フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 1 hour trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

流れから白血球を募集する炎症を起こした内皮の能力は、間葉系間質細胞によって調節されている。我々は、フローからの好中球動員を評価し、間葉系間質細胞は、このプロセスの調節に果たす役割を調べるために使用することができる一次ヒト細胞を組み込んだ2 のインビトロモデルを記述する。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. Exp. (95), e52480, doi:10.3791/52480 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

間質細胞は、隣接する内皮細胞とのクロストークを通じて炎症の間に循環白血球の動員を調節する。ここでは、炎症を起こした内皮細胞によって流れから循環好中球の動員を研究するための2 のin vitro「血管」のモデルについて説明します。これらのモデルの主な利点は、 生体内で起こるように、順番に白血球接着カスケードの各ステップを分析する能力である。また、両方のモデルは、白血球動員を調節する際に、この場合、間葉系幹細胞(MSC)は、間質細胞の役割を研究するために適合させることができる方法を記載している。

初代内皮細胞は、Ibidiマイクロスライド上または24時間トランスウェルフィルターの両側に直接接触したヒトMSCを単独で、または一緒に培養した。培養物を、4時間、腫瘍壊死因子α(TNFα)で刺激し、フローベースの接着アッセイに組み入れた。好中球のボーラスを灌流した4分間の内皮上。好中球と内皮との相互作用を流れるの捕獲は位相差顕微鏡により可視化した。

両方のモデルでは、サイトカイン刺激は、用量依存的に流れる好中球の内皮細胞の動員を増加させた。動員された好中球の挙動の分析は、ローリングの用量依存的減少および内皮を通じて遊走の用量依存的増加を示した。共培養では、MSCは、TNFαで刺激された内皮への好中球の接着を抑制した。

当社のフローベースの接着モデルが循環から白血球動員の初期段階を模倣する。白血球に加えて、彼らはそのような治療的に投与MSCまたは循環腫瘍細胞のような他の細胞型の動員を調べるために使用することができる。我々の多層共培養モデルは、MSCが炎症性サイトカインに対する応答を変更するために内皮と通信することが示されている、alteri好中球の動員をngの。このようなモデルを用いてさらに研究が完全に炎症中の白血球の動員をどのように影響するか、間質の異なる組織や条件から細胞(炎症性疾患または癌)を理解するために必要とされている。

Introduction

炎症は、微生物感染または白血球に入ると解像度1,2を可能にするために炎症を起こした組織からの出口の厳しい規制を必要とする組織損傷に対する防御応答である。内皮細胞(EC)、その行血管、循環白血球および組織常駐間質細胞の間のクロストークは、このプロセス3を調整するために不可欠である。しかし、白血球およびそれらの無効なクリアランスの制御されない動員は、慢性炎症性疾患4の発展を支える。健康および疾患における白血球動員の我々の現在の理解は不完全であり、より堅牢なモデルは、このプロセスを分析するために必要とされる。

後毛細血管細静脈の血管ECを通して血液から白血球の動員を支援するメカニズムはよく1,2,5に記載されている。循環白血球は、特殊な受容体( 例えば、VCAM-1、E-セレクチン、P-セレクチン)によって捕捉される炎症性内皮上にアップレギュレートされている。これらの一時的な相互作用は、白血球が表面に結合したケモカインおよび白血球、6- 11で表さインテグリンを活性化する脂質由来メディエーター(起源の内皮または間質のいずれか)と対話することを可能にする。これは、次に接着性を安定化し、内皮を横断し、組織12〜15への移行を駆動する。組織内では、白血球がそれらの運動性、機能および生存16,17に影響与える間質由来物質にさらされている募集。成長している証拠は、信号は、次のために募集プロセス条件白血球の各段階で受信したことを示唆している。しかし、白血球動員の我々の理解は不完全のままと非常に少ないが、組織内のコンポーネント整形白血球の動きについて知られている。

バーミンガムでは、からの白血球の動員を研究するためのin vitroでのいくつかの「血管」モデルを開発してきました流れ9,18,19。私たちは現在、白血球動員の血管のEC行為として即時の規制当局は、地元の微小環境の変化に対応していることを理解しています。具体的には、組織常駐間質細胞が活発に動員3におけるそれらの役割に影響を与えるために、隣接する血管ECと会話によって部分的に、炎症反応を調節することができる。我々は以前、様々な間質細胞は、組織特異的に接着および白血球の移動をサポートするECの能力を調節することが示されており、これらの効果は、慢性疾患13,16,20,21における変化したことになる。このように、間質細胞を各炎症反応22のコンテキストを定義する組織「アドレスコード」を確立する。より最近では、我々は、骨髄由来MSC(BMMSC)は強力両方の好中球の動員の低下につながる、サイトカインに対するECの応答をダウンレギュレートし、23リンパ球ことを実証した。

メカニズムGOVerning募集が明らかにin vitroでは、分離して単一の細胞型( 例えば、EC)またはタンパク質を組み込んだアッセイを使用している。しかし、これらの研究を考慮に入れていない局所組織環境の影響( すなわち、間質細胞の存在)の白血球の動員に関する組織へのそれらのその後の移行。ここでは、間質細胞は、特に間葉幹細胞た二フローベースの方法(MSC)を表すEC 23と共培養する。このようなモデルは、流れから白血球動員をサポートするために、特に能力、我々は、内皮応答に対する間質細胞の効果を調べることを可能にする。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

