이러스 재고 수량은 시험 하였다 : 5, 25, 50 μl를 상단 패널, 세포 추출물에서 hGAD65mut의 웨스턴 블롯 (레인 당 5 μg의의 TSP)을 낮은 패널, 쿠마시 염색 컨트롤을로드... NC는 대조군, 비 형질 전환 된 곤충 세포의 추출물 =. N.에서 (C) 과도 표현 pK7WG2 벡터를 이용하여 식물 benthamiana. 샘플은 매일 1-5 dpi로 (차선 1-5). 위 패널, 잎 추출물 hGAD65mut의 웨스턴 블롯 (레인 당 2.5 μg의의 TSP)을 수집 하였다. 낮은 패널을, 쿠마, 큰 소단위로 염색 컨트롤을로드인, rubisco의 분명하다. NC = 음성 대조군은 GFP 마커 유전자를 운반하는 벡터 pK7WG2 침투 식물. (D) N.에 과도 표현 MagnICON 벡터를 사용하여 benthamiana 식물. 샘플은 매일 1-8 dpi로 (차선 1-8). 위 패널, 잎 추출물 hGAD65mut의 웨스턴 블롯 (레인 당 5 μg의의 TSP)을 수집 하였다. 낮은 패널을, 쿠마시 염색 컨트롤을로드하는 인, rubisco의 큰 서브 유닛은 분명입니다 . NC = 음성 대조군은 만 pICH20111 5'-모듈과 pICH14011 인테그라 모듈 침투 식물. 숫자는 kDa의 분자 질량 마커를 나타냅니다. PC = 양성 대조군, 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템에서 제조 된 상업용 hGAD65 15 NG. (E) 안정 발현 N. tabacum 식물. 리프 샘플 상이한 T5 식물 (레인 1-11)로부터 수집 하였다. 상단 패널, 잎 추출물 hGAD65mut의 웨스턴 블롯 (레인 당 5 μg의의 TSP). 낮은 패널, 컨트롤을로드 승 스테인드i 번째 코마. NC는 음성 대조군 야생형 식물 =. 숫자는 kDa의 분자 질량 마커를 나타냅니다. PC = 양성 대조군, 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 시스템에서 제조 된 상업용 hGAD65 15 NG. (F) N. 안정 발현 tabacum 식물. 에서 파생 된 여러 세대에 걸쳐 hGAD65mut 축적의 상자 그림 표현은 RIA 데이터로부터 계산 ㎍ / g의 FLW로보고 hGAD65mut T1 형질 전환 담배 공장 실적이 최고입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

체계 [hGAD65mut (㎍ / ㎖) [hGAD65mut]
바큘 / 곤충 117.5 ± 7.7 11.8 ± 0.8 ㎍ / ml의 배양 배지
Transien 22.6 ± 0.9 67.8 ± 2.7 ㎍ / g의 FLW
MagnICON 26.3 ± 5.9 78.8 ± 17.8 ㎍ / g의 FLW
엘리트 T6 33.0 ± 3.8 99.1 ± 11.3 ㎍ / g의 FLW

표 1 : - 발효기 기반 (바큘 / 곤충)과 식물성 (N.의 benthamiana에 pK7WG2-과 MagnICON와 N에 tabacum 엘리트 T6) hGAD65mut는 서로 다른 플랫폼에서 hGAD65mut 수율을 얻을 수 있습니다. 둘째 열 - 단백질 추출물 hGAD65mut 농도 (㎍ / ㎖). 세 번째 열 - 식물 기반 플랫폼 및 발효기 기반 플랫폼을위한 세포 배양 배지 (㎍ / ㎖)에 신선한 잎 무게 (㎍ / g의 FLW)에서 hGAD65mut 내용.

Discussion

박테리아 세포, 배큘로 바이러스 / 곤충 세포 및 식물 : 본 연구에서는 세 가지 플랫폼은 재조합 인간 단백질의 발현을 비교 하​​였다. (- MagnICON 및 pK7WG2 기반 - 안정적인 즉, 과도) 식물 기반 플랫폼은 더 세 널리 사용되는 표현 기술을 이용하여 탐구 하였다. 이 실험 hGAD65mut 위해 선택된 표적 단백질은 이전에 다른 시스템 (13)으로 표현되었고, 그것의 생산 및 기능은 쉽게 검출 및 측정 할 수있다 (14).

hGAD65mut는 봉입체를 형성하기 때문에 세균 세포 따라서 힘드는 가용화를 요구 및 원시 형태를 달성하는 폴딩에도 저온 성장 조건에서, 효율적인 생산 플랫폼 아니었다. 실제로 복잡한 재조합 단백질의 발현을위한이 플랫폼의 주요 장애는 최종 제품의 우측 형태이다.

배큘로 바이러스 / 곤충 세포 플랫폼은 면역 재조합 단백질의 고 발현을 중재하지만,이 발현 계의 주요 한계는 곤충 세포 성장에 필요한 배양 배지의 고비용이다. 이 hGAD65mut의 1g에 대한 총 생산 비용 (필수 곤충 세포 배양 배지의 9 L을 고려)이 생산 플랫폼 700 유로에 도달 할 수있는 것으로 추정되었다. 이 식 플랫폼의 또 다른 한계는 무균 조작 기술을 가진 인력을 필요로 곤충 세포의 무균 배양의 필요성이다. 세포를 감염하는 데 사용되는 바이러스 재고 수량과 바이러스 감염의 타이밍 : 두 가지 중요한 매개 변수를주의 깊게 발현 시스템에서 제어해야 효율적인 재조합 단백질 축적을 확인합니다. 또한, 이후, Sf9 곤충 세포로부터 총 가용성 단백질 추출에 사용 세제, 대폭 재조합 단백질 용액 화에 영향을 미친다.

