Руководство по составления и использования hiPSC, полученных НПС по изучению неврологических заболеваний

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Экспрессия генов исследований нейронов, дифференцированных в пробирке из человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) нами 1 и других 2,3 показывают, что hiPSC нейроны напоминают плода, а не взрослых мозговой ткани. В настоящее время модели hiPSC основе может быть более подходящим для изучения предрасположенности к, а не конца особенностей, неврологические заболевания. Ранее мы уже сообщали, что значительная часть гена подписью шизофренией hiPSC полученных нейронов сохраняется у больных шизофренией hiPSC полученных нервных клеток-предшественников (НПС), указывая, что НПС может быть полезным типом клеток для изучения молекулярных путей, способствуя шизофрении 1 , Мы и другие сообщили, отклоняющееся миграции, повышение окислительного стресса и активных форм кислорода, чувствительность к югу от пороговых экологических стрессов и нарушения функции митохондрий при шизофрении hiPSC НПС 1,4-6, а также снижение нейронов Connectivity и синаптической функции у больных шизофренией hiPSC нейронов 5,7-10. Если молекулярные факторы, способствующие аномальным миграции и / или окислительного стресса у больных шизофренией hiPSC НПС также лежат в основе снижение нейронов подключения при шизофрении hiPSC полученных нейронов, НПС может быть надежной и высоко репликативной нейронной популяции, с которой для изучения механизмов, ответственных за болезни. Кроме того, поскольку можно быстро произвести большое количество клеток и не нужно ждать несколько недель или месяцев для созревания нейронов, анализы, основанные на NPC пригодны для изучения больших когорт пациентов и более пригодными для высокопроизводительного скрининга. Мы считаем, что hiPSC НПС может служить в качестве прокси для путей развития, потенциально способных к патогенезе заболевания, как уже было показано, при расстройствах как разнообразны, как шизофрения 1 и Хантингтона болезни 11.

Чтобы дифференцировать NPC, с hiPSCs, начальной нервной вводства осуществляется двойным SMAD торможения (0,1 мМ LDN193189 и 10 мМ SB431542) 12. Конфликтуя BMP и TGF- сигналов с этих малых молекул, эндодермы и мезодермы спецификация их, ускоряя дифференцировку нейронов и приводит к образованию видимых нервных розетками в течение одной недели обшивки. Нейронные рисунка происходит в начале этого процесса, по-видимому в период нейронной розеткообразования и сразу же после этого. При отсутствии других сигналов, эти примитивные нервные клетки предположить переднюю переднего мозга, как судьба 13. Сразу же после образования нервной розетки, и продолжается в течение расширения NPC, переднего мозга НПС культивируют с FGF2 8,14. Они имеют двойное клонов потенциал и могут быть дифференцированы в нейронных популяций 70-80% III-ТУБУЛИН-положительных нейронов и 20-30% глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) -позитивных астроцитов (рис 1). Большинство переднего мозга hiPSC нейронов VGLUT1-положительных, И поэтому по-видимому глутаматергическая, хотя около 30% нейронов GAD67-положительных (ГАМК) 8.

НПС регулярно пассировать более чем в десять раз в пробирке, сохраняя последовательные профили дифференциации, и без накопления кариотипа нарушения. Группы сообщили пассажи НПС более чем в 40 раз 15, однако, мы находим, что за десять проходов, НПС показывают увеличение склонности к астроцитов дифференциации. НПС хорошо переносят многократные замораживания-оттаивания может быть перешли расти, как нейросферах просто культивирование в неприлипающих пластин. НПС эффективно трансдуцировали вирусными векторами, что позволяет быстро оценить молекулярных и клеточных последствий генетической возмущений и легко расширяется до получения достаточного количества материала для биохимических исследований. Кроме того, поскольку допускает вирусные векторы надежный чрезмерной экспрессии и / или нокдауна болезни отношение генов, в любом управления или пациента происходит NeurAl клетки, можно использовать эту платформу для тестирования эффекта генетического фона на этих манипуляций. Хотя это и не подходит для Synaptic или деятельности на основе анализов, требующих зрелых нейронов, НПС может быть практической альтернативой для многих простых молекулярных или биохимических анализов пациента, полученных нервных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hiPSC дифференциация Neural клеток-предшественников