初代ヒト内皮細胞と間葉系幹細胞の単離および培養

  1. ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)の単離および培養:
    1. ペーパータオルでトレイにへその緒を入れて、70%エタノールでスプレー。組織培養フードに置きます。両端の静脈とカニューレを挿入を識別します。それを確保するためにカニューレを挿入端部の周りにケーブルタイを配置します。
    2. PBSを注射器を使用して静脈血を洗浄する。空気で注射器を記入し、残留PBSを除去し、廃棄するように静脈を通過する。
    3. 10 mg / mlのコラゲナーゼタイプIaの解凍および1mg / mlの最終濃度にPBSで1:10(カルシウムとマグネシウムと塩化)を希釈する。両方のカニューレが満たされるまで、静脈内にコラゲナーゼ溶液を渡します。両端にカニューレ上のクランプを閉じます。
    4. 組織とトレイをカバーし、70%エタノールでスプレー。 37℃で20分間、5%CO 2インキュベーターにコードを配置します。
    5. コー​​ドを取り出しインキュベーターのとケーブルタイを締めます。 1分間静かにコードをマッサージします。 10mlのPBSで細胞懸濁液を洗​​浄し、50 ml遠心チューブに集める。
    6. 空気をシリンジに充填し、ステップ1.1.5で使用されるの50ml遠心分離管にPBSを集め、二回残留PBSを除去するために静脈を通過する。 RTで5分間400×gで遠心分離する。
    7. EC培地完全な1ミリリットル中に吸引し上清とペレットを再懸濁し。 EC培地は、35 / mlの硫酸ゲンタマイシン、10ng / mlのヒト上皮増殖因子、1μg/ mlのヒドロコルチゾン、を2.5μg/ mlのアンフォテリシンB、および20%ウシ胎児血清を補充したM199から成る。
    8. 25cm 2のフラスコに、EC媒体とECサスペンションの4ミリリットルを追加します。次の日に培地をした後、2日ごとに変更します。
    9. ECは玉石様の形態( 図1Ai)を示す。彼らは100%のコンフルエンスに達したときに接着アッセイのために、ECは、一般的に播種する(1.4節を参照してください。
  2. 人間の臍帯からウォートンのゼリー間葉系幹細胞(WJMSC)の単離:
    1. 新鮮な臍帯からか、既にECを単離するために使用されてきたコードからホウォートンゼリー由来MSC(WJMSC)を単離する。長さ5cmの片に臍帯をカット。血管を明らかにするために、長手方向に各部分をカット(2動脈[白、リジッド]と1静脈を[黄色、膨張した])。
    2. 無菌のハサミとピンセットを使用すると、血管を除去し、廃棄する。 3mmの3枚- 2へのすべての組織を切断する。 50ミリリットルの遠心分離管に3ミリメートル3枚-鉗子場所2を使用する。
    3. 100mg / mlのストック型コラゲナーゼIIを解凍し、希釈1:1mg / mlの最終濃度に10mlのPBSで100。 2万U / mlのストックヒアルロニダーゼを解凍し、1を希釈:400コラゲナーゼ溶液中で50 U / mlの最終濃度に。
    4. 組織断片を含む遠心管に酵素カクテルを加える。組織fragmenをインキュベート遅い回転装置上で37℃で5時間tsが。
    5. 細胞懸濁液を希釈1:5をPBSで。新しい50ミリリットル遠心管に100ミクロンの孔フィルターを置きます。 100μmのポアフィルター上に細胞懸濁液を注ぐ。
      注:残りの組織フラグメントは、フィルター上に保持され、細胞を50mlの遠心分離管に収集することができる。
    6. フィルタを破棄。 RTで10分間400×gで細胞懸濁液を遠心します。 12ミリリットルで上清を吸引し再懸濁WJMSCペレット完全なWJMSC培養培地(DMEM低グルコース、10%のFCSおよび100U / mlのペニシリン+100μg/ mlのストレプトマイシンミックス)。
    7. 75cm 2の組織培養フラスコ中のすべての細胞を播種する。 WJMSC培地完全な12ミリリットルと24時間後に培地を変更します。 3日間 - ごとに2培地を交換してください。 2週間以内に80%のコンフルエンス - 細胞が70に到達する必要があります。 WJMSC 70達するパッセージ- 80%のコンフルエンス(1.4節を参照)。
  3. 骨髄由来MSC(BMMSC)の拡大: 以前に24を説明したように、人間の骨髄由来MSC(BMMSC)を単離する。 15mlの遠心管に10ミリリットル予め温めMSC増殖培地(MSCGM)を加える。
  4. 2分間37℃の水浴中に置くことによってp2のBMMSCのバイアルを解凍する。 MSCGMを含む遠心管にBMMSCサスペンションを追加します。ピペッティングでよく混ぜる。
  5. RTで5分間400×gで遠心分離する。完全に上清を吸引。
  6. 1ミリリットルMSCGMに再懸濁細胞や血球計算器またはそのようなcellometerなどのデジタル細胞カウンターを用いて細胞数を計測する。
  7. 12ミリリットルMSCGMで1cm 2当たり6000細胞- 5000の密度で75cm 2の培養フラスコにシード細胞。 12ミリリットルMSCGMと24時間後に培地を変更します。 12ミリリットルMSCGMとフィードセルごとに2から3日間。
  8. BMMSC 70達するパッセージ- 80%のコンフルエンス(1.4節を参照)。細胞は、線維芽細胞の形態( 図1Aii)を示す。
  • EC及びMSCの分離: 25cm 2の培養フラスコから培地を吸引。約2分間の0.02%EDTAの2ミリリットルを追加します。吸引物EDTA、2mlのトリプシン(2.5 mg / mlの)を追加します。顕微鏡下で見る細胞がラウンドになるまで。
  • 細胞を剥離するために、フラスコをタップします。培養フラスコと転写懸濁液を15mlの遠心管に、(HUVEC用EC媒体、BMMSCためWJMSCおよびMSCGMためDMEM LGの細胞型に依存)8ミリリットルの培地を添加することによってトリプシンを不活性化する。
  • RTで5分間400×gで遠心分離する。上清を吸引し、下記のようにペレットを再懸濁。
    1. MSC 3mlの培養培地中で再懸濁ペレットの継代のために。 3つの別々の75cm 2の培養フラスコに11ミリリットルの培地を加える。 (3分割1)各培養フラスコに1ミリリットルの細胞懸濁液を加える。通路WJMSCと共培養アッセイにおける使用の前にBMMSC 3回(p3が)。
    2. 接着アッセイでEC又はMSCをシードするため- セクション23を参照してください。
  • 凍結MSC:
    1. 通路3デタッチMSCでは第1.4節で説明したように。 3ミリリットルの氷冷CryoSFMで吸引し上清および再懸濁。 1.5ミリリットルの氷冷クライオバイアルに細胞懸濁液をピペット1は、1mlのアリコート。冷凍コンテナにクライオバイアルを置きます。
    2. -80°CO / Nで容器に保管してください。液体窒素に移す。 MSCの解凍バイアル( 手順1.3.1従い- 1.3.6)を 。再懸 ​​濁5ミリリットルの培養液中のMSC(WJMSCまたはBMMSCための適切なメディアを選択)し、25cm 2のフラスコに播種する。
  • 2. Ibidiマイクロスライド上の内皮間葉系幹細胞の共培養の確立