식물 기반 시스템은 가장 유익한 플랫폼 전자이었다RM은 hGAD65mut을 표현 : 식물 만든 재조합 단백질은 면역과 잎 조직에서 높은 수준의 축적이었다. 다른 식물계 발현 시스템을 비교 높은 수율 안정한 형질 전환 담배 식물 (표 1)에서 달성되었으며, N. 비교 담배 총 생물량을 고려하면 일시적인 발현에 사용 benthamiana은, 담배의 전반적인 생산성은 분명하다. 그러나, 안정된 형질 전환 담배 식물 기반 플랫폼의 주요 한계는 연구에서 20개월했다 시스템의 셋업에 필요한 시간이다. 실제로, 라인 동형 재조합 단백질 발현 균질성으로 선정되어야하며, 그 선을 표현 높은 T1부터 자기 크로스 사이클을 반복하여 필요로 할 수있다. 선택한 T1은 유전자 변형 특성의 하나 이상의 복사본이 설정된 경우, 특히, 육종 3 년까지 걸릴 수 있습니다.

일시적인 발현 시스템은 제안때문에 변환 및 표현과 표현 플랫폼의 셋업 사이에 짧은 간격 빠른 업 스케일링의 장점은 4 일이 필요했기 때문이다. 그러나, 식물 유래의 과도 시스템 제한은 농업 침투 용 전용 고급 장비를 사용하지 않으면 그들의 자동화 실험실 규모에 거의 구현 가능하다는 것이다. 그러므로, 과도 - 기반 시스템을 사용 hGAD65의 대규모 생산을위한 적절한 위치 계산을 수행 할 수 없다. 반면에, 우리는 T6 안정된 담배 줄을 사용하여 재조합 단백질 1g 총 제작비 (60 담배 식물을 재배 토양을 고려하여) 이하 5유로에서 산출 될 수 있다는 것을 추측. (식물 발달 단계 성장하고 아그로 박테 리움의 침투 조건이) 여러 중요한 매개 변수를 신중하게 제어해야 효율적 agroinfiltration 및 단백질 생산을 위해, 앞서 15을보고합니다. 또한, 각각의 표현해야한다 특정 시간 코스 분석 실험재조합 단백질의 축적을 허용 높은 DPI를 선택하여 수행.

여기서 설명하는 예는 기존의 시스템에 비해 식물 기반 생산의 특정 몇 가지 장점을 강조 원리 증명 사례 연구, 고려 될 수있다. 특히, 균질하게 재조합 단백질을 발현하는 형질 전환 담배 라인은 큰 양으로 요구되는 재조합 단백질의 대량 생산에 유용한 플랫폼 간주 될 수있다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract Sigma Y1333
Tryptone Formedium TRP03
Agar Bacteriological Grade Applichem A0949
Sf-900 II SFM medium Gibco 10902-088
Grace’s Insect Medium, unsupplemented Gibco 11595-030
Cellfectin II Reagent Invitrogen 10362-100
MS medium including vitamins Duchefa Biochemie M0222
Sucrose Duchefa Biochemie S0809
Plant agar Duchefa Biochemie P1001
Ampicillin sodium Duchefa Biochemie A0104 Toxic
Gentamycin sulphate Duchefa Biochemie G0124 Toxic
Ganciclovir Invitrogen I2562-023
Carbenicillin disodium Duchefa Biochemie C0109 Toxic
Kanamycin sulfate Sigma K4000 Toxic
Rifampicin Duchefa Biochemie R0146 Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO
Streptomycin sulfate Duchefa Biochemie S0148 Toxic
Spectinomycin dihydrochloride Duchefa Biochemie S0188
IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside) Sigma I5502 Toxic
MES hydrate Sigma M8250
MgCl2 Biochemical 436994U
Acetosyringone Sigma D134406 Toxic – 0.1 M stock in DMSO
Syringe (1 ml) Terumo
MgSO4 Fluka 63136
BAP (6-Benzylaminopurine) Sigma B3408 Toxic
NAA (Naphtalene acetic acid) Duchefa Biochemie N0903 Irritant
Cefotaxime Mylan Generics
Trizma base Sigma T1503 Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer
HCl Sigma H1758 Corrosive
NaCl Sigma S3014 1 M stock
KCl Sigma P9541
Na2HPO4 Sigma S7907
KH2PO4 Sigma P9791
PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride) Sigma P7626 Corrosive, toxic
Urea Sigma U5378
β-mercaptoethanol Sigma M3148 Toxic
Tween-20 Sigma P5927
Hepes Sigma H3375
DTT (Dithiothreitol) Sigma D0632 Toxic – 1 M stock, store at -20 °C
CHAPS Duchefa Biochemie C1374 Toxic
Plant protease inhibitor cocktail Sigma P9599 Do not freeze/thaw too many times
SDS (Sodium dodecyl sulphate) Sigma L3771 Flammable, toxic, corrosive – 10% stock
Glycerol Sigma G5516
Brilliant Blue R-250 Sigma B7920
Isopropanol Sigma 24137 Flammable
Acetic acid Sigma 27221 Corrosive
Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67 Sigma G5163 Do not freeze/thaw too many times
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody Sigma A6154 Do not freeze/thaw too many times
Sf9 Cells Life Technologies 11496
BL21 Competent E. coli New England Biolabs C2530H
Protein A Sepharose Sigma P2545
Cell culture plates Sigma CLS3516
Radio Immuno Assay kit Techno Genetics 12650805 Radioactive material

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References

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