  1. Расти и расширяться hiPSCs в человеческих эмбриональных стволовых клеток (HES) носитель (Таблица 1) совместно культивировали на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерного слоя до больших (но субконфлюентные) колонии не будут готовы для нейронной дифференциации с помощью эмбриоидного тела (EB) промежуточного (рисунок 2). Обычные hiPSC условия культивирования хорошо описаны в других 16,17; Кратко, не растут в hiPSCs HES сред на MEF фидерного слоя до сливной, а затем ферментативно проход с коллагеназы (1 мг / мл в DMEM) и расширить примерно 1: 3 раз в 7 дней.
  2. Для приготовления покрытых пластин поли-L-орнитин / ламинин, пальто пластин с 10 мкг / мл поли-L-орнитин в стерильной воде для пластиковых поверхностей (50 мкг / мл для стеклянных поверхностей) и инкубируют при комнатной температуре в течение 3-24 ч. Промыть по меньшей мере, один раз стерильной водой, а затем покрытие с 5 г / мл ламинин в стерильном PBS при комнатной температуре в течение 3-24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если завернутый в пластик, плиты могут бытьхраниться до шести месяцев при -20 ° C.
  3. На 1-й день, ферментативно поднимать субконфлюентные hiPSCs (как правило, выращенных на MEFs или hiPSCs, выращенных в определенных средах, таких как TeSR 18 на Матригель) от пластины, как больших колоний с использованием 1 мг / мл коллагеназы IV в DMEM / F12.
    Примечание: После 1-2 ч инкубации при 37 ° С, колонии будет плавающей в чашке.
  4. Осторожно промыть hiPSC колонии (отстаиванием, не центрифугирования) 1-2X с DMEM / F12, ресуспендируют в 2 мл / лунку N2 / B27 СМИ (таблица 1) и передачи не соблюдают 6-луночные планшеты (по совместительству 3-колодцы в 1 Ну) 19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ночь колонии образуют плавающие шаровые скопления называются "эмбриональных телец" (EBS). Ожидать существенных гибель клетки.
  5. На 2-й день, наклона пластин и позволяют ЭТ отстояться. Осторожно снимите СМИ и мыть один раз DMEM / F12, чтобы убрать мусор. Подача со N2 / B27 среде с добавлением двойного Smad ингибиторов (0,1 М LDN193189 и 10M SB431542) 12
  6. В дни 3-7, neuralization будет происходить в контексте двойного SMAD торможения; убедитесь, что ЭТ круглые, но не кистозная. Поток ЭТ каждый второй день с N2 / B27 среде с добавлением 0,1 М LDN193189 и 10М SB431542.
  7. В дни 7-14 после покрытие из ЭТ с поли-L-орнитин / ламинин пластин с покрытием, проверить с помощью микроскопа светлого, что нейронные розетки начинают появляться в течение нескольких дней (характеризуется как круглые кластеров нейроэпителиальных клеток с апикально-базальной полярности; Рисунок 1). Продолжайте кормить прилипшие ЭТ каждый второй день с N2 / B27 среде с добавлением 0,1 М LDN193189, 10M SB431542 и 1 г / мл ламинина.

2. Сбор Neural Розетки

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем, что нейронные розетки ферментативно собирают с использованием нейронных Розетка выбора реагента 20 или аналогичный выбора реагента. Хотя нейронные розетки можно вручную выбрал в 6-луночный планшет, покрытый поли-L-орнитин / ламинин, ThiМЕТОДОЛОГИЯ занимает обширную подготовку в освоении, и, в зависимости от пользователя мастерства, может потребоваться второй тур кусать день 20 для дальнейшего обогащения НПС и истощать без нервные типы клеток.