    1. (; セクション1.4のように〜1.5×10 6細胞)のECのコンフルエント25cm 2のフラスコをトリプシン処理。 380μlのMSCGMに再懸濁EC(1×25cm 2のフラスコを、全ての細胞TY接着アッセイのために、2つの6チャンネルIbidiのマイクロスライド(〜1.25×10 5 /チャネル)シードますPESは)MSCGMで培養される。各チャンネルにEC懸濁液の30μlのを追加します(これは、毛細管現象による成長エリアをカバーします)。 1時間CO 2を 37℃でIbidiのマイクロスライドをインキュベートし、5%。
    2. 各チャンネルに140μlのMSCGMを追加し、それをオフに吸引除去する。 3回の洗浄の合計のために二回繰り返します。 24時間CO 2を 37℃のインキュベーター中で140μlのMSCGMと場所を追加し、5%。
    3. 共培養のためには、MSC(1.4節切り離す。血球計数器またはcellometerを用いて細胞数を実行します。 1.5×10 5細胞/ mlにMSCの濃度を調整する。
    4. Ibidiチャネル(媒体中のチャンネルの唯一の成長分野を離れる)から吸引する過剰メディア。 IbidiチャネルにMSC懸濁液の30μlのを追加します。チャンネルの成長分野から排出された培地を吸引し、MSCのサスペンションの別の30μlを添加する。 <もう一度繰り返し、その後、37℃のインキュベーター中Ibidiのマイクロスライドを配置し、5%CO 21時間/サブ>。
    5. 各チャンネルに140μlのMSCGMを追加し、それをオフに吸引除去する。 3回の洗浄の合計のために二回繰り返します。 24時間CO 2を 37℃のインキュベーター中で各チャンネルの場所に140μlのMSCGMの最終容量を追加し、5%。
    6. 1×10 5 U / mlストックTNFαを解凍し、1希薄:100 U / mlの最終濃度(等価へ〜10ng / mlの)にMSCGMで1000。 10 U / mlのを得るために、MSCGMで1:10 100 U / mlのTNFαを希釈することにより、連続希釈を行います。 1 U / mlのを取得するために、MSCGMで1:10によって10 U / mlのTNFαを希釈する。
    7. アッセイの前に4時間、37℃でTNFαとのチャンネルを扱う。サイトカイン処理時の温度変動が観察された好中球動員のパターンを変える。未処理のチャンネルに新鮮なMSCGMを追加します。

    3.内皮間葉系を確立することはフィルター上の細胞共培養を幹

    1. 第1.4節で説明したようにWJまたはBMMSCを切り離します。ペレットを再懸濁1ミリリットルMSCGMで。血球計数器またはcellometerを使用して細胞数細胞を実行します。
    2. 最終濃度がMSCGMの500μlの5×10 5 MSCになるように音量を調整します。
    3. 滅菌ピンセットを使用すると、無菌ボックスで6ウェル、0.4μmのPETトランスウェルフィルターと場所を反転。
    4. フィルタの外 ​​表面上にシード5×10 5 MSC。 1時間、CO 2、37℃で、5%のフィルターをインキュベートする。
    5. フィルタの外表面からメディアを収集します。メディアにおける非接着MSCの数をカウントします。 3ミリリットルMSCGMを含む一致する6ウェルプレート中の滅菌鉗子と場所を使用して再反転フィルター。
    6. フィルタ( 図1B)の内面にMSCGMの2ミリリットルを追加します。 24時間CO 2を 37℃のインキュベーター中に置き、5%。 EC(; セクション1.4のように、図1Ai)のコンフルエント25cm 2のフラスコをトリプシン処理。
    7. 8ミリリットルMSCGMでECを再懸濁し(1×25センチメートル2フラスコのWi4つの6ウェルフィルターをシードちゃう。 〜5×10 5 EC /フィルタ)。多孔質フィルターの頂部及び底部から吸引する媒体。 (フィルターの下に)下部チャンバーに3ミリリットルの新鮮なMSCGMを追加します。各フィルタの内面に2ミリリットルEC懸濁液を加える。 37°Cで1時間、5%CO 2でインキュベート。
    8. 非接着ECを洗い流し、新鮮なMSCGMに交換する培地を吸引。最初の播種MSCずに内面に細胞を播種することにより、並列ECモノカルチャー·フィルタを設定します。 37℃でO / Nインキュベートし、5%CO 2。
    9. EC単層がコンフルエントで、隙間が含まれていないことを確認してください。サブコンフルエントな単層を、接着アッセイ( 図1B)のために使用することができない。
    10. 前( セクション2を参照)アッセイを4時間37℃で(〜10ng / mlのに相当)1、10、または100 U / mlのTNFαでのフィルターの上部および下部チャンバを扱う。

    白血球の4.絶縁

    1. 静脈を取る健康なボランティアと分量からすぐにEDTAチューブへの血液。反転チューブを静かに混合する。
    2. 10ミリリットルの丸底チューブで1119ヒスト2.5ミリリットルに1077ヒスト2.5ミリリットルレイヤ。ヒスト勾配上に層5ミリリットルの全血。 RTで40分間800×gで遠心分離する。
    3. (赤血球層の上)のHistopaque 1077と1119の界面での収穫周辺多形核好中球(PMN)。 10ミリリットルで行わ丸底チューブとPBSAで10mlに構成している。ゆっくりと室温で5分間400×gでチューブと遠心分離機を反転。
    4. (; PBSA w / v)の0.15%の最終濃度まで(カルシウムおよび塩化マグネシウムを有する)を100 mlのPBS中7.5%BSA溶液を1:50に希釈する。 10ミリリットルPBSAで吸引し上清および再懸濁。 RTで5分間400×gで遠心分離する。
    5. 1ミリリットルPBSAに懸濁します。細胞懸濁液の20μlのアリコートを取り、380μlのPBSA(1:20希釈)に追加する。血球計数器またはcellometerを用いて細胞数を計測する。必要なconceに希釈するPBSAでntration(1×10 6 / mlのトランスウェルフィルターとIbidiのマイクロスライド用)。アッセイまでRTでの好中球サスペンションを維持します。

