从整体组织和活检建立人类上皮Enteroids和Colonoids的

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Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy. J. Vis. Exp. (97), e52483, doi:10.3791/52483 (2015).

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Abstract

Introduction

胃肠道的衬里上皮细胞是在不断更新。这个过程是由肠干细胞(ISCS),它连续地产生子代迅速更换肠上皮,因为它翻转的增殖触发。增殖隔室包括所述ISC的被限制在隐窝的底部。综合监控系统产生的后代最终分化成吸收或分泌谱系。走出地下室,并到绒毛或表面上皮细胞逐步分化,因为他们去角质前向上迁移到管腔1。 ISC的产生所有肠上皮细胞类型,包括肠,微皱细胞,肠内分泌细胞,杯状细胞,绒头细胞和帕内特细胞。结肠的特点是多为结肠和杯状细胞组成的长形墓穴,有散肠内分泌和一簇细胞2。

体外 CULTURE系统构成有前途的工具,学习ISC维护和肠组织的动态平衡。然而,这是难以依靠组织培养技术的生理条件不充分再现和上皮微环境经常改变3,4。在ISC领域的一个重大进步是建立组织培养技术来维护和使用已定义的生长因子来替代正常的肠道利基信号扩大个体鼠ISC的。长期培养条件由Sato等人描述的,在其中单隐窝或从肠道上皮分离的干细胞的生长,以形成3维的上皮结构,包括多个隐窝样结构域5-7。这些立体结构发生裂变的事件不断扩大。有趣的是,所有的具体来源的组织中的肠细胞类型产生和以及被挤压成的内腔8。使用该系统的变型,上皮组织体可以从胃,小肠和结肠中产生。更具体地,从小肠上皮组织体是enteroids 9,以及那些从结肠是colonoids 9,10。这些上皮类器官培养系统已被用于测试分离的单细胞的充当干细胞在体外培养 ,从而检测分离的细胞5,6,10-15的“干细胞”的能力。其他研究者已经使用既enteroids和colonoids研究个体的上皮细胞16-21的功能。因此,enteroid和colonoid培养物可以被用于评估两个干和非干细胞的功能,并提供新的洞察肠子内基本细胞相互作用。

在2011年,佐藤和同事产生来自人小肠和结肠22,23衍生上皮组织体的长期培养。除了在介质组合物中,人上皮enteroids差异和colonoids表现出相同的特点及其小鼠对应。此外,他们可以从患病组织诸如巴雷特食管,腺瘤或腺癌,和囊性纤维化22,24产生。人类enteroids构成宝贵的系统来研究肠干细胞和上皮粘膜生物学,并作为一个新的实验系统,研究正常和异常消化道生理3。

这里,我们描述的方法来建立enteroids和colonoids来自人小肠和结肠隐窝( 图1)。在这种方法审查,我们强调从整个组织活检地下室集合。我们概括的培养方式,这对于成功的生长和维持人类enteroids和colonoids和由该模型所进行的可能的实验策略是至关重要的。

Protocol

注:伦理学声明:在使用CCHMC本文所述被批准的IRB人体组织的所有试验(IRB#2012年至2858年;#2014-0427)。从供体处CCHMC获得用于组织收集,储存和使用的样本的知情同意书。

