Geração de Murino Marcapasso Cardíaco Agregados célula com base na ES-Cell-Programação em combinação com Myh6-Promotor-Seleção

Developmental Biology

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Summary

Este protocolo descreve como produzir tecido nodal sinusal funcional a partir de células-tronco pluripotentes murino (PSC). T-Box3 (TBX3) superexpressão mais cardíaco miosina de cadeia pesada (Myh6) seleção antibiótico promotor conduz a agregados de células marcapasso altamente puras. Estes "induzida por sinoatrial-corpos" ("iSABs") contêm mais de 80 células marcapasso%, mostram altamente aumento das taxas de espancamento e são capazes de andar miocárdio ex vivo.

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Rimmbach, C., Jung, J. J., David, R. Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection. J. Vis. Exp. (96), e52465, doi:10.3791/52465 (2015).

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Abstract

O tratamento da "síndrome do seio doente" é baseado no marcapasso artificial. Estes suportar riscos, tais como falha da bateria e infecções. Além disso, eles não têm a capacidade de resposta da hormona e do procedimento geral é de custo elevado. "Pacemakers biológicos" gerados a partir de unidades de atendimento pode ser uma alternativa, no entanto, o conteúdo típico de células marcapasso em corpos embrióides (EBS) é extremamente baixo. O protocolo descrito combina "programação para a frente" de PSCs murino via o indutor TBX3 nó sinusal com a seleção antibiótico baseado Myh6-promotor. Isso produz agregados cardiomiócitos consistentes de> 80% de células marcapasso fisiologicamente funcionais. Estes "induzida por sinoatrial-corpos" ("iSABs") estão se contraindo de forma espontânea em frequências ainda não alcançados (400-500 bpm) correspondentes às células nodais isoladas de corações do rato e são capazes de andar miocárdio murino ex vivo. Utilizando o protocolo descrito seio altamente puracélulas individuais nodais pode ser gerada, o que por exemplo pode ser usado para o teste de drogas em vitro. Além disso, os iSABs gerados de acordo com este protocolo pode tornar-se um passo crucial para a engenharia de tecidos do coração.

Introduction

O termo "síndrome do nódulo sinusal", resume várias doenças que levam à deterioração do sistema de marcapasso cardíaco. Compreende patológico, bradicardia sintomática sinusal, bloqueio sinoatrial, parada sinusal, bem como a síndrome de taquicardia-bradicardia. Desse modo, a "síndrome do nódulo sinusal" é muitas vezes acompanhada por doenças cardíacas em geral, tais como doença cardíaca isquêmica, cardiomiopatias ou miocardite. Actualmente, as abordagens terapêuticas são baseadas na implantação de pacemakers eléctricos. No entanto, este vai, juntamente com um certo número de riscos, tais como infecções e falha da bateria. No geral, a incidência de complicações é ainda muito elevada em pacientes tendo implantado um marcapasso artificial. Além disso, ao contrário do pacemaker endógena, esses dispositivos não respondem à estimulação hormonal.

Uma alternativa futuro poderá contar com a disponibilidade de "pacemakers biológicas" para o qual poderia servir PSCscomo uma fonte celular adequada e que também seria muito valioso para o teste da droga em vitro. No entanto, um grande problema reside na aparência muito raro de células nodais sinusite dentro de corpos embrióides (EBS) - isso normalmente não ultrapassa 0,5% ~ 1.

Anteriormente, foi demonstrado que a "programação para a frente" no sentido de subtipos específicos de cardiomiócitos é viável através de sobre-expressão de fatores cardiovasculares precoces distintas de transcrição como o fator 1 (MesP1) específico-posterior-Mesoderma e NK2 transcrição relacionado, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. Para o tamanho e função do nó sinoatrial (SAN) normal, o T-box factor de transcrição Tbx3 é crucial, o qual tem sido mostrado para iniciar o programa de gene pacemaker e para controlar a diferenciação do SAN 4. Embora este reforço a aparência de células pacemaker funcional, o conteúdo ainda não exceda ~ 40% da população de células cardiomyocytic inteiro.