    5.フローシステムを組み立てる

    1. 図1Cに示すように、フローシステムをセットアップする。ヒーターの電源を入れ、37℃に設定。 3ウェイタップに20ミリリットルのシリンジ(プランジャーを削除します)し、5ミリリットル注射器を取り付けます。微細孔テープを使用してパースペックスチャンバにタップを取り付けます。
    2. 約バルブ、3方向タップとの間の距離であるシリコン2/4ミリメートル(厚さ)チューブの長い部分を測定し、切断した。 1/3ミリメートル(薄い)チューブの10ミリメートル、長ピースと太いチューブの一端に挿入 - 8をカット。 3方向タップ上に厚いチューブ側を接続してください。
    3. 電子3ウェイマイクロバルブのポート上に薄いチューブの端を接続します。これは、「洗浄槽」である。厚いと薄いチューブの8ミリメートル長い作品 - 6をカット。
    4. 太いチューブの一端に細いチューブを挿入します。 ATT太いチューブが2ミリリットルの注射器の上に終わるACH(プランジャーを削除します)。
    5. 「試料容器」を作るために、電子マイクロバルブのポート上に2ミリリットルの注射器の薄いチューブの端を接続します。マイクロバルブ及び顕微鏡ステージの中心間の距離である細い管の長い部分を測定して切断することにより、フィルタフローチャンバーにバルブを接続する。
    6. 細いチューブの端に太いチューブの10ミリメートルピース - マイクロスライドモデルの場合、8を取り付ける。太いチューブの端にL字コネクタを配置します。これはマイクロスライドに接続します。細いチューブの端にチューブを接続するPortexブルーラインマノメータの10ミリメートルピース - フィルタモデルの場合は、8を取り付ける。
    7. マイクロバルブの上に薄いチューブ先端を置きます。これは洗浄およびサンプル貯水池のための一般的な出力です。 PBSAと貯水池を埋める。気泡を除去するためにそれらを介してPBSAを流すことによって、プライムチューブ。
    8. 29ミリメートル(50ml)中のガラスsに圧力計チューブを取り付けるyringe。首相10ミリリットルPBSAで充填することによって、注射器。チューブに接続された端部が上方に向くように、注射器を逆さにし、すべての気泡を押し出す。 5ミリリットルPBSAで補充します。
    9. ガラスシリンジにつながる圧力計のチューブの端に太いチューブの12ミリメートルピース - のみマイクロスライドモデルの場合は、10を取り付ける。太いチューブの端にL字コネクタを配置します。点滴/撤退のためのシリンジポンプにガラスシリンジを置きます。
    10. を0.1Pa(トランスウェルフィルター)0.05 Paの(Ibidiマイクロスライド)は以下の式を使用して、所望の壁せん断応力を生成するために必要なリフィル流量(Q)(τパスカルでワット 、ペンシルベニア)を計算する。
      (6.Q)/(WH 2)= ワット γ
      τ=n.γ
      W =内部幅と流路のH =内部の深さ。 nは、流れる溶液の粘度、 PBSAは、n = 0.7·sである平行平板フィルタ流チャンバーは、幅(w)は4mmであると深さ(h)は0.133ミリメートルである。 Dチャンバーのepthは、使用されるパラフィルムガスケットの厚さの違いにより若干異なる場合があります。 Ibidiのマイクロスライドのために、幅が3.8ミリメートルであり、深さは0.4mmである。
      注:ための流路の寸法の違い、そして我々はフィルタモデル6に比べてマイクロスライドモデルごとに異なるせん断応力を使用し、キャプチャダイナミクスへ。

    6.平行平板フロー商工会議所の組み込みフィルタの設定

    1. 金属テンプレートを使用してパラフィルム片(カバーガラスと同じ大きさ)に切断。金属テンプレートを使用して(流路を作成する)パラフィルムで20×4 mmのスロットを切り取り。カバーガラスの流路をマークするガスケットを使用してください。
    2. ガラスカバースリップ上の6ウェルフィルターの端を揃えます。フィルタは流路マーキングをカバーすることを確認してください。慎重にタイプ10Aはメスを使用してフィルタを切り出す。
    3. その流路を確保し、パラフィルムガスケットのフィルタを注意深くをカバースロットは、フィルタ( 図1D)の真ん中にある。クリーンな組織片を使用し、すべての気泡を押し出す。
    4. パースペックスのフローチャンバーの底板の凹部にカバースリップを置きます。ガスケットの上にトップパースペックスプレートを置き、一緒にプレートをネジ( 図1D)。
    5. 洗浄バッファー(PBSA)が弁を通って流れるように3方向タップをオンにします。トップPersexプレートの入口ポートに圧力計チューブを接続します。気泡が通過することを可能にする流路を介して実行PBSA。
    6. パースペックスプレートの出口ポートにシリンジポンプからの圧力計チューブを接続します。リフィルを押し実行するようにシリンジポンプを設定します。チャンバーの上部プレートに滴下しているすべてのPBSAを清掃してください。
    7. 反転位相差顕微鏡のステージ上のチャンバを配置します。フィルター上のEC( 図1B)を可視化するためにフォーカスを調整します。

    7. <フローのためのマイクロスライドの設定/ pの>

    1. 反転位相差顕微鏡のステージ上にマイクロスライドを置きます。チャネルの入口ポートにL字型コネクタを接続します。流路をPBSAを実行します。
    2. チャネルの出口ポートにシリンジポンプからL字コネクタを配置します。リフィルを押し実行するようにシリンジポンプを設定します。マイクロスライド上に滴下しているすべてのPBSAを清掃してください。 EC単層を可視化するためにピントを調整します。

    白血球オーバー内皮細胞の8灌流

    1. サンプルリザーバに精製された好中球の2ミリリットルを入れ、2分間温めておきます。 2分間PBSAで内皮を洗ってください。
    2. 内皮上の好中球を灌流するバルブをONにします。 4分間の好中球のボーラスを配信。バルブをOFFにし、実験の残りのための洗浄槽からPBSAを灌流。
    3. これはEC monolayが中断されるように、気泡がアッセイ中の任意の時点での流路を通過しないことを確認してくださいERおよび接着性好中球の原因剥離。

    9.録音好中球のキャプチャと行動

    1. どちら好中球の流れやポスト灌流中に記録好中球動員。
    2. 流路の中央に10個のフィールド - 少なくとも5のすべてのデジタル録音を行います。入口ポートにおけるチャンネルの端に目標を移動すると、ポートの中央を識別することによって、チャネルの中心を特定する。
      1. 好中球の流れの間に記録する場合、1分ごとに10秒単一のフィールドの画像を撮影する。チャネルに沿って移動し、1分間別のフィールドを記録する。ボーラスの期間について繰り返します。
      2. (好中球ボーラスの終了後に、典型的には2分)、白血球の挙動を評価するための流路の中央下に10フィールド - ポスト灌流を記録するために、図5の10秒の記録を行う。イメージを10秒間隔内の毎秒してください。これは流れ、付着の挙動から捕獲のための十分な時間を可能にする中球分析すべきフィルス。
      3. 画像ごとに30秒を取って、5分間、少なくとも10転生好中球を含む単一のフィールドを記録します。これは、(内皮上または下のいずれか)移動した細胞の速度を計算するために使用することができる。
      4. 10秒のフィールド(通常は9分後に灌流)別の一連を記録します。これは、好中球時間は内皮単層を通過して移動することができます。
      5. シリンジポンプを停止し、チューブを外す。フローチャンバーを分解し、試料容器とチューブをすすぐ。その後のフィルター/マイクロスライドチャンネルに対して繰り返します。