1.准备文化

注:所有试剂都列在表1中

  1. 准备EDTA原液如下:准备0.5M的乙二胺四乙酸,pH值为8(EDTA)在超纯H 2 O,过滤消毒用0.22微米的过滤器。可选,存储EDTA原液在室温下去。
  2. 制备螯合缓冲如下:混合2%山梨糖醇,1%蔗糖,1%牛血清白蛋白组分V(BSA)和1×庆大霉素/在Dulbecco氏磷酸盐两性霉素溶液缓冲盐水不含Ca 2+和Mg 2+(DPBS),过滤灭菌与0.22微米的过滤器。准备螯合BUFFER新鲜。
  3. 制备的Wnt-3A条件培养基如下:的Wnt-3A条件培养基是使用细胞线L的Wnt-3A根据制造商的说明(ATCC,CRL-2647),制成在内部。补充了2mM谷氨酰胺,10毫米的HEPES,100U / ml的青霉素,100μg/ ml链霉素,1 N2添加剂,1 B27添加剂,1%BSA和过滤灭菌用0.22μm的过滤器中的介质。
    注:测试每一批的使用TOPFLASH试验的Wnt活性。根据制造商的说明使用稳定的HEK293 TOPFLASH细胞系(汉斯Clevers实验室)与Renilla荧光素酶测定试剂盒。正常化用100ng / ml人重组Wnt-3A的TOPFLASH测定。确认至少有10倍的变化与对照组相比的条件培养基的活性。分新鲜的Wnt-3A条件培养基到10ml等份在15ml锥形管中,并冷冻在-20℃下进行长达6个月。商店解冻等分长达5天4°C时不丧失活性。
  4. 公关epare人类minigut介质如下:补编高级DMEM / F12与2mM谷氨酰胺,10mM的HEPES,100U / mL的青霉素,100μg/ mL链霉素,1 N2添加剂,1 B27添加剂,1%BSA和过滤介质灭菌0.22微米的过滤器。
    注:在-20℃下进行长达3个月除以新鲜人minigut介质到10ml等分试样在15ml锥形管中并冷冻。商店解冻等分长达5天4°C时不丧失活性。
  5. 制备完整的人minigut介质如下:准备隐窝培养物或培养基改变人类minigut介质(见1.4),补充了50%的Wnt-3A条件培养基(见1.3),1微克/毫升的R-脊椎蛋白1(1前新鲜:1000稀释1毫克/毫升的股票),100毫微克/毫升的头蛋白(1:1000稀释100克/毫升的股票),50 ng / mL的EGF(1:10,000稀释500微克/毫升的股票),500 Nm的-83 ,10μMSB202190:(稀释500兆库存1000 1)(1:3000稀释的30mM库存)-01,10nM的〔亮氨酸〕15胃泌素1(1:10,000稀释的100μM的股票),10毫烟酰胺(1:稀释100 1M的股票)和1mM的N-乙酰半胱氨酸(1:1000稀释的1M股票)。
    注:存储完整的人类minigut媒体2天,4℃而不丧失活性。

从整个组织2地穴隔离

注意:从组织采集,它是必不可少的,以保持在盐水中的样品。建议保持组织上的冰块在运输过程中。应尽快进行样品地穴隔离的准备。
注:所有试剂都列在表1中 ,工具,设备和消耗品列于表2。

  1. 在开始实验前准备好所有的试剂。解冻在冰上和基底膜基质预先孵育,在37℃在CO 2培养箱24孔板中。
    注:另外,用15微升/孔的24的中心作出的薄层基底膜基质的-嗯板,并将其放置在CO 2培养箱中在37℃。此兼性步骤保持基底膜基质作为聚合过程中下降。
  2. 与洗组织冰冷Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水不含Ca 2+和Mg 2+(DPBS)。继续进行直到DPBS的内容是清楚的。
  3. 用0.2毫米直径minutien销,固定在组织上的硅氧烷涂层玻璃培养皿填充用冰冷的DPBS。伸展和针组织扁平的粘膜面朝上。
  4. 在解剖显微镜下,从粘膜下层和结缔组织使用微解剖剪和细点弯钳除去覆粘膜( 图2A,B)。
  5. 伸展和针的解剖粘膜平放在硅氧烷涂覆玻璃培养皿与粘膜面朝上。剩余的粘膜下层和结缔组织可以被丢弃或者用于进一步的实验( 图2C)。
  6. 平缓刮掉粘膜与弯钳的表面上。这一步是必要的,以改善该制剂的质量。
    1. 对于小肠,轻轻刮去粘膜去除绒毛。
    2. 对于结肠,轻轻刮去粘膜去除粘液和碎屑。
  7. 用冰冷的缓冲螯合洗粘膜3-4次,以除去绒毛和碎片。
  8. 盖上新鲜烹制2mM的EDTA螯合缓冲(200微升0.5M的EDTA在49.6毫升螯合缓冲)的粘膜。
  9. 广场上冰的培养皿中轻轻摇晃在水平轨道摇床30分钟。
  10. 洗组织3-4次,用冰冷的缓冲螯合无EDTA中。在洗涤后,离开粘膜冰冷螯合缓冲器。
  11. 处理使用弯曲和细镊子解剖显微镜下的粘膜。轻轻刮去黏膜释放使用弯钳肠腺。
  12. 轻轻用圆周率从培养皿去除隐窝悬浮佩特并转移到一个50ml锥形管中。
    注:检查组织,以确保几乎所有的隐窝已从粘膜去除。
  13. 通过150微米过滤隐窝暂停网2倍。
    注意:检查显微镜( 图2D)下流通的地穴富集。
  14. 离心地穴暂停5分钟50 XG,4℃。弃去上清液。
  15. 重悬在5ml冰冷缓冲螯合沉淀。
  16. 从步骤2.15计数每从悬浮液10微升滴隐窝数。转移所需要的电镀到5毫升的圆底管隐窝数。使用24孔盘200〜500隐窝每口井建立enteroids或colonoids。
  17. 离心机地下室部分为10分钟,在150克,4℃。去除上清。
  18. 使用隐窝后续文化。