  1. Для ферментативного отбора нейронных розетками на 14 день, аспирация средств массовой информации из придерживались ЭТ и добавить 1 мл нервной выбора розетка реагента на лунку для 6-луночного планшета. Инкубируют при 37 ° С в течение 1 часа.
  2. С P1000 Pipetman, аккуратно удалите фермент из каждой лунки. Добавить 1 мл DMEM / F12 на хорошо вымыть.
  3. С P1000, собирать 1 мл DMEM / F12 и быстро изгнать DMEM / F12 обратно в хорошо, таким образом, снятие розеток от пластины. Сбор розетки в трубки сокола.
  4. Внесите еще 1 мл DMEM / F12 и быстро изгнать в той же скважине, чтобы отделить оставшиеся розетки. (Не растереть. Старайтесь не порвать розеточные агрегатов). Сбор нервные розетки в той же трубки сокола.
  5. Повторите шаг 2,4, как это необходимо. Если розетки не отделить легко, добавьте месповторно фермента и повторить процесс (шаги 2.1-2.4)
  6. Спин клетки при 300 х г в течение 3 мин. Аспирируйте стирки и повторно приостанавливать розетки в 2 мл NPC информации (таблица 1). Передача клетки (1: 1) в поли-L-орнитин / ламинин покрытием 6-луночный планшет.
  7. От дней 15-21 нервные розетки будет расширяться; корма розетки каждый второй день с NPC СМИ.
  8. Оценка качества нервных розеток и гарантировать, что плоские фибробластов, как клетки не расширяется в культуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если не-розетки сохраняются, культура NPC иногда можно спасти с помощью ручного сбора, выбрав только лучшие из отборных розеток в Accutase. Диссоциируют 15 мин при 37 ° С. Пелле, мыть и пластины в NPC носителя, на 24-луночного поли-L-орнитин / ЛАМИНИНА пластины с покрытием.

3. Расширение Neural клеток-предшественников

Примечание: hiPSC НПС можно выращивать на любой Matrigel- или поли-L-орнитин / ламинин пластин с покрытием. Обычно мы используем MatrigeL-пластины, поскольку они могут быть получены быстрее и с меньшими затратами.

  1. Для приготовления пластины Матригель покрытием, быстро оттаивают и ресуспендируют в 1 мг замороженных аликвоту Матригель в 24 мл холодной DMEM / F12, и сразу же распределить 2 мл в каждую лунку два шесть-луночных планшетах. Инкубировать в течение, по меньшей мере 1 ч при 37 ° С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Matrigel нужно только атмосферный, не мыть, непосредственно перед использованием.
  2. Поток НПС каждый второй день и поддерживать на очень высокой плотности, или они будут спонтанно дифференцироваться в нейроны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на более установленных NPC, обычно расщепляются 1: 4 каждую неделю, очень низкие НПС канал может быть разделен 1: 2 редко, например раз в две недели.
  3. Чтобы разделить первые аспирации СМИ и добавить 1 мл теплой Accutase (1x) на лунку 6-луночного планшета. Инкубируют при 37 ° С в течение 10-15 мин.
  4. Осторожно передавать отдельные клетки в 15 мл пробирку, содержащую DMEM / F12 с минимальным механическим нагрузкам, как это возможно. Не титрования клеток, а в фермента. Пелле клеток путем spinniнг на 1000 мкг в течение 5 мин.
  5. Аспирируйте мыть и повторно приостанавливать НПС в ~ 1 мл среды на NPC исходного лунку 6-луночного.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидайте, что сливной колодец блюдо 6-а имеет 5-10 миллионов клеток; Это может быть подтверждено путем подсчета 10L аликвоту клеток с использованием гематоцитометр до повторного покрытия.
  6. После повторного приостановления, повторно пластины НПС в качестве NPC, нейронов или нейросферах. Для поддержания НПС, пластины приблизительно 1-2 миллионов клеток на лунку 6-луночного планшета. Эффективность формирования нейросфера может варьироваться в зависимости от экспериментов и клеточных линий, но обычно происходит лучше, если между 200000 и 1000000 клетки высевают на лунку в неприлипающими 6-луночный планшет; Если происходит слипание из нейросферах, уменьшить количество клеток, посеянных. Дифференцироваться в нейроны, плиты примерно 200 000 клеток на лунку 6-луночного планшета, замена NPC СМИ с нейронных СМИ.
  7. Иммуногистохимически проверки каждый установленный NPC линии. После достаточно клеточный материал был ExpanDED, этикетка НПС с антителами для нестин и SOX2. Проверенная NPC линии также должны быть дифференцированы в нейроны в течение 4-6 недель, и помечены с антителами для III-тубулина и MAP2AB.
    1. Исправить клеток в 4% параформальдегид в PBS при 4 ° С в течение 10 мин. Проницаемыми НПС при комнатной температуре в течение 15 мин в 1,0% Triton в PBS, а затем блокируют в 5% осла сыворотки с 0,1% Тритона при комнатной температуре в течение 30 мин.
    2. Выдержите с первичным антителом в 5% осла сыворотки с 0,1% Triton, в течение ночи при 4 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем следующие антитела: козий анти-Sox2, 1: 200; мышиного антитела против человеческого Нестин, 1: 200; кролика против βIII-тубулина, 1: 500; мышиное анти-βIII-тубулина, 1: 500; мышиное анти-MAP2AB, 1: 200. (Рисунок 2).
    3. После промывки PBS, инкубировать вторичными антителами клетки с соответствующим сопряженного вторичного антитела к козьим, мыши или кролика в масштабе 1: 300, в в 5% осла сыворотки с 0,1% Triton в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Для визуализации ядер, пятно клеток с 0,5 мкг / мл DAPI (4 '6-диамидино-2-фенилиндол), а затем установите с Vectashield.