    白血球募集と行動の10の分析

    1. 2分の時点で10秒間の録音中に、各フィールドにおける好中球の数を数える。すべての細胞を計数するために、第1番目のフィールドに存在しなければならない。視野の2辺( 例えば、上/右境界)のフィールドに部分的に細胞が含まれている数限り、それらは完全な10秒間のフィールドに残るように。
    2. フィールドあたりの付着性好中球の平均数を計算します。記録されたフィールドの長さと幅を測定します。フィールドの面積を計算します。 1ミリメートル2であるかを多くのフィールドを計算します。 1ミリメートル2のフィールドの数によって平均好中球数を掛けます。
    3. 算出した好中球の量を乗じることによって灌流された好中球の総数は、ボーラス( 例えば、4分の持続時間によって( 例えば、2×10 6 / mlの* Q [パラレルプレートフローチャンバーのための、例えば、0.0999ミリリットル/分])を灌流)。
    4. 付着した細胞の総数(接着細胞/ mmの灌流10分の2 6)を決定するために灌流した好中球の総数で好中球数/ mm 2で割る。
    5. 接着性好中球がしっかりと接着性または( 補足ビデオ1と2)転生、ローリングされているかどうかを評価する。
      1. A好中球ローリング相明るく、ゆっくり内皮単層に沿って移動します(1から10ミクロン/秒、 補足ビデオ1)。
      2. しっかりと接着細胞のいずれか( すなわち、記録中に移動していない)、または形状変化を受けており、ECの表面( 図1Ei)上に移行している静止残り、EC面に相明るいと結合している。
      3. 外遊中球は暗く、EC層( 図1Eii)を下回る相である。
    6. 静止して遊出し、展開している接着細胞の割合を計算します。代替的に、好中球の動作が( - 10.7ステップ10.6に記載されているように)、総接着性を計算するために使用したのと同じ式を適用して異なる挙動を示し、総細胞数として表すことができる。
      1. マーク·ローリング好中球の先端。マーク10秒シーケンスの終わりに同じセルの先端。ラインベットを描く2点をWEENし、細胞が移動した距離を測定します。
      2. セルが圧延されている記録( すなわち、10秒)の持続時間によって、この値を割る。試してみて、全体の10秒間隔のフィールドである好中球を選択します。
    7. 表面(成形、変更された位相明るい)または内皮(位相ダーク)の下の上に移行する好中球の速度を計算する( 補足ビデオ2)を記録 、5分を使用しています。
      1. シーケンスの始めに移動した細胞の輪郭を描き、シーケンス全体で彼らの動きを追跡。セルごとに各1分間隔で重心のXとYの位置をメモします。第2の画像内の値からシーケンスの最初の画像から、XとYの位置の値を減算する。これは、ピタゴラスの定理に基づいています。
      2. 第三の画像から第二の画像から値を減算します。シーケンス内のすべての画像のためにこれを行う。スクエアトン彼は、XとYの値と一緒にそれらを追加。
      3. 平方根結果の値。各分間隔で計算速度を平均化することによって、各セルのための速度を計算します。トラック10は、好中球を移行し、平均速度を計算する。

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    当初、我々はIbidiのマイクロスライドモデル( - 9第7節使用して、フローからの好中球の募集にTNFαでECを刺激する効果を分析した。 TNFα、任意の好中球は、内皮単層に付着した小さな場合( 図2A)の非存在下で。これは、25,26を結合サポートするために必要な接着分子(セレクチン)またはケモカインを発現しないEC休止/未処理として、期待された。対照的に、サイトカイン刺激は、用量依存的に有意に( 図2A)において内皮への好中球の接着を増加させた。接着は通常、検定の過程で安定している。未処理の内皮への白血球の結合は、ECが活性化されるのいずれか( すなわち、培養プロセス中のLPSで汚染)および/ ​​または好中球は、分離プロセス中に活性化されたことを示している。実際に、LPSは、E-セレクチン、ICAM-1の発現およびVCを増加させることが示されたAM-1、それらが好中球に結合することができるようにECの表面上の25-27。

    募集好中球の挙動を分析するとき、私たちは通常、内皮単層( 図2C)を通って移動する好中球の割合で併用投与量依存的に増加した( 図2B)をローリング好中球の割合の用量依存的な減少を観察します。 TNFα刺激(1 U / ml)での低用量での好中球の大きな割合は、それらが内皮細胞( 図2B)の頂端表面に付着していることを示す位相明るく現れる。対照的に、10および100 U / mlの(より高い用量)で補充された好中球の約40%は、これらの細胞は、内皮単層を通って移動し、内皮細胞( 図2C)の下にあることを示す2分で相が暗く見える。転生がmに達すると、2分 - 好中球は、1内のECを通過して移動することができます〜の10分の後灌流28時aximalレベル。ここでは、9分後に灌流( 図2C)を2分で40%から60%の好中球遊走の増加を観察した。好中球 - (12ミクロン/分〜10)私たちは(〜3程度/秒)ローリングの速度にTNFα濃度の何の効果も認められなかっまたは移行。

    フィルタベースのモデルにおいて、TNFα刺激は、Ibidiのマイクロスライドモデル( 図3A)を使用して見られるのと同様の用量依存的に好中球の接着を増加させた。パーセント遊走の用量依存的増加( 図3C)が観察された一方で挙動に関して、好中球のローリングは、TNFα投与量( 図3B)によって影響されなかった。この一連の実験において、我々は、好中球遊走( 図3C)上の時間の有意な効果は観察されない。

    我々は2つ​​の異なる共培養構築物を生成する方法の方法のそれぞれを提供するその具体的な質問に答えるように工夫されている。 Ibidiのマイクロスライドモデルでは、EC及びMSCは、互いに直接接触している単一の単層で培養される。このモデルは、血中へのMSCの治療注入の効果とEC単層へのそれらのその後の統合を検討するのに便利です。フィルタベースのモデルでは対照的に、ECおよびMSCは近接フィルタの両側の培養が、必ずしも直接接触している。これは、より密接に、内皮細胞が血管を表す単分子層を形成することで、組織に似ており、MSCは、内皮下の区画に存在する。これは、私たちは、サイトカイン刺激に対するECの応答上の組織常駐MSCの効果を調べることができます。

    私たちの経験に基づいて、我々は、ECが100 U / mlのTNFαで刺激されると、最大の好中球動員及び経内皮移動が発生することを確認します。このように、我々は、MSCの共培養の効果を調べるために、この濃度を使用しているフローからの好中球の内皮募集に関する。ここでは、マイクロスライドとフィルタベースのモデルを使用してECの共培養でBMMSCのデータを提示するが、MSCの他のタイプはまた、例えば、WJMSC調べることができる。 EC単独で培養された( 図4A)と比較した場合、両方のモデルにおいてBMMSCの存在は、ECへの好中球の接着を減少させた。圧延および遊出の同様のレベルは単独で培養EC上で観察またはMSC( 図4BおよびC)とを共培養は、動員された好中球の挙動に影響を及ぼさなかった。したがって、MSCは、流れから好中球動員を支持する能力を抑制するサイトカイン刺激に対するEC応答を変更することができる。