从活检3.地穴隔离

  1. 准备前的所有试剂开始实验。解冻在冰上和基底膜基质预先孵育,在37℃在CO 2培养箱24孔板中。
  2. 与洗活检冰冷Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水不含Ca 2+和Mg 2+(DPBS)。
  3. 使用直径0.1mm minutien销,固定在活检上硅氧烷涂层玻璃培养皿填充用冰冷的DPBS。伸展和针粘膜平与粘膜一侧朝上( 图2E)。
  4. 轻轻刮去黏膜弯钳的表面,以去除绒毛和碎片。这一步是必要的,以改善该制剂的质量。
  5. 用冰冷的缓冲螯合洗活检3-4次,以除去绒毛和碎片。
  6. 盖上新鲜烹制2mM的EDTA螯合缓冲(200微升0.5M的EDTA在49.8毫升螯合缓冲)活检。
  7. 广场上冰的培养皿中轻轻摇晃在水平轨道摇床30分钟。
  8. <LI>洗净切片3-4次用冰冷的螯合缓冲无EDTA。洗涤后,将留在冰冷的缓冲螯合活检。
  9. 处理使用弯曲和细镊子解剖显微镜下的活检。轻轻刮去粘膜用弯钳松开肠腺。
  10. 轻轻用移液管从培养皿中去除隐窝悬浮并转移到50ml锥形管中。
    注:检查组织,以确保几乎所有的隐窝已从粘膜去除。
  11. 过滤器通过一个150微米的尼龙地穴悬吊网2倍。
    注意:检查在显微镜下的流过的地穴富集。
  12. 离心地穴暂停5分钟50 XG,4℃。弃去上清液。
  13. 重悬在1ml冰冷缓冲螯合沉淀。转让墓穴悬挂到1.5 ml离心管。
  14. 离心机地穴分数在150 XG,4℃,10分钟。去除上清。</ li>
  15. 使用隐窝后续文化。

4.地穴文化基底膜基质

  1. 采用预冷枪头,悬浮颗粒隐窝(从步骤2.18或3.15)在基底膜基质(200〜500隐窝/ 50微升基底膜基质)。
  2. 申请50微升隐窝悬浮液以每孔基底膜基质上的预热板。慢慢喷射在井的中心基底膜基质。
  3. 将24孔板在37℃,5%CO 2的培养箱中30分钟,以使基底膜基质的完全聚合。
  4. 覆盖基底膜基质用500微升完整的人类minigut介质中添加2.5μMCHIR99021(1:4000稀释10毫米股票)和2.5μMThiazovivin(1:4000稀释10毫米股票)。
  5. 孵育所述板在37℃,5%CO 2的培养箱中培养。
  6. 用新鲜完整的呼玛更换介质ñminigut中每2天。

5.传代培养Enteroids和Colonoids的。

注:通道Enteroids和Colonoids初步电镀后,每7〜10天。通常,分割1以及3〜4个孔。

  1. 在实验开始前,准备所有试剂。解冻在冰上和基底膜基质预先孵育,在37℃在CO 2培养箱24孔板中。
  2. 使用无菌针头和覆盖用1毫升冰冷的DPBS中取出介质。
  3. 吸管来回1000微升提示。转移在一个新的15毫升锥形管中的溶液中。
  4. 加入2 ml人minigut培养基补充有每1ml培养基中的5%FBS中。
  5. 离心5分钟,该溶液在50×g离心,4℃。弃去上清液。
  6. 重悬沉淀用2ml的细胞解离酶补充有10μM的Y-27632(1:1000稀释的10mM储备)。孵育,持续5分钟在37℃在水 - 浴中。
  7. 分离使用3毫升鲁尔锁注射器配备了一个18-G填充/钝针的细胞团块。轻轻吸取的溶液来回使用注射器10倍。
  8. 离心机暂停5分钟,在500 XG,4℃。弃去上清液。
  9. 用预冷的枪头,重悬在基底膜基质细胞沉淀。
  10. 申请50微升隐窝悬浮液以每孔基底膜基质上的预热板。慢慢喷射在井的中心基底膜基质。
  11. 将24孔板在37℃,5%CO 2的培养箱中20分钟,以使基底膜基质的完全聚合。
  12. 覆盖基底膜基质用500微升完整的人类minigut介质辅以10μMY-27632(1:1000稀释10毫米股票)。
  13. 孵育所述板在37℃,5%CO 2的培养箱中培养。
  14. 术后第2天(:1000稀释10毫米的股票1),更换新鲜完整的人类minigut培养基中添加10μMY-27632的培养基中。此后,用新鲜的,完整的人类minigut中更换培养基隔日1次。

6.冷冻培养Enteroids和Colonoids的

注:通常冻结一口井成2-3冷冻管。

  1. 重复步骤5.1至5.8。
  2. 悬浮用冷冻介质中的颗粒。转移1毫升冷冻液到标记离心管中。将离心管中含有500毫升异丙醇的冷冻集装箱。
  3. 在冷冻集装箱转移到80℃的冷冻24小时,然后转移到离心管液氮储存。
    注:存储Enteroids和Colonoids长达1年。

Representative Results

图2D示出的新鲜分离的隐窝从整个组织( 图2D)的典型例子。隐窝从活检中分离的数目比在整个组织中低。使用标准容量活检钳针,我们通常在单次执行两种活检叮咬。每个活检咬结果在10 mm 2的表面与每个活检平均50至100隐窝( 图2F)。

文化基底膜基质后,隐窝围捕,形成enterospheres的小肠和colonospheres结肠癌。地穴萌芽通常发生在5〜6天,播种后。然而这是不寻常地看到任enteroids(enteroids)或colonoids(colonoids)形成在基底膜基质球体( 图3A-C;电影1)。的传代可以在7天之内完成,这取决于enteroids的大小。该enteroids或colonoids establ从活检ished进行文化同发展。然而,由于在播种隐窝密度较低,传代通常在10至12天的文化做了(图4a,b)所示。 Enteroids和colonoids培养扩大可重复的方式。

既enteroids和colonoids呈现腔侧,并衬有上皮( 图5A,B)。增生细胞可在enteroids内被观察和位于芽尖端( 图5C,D)的范围内。沾上E-cadherin的(ECAD)enteroids的共焦成像显示上皮细胞( 图5E)。

既enteroids和colonoids可以从患者的遗传/先天性疾病获得的组织来确定。 图6示出了由于在上皮细胞广告先天性突变代表enteroids从囊性纤维化( 图6A)和一个簇绒肠病的患者不断增加HESION分子基因(EpCAM的)( 图6B)。旁边的遗传缺陷,该enteroids没有表现出在基础条件的差异。

图1
图1.工作流的隐窝解离和代人enteroids和文化colonoids的。地穴(从人体小肠或结肠)由EDTA螯合隔离。培养隐窝形成enteroids的小肠和colonoids的结肠。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.解剖过程地穴隔离。(A)小肠specimen被拉伸和钉扎平成聚硅氧烷涂覆的培养皿。 (B)中的粘膜被从底层粘膜下层分离。 (C)的该解剖粘膜被拉伸和钉扎平成聚硅氧烷涂覆的培养皿。 (D)中的EDTA螯合作用后,将隐窝从组织中分离。 (E)一种活检拉伸和钉扎平成聚硅氧烷涂覆的培养皿。 (F)EDTA螯合后,隐窝从活检隔离。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.地穴文化和人力enteroid和colonoid代从整个组织。(A)隔离后镀在基底膜基质空肠隐窝。隐窝是后3至4小时闭起来,并开始球囊起来,形成超出这个时间enterospheres。在第7天,空肠enteroids形成。 (B)分离培养后,回肠隐窝表现得像空肠隐窝,形成回肠enteroids。 (C)结肠隐窝被隔离后镀在基底膜基质。 7天后(比例尺:100微米)隐窝密切和形式colonoids。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.地穴文化和人力enteroid和colonoid一代从活检。(A)隔离后镀在基底膜基质十二指肠隐窝。隐窝是3收盘后至4小时,并开始了气球beyo次此时间形成enterospheres。在第7天,将enteroids形成。 (B)分离培养后,结肠隐窝铺在基底膜基质。隐窝收起来,形成colonospheres再经过7天 ​​(比例尺:100微米)colonoids。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
经过6天的文化图5人enteroids肠谱系。(A)人力enteroid。 (B)(A)展示上皮衬里enteroids的苏木精-伊红节(比例尺:100微米)。 ( 光盘 )后的EdU染色(品红色)enteroids的共聚焦成像显示增殖性细胞的存在。 (E 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6.地穴文化和人力enteroid一代的病变组织。(A)Enteroids从囊性纤维化标本建立的。 (B)Enteroids从先天性簇绒肠病标本建立的(比例尺:100微米)。 请点击此处查看该图的放大版本。

电影1 Enterosphere形成人类enteroid培养32小时时间圈e动画显示了从人体小肠回缩,形成文化的enteroid建立了enterosphere。 请点击此处观看该视频。

试剂名称 公司 目录编号 溶剂 股票集中度 终浓度 评论
Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水的Ca 2+,Mg 2 +的自由(DPBS) Life技术; GIBCO 14190-144 - - 1X
乙二胺
四乙酸(EDTA)
Sigma-Aldrich公司 431788 超纯的dh 2 O 2毫米
山梨糖醇菲舍尔科学 BP439-500 DPBS 2%
蔗糖菲舍尔科学 BP220-1 DPBS 1%
牛血清白蛋白(BSA)的V组分菲舍尔科学 BP1600-100 DPBS 1%
Gzntamycin /两性霉素B的解决方案 Life技术; GIBCO R-015-10 - 500X 1X
Wnt信号-3A conditionned媒体在内部 - - - -
先进的DMEM / F12 Life技术; GIBCO 12634-028 - - -
1M HEPES Life技术; GIBCO 15630-080 - 1M的 10毫
含有GlutaMAX(谷氨酰胺) Life技术; GIBCO 35050-061 - 100X 1X
青霉素链霉素(10,000 U /毫升) Life技术; GIBCO 15140-148 - 100X 1X
N2补充 Life技术; GIBCO 17502-048 - 100X 1X
B27补充 Life技术; GIBCO 17504-044 - 50X 1X
N-乙酰半胱氨酸 Sigma-Aldrich公司 A9165-5G DPBS 1M的 1毫米 </ TD>
Nicotidamide Sigma-Aldrich公司 N0636 DPBS 1M的 10毫
基底膜,肾小球滤过率,无苯酚(基底膜基质) 康宁 356231 - - - REQUIRED
人重组头蛋白研发 6057-NG / CF DPBS 100微克/毫升 100ng / ml的其他供应商:R&D组; Anaspec和Preprotech
重组人R-脊椎 Preprotech 120-38 DPBS 1mg / ml的 1微克/毫升
重组人表皮生长因子 Sigma-Aldrich公司 E9644-.2MG DBPS 500微克/毫升 50ng / ml的
Y-27632 Sigma-Aldrich公司 Y0503-1MG DPBS 10毫 10μM
A-83-01 Tocris 2939 DMSO 500μM 500纳米
SB202190 Sigma-Aldrich公司 S7067-5MG DMSO 30毫米 10μM
人〔亮] 15胃泌素1 Sigma-Aldrich公司 G9145-.1MG DPBS 100μM 10纳米
CHIR99021 Stemgent建立 04-0004 DMSO 10毫 2.5μM
Thiazovivin Stemgent建立 04-0017 DMSO 10毫 2.5μM
的TrypLE快递酶(1X),酚红(细胞解离酶) Life技术; GIBCO 12605-010 - - - 传代
胎牛血清 Life技术; GIBCO 10082-1​​47 - - - 传代
CTS合成器-A-冻结介质(冷冻介质) Life技术; GIBCO A13713-01 - - - 对于冻结
L的Wnt-3A细胞系 ATCC CRL-2647 - - - Wnt信号-3A conditionned媒体制作
海肾荧光素酶检测 Promega公司 E2710 - - - Wnt信号-3A conditionned媒体活动
人重组的Wnt-3A 研发 5036-WN / CF DPBS 100微克/毫升 100ng / ml的
HEK293 TOPFLASH细胞系 - - - - - Wnt信号-3A conditionned媒体的活动;从汉斯Clevers实验室礼品

表1.详细试剂列表首选的制造商和目录编号。

离心分离机
设备 耗材 工具
层流罩 15-和50毫升锥形管中杜蒙#5镊子标准(FST;#11251-20)
的CO 2培养箱离心管杜蒙#7,弯细镊子(FST;#11274-20)
立体显微镜 24孔板精细剪刀(FST;#14060-09)
0.22微米的过滤器(赛多利斯) Vannas弹簧剪刀(FST;#15018-10)
轨道摇床血清移液器直径minutien0.2毫米引脚(FST;#26002-20)
冷冻集装箱(的Nalgene) 微量提示直径minutien0.1毫米引脚(FST;#26002-10)
SYLGARD 184硅(道康宁) 150微米网孔,尼龙筛(动态水族供给)
玻璃培养皿 5毫升圆底聚丙烯管(Falcon)中
血清学移液器 18G钝补针(BD)
微管 3毫升lsyringes与鲁尔锁定提示(BD)
离心管

Discussion

这种方法提供了一个完整的系统复制肠上皮细胞系和上皮动态构成来研究肠上皮生物学的有用工具。本文介绍的方法是改编自原鼠研究佐藤和Clevers 22有效地导致人类enteroids和colonoids。在这里,我们手动拾取隐窝通过显微解剖,以避免任何细胞污染物。此方法允许隐窝的直接可视化,并通过“摇动”导致稠度加班相比原来隐窝集合。其他小组开发出了类似的工艺使用略有不同的方法尤其是胶原酶25取代螯合通过EDTA。除了 ​​在隐窝集合的差异,这些工艺使用一个所需生长人类enteroids中培养22限定的介质。为了增加在隐窝播种生长效率,我们增加GSK3抑制剂(CHIR99021)对于前两天12。

组织或活检的处理是很重要的,并隐窝隔​​离应尽快组织到达在实验室进行的。然而,延迟隐窝分离和培养可进行到组织收集后24小时(数据未示出)如前对小鼠组织26进行说明。肠组织应放置在一个锥形管完全填充用DPBS,以避免组织破坏,并应保持在4℃。延迟准备允许组织装运,但在运输过程中应避免温度变化。所需的初始隐窝电镀的总时间是约2小时,用15至30分钟来处理所述组织和1至2小时,以分离和板隐窝。组织的显微切割是一种清洁的隐窝制备的一个关键因素和谓词。然而,地穴释放握手中各种协议描述的可能22,23。

尽管与鼠enteroid(enteroids)系统的相似性,人类enteroids需要特定的分子,以提高和维持其随时间增长。生长因子,EGF,头蛋白,R-脊椎蛋白被类似地使用与鼠上皮组织体。然而,使用的Wnt-3A是至关重要的。我们注意到,形成以及生长效率大于使用的Wnt-3A条件培养基比人类重组蛋白质。与此同时,我们展示了使用的糖原合酶激酶3(CHIR99021)12抑制剂改善培养条件。重组生长因子可通过的Wnt-3A,R脊椎蛋白,头蛋白和调节介质代替。阿的Wnt-3A表达L-细胞系可购(ATCC)。其它基团已经开发的R-脊椎-1- 23,27,Noggin- 19,和的Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28表达细胞系。两个小分子抑制剂在培养中使用了我直径和所必需的培养29的维护。 A-83-01是转化生长因子β和激活素/交点受体的选择性抑制剂(激活素样激酶4,5,7)和SB202190是p38促分裂原活化蛋白激酶抑制剂(MAPK)。这两种抑制剂已被分别用来维持人类诱导多能干细胞自我更新和建立人类天真多能干细胞30-32。此外,烟酰胺,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的前体,需要保持enteroids和colonoids膨胀在一个长期的方式22,29。

在EDTA螯合是重要的一步,因为它决定了从地穴编制的产量。我们已经成功了2mM EDTA处理。然而,EDTA浓度可以从2mM的进行修改,以对组织类型为15mM。在这种情况下,温育时间,必须凭经验确定。最初的电镀后,隐窝将全面-Up和最终形成enteroids。然而,enteroids或colonoids往往表现出“干”型形成球体几乎没有分化的细胞。在这种情况下,分化可以通过抽出的Wnt-3A,烟酰胺和p38蛋白抑制剂来启动。使用的Notch抑制剂诸如DAPT或DBZ有助于enteroids 22内增强的分化。

该模型概括肠生理学与来自干细胞区室所产生的含有吸收和分泌分化谱系持续隐窝出芽事件以及绒毛状上皮域。有趣的是,该系统不包含任何间充质细胞,并使用特定的介质的条件,以满足利基信号要求。

像的小鼠模型,人类enteroids可以从分离的肠上皮细胞中产生,以测试这些细胞以用作干细胞的能力。塞弗RAL研究使用的分化标志物(CD44,CD24和CD166)和EPHB2阳性细胞群的细胞来丰富与干性12,23,33。总之,这些研究表明人类enteroids培养物的效用,用于测试的干性。其他研究者使用该模型来调查肠道疾病,如感染性腹泻病,囊性纤维化,或结肠直肠癌22,34-37。这些研究表明,人类enteroids构成具有可能性的可靠的人类疾病模型走向个性化的筛选。人类enteroids可以使用DNA转染或感染病毒颗粒38转基因。这提供了一个有力的工具,以在人上皮组织体或正确的基因突变中研究基因的特定功能。近日,施万克和他的同事证明的可能性,以编辑的基因组与CRISPR / Cas9制度和纠正CFTR基因交流造成的基因突变ystic纤维化24。人类enteroids构成宝贵的系统来研究肠干细胞和上皮粘膜生物学,并作为一个新的实验系统,研究正常和异常消化道生理学。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) Life technologies; Gibco 14190-144
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich 431788
Sorbitol Fischer Scientific BP439-500
Sucrose Fischer Scientific BP220-1
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V Fischer Scientific BP1600-100
Gzntamycin/Amphotericin B solution Life technologies; Gibco R-015-10
Wnt-3A conditioned medium in house
Advanced DMEM/F12 Life technologies; Gibco 12634-028
HEPES 1M Life technologies; Gibco 15630-080
GlutaMAX (glutamine) Life technologies; Gibco 35050-061
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Life technologies; Gibco 15140-148
N2 Supplement Life technologies; Gibco 17502-048
B27 Supplement Life technologies; Gibco 17504-044
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
Nicotidamide Sigma-Aldrich N0636
Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) Corning 356231
human recombinant Noggin R&D 6057-NG/CF
human recombinant R-Spondin Preprotech 120-38
human recombinant EGF Sigma-Aldrich E9644-.2MG
Y-27632 Sigma-Aldrich Y0503-1MG
A-83-01 Tocris 2939
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-5MG
human [Leu]15-Gastrin 1 Sigma-Aldrich G9145-.1MG
CHIR99021 Stemgent 04-0004
Thiazovivin Stemgent 04-0017
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) Life technologies; Gibco 12605-010
Fetal Bovine Serum Life technologies; Gibco 10082-147
CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) Life technologies; Gibco A13713-01
L Wnt-3A cell line ATCC CRL-2647
Renilla luciferase assay Promega E2710
human recombinant Wnt-3A R&D 5036-WN/CF
HEK293 TOPflash cell line

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