4. NPC Трансдукция

  1. Использование spinfection (центрифугирование клеточной культуры пластин в присутствии вируса в 1000 мкг в течение 1 часа), чтобы увеличить процент трансфицированных клеток 21. Вытяжку СМИ и заменить соответствующей гиперэкспрессией (или управления) Лентивирусов (или ретровирусы), титровать до желаемого множественности заражения (МВД) (обычно 1-10), разведенного в NPC СМИ. Использование 1,5 мл объема на лунку 6-луночного планшета с (или соответствующим образом масштабированного объема для других типов тканей культуральных планшетах). Спин на 1000 мкг и 37 ° С в течение 1 ч в тарельчатой ​​центрифуге.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, преобразовывать НПС лентивирусными или ретровирусных векторов в течение 1-2 дней расщепления. Ли с использованием коммерческих или лабораторно получают вирусы, это может быть полезно, чтобы надлежащим образом титр вируса партии заранее путем серийного разведения. (Рисунок 3).
  2. Чтобы уменьшить КВЖДlular смерть, заменить средства массовой информации в течение 8 ч в spinfection.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусный интеграция и экспрессия трансгена должны быть обнаружены в пределах 24 часов по флуоресценции гена-репортера. (Если вирус не хватает флуоресцентный репортер, это более трудно оценить, успешно трансфекции может лучше быть подтверждено иммуноблот, иммуногистохимии или кПЦР сверхэкспрессию продуктов.) Полный выражение может занять 3-7 дней; повторные spinfections с дополнительным вируса может потребоваться, чтобы увеличить процент трансфицированных клеток. Периодические spinfections может произойти ежедневно, но не должно быть так часто. В идеале, если с помощью флуоресцентного репортер,> 80% клеток должны быть маркированы.

5. нейросфера Анализ миграции

Примечание: нейросферах форма спонтанно, после ферментативной диссоциации НПС (в форме идентичной той, которая используется в расширении NPC - шаги 3,3-3,6), если клетки культивируют в суспензии в NPC сред.