    図1
    図1. EC-MSCの共培養の確立及びフローベースの接着アッセイを使用して、好中球動員を分析する。(A) (i)の主要なEC及び組織培養フラスコ上で増殖させた(ii)の継代3 BMMSCの強い>顕微鏡写真。、6ウェルトランスウェルフィルターインサート上で培養EC及びMSCの(B)の顕微鏡写真。生成するために使用される灌流システムの(C)図フローからECへの動員を次のフロー(FA)にしっかりと付着した(i)の(D)の平行平板フィルタフローチャンバの略図。(E)顕微鏡写真、および(ii)(TM)遊出好中球は、100 U / mlのTNFαで刺激。 画像CとD分子生物学の方法では、図2及び図3から取得されます:。スプリンガー科学とビジネス·メディアからの親切な許可を得て、T細胞移動、2010、PG 53-54 28 本の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。


    Ibidiマイクロスライドを用いてTNFαで刺激されたECのフローから図2の好中球の動員 ECTNFαの濃度を増加させながら刺激した - 4時間(0〜100 U / ml)を。好中球の4分のボーラスは0.05 PaのEC単層の上に灌流した。2分で評価(A)好中球の接着。 ANOVAは、好中球の接着はp <0.01でのTNFα処置の有意な効果を示した。好中球の動作は2,9分で評価し、(B)ローリングまたは(C)遊出した接着細胞のパーセンテージとして表した。 ANOVAは、接着性好中球はp <0.001の挙動にTNFα処置の有意な効果を示した。 Cでは、ANOVAは転生した好中球P <0.01でかなりの時間を示した。データは、n = 3の実験から平均値±SEMである。 *はp <0.05および**ダネット事後検定によって刺激されていない(0 U / ml)のEC対照と比較してp <0.01。##はp <0.01および###ボンフェローニポストによって同じ時点で1 U / mlのECと比較してp <0.001テスト。

    図3
    フィルターベースアッセイを用いてTNFαで刺激されたECのフローから図3の好中球の動員 ECTNFαの濃度を増加させながら刺激した - 4時間(0〜100 U / ml)を。好中球の4分のボーラスは0.1 PaのEC単層の上に灌流した。2分で評価(A)好中球の接着。 ANOVAは、好中球の接着はp <0.001でのTNFα処置の有意な効果を示した。好中球の動作は2,9分で評価し、(B)ローリングまたは(C)遊出した接着細胞のパーセンテージとして表した。 Cでは、分散分析翔好中球の遊出の時刻とサイトカイン処置の有意な効果を結婚に、p <0.05。データは、n = 3の実験から平均値±SEMである。 **はp <0.01および***はp <ボンフェローニポストによって同じ時点で1 U / mlのECと比較してダネット事後検定。#(p <0.05)であることによって刺激されていない(0 U / ml)のEC対照と比較して0.001 -test。

    図4
    TNFαで刺激されたEC-BMMSCの共培養への流れから図4.好中球動員を。BMMSC前4時間100U / mlのTNFαでの刺激に24時間ECと共培養した。好中球の4分のボーラスは(A、C、E)マイクロスライド0.05 Paと(B、D、F)フィルタ0.1 PaのEC単層を介して灌流した。(AB)、好中球の接着は、2分で評価した。好中球の挙動は2と9メートルで評価された及び(CD)ローリングまたは遊出(EF)であった接着細胞の割合として表した。 C及びDにおいて、ANOVAは、好中球のローリングはp <0.05での培養条件の有意な効果を示した。 E及びFにおいて、ANOVAは、好中球の遊出、p <0.05での時間の有意な効果を示した。しかし、有意差はボンフェローニ事後検定によって、個々の治療間の遊出は観察されなかった。データは、n = 5の実験から平均値±SEMである。 * P <0.05、対応のあるt検定またはボンフェローニポストテストによるECの単一栽培に比べて。

    好中球のローリング速度の補足動画1.分析トランスウェルフィルター上で培養ECで4時間、100 U / mlのTNFαで刺激した。好中球のボーラスは、4分のためにECの上に灌流した。単一の10秒フィールドの代表デジタル化シーケンスは2を取っ分後に灌流。 10秒シーケンスの開始から終了までの単ローリング好中球の位置の変化は、好中球ローリングされた速度を計算するために使用することができる。

    好中球遊走速度の補足動画2解析 ECを4時間100 U / mlのTNFαで刺激したトランスウェルフィルター上で培養した。好中球のボーラスは4分間ECかけて灌流した。遊出した好中球の移動を追跡するために、単一の5分間のフィールドの代表的なデジタル化された配列。これは速度を計算するために使用することができる。

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    ここでは、炎症を起こした内皮によって循環好中球の動員を研究するための2 のin vitro「血管」のモデルについて説明します。これらのモデルの主な利点は、 生体内で起こるように、順番に白血球接着カスケードの各ステップを分析する能力である。我々は以前、TNFαで刺激されたEC 9,29を通じて用量依存的に好中球の接着の増加と転生を観察している。また、両モデルは、白血球動員上の間質細胞の効果を研究するために適合させることができる方法について説明します。ここでは、MSCは、Ibidiのマイクロスライドまたは多孔質フィルターの両側にECと共培養した。これは、両方の細胞型は、それによって互いの表現型応答を改変する、相互に通信することを可能にする。私たちは、MSCの存在は、TNFαで刺激されたECへの好中球の接着を抑制したことを、ここに示されており、これまでの研究23できた。これは間質細胞は、EC応答を改変することを示していますその後サイトカインおよびへの循環白血球の動員を変更します。

    上述のモデルに加えて、Cellixバイオチップ、Bioflux板とGlyotechパラレルプレートフローチャンバーは、内皮細胞を培養し、動員を観察するための表面を提供する市販の流路システムである。すべてのシステムでは、特定のパラメータは、内皮培養物を確立し、以下および以前の報告30,31で強調表示され、そのうちのいくつかのフローベースの接着アッセイを実行する一方で考慮されるべきである。サイトカイン応答に影響を与える可能性ヒドロコルチゾンなどの任意の抗炎症剤は、培養およびアッセイ18,29の間、培地から除外されるべきである。これらはEC単層を崩壊させるように、ECの培養中の流路に存在する気泡がないことを確認マイクロスライドIbidiを使用している場合。 cytokiする内皮単層の完全性を確認すべきである前に、NE-治療、好中球はBSAがマイクロスライド/フィルタをコーティングしており、単層のギャップに結合するであろうように。これは、TNFαは温度感受性であり、唯一の37℃での最大効果を有するため、ECは、サイトカイン刺激を通して37℃に維持されることを保証することも重要である。フローアッセイ自体については、適切な洗浄バッファーを選択し、我々は一般的に短いアッセイ(未満30分)となりましたアッセイのためにBSA(0.15%)を補充したM199培地のためのPBSAを使用します(1から48時間)30,31。最後に、これは流量、損害賠償のEC単層を破壊し、付着性好中球を活性化させるようにアッセイ中の流路に存在する気泡がないことを確認。

    ここで説明した多細胞のインビトロモデルの主要な利点の1つは、ECおよび間質細胞の間でのインビボ相互作用を複製する能力である。それは、 インビボで特定の間質成分の影響を分離することは困難であるそして制御された方法でそれらを変更します。我々のモデルでは、間質細胞は、ECと通信し、健康および疾患における炎症プロセスに影響を与えるかを解明するために操作することができる。例えば、我々は以前に、共培養中にMSCによりIL-6の産生を示したsiRNA技術を用いて、それらの免疫抑制効果は23のために必要であった。各モデルは、特定の問題、すなわち、白血球動員に組織常駐間質細胞(フィルタベースのモデル)または治療的に投与ストローマ細胞(Ibidiマイクロスライドと他の市販のシステム)の効果に対処するために使用することができる。両方の場合では、それらの生存を確実にするために、採用15,25への影響を評価するためのECにストローマ細胞の適切な比率を確立するために、異なる間質細胞型を滴定している。同様に、培養培地は、モデルに組み込まれた各細胞型との互換性が必要です。我々の手で共培養は、典型的には、間質細胞メートルで行われるedium 11,18,23,31。

    フィルタベースのモデルを使用して、我々は以前に、種々の間質細胞は、組織特異的に白血球の接着および遊走を支持し、これらの効果は、慢性疾患3において変化なるようにするECの能力を調節することが示されている。これは、間質細胞が活発に炎症組織24への白血球の動員を調節する組織特異的な「アドレスコード」を確立するという概念をもたらした。これらのモデルは、具体的には非常に詳細に募集の初期段階を調べるために設計されたが、(組織の中に離れて内皮からの、すなわち )内皮下スペース内の後続の移行を検討することはできませんされている。そのような静的なコラーゲンゲルアッセイ12,32などの多細胞、多層3D構築物は、動員これらの後者の段階を研究するためのより適切であろう。

    当社のフローベースの接着のモデルは非常に汎用性があります。私たちは、DESを持っている好中球動員の文脈におけるそれらの使用をcribedが、他の白血球サブセットは、同様の方法で調べることができる。また、EC 23によりMSC循環の動員を調査するIbidiのマイクロスライドシステムを使用し、これは、同じ接着カスケードを介して発生しているか否かの白血球について報告されている。同様に、これらのモデルは、動員および転移性腫瘍細胞株の取り込み、および内皮応答および白血球動員に対するそれらのその後の効果を調べるために使用することができる。あるいは、フィルタベースのモデルは、健康な組織13,21および疾患11,18,20の部位から間質細胞の異なるタイプ( 例えば、線維芽細胞、有足細胞、平滑筋細胞)を組み込むように適合させることができる。これはECおよび/または白血球上のレベルで作用する組織特異的調節経路の研究を可能にする。全ての場合において、疾患状態の範囲の通常の調節プロセスの破壊は、ケを識別するために調べることができるそして潜在的な新しい治療標的(例えば、IL-6およびTGFβなど)yの規制のメディエーター。慢性炎症の文脈では、これらの薬剤は、癌生物学における一つの腫瘍を標的とするために募集をオンにするためのそれらの使用を想像しながら、採用プロセスをスイッチオフするために使用され得る。

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Collagenase Type Ia Sigma C2674 Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Dulbecco's PBS Sigma D8662 With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
    1X Medium M199 Gibco 31150-022 Warm in 37 °C water bath before use.
    Gentamicin sulphate Sigma G1397 Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
    Human epidermal growth factor Sigma E9644 Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Fetal calf serum (FCS) Sigma F9665 FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
    Amphotericin B Gibco 15290-026 Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Hydrocortisone Sigma H0135 Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Collagenase Type II Sigma C6885 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    Hyaluronidase Sigma H3631 Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube Scientific Lab Supplies (SLS) 352360 Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
    DMEM low glucose Biosera LM-D1102/500 Warm in 37 °C water bath before use.
    Penicillin/Streptomycin mix Sigma P4333 Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    25 cc tissue culture flask SLS 353109
    75 cc tissue culture flask SLS 353136
    Bone marrow mesenchymal stem cells vial Lonza PT-2501 Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
    Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) Lonza PT-3001 Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
    EDTA (0.02%) solution Sigma E8008 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
    Trypsin solution Sigma T4424 Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
    Cryovials Greiner bio-one 2019-02 Keep on ice before adding before adding cell suspension.
    Mr. Frosty Freezing Container Nalgene 5100-0001 Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
    Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile Ibidi IB-80606 Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
    Cell tracker green dye Life technologies C2925 Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
    Cell counting chambers Nexcelom SD-100 Alternatively a haemocytometer can be used.
    Cellometer auto T4 cell counter Nexcelom Auto T4-203-0238
    Tumor necrosis factor α (TNFα) R&D Systems 210-TA-100 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
    6-well, 0.4 µm PET Transwell filters SLS 353090
    K2-EDTA in 10ml tubes Sarstedt Store at RT.
    Histopaque 1119 Sigma 11191 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    Histopaque 1077 Sigma 10771 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    10 ml round bottomed tube Appleton Woods SC211 142 AS
    7.5% BSA Fraction V solution Life technologies 15260-037 Store at 4 °C.
    20 ml Plastipak syringes BD falcon 300613
    5 ml Plastipak syringes BD falcon 302187
    2 ml Plastipak syringes BD falcon 300185
    3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm Micropore 1530-1 Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
    Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) Fisher Scientific FB68854 Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
    Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) Fisher Scientific FB68855
    Portex Blue Line Manometer tubing Smiths 200/495/200 Tubing leading to the syringe pump.
    3-way stopcock BOC Ohmeda AB
    Glass 50 ml syringe for pump Popper Micromate 550962 Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
    Glass coverslip Raymond A Lamb 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
    Parafilm gasket American National Can Company Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
    Two perspex parallel plates Wolfson Applied Technology Laboratory Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
    Electronic 3-way microvalve with min. dead space Lee Products Ltd. LFYA1226032H Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
    Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) Harvard Apparatus 70-2001 Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
    L-shaped connector Labhut LE876 To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
    Video camera Qimaging 01-QIC-F-M-12-C Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
    Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics 41N70000-61592 For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
    Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Springer, T. A. Traffic signals on endothelium for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration. Ann. Rev. Physiol. 57, 827-872 (1995).
    2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature reviews. Immunology. 7, (9), 678-689 (2007).
    3. McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Tissue stroma as a regulator of leukocyte recruitment in inflammation. Journal of leukocyte biology. 91, (3), 385-400 (2012).
    4. Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nature immunology. 6, (12), 1191-1197 (2005).
    5. Schmidt, S., Moser, M., Sperandio, M. The molecular basis of leukocyte recruitment and its deficiencies. Molecular immunology. 55, 49-58 (2013).
    6. Luu, N. T., Rainger, G. E., Nash, G. B. Differential Ability of Exogenous Chemotactic Agents to Disrupt Transendothelial Migration of Flowing Neutrophils. The Journal of Immunology. 164, (11), 5961-5969 (2000).
    7. Smith, C. W., Rothlein, R., et al. Recognition of an endothelial determinant for CD 18-dependent human neutrophil adherence and transendothelial migration. The Journal of clinical investigation. 82, (5), 1745-1756 (1988).
    8. Luscinskas, F. W., Brock, A. F., Arnaout, M. A., Gimbrone, M. A. Endothelial-leukocyte adhesion molecule-1-dependent and leukocyte (CD11/CD18)-dependent mechanisms contribute to polymorphonuclear leukocyte adhesion to cytokine-activated human vascular endothelium. J. Immunol. 142, (7), (1989).
    9. Bahra, P., Rainger, G. E., Wautier, J. L., Nguyet-Thin, L., Nash, G. B. Each step during transendothelial migration of flowing neutrophils is regulated by the stimulatory concentration of tumour necrosis factor-alpha. Cell adhesion and communication. 6, (6), 491-501 (1998).
    10. Piali, L., Weber, C., et al. The chemokine receptor CXCR3 mediates rapid and shear-resistant adhesion-induction of effector T lymphocytes by the chemokines IP10 and Mig. European journal of immunology. 28, (3), 961-972 (1998).
    11. McGettrick, H. M., Smith, E., et al. Fibroblasts from different sites may promote or inhibit recruitment of flowing lymphocytes by endothelial cells. European journal of immunology. 39, (1), 113-125 (2009).
    12. McGettrick, H. M., Hunter, K., Moss, P. a, Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. Direct observations of the kinetics of migrating T cells suggest active retention by endothelial cells with continual bidirectional migration. Journal of leukocyte biology. 85, (1), 98-107 (2009).
    13. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Filer, A., Rainger, G. E., Nash, G. B. Stromal cells differentially regulate neutrophil and lymphocyte recruitment through the endothelium. Immunology. 131, (3), 357-370 (2010).
    14. Tull, S. P., Yates, C. M., et al. Omega-3 Fatty acids and inflammation: novel interactions reveal a new step in neutrophil recruitment. PLoS biology. 7, (8), e1000177 (2009).
    15. Ahmed, S. R., McGettrick, H. M. Prostaglandin D2 regulates CD4+ memory T cell trafficking across blood vascular endothelium and primes these cells for clearance across lymphatic endothelium. Journal of immunology. 187, (3), 1432-1439 (2011).
    16. Bradfield, P. F., Amft, N., et al. Rheumatoid fibroblast-like synoviocytes overexpress the chemokine stromal cell-derived factor 1 (CXCL12), which supports distinct patterns and rates of CD4+ and CD8+ T cell migration within synovial tissue. Arthritis and rheumatism. 48, (9), 2472-2482 (2003).
    17. Filer, A., Parsonage, G., et al. Differential survival of leukocyte subsets mediated by synovial, bone marrow, and skin fibroblasts: site-specific versus activation-dependent survival of T cells and neutrophils. Arthritis and rheumatism. 54, (7), 2096-2108 (2006).
    18. Lally, F., Smith, E., et al. A novel mechanism of neutrophil recruitment in a coculture model of the rheumatoid synovium. Arthritis and rheumatism. 52, (11), 3460-3490 (2005).
    19. Chakravorty, S. J., McGettrick, H. M., Butler, L. M., Buckley, C. D., Rainger, G. E., Nash, G. B. An in vitro. model for analysing neutrophil migration into and away from the sub-endothelial space: Roles of flow and CD31. Biorheology. 43, (1), 71-82 (2006).
    20. Rainger, G. E., Nash, G. B. Cellular Pathology of Atherosclerosis Smooth Muscle Cells Prime Cocultured Endothelial Cells for Enhanced Leukocyte Adhesion. Circulation Research. 88, (6), 615-622 (2001).
    21. Kuravi, S. J., McGettrick, H. M. Podocytes regulate neutrophil recruitment by glomerular endothelial cells via IL-6-mediated crosstalk. Journal of immunology. 193, (1), 234-243 (2004).
    22. Parsonage, G., Filer, A. D. A stromal address code defined by fibroblasts. Trends in immunology. 26, (3), 150-156 (2005).
    23. Luu, N. T., McGettrick, H. M. Crosstalk between mesenchymal stem cells and endothelial cells leads to downregulation of cytokine-induced leukocyte recruitment. Stem cells. 31, (12), 2690-2702 (2013).
    24. Bevilacqua, M. P., Nelson, R. M., Mannori, G., Cecconi, O. Endothelial-leukocyte adhesion molecules in human disease. Annual review of medicine. 45, 361-378 (1994).
    25. Stanness, K. A., Beatty, P. G., Ochs, H. D., Harlan, J. M. An endothelial cell surface factor(s) induced in vitro. 136, (12), 4548-4553 (1986).
    26. Burton, V. J., Butler, L. M. Delay of migrating leukocytes by the basement membrane deposited by endothelial cells in long-term culture. Experimental cell research. 317, (3), 276-292 (2011).
    27. Luu, N. T., Rainger, G. E., Buckley, C. D., Nash, G. B. CD31 Regulates Direction and Rate of Neutrophil Migration over and under Endothelial Cells. Journal of Vascular Research. 40, (5), 467-479 (2003).
    28. McGettrick, H. M., Buckley, C. D., Ed Rainger, G., Nash, G. B. Influence of stromal cells on lymphocyte adhesion and migration on endothelial cells. Methods in molecular biology. 616, 49-68 (2010).
    29. Butler, L. M., McGettrick, H. M., Nash, G. B. Static and dynamic assays of cell adhesion relevant to the vasculature. Methods in molecular biology. 467, 211-228 (2009).
    30. Jeffery, H. C., Buckley, C. D., Moss, P., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. M. Analysis of the effects of stromal cells on the migration of lymphocytes into and through inflamed tissue using 3-D culture models. Journal of immunological methods. 400-401, 45-57 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics