Análise dos efeitos de células estromais no recrutamento de leucócitos de Fluxo

Immunology and Infection

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Summary

A capacidade do endotélio inflamado para recrutar leucócitos do fluxo é regulado por células estromais mesenquimais. Descrevemos dois modelos in vitro que incorporam as células humanas primárias que podem ser utilizadas para avaliar o recrutamento de neutrófilos a partir do caudal e examinar o papel que as células estromais mesenquimatosas jogar na regulação neste processo.

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Munir, H., Rainger, G. E., Nash, G. B., McGettrick, H. Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow. J. Vis. Exp. (95), e52480, doi:10.3791/52480 (2015).

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Abstract

As células estromais regular o recrutamento de leucócitos circulantes durante a inflamação através de cross-talk com células endoteliais vizinhas. Aqui nós descrevemos dois modelos in vitro "vasculares" para estudar o recrutamento de neutrófilos circulantes de fluxo pelas células endoteliais inflamadas. Uma grande vantagem destes modelos é a capacidade de analisar cada passo na cascata de adesão de leucócitos no fim, como poderia ocorrer in vivo. Descrevemos também como ambos os modelos podem ser adaptados para estudar o papel das células estromais, neste caso as células estaminais mesenquimais (MSC), em regular o recrutamento de leucócitos.

Células endoteliais primárias foram cultivadas isoladamente ou em conjunto com MSC humana em contacto directo em microslides Ibidi ou em lados opostos de um filtro Transwell durante 24 h. As culturas foram estimuladas com factor de necrose tumoral alfa (TNFa) durante 4 horas e incorporadas num ensaio de adesão com base em fluxo. Um bolus de neutrófilos foi perfundidoao longo do endotélio, durante 4 min. A captura de fluir neutrófilos e suas interações com o endotélio foi visualizado por microscopia de contraste de fase.

Em ambos os modelos, a estimulação de citoquinas-endotelial aumento do recrutamento de neutrófilos fluindo de uma maneira dependente da dose. A análise do comportamento dos neutrófilos recrutados mostraram um decréscimo dependente da dose no rolamento e um aumento dependente da dose na transmigração através do endotélio. Em co-cultura, MSC suprimida adesão de neutrófilos ao endotélio estimulada-TNF.

Os nossos modelos baseados na aderência de fluxo de imitar as fases iniciais do recrutamento de leucócitos da circulação. Além de leucócitos, que pode ser usado para examinar o recrutamento de outros tipos de células, tais como células tumorais circulantes ou MSC administrados terapeuticamente. Os nossos modelos de multi-camadas de co-cultura MSC demonstraram que comunicam com endotélio para modificar a sua resposta a citocinas pró-inflamatórias, Altering o recrutamento de neutrófilos. Mais pesquisas utilizando esses modelos é necessário para entender completamente como células estromais de diferentes tecidos e condições (doenças inflamatórias ou câncer) influenciam o recrutamento de leucócitos durante a inflamação.

Introduction

A inflamação é uma resposta protectora contra a infecção microbiana ou lesão do tecido que requer regulação apertada de entrada e saída de leucócitos a partir do tecido inflamado para permitir a resolução de 1,2. Conversa cruzada entre as células endoteliais (CE) que os navios de linha de sangue, leucócitos circulantes e células do estroma do tecido residente é essencial para coordenar este processo 3. No entanto, o recrutamento descontrolada de leucócitos e sua desobstrução ineficaz de apoiar o desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas 4. A nossa compreensão atual de recrutamento de leucócitos na saúde e na doença é incompleta e modelos mais robustos são necessários para analisar este processo.

Os mecanismos de apoio ao recrutamento de leucócitos do sangue por meio CE vascular em vênulas pós-capilares foram bem descritas 1,2,5. Leucócitos circulantes são capturados por receptores especializados (por exemplo, VCAM-1, E-selectina, P-selectina) quesão-regulada no endotélio inflamado. Essas interações transientes permitir leucócitos para interagir com a superfície vinculado quimiocinas e mediadores derivados de lipídeos (ou endoteliais ou estromais na origem) que ativam integrinas expressas pelos leucócitos 6- 11. Este, por sua vez estabiliza adesão e migração unidades através do endotélio e no tecido 12- 15. Dentro do tecido, os leucócitos são recrutados sujeitos a agentes derivados de estroma que influenciam a motilidade, função e sobrevivência 16,17. Evidências crescentes sugerem fortemente que os sinais recebidos em cada etapa das condições do processo de recrutamento de leucócitos para a próxima. No entanto, a nossa compreensão do recrutamento de leucócitos permanece incompleta e muito pouco se sabe sobre o movimento de leucócitos componentes formação dentro do tecido.

Em Birmingham, temos desenvolvido vários modelos in vitro "vasculares" para estudar o recrutamento de leucócitos a partir defluir 9,18,19. Agora entendemos que atuam CE vascular reguladores como imediatos de recrutamento de leucócitos de responder às mudanças em seu microambiente local. Especificamente, as células do estroma do tecido residente pode regular ativamente a resposta inflamatória, em parte, conversando com a vizinha CE vascular para influenciar o seu papel no recrutamento 3. Mostrámos previamente que várias células do estroma modular a capacidade da EC para suportar a adesão e migração de leucócitos de uma forma específica do tecido, e que estes efeitos são alteradas em doenças crónicas 13,16,20,21. Assim, as células do estroma estabelecer tecido 'Endereço-códigos "que definem o contexto de cada resposta inflamatória 22. Mais recentemente, têm demonstrado que o MSC de medula óssea derivada (BMMSC) potentemente a infra-regular a resposta de CE de citocinas, que conduz a uma redução no recrutamento dos neutrófilos e linfócitos 23.

Os mecanismos govlando recrutamento elucidados in vitro foram amplamente utilizados ensaios incorporando um único tipo de células (por exemplo, EC) ou proteína de forma isolada. No entanto, estes estudos não levam em consideração os efeitos do ambiente local do tecido (isto é, a presença de células estromais) sobre o recrutamento de leucócitos e a sua subsequente migração para o tecido. Aqui nós descrevemos dois métodos baseadas no fluxo em que as células do estroma, especificamente as células-tronco mesenquimais (MSC), são co-cultivadas com EC 23. Esses modelos permitem-nos examinar o efeito de células do estroma em respostas endoteliais, em particular a sua capacidade de apoiar o recrutamento de leucócitos de fluxo.

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Protocol

1. Isolamento e cultura de células endoteliais humanas primárias e Células-Tronco Mesenquimais

  1. Células isolamento e cultivo de humanos umbilical endoteliais veia (HUVEC):
    1. Coloque cordão umbilical num tabuleiro com toalhas de papel e pulverizar com etanol a 70%. Coloque em uma capa de cultura de tecidos. Identificar a veia e canular em ambas as extremidades. Coloque uma braçadeira em torno do fim canulada para prendê-lo.
    2. Lave a sangue venoso com PBS usando uma seringa. Encha a seringa com ar e passar através da veia para remover e descartar o PBS residual.
    3. Descongelar 10 mg / ml de colagenase de tipo Ia e dilua 1:10 em PBS (com cálcio e cloreto de magnésio) a uma concentração final de 1 mg / ml. Passe solução de colagenase na veia até que ambas as cânulas são preenchidos. Feche os grampos em cânulas em ambas as extremidades.
    4. Cobrir a bandeja com o tecido e pulverizar com etanol a 70%. Colocar o cabo em uma incubadora durante 20 min a 37 ° C e 5% de CO 2.
    5. Tire o cabo de forada incubadora e apertar abraçadeiras. Massageie suavemente o cabo de 1 min. Lave a suspensão de células com 10 ml de PBS e recolher num tubo de centrífuga de 50 ml.
    6. Encher a seringa com ar e passar através da veia para remover qualquer PBS residual duas vezes, recolher o PBS num tubo de centrífuga de 50 ml usado no passo 1.1.5. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    7. Aspirar o sobrenadante e ressuspender sedimento em 1 ml médio completo da CE. Meio CE consiste em M199 suplementado com 35 ug / ml de sulfato de gentamicina, 10 ng / factor de crescimento epidérmico humano mL, 1 ug / ml de hidrocortisona, 2,5 ng / mL de anfotericina B, e 20% de soro fetal de vitelo.
    8. Adicione 4 ml de meio CE ea suspensão CE a um frasco de 25 cm2. Mudar a forma no dia seguinte e, em seguida, a cada 2 dias.
    9. CE apresentam uma morfologia paralelepípedos-like (Figura 1Ai). Para ensaios de adesão, CE são geralmente semeadas quando atingem 100% de confluência (ver secção 1.4
  2. Isolamento de células-tronco mesenquimais geléia de Wharton (WJMSC) de cordões umbilicais humanos:
    1. Isolar derivados de geléia MSC, da Wharton (WJMSC) de cordões umbilicais frescas ou de cabos que já foram utilizadas para isolar CE. Cortar cordão umbilical em 5 centímetros de comprimento. Corte cada pedaço longitudinalmente para revelar os vasos sanguíneos (artérias 2 [brancos, rígida] e uma veia [amarelo, distendido]).
    2. Com uma tesoura e pinça estéril remover os vasos sanguíneos e descarte. Cortar todo o tecido em 2-3 mm3 peças. Usando fórceps lugar de 2 - 3 mm3 peças para um tubo de centrífuga de 50 ml.
    3. Descongelar 100 mg / mL de colagenase tipo II estoque e dilua 1: 100 em 10 mL de PBS a uma concentração final de 1 mg / ml. Descongelar 20.000 U / ml de hialuronidase estoque e dilua 1: 400 para uma concentração final de 50 U / ml em solução de colagenase.
    4. Adicionar cocktail enzimática para o tubo de centrífuga contendo os fragmentos de tecido. Incubar as Fragmen tecidots durante 5 horas a 37 ° C num agitador rotativo lento.
    5. Dilui-se a suspensão de células 1: 5 em PBS. Colocar um filtro de poro 100 para um novo tubo de centrífuga de 50 ml. Verter a suspensão de células sobre o filtro de poros de 100 um.
      NOTA: fragmentos de tecido restante será retida no filtro e as células serão coletadas no tubo de 50ml centrífuga.
    6. Descartar o filtro. Centrifuga-se a suspensão de células a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em WJMSC 12 ml de meio de cultura completo WJMSC (DMEM de baixa glucose, 10% FCS e 100 U / ml de penicilina + 100 ug / ml de mistura de estreptomicina).
    7. Semente todas as células num frasco de cultura de tecidos de 2 75 cm. Alterar o meio após 24 horas, com 12 ml de meio de cultura completo WJMSC. Substituir médio a cada 2-3 dias. As células devem chegar a 70-80% de confluência dentro de 2 semanas. Passage quando WJMSC atingir 70-80% de confluência (ver Secção 1.4).
  3. Expansão de MSC derivadas de medula óssea (BMMSC): Isolar MSC derivadas da medula óssea humana (BMMSC) como previamente descrito 24. Adicionar 10 mL de meio de crescimento MSC pré-aquecido (MSCGM) para um tubo de centrífuga de 15 ml.
  4. Descongelar um frasco de p2 BMMSC por colocação em um banho de água a 37 C ° durante 2 min. Adicionar a suspensão BMMSC para o tubo de centrífuga contendo MSCGM. Misture bem por pipetagem.
  5. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante completamente.
  6. Ressuspender as células em 1 ml MSCGM e contar as células utilizando um hemocitómetro ou um contador celular digital tal como uma cellometer.
  7. Semear as células em frascos de 75 cm2 de cultura com uma densidade de 5.000 - 6.000 células por cm 2 em 12 ml MSCGM. Alterar o meio após 24 horas com 12 ml MSCGM. Células alimentação animal, com 12 ml MSCGM a cada 2-3 dias.
  8. Passage quando BMMSC atingir 70-80% de confluência (ver Secção 1.4). As células exibem uma morfologia fibroblástica (Figura 1Aii).
  • Destacamento da CE e MSC: Aspirar o meio de 25 cm2 frascos de cultura. Adicionar 2 ml de 0,02% EDTA durante 2 min. Aspirar EDTA e adicionar 2 ml de tripsina (2,5 mg / ml). Vista sob o microscópio até as células se tornam round.
  • Toque no balão para separar as células. Inativar a tripsina, adicionando 8 ml de meio de cultura (depende do tipo de célula; médio CE para HUVEC, DMEM LG para WJMSC e MSCGM para BMMSC) para o frasco de cultura e suspensão transferência para um tubo de centrífuga de 15 ml.
  • Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento como descrito abaixo.
    1. Para passaging da MSC, pellet ressuspender em 3 ml de meio de cultura. Adicionar 11 ml de meio de cultura em três separados 75 centímetros 2 frascos de cultura. Adicionar 1 ml de suspensão de células de cada frasco de cultura (1: 3 de divisão). WJMSC passagem e BMMSC 3 vezes (p3) antes da utilização em ensaios de co-cultura.
    2. Para semear CE ou MSC em ensaios de adesão - ver Secções 2 e 3.
  • MSC congelamento:
    1. Na passagem 3 detach MSC conforme descrito na Seção 1.4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 3 ml gelada CryoSFM. Pipetar alíquotas de 1 ml de suspensão de células em criotubos 1,5 ml de gelo-frio. Coloque criotubos num recipiente de congelação.
    2. Armazenar o recipiente a -80 ° CO / N. Transferir para nitrogênio líquido. Vial Thaw da MSC (siga os passos 1.3.1 - 1.3.6). Ressuspender MSC em 5 ml de meio de cultura (escolher meio apropriado para WJMSC ou BMMSC) e de sementes em um frasco de 25 cm2.
  • 2. Estabelecer Endotelial-CTM a co-culturas em Ibidi Microslides

    1. Tripsinizar um balão de 2 cm CE confluente 25 (~ 1,5 x 10 6 células, como a Seção 1.4). Ressuspender CE em 380 ul MSCGM (1 x 25 cm 2, balão semearão dois microslides 6 canais Ibidi (~ 1,25 x 10 5 / canal), para ensaios de adesão tudo ty celularpes são cultivadas em MSCGM). Adicionar 30 mL de suspensão CE para cada canal (isto irá cobrir a área de crescimento através da ação capilar). Incubar Ibidi microlâmina a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 1 h.
    2. Adicionar 140 ul MSCGM para cada canal e, em seguida, aspirar-lo. Repita duas vezes para um total de 3 lavagens. Adicionar 140 ul e MSCGM lugar na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas.
    3. Para co-culturas destacar MSC (Seção 1.4). Executar uma contagem de células utilizando um hemocitómetro ou um cellometer. Ajustar a concentração de MSC de 1,5 x 10 5 células / mL.
    4. Aspirar o excesso de meio de canais Ibidi (deixando apenas a área do crescimento do canal em meio). Adicionar 30 ul da MSC suspensão aos canais Ibidi. Aspirar o meio que foi ejectado a partir da área de crescimento do canal e adicionar mais 30 ul de suspensão MSC. Repetir mais uma vez e, em seguida, colocar a microlâmina Ibidi na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 </ Sub>, durante 1 hora.
    5. Adicionar 140 ul MSCGM para cada canal e, em seguida, aspirar-lo. Repita duas vezes para um total de 3 lavagens. Adicionar um volume final de 140 ul MSCGM para cada canal e colocar na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas.
    6. Descongelar 1 x 10 5 U estoque / ml de TNFa e dilua 1: 1000 em MSCGM para uma concentração final de 100 U / ml (equivalente a ~ 10 ng / ml). Efectuar uma diluição em série através da diluição de 100 U / mL de TNFa por 1:10 em MSCGM obter 10 U / ml. Dilui-se 10 U / ml de TNFct por 1:10 em MSCGM obter 1 U / ml.
    7. Tratar canais com TNFa, a 37 ° C durante 4 horas antes do ensaio. As flutuações de temperatura durante o tratamento de citoquinas irá alterar os padrões de recrutamento de neutrófilos observados. Adicionar MSCGM fresco para canais não tratados.

    3. Estabelecer Endotelial-CTM a co-culturas em filtros

    1. Retire WJ ou BMMSC conforme descrito na Seção 1.4. Ressuspender o sedimentoem 1 ml MSCGM. Realize um células de contagem de células utilizando um hemocitómetro ou um cellometer.
    2. Ajustar o volume de modo a que a concentração final é de 5 x 10 5 MSC em 500 ul de MSCGM.
    3. Utilizando uma pinça estéril inverter 6 poços, 0,4 mm filtros PET Transwell e coloque em uma caixa estéril.
    4. Semente de 5 x 10 5 MSC sobre a superfície exterior dos filtros. Incubar os filtros a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 1 h.
    5. Recolhe meios a partir da superfície exterior do filtro. Contar o número de não-aderentes MSC nos meios de comunicação. Re-invertido filtros usando uma pinça estéril e coloque em uma placa de 6 poços correspondência contendo 3 ml MSCGM.
    6. Adicionar 2 ml de MSCGM sobre a superfície interior do filtro (Figura 1B). Colocar numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas. Tripsinizar um balão de 2 cm CE confluente 25 (Figura 1Ai; como a Seção 1.4).
    7. Ressuspender CE, em 8 ml MSCGM (1 x 25 cm 2 balão wisemente ll quatro filtros de 6 poços; ~ 5 x 10 5 CE / filtro). Aspirar o meio da parte superior e na parte inferior dos filtros porosos. Adicionar 3 ml MSCGM fresco para dentro da câmara inferior (debaixo do filtro). Adicionar 2 ml de suspensão CE à superfície interna de cada filtro. Incubar durante 1 hora a 37 ° C e 5% de CO 2.
    8. Aspirar médio para lavar não aderente CE e substituir por fresco MSCGM. Configurar filtros de mono-cultura paralelas CE semeando células na superfície interna sem primeiro MSC semeadura. Incubar O / N a 37 ° C e 5% de CO 2.
    9. Verifique se o monocamada CE é confluente e não contém lacunas. Monocamadas sub-confluentes não podem ser utilizadas para ensaios de adesão (Figura 1B).
    10. Tratar as câmaras superiores e inferiores dos filtros com 1, 10 ou 100 U / mL de TNFa (equivalente a ~ 10 ng / ml) a 37 ° C durante 4 horas antes do ensaio (descrito na Secção 2).

    4. Isolamento de Leucócitos

    1. Tome venososangue de voluntários saudáveis ​​e alíquota imediatamente em tubos com EDTA. Tubos inverter cuidadosamente para misturar.
    2. Camada de 2,5 ml HISTOPAQUE 1077 sobre 2,5 ml Histopaque 1119 em um 10 ml de fundo redondo tubo. Camada 5 ml de sangue total para o gradiente de Histopaque. Centrifugar a 800 xg durante 40 min à temperatura ambiente.
    3. Colheita neutrófilos periféricos polimorfonucleares (PMN) na interface de Histopaque 1077 e 1119 (acima da camada de eritrócitos). Coloque em um 10 ml de fundo redondo de tubo e fazer até 10 ml com PBSA. Inverter cuidadosamente tubo e centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    4. Diluir solução de BSA a 7,5% a 1:50 em 100 ml de PBS (com cálcio e cloreto de magnésio) a uma concentração final de 0,15% (w / v; PBSA). Aspirar o sobrenadante e ressuspender em 10 ml de PBSA. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    5. Ressuspender em 1 ml de PBSA. Tomar uma aliquota de 20 uL da suspensão de células e adicionar 380 ul de PBSA (diluição de 1:20). Contagem de células utilizando um hemocitómetro ou um cellometer. Diluir para o conce necessáriantration (1 x 10 6 / ml em filtros Transwell e Ibidi microlâmina) em PBSA. Manter a suspensão de neutrófilos em RT até ao ensaio.

    5. Montagem do Sistema de Fluxo

    1. Configurar o sistema de fluxo como mostrado na Figura 1C. Ligar o aquecedor e ajustado para 37 ° C. Anexar uma seringa de 20 ml (remover o êmbolo) e uma seringa de 5 ml a uma torneira de 3 vias. Fixe a torneira para a câmara de perspex usando fita micropore.
    2. Medir e cortar um pedaço comprido de silício 2/4 mm (espessura) tubagem que é aproximadamente a distância entre a válvula e a torneira de 3 vias. Cortar um 8-10 mm de comprimento pedaço de 1/3 mm (fina) tubulação e inserir em uma das extremidades do tubo de espessura. Prenda o lado tubulação grossa para o 3-way torneira.
    3. Ligue a extremidade da tubagem fina para um porto da eletrônica 3-way microválvula. Este é o "reservatório de lavagem". Corte um 6-8 mm de comprimento pedaço de tubo grosso e fino.
    4. Inserir o tubo fino em uma das extremidades do tubo de espessura. Attach acabar com a tubulação de espessura em uma seringa de 2 ml (remover o êmbolo).
    5. Ligue a extremidade da tubagem fina da seringa de 2 ml para um porto na microválvula eletrônico para fazer o "reservatório de amostra". Ligar-se a válvula para a câmara de filtro de fluxo através da medição e corte de um longo pedaço de tubo fino, que é a distância entre o microválvula e o centro da platina do microscópio.
    6. Para o modelo de microlâmina, anexar um 8 - mm pedaço de tubo de espessura 10 para a extremidade da tubagem fina. Inserir um conector em forma de L para a extremidade da tubagem de espessura. Isso vai se conectar à microlâmina. Para o modelo de filtro, anexar um 8 - mm pedaço de Portex Blue Line manômetro 10 a ligação de tubagens para a extremidade do tubo fino.
    7. Coloque a extremidade da tubagem fina para o microválvula. Esta é a saída comum para os reservatórios de lavagem e de amostra. Preencha reservatórios com PBSA. Tubing Prime fluindo PBSA através deles para remover quaisquer bolhas de ar.
    8. Anexar manômetro tubulação para um 29 mm (50 ml) de vidro syringe. Primeiro a seringa de enchimento com 10 ml PBSA. Inverta a seringa de modo a que a outra extremidade conectada ao tubo virado para cima e empurrar para fora todas as bolhas de ar. Recarga com 5 ml PBSA.
    9. Por apenas o modelo microlâmina, anexar a 10 - pedaço de tubo de 12 milímetros de espessura para a extremidade do tubo do manómetro levando à seringa de vidro. Inserir um conector em forma de L na extremidade da tubagem de espessura. Coloque a seringa de vidro em uma bomba de seringa para infusão / retirada.
    10. Calcula-se a taxa de fluxo de reenchimento (Q) necessária para gerar a tensão de cisalhamento de parede desejada (τ w em Pascal, Pa) de 0,1 (filtros Transwell Pa) ou 0,05 (microslides Ibidi Pa), utilizando as fórmulas seguintes:
      γ w = (6.Q) / (wh 2)
      τ = n.γ
      Quando a largura w = interno e h = profundidade interna do canal de fluxo. n = viscosidade da solução de fluxo; PBSA é n = 0,7 mPa.s. Para a câmara de fluxo do filtro de placas paralelas, a largura (w) é de 4 mm e a profundidade (h) é 0,133 milímetros. O depth da câmara pode variar ligeiramente devido às diferenças na espessura da junta de vedação utilizado Parafilm. Para a microlâmina Ibidi, a largura é de 3,8 mm e a profundidade é de 0,4 mm.
      NOTA: Devido a diferenças nas dimensões do canal de fluxo, e dinâmica de captura usamos tensões de corte diferentes para o modelo microlâmina em comparação com o modelo de filtro 6.

    6. Configuração da Placa Paralela Fluxo Câmara Incorporando Filtros

    1. Cortar um pedaço de Parafilm (o mesmo tamanho que a lamela de vidro) utilizando um molde de metal. Cortar uma ranhura 20 x 4 mm de o Parafilm (para criar o canal de fluxo) utilizando um molde metálico. Use a junta para marcar o canal de fluxo na lamela de vidro.
    2. Alinhar as bordas do filtro de 6 poços na lamela de vidro. Certifique-se de que o filtro abrange as marcas de canais de escoamento. Retirar cuidadosamente o filtro usando um bisturi tipo 10A.
    3. Cobrir o filtro cuidadosamente com uma junta de Parafilm, assegurando que o canal de escoamentoranhura está no meio do filtro (Figura 1D). Use um pedaço de tecido limpo e empurrar para fora todas as bolhas.
    4. Coloque a lamela em recesso da chapa de fundo da câmara de fluxo de Perspex. Posicionar a placa de perspex de topo sobre a parte superior da junta e parafuso as placas em conjunto (Figura 1D).
    5. Virar a torneira de 3 vias para permitir que o tampão de lavagem (PBSA) para fluir através da válvula. Conectar Manómetro tubagem para a abertura de entrada da placa de topo Persex. Executar PBSA através do canal de fluxo para permitir que as bolhas de passar através.
    6. Ligar o tubo do manómetro da bomba de seringa para dentro do orifício de saída da placa de perspex. Defina a bomba de seringa para encher e tiragem. Limpar qualquer PBSA que tenha gotejado sobre a placa superior da câmara.
    7. Coloque a câmara na platina de um microscópio invertido de contraste de fase. Ajustar o foco para visualizar o CE acima dos filtros (Figura 1B).

    7. Configurando Microslides for Flow </ P>

    1. Coloque o microlâmina para o palco de um microscópio de contraste de fase invertido. Ligue o conector em forma de L na porta de entrada de um canal. Executar PBSA através do canal de fluxo.
    2. Inserir o conector em forma de L a partir da bomba de seringa para dentro do orifício de saída do canal. Defina a bomba de seringa para encher e tiragem. Limpe qualquer PBSA que pingou sobre a microlâmina. Ajuste o foco para visualizar a monocamada CE.

    8. Ao longo de Perfusão de Leucócitos Células Endoteliais

    1. Coloque 2 ml de neutrófilos purificados para o reservatório da amostra e deixar a aquecer durante 2 min. Lavar o endotélio com PBSA durante 2 min.
    2. Gire a válvula ON para perfundir neutrófilos sobre o endotélio. Entregar o bolus de neutrófilos para 4 min. Desligue a válvula e perfundir PBSA a partir do reservatório de lavagem durante o resto da experiência.
    3. Verifique se o ar bolhas não passar pelo canal de fluxo em qualquer momento durante o ensaio, pois isso vai atrapalhar o monolay CEer e causa descolamento dos neutrófilos aderentes.

    9. Recording Neutrophil Capture and Behavior

    1. Recrutamento de neutrófilos registro ou durante o fluxo de neutrófilos ou pós-perfusão.
    2. Adicione todas as gravações digitais de, pelo menos, 5 - 10 campos no centro do canal de fluxo. Identificar o centro do canal movendo o objectivo para a borda do canal na abertura de entrada e identificar o meio da porta.
      1. Para gravar durante o fluxo de neutrófilos, tirar fotos de um único campo a cada 10 segundos durante 1 min. Mover ao longo do canal e gravar outro campo para 1 min. Repita o procedimento para duração do bolus.
      2. Para a gravação de pós-perfusão, fazer a gravação de 10 seg de 5 - 10 campos para baixo o centro do canal de fluxo para avaliar o comportamento dos leucócitos (tipicamente de 2 minutos após o final do bolo de neutrófilos). Tire fotos a cada segundo dentro do intervalo de 10 segundos. Isso dá tempo suficiente para a captura de fluxo e do comportamento dos neutro aderentephils a ser analisado.
      3. Gravar um único campo que contém pelo menos 10 neutrófilos transmigrou durante 5 min, a tomada de imagens a cada 30 seg. Isto pode ser usado para calcular a velocidade de células que migraram (acima ou por baixo do endotélio).
      4. Grave outra série de 10 campos seg (normalmente 9 min pós-perfusão). Isto permite que os neutrófilos tempo para migrar através da monocamada endotelial.
      5. Parar a bomba de seringa e remover o tubo. Desmonte a câmara de fluxo e lave o reservatório de amostra e tubos. Repita o procedimento para filtros / canais MicroSlide subseqüentes.

    10. Análise de Leucócitos Recrutamento e Comportamento

    1. Contar o número de neutrófilos em cada campo durante os 10 gravações seg no ponto de tempo de 2 min. Todas as células devem estar presentes no primeiro segundo campo, a fim de serem contados. As células que são parcialmente no campo em dois lados (por exemplo, superior / fronteira direita) do campo de visão estão incluídas naas contagens, enquanto eles permanecem no campo para a completa 10 seg.
    2. Calcula-se a média do número de neutrófilos aderentes por campo. Medir o comprimento e largura do campo gravado. Calcula-se a área do campo. Calcula quantos campos existem in 1 mm 2. Multiplicar a contagem de neutrófilos significativo pelo número de campos in 1 mm 2.
    3. Calcula-se o número total de neutrófilos perfundidos através da multiplicação da quantidade de neutrófilos perfundido (por exemplo, 2 x 10 6 / ml * Q [por exemplo, 0,0999 ml / min para o fluxo de placas paralelas câmara]) pela duração do bolus (por exemplo, 4 min ).
    4. Dividir a contagem de neutrófilos / mm 2 pelo número total de neutrófilos perfundidos para determinar o número total de células que aderiram (células aderentes / mm 2/10 6 O perfundido).
    5. Avaliar se os neutrófilos aderentes estão rolando, firmemente aderente ou transmigrou (Recurso Video 1 e 2).
      1. Aneutrófilo é a fase brilhante e lentamente vai se mover ao longo da monocamada endotelial (1-10 mm / seg; Suplementar Video 1).
      2. Células firmemente aderentes são fase brilhante e ligado à superfície CE, quer permanecer parado (ou seja, sem se mover durante a gravação) ou sofreram alteração de forma e estão migrando sobre a superfície CE (Figura 1Ei).
      3. A neutrófilos transmigrou é fase escura e abaixo da camada CE (Figura 1Eii).
    6. Calcular a percentagem de células aderentes que estão rolando, estacionário e transmigrou. Alternativamente, o comportamento de neutrófilos podem ser expressos como números de células totais que apresentam os diferentes comportamentos, aplicando a mesma fórmula usada para calcular a aderência total (conforme descrito nos passos 10,6-10,7).
      1. Mark vanguarda da neutrófilo rolamento. Marcar o bordo de ataque da mesma célula no final da sequência de 10 seg. Desenhar uma linha de apostaween os dois pontos e medir a distância que a célula tenha percorrido.
      2. Dividir esse valor, a duração de gravação, em que a célula é de rolamento (isto é, 10 seg). Tente e seleccionar os neutrófilos que se encontram no campo de todo o intervalo de 10 seg.
    7. Para calcular a velocidade de neutrófilos migram sobre a superfície (em forma brilhante fase alterada) ou por baixo do endotélio (dark fase) usar a 5 min de gravação (Recurso Video 2).
      1. Desenhar um esboço de células que migraram no início da sequência e controlar os seus movimentos ao longo da sequência. Anote as posições X e Y do centróide a cada intervalo de 1 min para cada célula. Subtrair os valores de X e a posição Y a partir da primeira imagem da sequência a partir dos valores na segunda imagem. Isto é baseado no teorema de Pitágoras.
      2. Subtrair os valores de a segunda imagem a partir da terceira imagem. Faça isso para todas as imagens na seqüência. Praça tele valores X e Y e adicioná-los juntos.
      3. Raiz quadrada o valor resultante. Calcula-se a velocidade para cada célula através da média das velocidades calculadas em cada intervalo de minutos. Pista 10 migraram neutrófilos e calcular a velocidade média.

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    Representative Results

    Inicialmente, analisamos o efeito de estimular CE com TNF sobre o recrutamento de neutrófilos de fluxo, utilizando o modelo microlâmina Ibidi (Seção 7-9). Na ausência de TNF, pouco se qualquer neutrófilos aderida à monocamada endotelial (Figura 2A). Isto era esperado, como não tratada / descansando CE não expressam as moléculas necessárias adesão (selectinas) ou quimiocinas para apoiar obrigatório 25,26. Em contraste, a estimulação de citoquinas-aumentou significativamente a adesão dos neutrófilos ao endotélio em uma maneira dependente da dose (Figura 2A). Adesão normalmente permanece estável ao longo do ensaio. A ligação de leucócitos a endotélio não tratados indica que tanto o CE são activadas (isto é, contaminados com LPS durante o processo de cultura) e / ou os neutrófilos foram activados durante o processo de isolamento. Com efeito, o LPS foi demonstrado que o aumento da expressão de E-selectina, ICAM-1 e VCAM-25-27 janeiro na superfície do CE, permitindo que eles se ligam neutrófilos.

    Ao analisar o comportamento dos neutrófilos recrutados que tipicamente observar uma diminuição dependente da dose na percentagem de neutrófilos rolantes (Figura 2B), com um concomitante aumento dependente da dose na percentagem de neutrófilos que migram através da monocamada endotelial (Figura 2C). Nas doses mais baixas de TNF-estimulação (1 U / ml) uma maior proporção de neutrófilos parecem brilhantes fase indicando que estão ligados à superfície apical do endotélio (Figura 2B). Em contraste, a 10 e 100 U / ml (doses mais elevadas), aproximadamente 40% dos neutrófilos recrutados aparecem escuras na fase 2 minutos, indicando que estas células que migraram através da monocamada de células endoteliais e são por baixo do endotélio (Figura 2C). Os neutrófilos são capazes de migrar através da CE dentro de 1 - 2 minutos, com a transmigração atingindo mníveis aximal na ~ 10min pós-perfusão 28. Aqui observamos um aumento de neutrófilos transmigração de 40% em 2 min a 60% em 9 min pós perfusão (Figura 2C). Não se observou efeito de uma concentração de TNFa sobre a velocidade de rolamento (~ 3 mm / seg) ou migração (~ 10 - 12 um / min) neutrófilos.

    No modelo baseado filtro, TNFa-estimulação aumento da adesão de neutrófilos numa forma dependente da dose semelhante à observada utilizando o modelo microlâmina Ibidi (Figura 3A). Em termos de comportamento, de rolamento dos neutrófilos não foi afectada pela dose de TNFa (Figura 3B), enquanto que foi observado um aumento dependente da dose na percentagem transmigração (Figura 3C). Nesta série de experiências foi observado nenhum efeito significativo sobre o tempo de transmigração de neutrófilos (Figura 3C).

    Nós fornecemos métodos sobre como gerar duas construções co-cultura diferentes, cada um deque é concebido para responder a perguntas específicas. No modelo microlâmina Ibidi, CE e MSC são cultivadas numa monocamada em contacto directo uma com a outra. Este modelo é útil para examinar o efeito da injeção terapêutica do MSC para o sangue e sua posterior integração na monocamada CE. Em contraste, no modelo baseado em filtro, CE e MSC são cultivadas em lados opostos do filtro em estreita proximidade, mas não necessariamente em contacto directo. Isto assemelha-se mais estreitamente tecido, com células endoteliais que formam uma monocamada que representa o vaso sanguíneo, e MSC residente no compartimento subendotelial. Isso nos permite examinar os efeitos da MSC tecido residente na resposta da CE à estimulação de citocinas.

    Com base em nossas experiências, podemos observar que o recrutamento de neutrófilos máxima e migração trans ocorre quando CE são estimuladas com 100 U / ml TNF. Como tal, utilizou-se esta concentração para examinar o efeito da co-cultura MSCsobre o recrutamento endotelial de neutrófilos de fluxo. Aqui, apresentamos dados para BMMSC em co-cultura com CE usando o microlâmina e modelos baseados em filtro por exemplo, no entanto, outros tipos de MSC também podem ser examinados, WJMSC. Em ambos os modelos, a presença de BMMSC reduziu significativamente a adesão de neutrófilos para o CE quando comparado com CE cultivadas isoladamente (Figura 4A). Co-cultura não teve nenhum efeito sobre o comportamento de neutrófilos recrutados, com níveis similares de rolamento e transmigração observado em CE cultivados sozinhos ou com MSC (Figura 4B e C). Assim, MSC pode modificar a resposta da CE à estimulação de citocinas, que suprime sua capacidade de apoiar o recrutamento de neutrófilos de fluxo.

    Figura 1
    Figura 1. Estabelecimento de co-cultura EC-MSC e analisar o recrutamento de neutrófilos usando um ensaio de adesão com base em fluxo. (A) (i) CE primária e (ii) passagem 3 BMMSC cultivadas em frascos de cultura de tecido. (B) Micrografia de CE e MSC cultivadas em 6 poços de filtro Transwell inserções. (C) Esquema do sistema de perfusão utilizado para gerar fluxo. (D) Representação esquemática da câmara de fluxo do filtro de placas paralelas. (E) Micrografia de (i) firmemente aderente (FA) e (ii) transmigrou (TM) recrutamento de neutrófilos na sequência de fluxo CE para estimuladas com 100 U / mL de TNFa . Imagens C e D são tomadas a partir das Figuras 2 e 3 em Métodos em Biologia Molecular.: Tráfico de células T, 2010, pg 53-54 28 com a devida permissão de Springer Science and Business Media Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


    . Figura 2. recrutamento de neutrófilos a partir de fluxo ao TNFa estimulada usando microslides Ibidi CE CE foram estimuladas com concentrações crescentes de TNFa (0 - 100 U / ml) durante 4 horas. Um bolus de 4 min de neutrófilos foi perfundido através da monocamada CE a 0,05 Pa. (A) Neutrófilos aderência avaliada em 2 min. ANOVA mostrou um efeito significativo do tratamento TNFa em adesão de neutrófilos, p <0,01. Comportamento de neutrófilos foi avaliada aos 2 e 9 min e expressos como uma percentagem de células aderentes que foram (B) ou de rolamento (C) transmigrou. ANOVA revelou um efeito significativo de tratamento de TNFa no comportamento dos neutrófilos aderentes, p <0,001. Em C, a ANOVA revelou um significativo de tempo em transmigrou neutrófilos p <0,01. Os dados são média ± SEM de n = 3 experiências. * P <0,05 e **p <0,01 em comparação com o não estimulado (0 U / mL) por CE controlo pós-teste de Dunnett. ## p <0,01 e ### p <0,001 em comparação com o 1 U / ml de CE, no mesmo ponto de tempo de Bonferroni pós teste.

    Figura 3
    . Figura 3. recrutamento de neutrófilos a partir de fluxo ao TNFa estimulada CE utilizando um ensaio baseado em filtro CE foram estimuladas com concentrações crescentes de TNFa (0 - 100 U / ml) durante 4 horas. Um bolus de 4 min de neutrófilos foi perfundido através da monocamada CE a 0,1 Pa. (A) Neutrófilos aderência avaliada em 2 min. ANOVA mostrou um efeito significativo do tratamento TNFa em adesão de neutrófilos, p <0,001. Comportamento de neutrófilos foi avaliada aos 2 e 9 min e expressos como uma percentagem de células aderentes que foram (B) ou de rolamento (C) transmigrou. Em C, ANOVA shocasar com um efeito significativo de tempo e tratamento de citocinas na transmigração de neutrófilos, p <0,05. Os dados são média ± SEM de n = 3 experiências. ** P <0,01 e *** p <0,001 em comparação com o não estimuladas (0 U / mL) por CE controlo pós-teste de Dunnett. # P <0,05 em comparação com o CE 1 U / mL, no mesmo ponto de tempo de Bonferroni pós -teste.

    Figura 4
    Figura 4. recrutamento de neutrófilos a partir de fluxo ao TNFa estimuladas CE-BMMSC co-culturas. BMMSC foram co-cultivadas com CE durante 24 horas antes da estimulação com 100 U / mL de TNFa durante 4 h. Um bolus de 4 min de neutrófilos foi perfundido através da monocamada CE em 0,05 Pa (para A, C, E) e 0,1 Pa microslides para (B, D, F) filtros. (AB) Neutrófilos adesão foi avaliada em 2 min. Comportamento de neutrófilos foi avaliada aos 2 e 9 me expressos como uma percentagem de células aderentes que foram (CD) ou rolamento (EF) transmigrou. Em C e D, ANOVA mostrou um efeito significativo das condições de cultivo no rolamento de neutrófilos, p <0,05. Em E e F, ANOVA mostrou um efeito significativo de tempo a transmigração de neutrófilos, p <0,05. No entanto, não foram observadas diferenças significativas na transmigração entre os tratamentos individuais por Bonferroni pós-teste. Os dados são média ± SEM de n = 5 experiências. * P <0,05 em relação ao monocultivo CE, pelo teste t pareado ou Bonferroni pós-teste.

    Suplementar Vídeo 1. Análise de velocidades de rolamento dos neutrófilos. CE cultivadas sobre um filtro Transwell foram estimuladas com 100 U / mL de TNFa durante 4 h. Um bolus de neutrófilos foi perfundido através da CE para 4min. Seqüência digitalizado representante de um único campo 10 seg tomadas 2min pós-perfusão. A mudança de posição de um único neutrófilos rolamento desde o início até ao fim da sequência de 10 segundos pode ser usada para calcular a velocidade a que o neutrófilo é rolamento.

    Suplementar vídeo 2. Análise de velocidades de migração de neutrófilos. CE cultivadas num filtro Transwell foram estimuladas com 100 U / mL de TNFa durante 4 h. Um bolus de neutrófilos foi perfundido através da CE por 4 min. Seqüência digitalizado Representante de uma única 5 min campo para rastrear o movimento de neutrófilos transmigrou. Isto pode ser usado para calcular a velocidade.

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    Discussion

    Aqui nós descrevemos dois modelos in vitro "vasculares" para estudar o recrutamento de neutrófilos circulantes por endotélio inflamado. Uma grande vantagem destes modelos é a capacidade de analisar cada passo na cascata de adesão de leucócitos no fim, como poderia ocorrer in vivo. Nós já observado um aumento dependente da dose da adesão de neutrófilos e a transmigração através estimuladas por TNFa CE 9,29. Descrevemos também como ambos os modelos podem ser adaptados para estudar os efeitos de células estromais de recrutamento de leucócitos. Aqui, a MSC foram co-cultivadas com uma microlâmina em CE Ibidi ou em lados opostos de um filtro poroso. Isto permite que ambos os tipos de células para comunicar uns com os outros, modificando assim o fenótipo e a resposta de cada outro. Mostrámos aqui, e em estudos anteriores 23, que a presença de MSC suprimida adesão dos neutrófilos ao TNFa estimulada CE. Isto indica que as células estromais de modificar a resposta CEa citoquinas e subsequentemente altera o recrutamento de leucócitos circulantes.

    Além dos modelos acima descritos, Biochips Cellix, placas BioFlux e Glyotech câmaras de fluxo de placas paralelas estão comercialmente disponíveis sistemas de canais de escoamento que proporcionam uma superfície para a cultura de endotélio e observando recrutamento. Em todos os sistemas, certos parâmetros podem ser utilizados ao mesmo tempo que cria culturas endoteliais e realizando os ensaios de adesão baseadas no fluxo, algumas das quais estão salientadas abaixo e nos relatórios anteriores 30,31. Quaisquer agentes anti-inflamatórios, tais como hidrocortisona, que podem afectar as respostas das citocinas deve ser omitidos a partir do meio para a duração da cultura e ensaio de 18,29. Ao usar o Ibidi MicroSlide garantir que não há bolhas presentes no canal de fluxo de ar durante a cultura da CE como estes irão perturbar a monocamada CE. A integridade da monocamada endotelial deve ser confirmado antes de cytokine-tratamento, como neutrófilos se ligarão aos lacunas na monocamada onde a BSA tem revestido a microlâmina / filtro. Também é essencial para garantir que as CE são mantidas a 37 ° C durante toda a citoquina porque a estimulação de TNFa é sensível à temperatura e apenas tem o efeito máximo a 37 ° C. Para o ensaio de escoamento em si, seleccionar um tampão de lavagem adequado, que usam tipicamente PBSA para ensaios de curta duração (menos de 30 minutos) e o meio M199 suplementado com BSA (0,15%) para os ensaios mais longas (1-48 hr) 30,31. Finalmente garantir que não há bolhas presentes no canal de fluxo de ar durante o ensaio como este interrompe o fluxo, danos a monocamada CE e ativa neutrófilos aderentes.

    Uma das principais vantagens dos modelos em multi-celulares in vitro descritos aqui é a sua capacidade para replicar in vivo, as interacções entre as células do estroma e CE. É difícil isolar os efeitos dos componentes do estroma específicos in vivoe modificá-los de uma maneira controlada. Em nossos modelos, as células do estroma pode ser manipulado para elucidar como eles se comunicam com CE e influenciar o processo inflamatório na saúde e na doença. Por exemplo, utilizando a tecnologia de siRNA mostrámos previamente que a produção de IL-6 por MSC durante a co-cultura foi necessária devido aos seus efeitos imunossupressores 23. Cada modelo pode ser usado para tratar de questões específicas ou seja, o efeito das células do tecido residente do estroma (modelo baseado em filtro) ou células estromais administrados terapeuticamente (microslides Ibidi e outros sistemas disponíveis no mercado) sobre o recrutamento de leucócitos. Em ambos os casos, temos titulada diferentes tipos de células do estroma para assegurar a sua viabilidade e estabelecer uma relação adequada de células do estroma a CE para avaliar os efeitos sobre o recrutamento 15,25. Do mesmo modo o meio de cultura deve ser compatível com cada tipo de célula incorporada no modelo. Nas nossas mãos co-culturas são tipicamente realizadas na célula estromal medium 11,18,23,31.

    Usando o modelo baseado no filtro, mostrámos previamente que várias células do estroma modular a capacidade da EC para suportar a adesão e migração de leucócitos de uma forma específica do tecido e que estes efeitos são alteradas em doenças crónicas 3. Isto leva ao conceito de que as células estromais "estabelecer códigos de endereço" específicos de tecido que regulam activamente o recrutamento de leucócitos para o tecido inflamado 24. Estes modelos são especificamente concebido para analisar as fases iniciais do recrutamento em grande detalhe, mas não são capazes de estudar a migração subsequente dentro do espaço subendotelial (isto é, longe do endotélio para os tecidos). 3D, as construções de multicamadas multi-celulares, tais como um ensaio de gel de colagénio estática 12,32 seria mais apropriado para estudar estas últimas fases de recrutamento.

    Os nossos modelos de adesão baseadas no fluxo são altamente versátil. Temos descrita a sua utilização no contexto de recrutamento de neutrófilos, mas outros subconjuntos de leucócitos pode ser investigado de um modo semelhante. Temos também utilizado o sistema microlâmina Ibidi para investigar o recrutamento de circular MSC pela EC 23, e se tal se verifica por meio da mesma cascata de adesão relatada por leucócitos. Da mesma forma estes modelos podem ser utilizados para examinar o recrutamento e incorporação de linhas de células de tumores metastáticos, e seus efeitos subsequentes sobre respostas endoteliais e o recrutamento de leucócitos. Alternativamente, o modelo baseado em filtro pode ser adaptado para incorporar diferentes tipos de células do estroma (por exemplo, fibroblastos, podócitos, células musculares lisas) a partir de tecidos saudáveis ​​13,21 e locais de doença 11,18,20. Isto permitiria o estudo de vias de regulação específicos de tecidos que actuam ao nível da sobre CE e / ou leucócitos. Em todos os casos, a interrupção de processos regulatórios normais em uma variedade de condições de doença pode ser examinada para identificar kemediadores reguladoras y (tais como IL-6 e o ​​TGF-p) e potenciais alvos terapêuticos novos. No contexto de inflamação crônica estes agentes pode ser utilizado para desligar o processo de recrutamento, enquanto na biologia do câncer se poderia imaginar a sua utilização para ligar recrutamento para atingir o tumor.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Collagenase Type Ia Sigma C2674 Dilute in 10 ml PBS to get a final concentration of 10 mg/ml. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Dulbecco's PBS Sigma D8662 With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at RT.
    1X Medium M199 Gibco 31150-022 Warm in 37 °C water bath before use.
    Gentamicin sulphate Sigma G1397 Store at 4 °C. Add to M199 500 ml bottle.
    Human epidermal growth factor Sigma E9644 Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Fetal calf serum (FCS) Sigma F9665 FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56 °C. Store in 10 ml aliquots at -20 °C.
    Amphotericin B Gibco 15290-026 Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    Hydrocortisone Sigma H0135 Stock is in ethanol. Store at -20 °C in 10 µl aliquots.
    Collagenase Type II Sigma C6885 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100 mg/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    Hyaluronidase Sigma H3631 Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000 U/ml. Store at -20 °C in 100 µl aliquots.
    100 µm cell strainer for 50 ml centifuge tube Scientific Lab Supplies (SLS) 352360 Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
    DMEM low glucose Biosera LM-D1102/500 Warm in 37 °C water bath before use.
    Penicillin/Streptomycin mix Sigma P4333 Store at -20 °C in 1 ml aliquots.
    25 cc tissue culture flask SLS 353109
    75 cc tissue culture flask SLS 353136
    Bone marrow mesenchymal stem cells vial Lonza PT-2501 Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
    Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) Lonza PT-3001 Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
    EDTA (0.02%) solution Sigma E8008 Store at 4 °C. Warm in 37 °C water bath before use.
    Trypsin solution Sigma T4424 Store at -20 °C in 2 ml aliquots. Thaw at RT and use immediately.
    Cryovials Greiner bio-one 2019-02 Keep on ice before adding before adding cell suspension.
    Mr. Frosty Freezing Container Nalgene 5100-0001 Store at RT. When adding cryovials with cells store at -80 °C for 24 hr before transfering cells to liquid nitrogen.
    Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile Ibidi IB-80606 Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
    Cell tracker green dye Life technologies C2925 Store in 5 µl aliquots at -20 °C. Dilute in 5 ml prewarmed (at 37 °C) MSCGM.
    Cell counting chambers Nexcelom SD-100 Alternatively a haemocytometer can be used.
    Cellometer auto T4 cell counter Nexcelom Auto T4-203-0238
    Tumor necrosis factor α (TNFα) R&D Systems 210-TA-100 Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000 U/ml. Store at -80 °C in 10 µl aliquots.
    6-well, 0.4 µm PET Transwell filters SLS 353090
    K2-EDTA in 10ml tubes Sarstedt Store at RT.
    Histopaque 1119 Sigma 11191 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    Histopaque 1077 Sigma 10771 Store at 4 °C. Warm to RT before use.
    10 ml round bottomed tube Appleton Woods SC211 142 AS
    7.5% BSA Fraction V solution Life technologies 15260-037 Store at 4 °C.
    20 ml Plastipak syringes BD falcon 300613
    5 ml Plastipak syringes BD falcon 302187
    2 ml Plastipak syringes BD falcon 300185
    3M hypo-allergenic surgical tape 9 m x 2.5 cm Micropore 1530-1 Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
    Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3 mm (thin tubing) Fisher Scientific FB68854 Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
    Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4 mm (thick tubing) Fisher Scientific FB68855
    Portex Blue Line Manometer tubing Smiths 200/495/200 Tubing leading to the syringe pump.
    3-way stopcock BOC Ohmeda AB
    Glass 50 ml syringe for pump Popper Micromate 550962 Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
    Glass coverslip Raymond A Lamb 26 x 76 mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
    Parafilm gasket American National Can Company Cut a 26 x 76 mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20 x 4 mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133 µm.
    Two perspex parallel plates Wolfson Applied Technology Laboratory Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
    Electronic 3-way microvalve with min. dead space Lee Products Ltd. LFYA1226032H Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
    Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) Harvard Apparatus 70-2001 Set the diameter to 29 mm and refill (flow) rate.
    L-shaped connector Labhut LE876 To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
    Video camera Qimaging 01-QIC-F-M-12-C Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
    Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics 41N70000-61592 For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
    Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.

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    References

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