Portanto, uma etapa de seleção antibiótico baseado Myh6-promotor adicional de 5 foi introduzido por nós. Isto conduz, finalmente, para os agregados de cardiomiócitos ainda não observados ("corpos induzidos sino-atrial;" iSABs ") que exibem um aumento altamente frequências batendo (> 400 bpm) in vitro, para a primeira vez que se aproximam dos de um coração de murídeo e comparável ao cultivo in vitro células nodais sinusite isoladas de um coração murino 6. Sob a administração Isoprenalina batendo mesmo freqüências de 550 bpm são alcançados. Notavelmente, iSABs consistem em mais de 80% de células nodais funcionais, como é evidente a partir de extensa fisiológica analisa 7. Recentemente, várias abordagens para gerar células nodais seio usando reprogramação direta 19, marcadores de superfície 14 ou tratamento farmacológico com pequenas moléculas 16,17 foram descritos. No entanto, nenhum destes métodos conduziram a um tal elevado grau de pureza das células ea batendo frequências próximas da murino elearte como observado em iSABs.

Além disso, em um modelo ex vivo de fatias ventriculares adulto rato cultivadas que perderam a sua actividade batimento espontâneo, os iSABs são capazes de integrar no tecido fatia, mantendo-se, assim, espontaneamente ativa e enérgica estimulação as fatias de coração para contrações 7. Um protocolo detalhado para a geração destas iSABs é descrito neste documento.

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Protocol

1. Recomendações Antes da partida

  1. Não use PSCs contaminadas por micoplasmas, porque não vai diferenciar adequadamente nas células do nó sinusal. Teste para contaminação por micoplasma, antes de iniciar o protocolo. Faça isso usando um kit de PCR para detecção rápida, altamente sensível de micoplasmas e seguir o protocolo do fabricante.
  2. Para cada placa de Petri (passo 2.3.4), um casaco 10 2 célula cultura prato com estéril gelatina 7 ml de 0,1% a partir de pele de peixe de água fria durante 1 hora a 37 ° C cm. Retire a gelatina e deixe secar prato em condições estéreis em um banco estéril.
  3. Antes de começar o protocolo diferenciação você precisa de um duplo do mouse estável transf ES clone linha de células que contém as seguintes características: i) Constitutivo sobre-expressão de TBX3 usando um vetor de mamífero. Ii) O gene de resistência a G418, sob o controlo do promotor Myh6-5.
  4. As células indiferenciadas PSCs deve ser co-cultivard com células alimentadoras irradiadas em condições padrão como descrito 1.

2. Diferenciação Procedimento

  1. Dois dias antes Diferenciação - Retirar PSCs a partir de células alimentadoras.
    1. Aspirar o meio, lavar as células com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato PBS, adicionar 7 ml de solução de colagenase IV e incubar as células durante 10 min a 37 ° C. Coloque um 40 um filtro estéril em um tubo de 50 ml.
    2. Lavar cuidadosamente as colônias PSC (evitar para remover as células alimentadoras) pipetando a solução de colagenase cima e para baixo 5 vezes.
    3. Transferir a suspensão de células para um filtro de 40 um, lavar o filtro três vezes com 8 ml de PBS. Vire-se o filtro e colocá-lo de cabeça para baixo em uma placa de Petri. Retirar as colónias de células PSC pipetando 10 ml de PBS para o fundo do filtro.
    4. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar durante 5 minutos a 300 x g.
    5. Retire a PBS, suspender as células em 1 ml Accutase e incubate a 37 ° C durante 5 min.
    6. Adicionar 10 ml de PBS, misturar a solução de células por pipetagem para cima e para baixo cinco vezes e centrifugar durante 5 minutos a 300 x g.
    7. Remover o PBS, suspender as células em 10 ml de meio de cultura e determinar o número de células.
    8. Semente 15000 células / cm2 num balão de 2 filtro de 75 cm e cultivam-los durante 2 dias a 37 ° C, 5% de CO2. Após 2 dias, o frasco deve ser de 50-70% confluentes.
  2. Dia 0 - Início da Diferenciação
    1. Remover o meio e lava-se as células com 10 ml de PBS.
    2. Aspirar o PBS, adicionar 2 ml de Accutase e incubar as células a 37 ° C durante 5 min. Coloque um 40 um filtro estéril em um tubo de 50 ml.
    3. Adicionar 10 ml de PBS, transferir a suspensão de célula para o filtro de 40 um, lavar o filtro através da adição de 10 ml de PBS e centrifugar o fluxo de passagem de 5 min a 300 x g.
    4. Suspender as células em 10 ml de meio de diferenciação e determinar o número de células.
    5. Diluir tele de células em suspensão com meio de diferenciação para uma concentração final de 20000 células / ml.
    6. Pipetar 20 ml de água e 5 ml de solução de gotas (HD) numa placa de Petri quadrática para evitar a secagem de HDS da suspensão.
      NOTA: Para cada placa de 24 poços contendo iSABs (ver secção 2.8.6.4/2.8.7) começar com 16 placas de Petri.
    7. Pipeta até 50 ml suspensão de células em uma bandeja.
    8. Virar-se a tampa da placa de petri. Coloque 180 HDS cada uma contendo 20 ul (400 células / HD) suspensão de células sobre a tampa, utilizando uma pipeta de 12 canais.
    9. Vire com cuidado ao redor da tampa e coloque-a na placa de Petri.
      NOTA: A velocidade de virar a tampa é muito importante. Se a tampa é virada muito lenta ou muito rápida, a tensão superficial da suspensão de células não é suficientemente elevada para manter a suspensão gotas na tampa. Antes de tentar produzir HDs para primeiro treino tempo girando em torno da tampa com 20 gotas mL de meio.
    10. Cultivar as células durante 2 dias a 37 ° C, 5% de CO 2 para que eles formam EB.
      NOTA: Coloque um prato de Petri cheio de água no topo de uma pilha de cinco placas de Petri. Caso contrário, o HD na placa de petri superior vai secar.
  3. Dia 2
    1. Cuidadosamente gire em torno da tampa do prato Petri quadrática e transferir os CEs derivadas de duas placas de Petri (360 EBS) para um tubo de 50 ml.
    2. Aguarde 10 minutos para deixar as EBs se depositam no fundo do tubo (Não centrifugar o EBS).
    3. Aspirar o meio tanto quanto possível, os CEs suspender em 10 ml de meio de diferenciação e transferir a suspensão para uma placa de Petri de 10 cm.
  4. Dia cultura 2-6 Suspension
    1. Cultivar as CEs em suspensão durante 4 dias a 37 ° C, 5% de CO 2, alterar forma, após 2 dias.
      NOTA: Mesmo que a placa de Petri, não revestido (como oposição a um prato de cultura de células) a EB frequentemente aderem à superfície. Controlar as placas de Petri para EBs anexados a cada dia e se destacam necessário EBSa partir da superfície por pipetagem suave. Opcional: Agitar as placas de petri de forma contínua durante o período de cultura em suspensão. Tenha cuidado com a velocidade do agitador. EBS deve nem acumular no meio nem flutuar até a fronteira das placas de Petri.
  5. Dia 6
    1. Transfira as EBs de uma placa de Petri com uma gelatina revestidos 10 centímetros 2 célula cultura prato.
  6. Dia 12/07
    1. As células devem começar a vencer depois de 8-12 dias. Verificar para bater focos das células diariamente sob um microscópio. As células começam a formar uma camada.
    2. Alterar médio diário.
      NOTA: Depois de mudar médio, as células necessitam de 3-4 horas para recuperar e começar a bater novamente.
  7. Dia 15/12 Seleção de células nodais de sinusite.
    1. Três dias após as células começaram a bater (por volta do dia 12-15), Aspirar o meio e pipeta 10 ml de meio de diferenciação fresco contendo 400 ug / ml de G418 para as células.
  8. NOTA: É possível que a camada de células já está separado da superfície.
    1. Retire cuidadosamente o meio sem aspirar a camada de células.
    2. Adicionar 10 ml de PBS e cuidadosamente remover o PBS sem aspirar a camada de células.
    3. Adicionar 10 ml de solução de colagenase IV, transferência das células para um tubo de 50 ml e incuba-se as células a 37 ° C durante 5 min.
    4. Misturar vigorosamente a suspensão por pipetagem para cima e para baixo 10 vezes e incuba-se as células a 37 ° C durante 5 min. Uma suspensão de pequenos aglomerados deverá ocorrer. Se ainda há enormes partes da camada de esquerda, em seguida, repita o passo mais 2.8.4 duas vezes.
    5. Adicionar 20 ml de PBS e centrifugação durante 10 min a 300 x g.
    6. Aspirar o PBS com cuidado.
      NOTA: Se iSABs devem ser gerados continue com o passo 2.8.7. Se ISAB sinusite derivada de células individuais nodais devem ser geradas continuar com o passo 2.9.
    7. Suspender as célulasem 12 ml de meio de diferenciação contendo 400 ug / ml de G418 e semear-los em 6 poços de 24 poços revestidas com gelatina (2 ml / poço).
  9. Geração de célula nodal single.
    1. Suspender as células a partir do passo 2.8.6 em 5 ml de Accutase e incubar a 37 ° C durante 5 min.
    2. Misturar vigorosamente a suspensão por pipetagem para cima e para baixo 10 vezes e incuba-se as células a 37 ° C durante 5 min.
    3. Adicionar 20 ml de PBS e centrifugação durante 5 min a 300 x g.
    4. Suspender as células em 12 ml de meio de diferenciação contendo 400 ug / ml de G418 e semear-los em 6 poços de uma gelatina revestidos 24 poços (2 ml / poço).
  10. Dia 2 após dissociação, aspirar o meio e lava-se as células três vezes com PBS. Adicionar 1 mL de meio de diferenciação / poço.
  11. Dia 08/04, após a dissociação, mudar Medium cada dia. No dia 10 após o uso Dissociation iSABs ou ISAB seio derivado nodal células individuais estão disponíveis para análise posterior.

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Representative Results

O protocolo descrito permite a geração de iSABs com uma freqüência de batimento de cerca de 450 bpm de unidades de atendimento (mostrados no filme), que fica perto da freqüência de batimento do coração mouse. Após dissociação de iSABs (passo 2.8.8) as células individuais observados mostram a forma típica de células do nódulo sinusal (células fusiformes e da aranha), como mostrado na Figura 1. Estas células proteínas altamente expresso, que são conhecidos como sendo essencial para a função do nó sinusal como ativada por hiperpolarização cíclico fechado de nucleotídeo cação canal 4 (Hcn4), Connexin45 (Cx45), Connexin30.2 (Cx30.2) e Myh6 (Figura 2A - C). Após o tratamento de células com isab derivados farmacêuticos, as células mostram o comportamento esperado: como no nódulo sinusal, o bloqueador de canal engraçado ZD7288 (Figura 3A), bem como o agonista de receptor muscarínico carbacol (Figura 3B), tanto provocar um batimento significativamente reduzida freqüência de deriv ISABcélulas ed. O agonista do receptor adrenérgico isoprenalina β leva a uma frequência de batimento elevada (Figura 3C).

Figura 1
Figura 1: forma Celular do fuso e da aranha células forma celular típica de ISAB fuso derivado (A) e aranha (B) célula nodal. Barra de escala 20? M.

Figura 2
Figura 2: Expressão de marcadores do nó sinusal. (A) Expressão de HCN4 (amarelo) e Cx45 (magenta), (B) A expressão de Cx45 (magenta) e Cx30.2 (amarelo) e (C) Myh6 (magenta) em células de nódulo sinusal. A contracoloração de núcleos (turquois). Barra de escala 20? M.


Figura 3: O tratamento farmacológico de iSABs representativas batendo frequência de iSABs antes (controlo) e após o tratamento com ZD7288 (A), carbacol (B) e isoprenalina (C). Os dados representam oito iSABs independentes e são apresentados como média ± SD. *** P <0,001

Figura 4
Figura 4: Representação esquemática do protocolo de diferenciação. Desenhos animados Simplificado refletindo o fluxograma experimental para geração ISAB.

Filme:. Espancamento de iSABs espancamento de um corpo sinoatrial induzida típico (ISAB) após dissociação Please, clique aqui para ver este vídeo.

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Discussion

A capacidade para produzir células estaminais derivadas de marcapasso cardíaco pode permitir a reconstituição de células do ritmo cardíaco adequado no sentido de "pacemakers" biológicos. Da mesma forma, o teste de drogas in vitro se beneficiará de sua disponibilidade. PSCs pode dar origem a qualquer tipo de célula do corpo dos mamíferos, incluindo os cardiomiócitos com propriedades de células marcapasso 8,9,10,11,12,13. No entanto, normalmente as populações de células dentro de "corpos embrióides" são altamente heterogêneo, o que inevitavelmente leva à exigência de estratégias de seleção e isolamento seguro - isso se aplica, em especial, para o tipo de célula muito raro de células nodais cardíacos. Inúmeras abordagens baseadas na superfície exógenos e endógenos marcadores 14, sobre a administração farmacológica de pequenas moléculas 15,16,17 e em estratégias de reprogramação direta 18,19 têm sido seguidas. Além disso, as abordagens não-tronco de células-base que visa imitar marcapassos biológicosatravés de manipulação de moléculas efectoras terminais subjacentes em vez de sarcolema electrofisiologia de novo gerando células nodais totalmente funcionais 20,21.

No entanto, nenhum destes veio com as frequências de contração necessárias altas espontâneas e pureza celular. Em contraste, o nosso protocolo leva a células que não só apresentam oscilações elétricas, mas também as características de sinalização eletrofisiológico e cálcio sutis, bem como distintivos características morfológicas das células marcapasso endógenos 7. Esta tecnologia pode tornar-se um requisito importante para alternativas aos dispositivos de estimulação eletrônicos.

Apesar de este protocolo foi otimizada durante o seu desenvolvimento, ainda existem alguns passos que podem causar problemas: O ponto de partida para a seleção de ISAB é crítico do protocolo. Beating das células é um indicador para αMHC-Expression na diferenciação das células. Myh6-Expression vai junto com expressão do gene de resistência a G418. A partir da seleção muito cedo vai extinguir um monte de células que potencialmente seria diferenciar em cardiomiócitos e, portanto, diminuir o rendimento global das células nodais de sinusite. Um outro passo crucial é a dissociação da camada de células (passo 2.8). A razão para isto é que as células formam uma matriz extracelular robusta e uma grande força é necessária para dissociar a camada de células. Se necessário, o passo 2.8.4 deve ser repetido até pequenos aglomerados de células se desenvolveram a partir da camada de células. Evite dissociação direta da camada de células por exemplo tripsina porque acabou por ser de muito baixa eficiência.

Para futuras aplicações clínicas, os seguintes obstáculos ainda precisam ser abordadas: a transferência da abordagem para a geração de iSABs humanos, que podem tornar-se um passo crucial para a terapia celular no futuro e de teste de drogas vitro. Além disso, a técnica ainda é baseado em modifi genética estávelcatiões de unidades e, por conseguinte, terá de ser modificado antes que possa ser aplicado aos doentes.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's liquid medium with stable glutamine Biochrom AG FG 0465
DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine Biochrom AG FG 0435
CLS type IV, CLS IV Biochrom AG C4-22
Non-essential amino acids Biochrom AG K 0293
FBS Superior Biochrom AG S 0615
Sodium pyruvate (100 mM) Biochrom AG L 0473
G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile Biochrom AG A 2912
Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile Brand 703409
Accutase eBioscience,Inc. 00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette Eppendorf 4861000155
Falcon Cell Strainer 40 µm Falcon 352340
Penicillin/Streptomycin  GE Healthcare P11-010
Petri Dishes Greiner BioOne 663102
DPBS without Ca and Mg PAN-Biotech P04-36500
Fetal bovine serum PAN-Biotech P30-3302
Leukemia inhibitory factor Phoenix Europe GmbH LIF-250
Quadratic petri dishes Roth PX67.1
Gelatin from cold water fish skin SigmaAldrich G7765
2-Mercaptoethanol SigmaAldrich M3148 
1-Thioglycerol SigmaAldrich M6145
Tissue culture dishes TPP 93100
Tissue culture flask TPP 90076
Tissue culture test plates (24 well) TPP 92424

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References

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