  1. Короче говоря, расти отделитьD НПС в NPC СМИ за 48 ч в прилипших пластин в целях стимулирования нейросферы. (Рисунок 4).
  2. Для нейросфера миграции, подготовить свежие матригель пластины с помощью холодных СМИ NPC, а не DMEM, в 96-луночного планшета, 1-2 ч до нейросфера сбора. Не аспирации Матригель из скважин.
  3. Как первоначально опубликован для сотовых полученных нейросферах 22 эмбриональных стволовых вручную выбрать NPC-производные нейросферы под микроскопом, после промывки в NPC СМИ, чтобы удалить остатки клеток. Передача один нейросфера в каждую лунку в Матригель покрытием 96-луночного планшета.
  4. Добавить дополнительный 0,5 мг Matrigel, разбавленный в холодных средах NPC, с нейросферах в каждом 96-луночном планшете.
  5. Вручную центр каждого отдельного нейросфера в середине и с использованием наконечника пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы забрать нейросферы такого же размера, для того, чтобы уменьшить изменчивость в результатах поиска.
  6. Разрешить миграция происходит в течение 48 часов, а затем исправить клетки WIth 4% параформальдегида и пятен с заданными иммуногистохимических маркеров.
  7. Если радиальная миграция должна быть определена, их фотографии нейросферы в их полностью с помощью 4x объектива микроскопа. Исключить любые нейросферы контактирующих край скважины или второй нейросфера из анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если миграция происходит дольше, чем 48 часа, в результате радиального переноса, вероятно, будет слишком большим, чтобы изображение с помощью 4x цели.
  8. Измерьте среднюю миграции из каждого нейросфера с помощью программного обеспечения NIH ImageJ (рисунок 5). Это может быть сделано с помощью одного из методов анализа, описанных ниже:
    1. Радиальная миграция:
      1. Вручную проследить край дальние миграции клеток с помощью инструмента выбора от руки, то использовать меру функцию (Ctrl + M), чтобы вычислить площадь полученной фигуры. Перед измерением область Убедитесь, что зона проверяется в окне Set Измерения найти на вкладке анализировать. ИспользуйтеЗначение измерения площади и уравнения для площади круга (= πr 2), чтобы определить радиус (внешний).
      2. Трассировка край исходного нейросфера, измерить и рассчитать площадь радиус (внутренний) таким же образом. Рассчитать общую радиальную миграцию как разность между наружным и внутренним радиусами.
    2. Наибольшее клеточной миграции:
      1. Измерьте расстояние перемещается из пяти удаленных клеток от края внутренней нейросфера помощи функции выбора прямой линии, за которой следует Меры функции (Ctrl + M).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Нервные розетки могут быть идентифицированы морфологически, используя светлое микроскопа, по их характерному внешнему виду как круглые кластеров нейроэпителиальных клеток с апикально-базальной полярности (рис 1). Хотя персонажи, как правило, культивируют при очень высокой плотности клеток, сразу же после пассирования, слегка пирамидальной формы сома и биполярное аксонов видна структура (рис 1D). Утвержденные НПС выразить нестин и SOX2 в большинстве клеток, хотя окрашивание III-ТУБУЛИН также видна во всех популяциях NPC, указывая, что некоторые доля НПС постоянно инициирует дифференцировку нейронов в культуре (рис 1F). Маркеры нервных стволовых клеток, таких как SOX2 и PAX6 и переднего мозга нейрональных клеток-предшественников, таких как TBR2, также выражены в НПС, а среднего мозга маркеры, такие как LMX1A и не Foxa2 (фиг 1G-I). Значительная часть крупных и плоских фибробластоподобных клеток в Население NPC указывает, что плохое качество НПС был создан, который вряд ли даст большое количество нейронов следующие дифференцировки нейронов (рис 2).

После успешной трансдукции с высоким титром лентивирусов или ретровирусов вектора, больше, чем 80% клеток должны быть помечены флуоресцентным репортер включены в векторе (рисунок 3). Поколение нейросфера должно дать население нейросферах сравнительно однородный размер (рис 4), которые, при регулярном кормлении, может оставаться здоровым в культуре в течение примерно одной недели. Нейросфера миграция происходит энергично у здоровых нейросферах (рисунок 5), и hiPSC НПС подвергаются быстрому дифференциации в ходе в нейросфера анализа миграции 1.

Рисунок 1

палатка "> Рисунок 1. конкретного пациента hiPSCs, NPC и нейронов. Светлое изображения hiPSC нервной дифференциации, от hiPSCs (А), в эмбриональных органов (B), нейронные розеток (С), НПЦ (D) и нейронов (E) ... 100x, шкала бар 100 мкм FI hiPSC НПС положительны по ряду переднего мозга нервных стволовых клеток и нейронных маркером клеток-предшественников, в том числе маркера нестин NPC (зеленый) и нейрональной маркера III-тубулина (красный) (F); нейронная транскрипции стволовых клеток факторы SOX2 (зеленый) и PAX6 (красный) (G) и маркера переднего мозга предшественников TBR2 (красный) (H), но не средний мозг маркеры LMX1A (зеленый) и Foxa2 (красный) (I). DAPI-окрашенные ядра (синий). 100x, масштабная линейка 100 мкм. J. НПС могут дифференцироваться до 70-80% III-тубулина-позитивных нейронов (зеленый) и 20-30% глиальных фибриллярного кислого белка (GFAP) -положительных астроциты (красный). 200x, масштабная линейка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2

Рисунок 2. Неактивированные NPC линии. Высокое качество (вверху слева) hiPSC НПС экспресс нестин (красный) и SOX2 (зеленый). в большинстве клеток (ядер, окрашенных DAPI (синий)), в то время как низкое качество (внизу слева) НПС участки SOX2-отрицательных и нестин-негативных клеток (справа). 4-недельных нейроны, дифференцированные из высоких НПС качества выразить MAP2AB (зеленый) и III-тубулина (красный) (вверху справа), но те, отличается от низких НПС качества нет (внизу справа). 100x, масштабная линейка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть больше веrsion этой фигуры.

Рисунок 3

Рисунок 3. Вирусный трансдукция NPC. Светлое (вверху) и GFP флуоресцентные (внизу) изображения hiPSC НПС до (слева) и после вирусной spinfection. 100x, масштабная линейка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4

Рисунок 4. нейросфера Образование. Светлое изображения примыкающих NPC (слева) и вновь образованных нейросферах (справа). 100x, масштабная линейка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть LARGER версия этой фигуры.

Рисунок 5

Рисунок 5. нейросфера миграции. AB. Светлое изображения нейросферах до (а) и после (б) 48 ч миграции в Matrigel. 100x, масштабная линейка 100 мкм. CG. Захват изображения экрана, демонстрирующие методологию для анализа радиального нейронной миграции с помощью программного обеспечения NIH ImageJ. Нажмите на "от руки выборов" на панели инструментов ImageJ (C). Проследите краю дальше мигрировавших клеток вокруг нейросферах (D). Убедитесь, что зона будет проверить в окне Set измерений (E). Используйте функцию Измерить (Ctrl + M) (F). Проследите края оригинала нейросферах (G) и использовать функцию Measure (Ctrl + M). Измерения могут быть экспортированы в Excel для анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Средства массовой информации Компоненты
HES СМИ DMEM / F12 (Life Technologies # 11330)
20% КО-сыворотка Замена (Life Technologies # 10828)
1x Glutamax (Life Technologies # 35050)
1x NEAA (Life Technologies # 11140)
1x 2-меркаптоэтанол (55 мм 1000x) (Life Technologies # 21985-023)
20 нг / мл FGF2 (Life Technologies 13256-029)
N2 / B27 СМИ DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
NPC СМИ DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
20 нг / мл FGF2 (Life Technologies)
1 мг / мл Натуральный мыши Ламинин (Life Technologies # 23017-015)
Нейронные СМИ DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
1 мг / мл природного мышь ламинина (Life Technologies)
20 нг / мл BDNF (Peprotech # 450-02)
20 нг / мл GDNF (Peptrotech # 450-10)
500 мкг / мл дибутирил циклического АМФ-(Sigma # D0627)
200 нМ L-аскорбиновая кислота (Sigma # A0278)

Таблица 1. СМИ рецепты.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы описали методы, с помощью которых дифференцировать hiPSCs в НПС, нейронная тип клеток, в которых значительная часть генов подписью hiPSC, полученных из нейронов сохраняется и может служить в качестве прокси-сервера для путей развития, потенциально способных к патогенезе заболевания 8, 11. Кроме того, как мы детально, НПС в энергично репликативной и легко Трансдуцированные нейронной население, которое, как мы считаем, может быть пригодным для молекулярных и биохимических исследований предрасположенности заболевания.

Хотя у нас есть подробные описания методов, дифференцировать и культуры переднего мозга рисунком НПС, они могут быть легко адаптированы для получения НПС с рисунком с другими судьбами клеток. Например, если плавающие ЭТ сначала обрабатывают 0,5 мг / мл DKK1, 10 мМ SB431542, 0,5 мг / мл Noggin и 1 мМ cyclopamine, гиппокампа NPC, будет сгенерирован которая может быть расширена в NPC СМИ и дифференцированные в нейронных среде с добавлением 20 нг / мл WNT3A 7 12,23. Учитывая, что большинство субтипспецифичной нейронов протоколы дифференциации протекают по нестин и SOX2-positve промежуточный, мы прогнозируем, что подобные методы могут быть адаптированы для GABAergic- 2,24 и glutamatergic- 3,25,26 конкретных групп населения NPC.

Есть несколько важных шагов в протоколе стоит отметить. Во-первых, если сверхэкспресирующим или стучать вниз эндогенной экспрессии гена, то лучше использовать вектор управления выражая флуоресцентный белок из той же вирусной позвоночника, как мы видели существенные различия в цветении, когда журналисты выражаются векторов переменных размеров (за счет к снижению упаковывая эффективностис вектором размера) или с разницей промоутеры (из-за различий в эффективности Организатором). Во-вторых, мы рекомендуем завершения вирусной трансдукции до нейросфера образование, как мы видели плохой пенетрантность вирусных векторов в плотной структурой нейросфера. В-третьих, как переход количества НПС возрастает за проход десяти, мы часто наблюдаем существенно нарушенной миграции в нейросфера анализа. В самом деле, учитывая склонность НПС для получения большего процента астроцитов с прохода, очень важно, чтобы соответствовать прохождение NPC линий в каждом эксперименте.

И, наконец, важно рассмотреть биологические и технические недостатки способов, описанных. Хотя НПС-видимому, морфологически сходны с глазом, они гетерогенную популяцию состоит из клеток, способных генерировать как глутаматэргических и ГАМКергических нейронов. В то время как мы наблюдаем удивительно последовательной переднего мозга паттерна NPC линий между людьми с помощью этой метоd 1, это только при сравнении полностью проверенные высококачественные линии NPC - имеются существенные различия между добром и бедными линий качество NPC. Кроме того, вирусные дает трансдукции генетически разнородных клеток, каждый с интеграцией вирусного вектора в уникальной геномной месте; Поэтому, отдельные клетки будут меняться как в местоположении и количество геномных сайтов интеграции. Более последовательные изменения в экспрессии генов будет происходить всегда, когда генетические манипуляции предназначен для точного и определенного места, происходит ли это пальцем цинка, Тален или стратегий CRISPR основе.

Пациент hiPSC происходит НПС может быть использована для изучения как на глобальном, возмущения экспрессии генов, происходящих в неврологических заболеваний, а также молекулярные и / или клеточные эффекты манипулирования генов-кандидатов, или микроРНК в контексте либо здоров, либо больных нервных клеток пациента происхождения. Таким образом, последствия манипулирования одно или несколько ключевыхаллель (а) риск может быть охарактеризован в контексте различных генетических фонов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
  3. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
  4. Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
  5. Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18, (10), 1067-1076 (2013).
  6. Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21, (7), 1547-1559 (2012).
  7. Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473, (7346), 221-225 (2011).
  9. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. (2014).
  10. Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. (2014).
  11. An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11, (2), 253-263 (2012).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  14. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
  15. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  17. Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  18. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  19. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
  20. Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
  21. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  22. Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
  23. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  24. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  25. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics