मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के अध्ययन के लिए उत्पन्न और का प्रयोग hiPSC व्युत्पन्न NPCs के लिए एक गाइड

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Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

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Abstract

Introduction

हमें एक से मानव प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (hiPSCs) से इन विट्रो में भेदभाव न्यूरॉन्स और दूसरों 2,3 के जीन अभिव्यक्ति पढ़ाई hiPSC न्यूरॉन्स भ्रूण बजाय वयस्क के मस्तिष्क के ऊतकों जैसे लगते हैं कि संकेत मिलता है। वर्तमान में, hiPSC आधारित मॉडल बल्कि की देर सुविधाओं, मस्तिष्क संबंधी बीमारी से, करने के लिए गड़बड़ी के अध्ययन के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है। हम पहले NPCs के एक प्रकार का पागलपन एक योगदान करने के लिए आणविक मार्ग का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी सेल प्रकार हो सकता है यह दर्शाता है कि एक प्रकार का पागलपन hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की जीन हस्ताक्षर का एक महत्वपूर्ण अंश एक प्रकार का पागलपन hiPSC व्युत्पन्न तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (NPCs) में संरक्षित है सूचित किया है कि । हम और दूसरों को न्यायपालिका माइग्रेशन, बढ़ oxidative तनाव और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, उप दहलीज पर्यावरण तनाव और मानसिक असंतुलन में बिगड़ा mitochondrial समारोह hiPSC NPCs के 1,4-6 के प्रति संवेदनशीलता, साथ ही कमी हुई न्यूरोनल सी सूचना दी हैonnectivity और मानसिक असंतुलन hiPSC न्यूरॉन्स 5,7-10 में synaptic समारोह। एक प्रकार का पागलपन hiPSC NPCs में न्यायपालिका प्रवास और / या oxidative तनाव के लिए योगदान दे आणविक कारकों को भी एक प्रकार का पागलपन hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में कम न्यूरोनल कनेक्टिविटी आबाद हैं, NPCs के रोग के लिए जिम्मेदार तंत्र का अध्ययन करने के साथ जो एक मजबूत और अत्यधिक replicative तंत्रिका आबादी हो सकता है। एक तेजी से कोशिकाओं की बड़ी संख्या उत्पन्न कर सकते हैं और neuronal परिपक्वता के लिए हफ्तों या महीनों के इंतजार की जरूरत नहीं है, क्योंकि इसके अलावा, एनपीसी आधारित assays बड़ा रोगी साथियों के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं और उच्च throughput प्रदर्शन के लिए उत्तरदायी हैं। हम पहले से ही एक प्रकार का पागलपन एक और हंटिंग्टन रोग के रूप में 11 के रूप में विविध विकारों में प्रदर्शन किया गया है के रूप में hiPSC NPCs, संभावित रोग रोगजनन के लिए योगदान विकास के रास्ते के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा कर सकते हैं कि विश्वास करते हैं।

HiPSCs में प्रारंभिक तंत्रिका से NPCs के अंतर करने के लिएduction दोहरे SMAD निषेध (0.1mm LDN193189 और 10mm SB431542) 12 से पूरा होता है। इन छोटे अणुओं के साथ संकेत बीएमपी और TGF नाराज करके, अन्तर्जनस्तर और मेसोडर्म विनिर्देश neuronal भेदभाव को बढ़ाने और चढ़ाना के एक सप्ताह के भीतर दिखाई दे तंत्रिका rosettes के गठन के लिए अग्रणी, अवरुद्ध है। तंत्रिका patterning के संभवतः तुरंत बाद तंत्रिका थाली गठन और की अवधि के दौरान, जल्दी इस प्रक्रिया में होता है। अन्य संकेतों के अभाव में इन आदिम तंत्रिका कोशिकाओं को एक पूर्वकाल अग्रमस्तिष्क तरह भाग्य 13 मान। इसके तत्काल बाद तंत्रिका थाली गठन के बाद, और एनपीसी विस्तार भर में चल रहे, अग्रमस्तिष्क NPCs के FGF2 8,14 साथ सुसंस्कृत हैं। वे दोहरी वंश की क्षमता है और 70-80% तृतीय ट्यूबिलिन पॉजिटिव न्यूरॉन्स और 20-30% glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) -positive astrocytes (चित्रा 1) के तंत्रिका आबादी के लिए भेदभाव किया जा सकता है। अग्रमस्तिष्क hiPSC न्यूरॉन्स के बहुमत VGLUT1 पॉजिटिव हैंन्यूरॉन्स का लगभग 30% GAD67 पॉजिटिव (GABAergic) कर रहे हैं, हालांकि, और इसलिए, शायद glutamatergic हैं 8।

NPCs के नियमित लगातार भेदभाव प्रोफाइल को बनाए रखने, और कुपोषण असामान्यताएं जमते के बिना, जबकि इन विट्रो में अधिक से अधिक दस बार passaged कर रहे हैं। समूह passaging के NPCs के 15, तथापि, हम दस मार्ग से परे है, NPCs के अस्थिकणिका भेदभाव के लिए प्रवृत्ति में वृद्धि हुई बताते हैं कि लगता है और अधिक से अधिक 40 बार सूचना दी है। NPCs के कई फ्रीज thaws अच्छी तरह-सहन और केवल गैर-पक्षपाती प्लेटों में संवर्धन द्वारा neurospheres के रूप में विकसित करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। NPCs के कुशलता से जैव रासायनिक अध्ययन के लिए पर्याप्त सामग्री उपज के लिए तेजी से आनुवंशिक गड़बड़ी की आणविक और सेलुलर परिणामों का मूल्यांकन, और आसानी से विस्तार योग्य, सक्षम करने वायरल वैक्टर द्वारा transduced कर रहे हैं। इसके अलावा, क्योंकि वायरल वैक्टर की अनुमति मजबूत अधिक अभिव्यक्ति नियंत्रण या रोगी व्युत्पन्न Neur या तो में और / या रोग-प्रासंगिक जीनों के पछाड़ना,अल कोशिकाओं, एक इन जोड़तोड़ पर आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इस मंच का उपयोग कर सकते हैं। अन्तर्ग्रथनी या परिपक्व न्यूरॉन्स की आवश्यकता होती है गतिविधि आधारित assays के लिए उपयुक्त नहीं है, हालांकि NPCs के मरीज व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिकाओं के कई सीधा आणविक या जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एक व्यावहारिक विकल्प हो सकता है।

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Protocol

1. hiPSC भेदभाव तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को

  1. आगे बढ़ें और मानव भ्रूण स्टेम सेल में hiPSCs का विस्तार (HES) मीडिया (1 टेबल) के सह-सुसंस्कृत एक माउस भ्रूण fibroblast (MEF) बड़े (लेकिन subconfluent) कालोनियों एक embryoid शरीर (ईबी) मध्यवर्ती के माध्यम से तंत्रिका भेदभाव के लिए तैयार कर रहे हैं जब तक फीडर परत पर (चित्र 2)। नियमित hiPSC संस्कृति की स्थिति में अच्छी तरह से अन्यत्र 16,17 वर्णित हैं; 3 हर 7 दिन: संक्षेप में, मिला हुआ जब तक एक MEF फीडर परत पर HES मीडिया में hiPSCs बढ़ती है, तो enzymatically collagenase (DMEM में 1mg / एमएल) के साथ पारित होने और लगभग 1 का विस्तार करें।
  2. पाली एल ओर्निथिन (ग्लास सतहों के लिए 50 ग्राम / एमएल) प्लास्टिक की सतहों के लिए बाँझ पानी में मिलीग्राम / जी 10 के साथ पाली एल ओर्निथिन / laminin लेपित प्लेटें, कोट प्लेटें तैयार करने और 3-24 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं। 3-24 घंटे के लिए आरटी पर बाँझ पीबीएस में 5g / एमएल laminin साथ बाँझ पानी और फिर कोट के साथ कम से कम एक बार धोएं।
    नोट: प्लास्टिक में लिपटे हैं, प्लेटें किया जा सकता हैछह महीने तक -20 पर डिग्री सेल्सियस के लिए भंडारित किया।
  3. 1 दिन पर, enzymatically DMEM / F12 में 1mg / एमएल Collagenase चतुर्थ का उपयोग कर थाली के रूप में बड़ी कालोनियों से (जैसे Matrigel पर TeSR 18 के रूप में परिभाषित मीडिया में उगाई जाने वाली आम तौर पर MEFs पर हो, या hiPSCs) subconfluent hiPSCs उठा।
    नोट: 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 1-2 घंटा के बाद, कालोनियों पकवान में तैर कर दिया जाएगा।
  4. धीरे DMEM / F12, 2ml / अच्छी तरह से एन 2 / B27 मीडिया (1 टेबल) और गैर-पक्षपाती 6 अच्छी तरह से बर्तन को हस्तांतरण में Resuspend साथ 1-2x (नहीं centrifugation, निपटाने के द्वारा) hiPSC कालोनियों धोने (1 में 3-कुओं गठबंधन -well) 19।
    नोट: रातों रात, कालोनियों अस्थायी गोलाकार समूहों बनेगी "embryoid निकायों" (ईबीएस) करार दिया। पर्याप्त सेलुलर मौत की अपेक्षा करें।
  5. और 2 दिन, झुकाव प्लेटों पर ईबीएस व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं। ध्यान से मीडिया को दूर करने और मलबे को हटाने के लिए DMEM / F12 के साथ एक बार धो लें। एन 2 के साथ फ़ीड / दोहरी SMAD अवरोधक (0.1M LDN193189 और 10M SB431542) 12 के साथ पूरक B27 मीडिया
  6. दिन 3-7 पर, neuralization दोहरी SMAD निषेध के संदर्भ में हो जाएगा; ईबीएस दौर लेकिन सिस्टिक नहीं कर रहे हैं की जाँच करें। ईबीएस 0.1M LDN193189 और 10M SB431542 के साथ पूरक एन 2 / B27 मीडिया के साथ हर दूसरे दिन फ़ीड।
  7. तंत्रिका धब्बे (apico-बेसल polarity के साथ neuroepithelial कोशिकाओं के दौर समूहों के रूप में होती कुछ दिनों के भीतर आने लगते हैं कि दिन 7-14 पर, लेपित प्लेटें पाली एल ओर्निथिन / laminin को ईबीएस के चढ़ाना के बाद, एक brightfield माइक्रोस्कोप का उपयोग जाँच; चित्र 1)। पक्षपाती ईबीएस 0.1M LDN193189, 10M SB431542 और 1 ग्राम / मिलीलीटर laminin के साथ पूरक एन 2 / B27 मीडिया के साथ हर दूसरे दिन खिलाने के लिए आगे बढ़ें।

तंत्रिका rosettes के 2. हार्वेस्ट

नोट: हम तंत्रिका rosettes के enzymatically तंत्रिका रोसेट चयन अभिकर्मक 20 या इसी तरह की चयन अभिकर्मक का उपयोग कर काटा जा सलाह देते हैं। तंत्रिका rosettes के लिए मैन्युअल रूप से 6 अच्छी तरह से पाली एल ओर्निथिन / laminin लेपित प्लेट, थी में उठाया जा सकता हैएस कार्यप्रणाली आगे NPCs के लिए समृद्ध और गैर-तंत्रिका कोशिका प्रकार खाली करने के लिए दिन में 20 पर उठा के एक दूसरे दौर की आवश्यकता हो सकती, उपयोगकर्ता कौशल पर निर्भर करता है, गुरु के लिए व्यापक प्रशिक्षण लेता है, और।

  1. 14 दिन में तंत्रिका rosettes के एंजाइमी चयन के लिए, पालन ईबीएस से महाप्राण मीडिया और 6 अच्छी तरह से थाली के लिए अच्छी तरह से प्रति तंत्रिका थाली चयन अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. एक P1000 Pipetman के साथ, धीरे प्रत्येक अच्छी तरह से एंजाइम को हटा दें। धोने के लिए अच्छी तरह से प्रति DMEM / F12 के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. एक P1000 के साथ, DMEM / F12 के 1 मिलीलीटर इकट्ठा करने और जल्दी से इस प्रकार की थाली से rosettes के detaching, कुएं में वापस DMEM / F12 निष्कासित। एक बाज़ ट्यूब में rosettes के लिए ले लीजिए।
  4. Pipet एक और एक DMEM / F12 के मिलीलीटर और जल्दी से शेष rosettes के अलग करने के लिए एक ही कुएं में निष्कासित। (Triturate मत करो। थाली समुच्चय को तोड़ने के लिए नहीं की कोशिश)। एक ही फाल्कन ट्यूब में तंत्रिका rosettes के लिए ले लीजिए।
  5. दोहराएँ कदम के रूप में आवश्यक 2.4। Rosettes के आसानी से अलग नहीं है, मो जोड़नेएंजाइम कर रहे हैं और इस प्रक्रिया को दोहराने (2.1-2.4 कदम)
  6. 3 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं स्पिन। महाप्राण धोने, और एनपीसी मीडिया (1 टेबल) के 2 मिलीलीटर में rosettes के फिर से निलंबित। स्थानांतरण कोशिकाओं (1: 1) एक पाली एल ओर्निथिन / laminin में 6 अच्छी तरह से थाली में लिपटे।
  7. दिन 15-21 से, तंत्रिका rosettes के विस्तार होगा; फीड rosettes के एनपीसी मीडिया के साथ हर दूसरे दिन।
  8. तंत्रिका धब्बे की गुणवत्ता का मूल्यांकन और फ्लैट तंतुप्रसू कोशिकाओं की तरह संस्कृति के भीतर का विस्तार नहीं कर रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं।
    नोट: गैर-धब्बे जारी रहती है, एनपीसी संस्कृति कभी कभी Accutase में उठाया rosettes के ही सर्वश्रेष्ठ का चयन, मैनुअल उठा द्वारा बचाया जा सकता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के अलग कर देना। गोली, धोने और एनपीसी मीडिया में प्लेट 24 अच्छी तरह से पाली एल ओर्निथिन / laminin लेपित प्लेट पर।

तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं 3. विस्तार

नोट: hiPSC NPCs के Matrigel- या पाली एल ओर्निथिन / laminin लेपित प्लेट पर या तो उगाया जा सकता है। आम तौर पर हम Matrige उपयोगएल प्लेटों वे और अधिक जल्दी से तैयार है और कम कीमत पर किया जा सकता है के रूप में।

  1. जल्दी से, Matrigel लेपित प्लेटें तैयार पिघलना और 24 मिलीलीटर में Matrigel की एक 1mg जमे हुए विभाज्य resuspend ठंड DMEM / F12 और तुरंत दो छह अच्छी तरह प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 2 मिलीलीटर वितरित करने के लिए। 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए सेते हैं।
    नोट: Matrigel केवल उपयोग करने के तुरंत पहले, धोया नहीं, aspirated की जरूरत है।
  2. हर दूसरे दिन NPCs के फ़ीड और बहुत ही उच्च घनत्व पर बनाए रखने या वे अनायास न्यूरॉन्स के लिए अलग होगा।
    नोट: हालांकि अधिक स्थापित NPCs के लिए आम तौर पर एक विभाजित कर रहे हैं: 2 के रूप में बार बार के रूप में एक बार हर दो हफ्ते: हर सप्ताह 4, बहुत कम बीतने NPCs के एक विभाजित किया जा सकता है।
  3. विभाजन पहले महाप्राण मीडिया और 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर गर्म Accutase (1x) जोड़ने के लिए। 10-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. धीरे जितना संभव हो कम यांत्रिक तनाव के साथ DMEM / F12 युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में अलग कोशिकाओं को हस्तांतरण। एंजाइम में जबकि कोशिकाओं टाइट्रेट मत करो। Spinni द्वारा गोली कोशिकाओं5 मिनट के लिए 1000 XG पर एनजी।
  5. धोने Aspirate, और मूल प्रति अच्छी तरह से ~ 1 मिलीलीटर एनपीसी मीडिया में NPCs फिर से निलंबित की 6 अच्छी तरह से।
    नोट: 6 अच्छी तरह से पकवान का एक मिला हुआ अच्छी तरह से 5-10 मिलियन कोशिकाओं है कि उम्मीद है, यह एक hematocytometer से पहले फिर से चढ़ाना का उपयोग कोशिकाओं की एक 10L विभाज्य गिनती से इसकी पुष्टि की जा सकती है।
  6. NPCs के न्यूरॉन्स या neurospheres के रूप में फिर से निलंबन, फिर थाली NPCs के बाद। 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से लगभग 1-2 मिलियन कोशिकाओं की थाली, NPCs के बनाए रखने के लिए। neurosphere गठन की दक्षता प्रयोगों और सेल लाइनों के बीच भिन्न है, लेकिन दो लाख के बीच है और दस लाख कोशिकाओं को एक गैर पक्षपाती 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त कर रहे हैं तो आम तौर पर सबसे अच्छा तब होती है सकते हैं; neurospheres की clumping को होता है, वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या कम हो। न्यूरॉन मीडिया के साथ एनपीसी मीडिया की जगह 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए, थाली लगभग 200,000 कोशिकाओं,।
  7. Immunohistochemically हर स्थापित एनपीसी लाइन को मान्य। एक बार जब पर्याप्त सेलुलर सामग्री दिया गया है expannestin और Sox2 के लिए एंटीबॉडी के साथ ded, लेबल NPCs के। मान्य एनपीसी लाइनें भी 4-6 सप्ताह के लिए न्यूरॉन्स में भेदभाव, और तृतीय ट्यूबिलिन और MAP2AB के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाना चाहिए।
    1. 10 मिनट के लिए 4C पर पीबीएस में 4% paraformaldehyde में कोशिकाओं को ठीक करें। पीबीएस में 1.0% ट्राइटन में 15 मिनट के लिए आरटी पर NPCs के permeabilize, और फिर 30 मिनट के लिए आरटी पर 0.1% ट्राइटन के साथ 5% गधा सीरम में ब्लॉक।
    2. रातोंरात 4C में, 0.1% ट्राइटन के साथ 5% गधा सीरम में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते हैं।
      नोट: हम निम्नलिखित एंटीबॉडी की सिफारिश: बकरी विरोधी Sox2, 1: 200; माउस विरोधी मानव nestin, 1: 200; खरगोश विरोधी βIII ट्यूबिलिन, 1: 500; माउस विरोधी βIII ट्यूबिलिन, 1: 500; माउस विरोधी MAP2AB, 1: 200। (चित्र 2)।
    3. आरटी पर 1-2 घंटे के लिए 0.1% ट्राइटन के साथ 5% में गधा सीरम में, 300: पीबीएस के साथ एक धोने के बाद, एक पर बकरी, माउस या खरगोश के लिए उपयुक्त संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी कोशिकाओं सेते हैं। 0.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / DAPI (4 'के साथ नाभिक, दाग कोशिकाओं कल्पना करने के लिए6-diamidino-2-phenylindole तो) और Vectashield के साथ माउंट।

4. एनपीसी पारगमन

  1. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं 21 का प्रतिशत बढ़ाने के लिए (1 घंटे के लिए 1000 XG पर वायरस की उपस्थिति में सेल संस्कृति प्लेटों के centrifugation) spinfection का प्रयोग करें। एनपीसी मीडिया में पतला संक्रमण के वांछित बहुलता (आमतौर पर 1-10) (MOI), के लिए titered महाप्राण मीडिया और प्रासंगिक overexpression (या नियंत्रण) lentiviruses (या रेट्रोवायरस) के साथ की जगह। 1.5 एमएल 6 अच्छी तरह से थाली के प्रति अच्छी तरह से मात्रा (या टिशू कल्चर प्लेटों के अन्य प्रकारों के लिए एक उचित पहुंचा मात्रा) का प्रयोग करें। 1000 XG पर स्पिन और एक थाली अपकेंद्रित्र में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: आदर्श रूप में, बंटवारे के 1-2 दिनों के भीतर lentiviral या रेट्रोवायरल वैक्टर के साथ NPCs के transduce। वाणिज्यिक या प्रयोगशाला तैयार वायरस का उपयोग करते हुए या नहीं, यह उचित धारावाहिक कमजोर पड़ने से अग्रिम में वायरस के बैच अनुमापांक के लिए उपयोगी हो सकता है। (चित्र तीन)।
  2. सेल को कम करने के लिएlular मौत, spinfection के 8 घण्टे के भीतर मीडिया की जगह।
    नोट: वायरल एकीकरण और transgene अभिव्यक्ति रिपोर्टर जीन प्रतिदीप्ति द्वारा 24 घंटा के भीतर पता लगाने योग्य होना चाहिए। (वायरस एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का अभाव है, इस आकलन करने के लिए और अधिक कठिन है, सफल अभिकर्मक सबसे अच्छा overexpression के उत्पादों के लिए immunoblot, immunohistochemistry या qPCR के द्वारा मान्य किया जा सकता है।) पूर्ण अभिव्यक्ति 3-7 दिन लग सकते हैं; अतिरिक्त वायरस के साथ दोहराया spinfections ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकता है। बारम्बार spinfections दैनिक हो सकता है, लेकिन ऐसा अक्सर नहीं होना चाहिए। आदर्श रूप में, एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का उपयोग करते हुए, तो> कोशिकाओं के 80% लेबल किया जाना चाहिए।

5. neurosphere प्रवासन परख

नोट: NPCs के एंजाइमी हदबंदी निम्नलिखित अनायास Neurospheres फार्म, - कोशिकाओं एनपीसी मीडिया में निलंबन में संवर्धित कर रहे हैं, तो (एनपीसी विस्तार में इस्तेमाल किया है कि समान तरीके से 3.3-3.6 कदम)।

  1. संक्षेप में, अलग कर देना बढ़नेneurospheres उत्पन्न करने के क्रम में nonadherent प्लेटों में 48 घंटे के लिए एनपीसी मीडिया में डी NPCs के। (चित्रा 4)।
  2. Neurosphere प्रवास के लिए, एक 96 अच्छी तरह से थाली में, बल्कि DMEM से उठा neurosphere करने से पहले 1-2 घंटा ठंड एनपीसी मीडिया का उपयोग कर नए सिरे से Matrigel प्लेटें तैयार करते हैं। कुओं से Matrigel महाप्राण न करें।
  3. मूल रूप से भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न neurospheres 22 के लिए प्रकाशित किया है, मैन्युअल रूप से सेलुलर मलबे को हटाने के लिए एनपीसी मीडिया में एक बार धोने के बाद, एक खुर्दबीन के नीचे एनपीसी व्युत्पन्न neurospheres उठाओ। एक Matrigel लेपित 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक neurosphere स्थानांतरण।
  4. प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली में neurospheres के लिए, ठंड एनपीसी मीडिया में पतला एक अतिरिक्त 0.5 मिलीग्राम Matrigel, जोड़ें।
  5. मैन्युअल में अच्छी तरह से एक pipet टिप का उपयोग कर के बीच में प्रत्येक व्यक्ति neurosphere केंद्र।
    नोट: यह परिणामों में परिवर्तनशीलता को कम करने के क्रम में, समान आकार के neurospheres लेने के लिए महत्वपूर्ण है।
  6. माइग्रेशन 48 घंटा के लिए होते हैं और फिर डब्ल्यू कोशिकाओं को ठीक करने की अनुमति देंवांछित immunohistochemical मार्कर के साथ ith 4% paraformaldehyde और दाग।
  7. रेडियल माइग्रेशन उनकी पूरी तरह से एक 4x खुर्दबीन उद्देश्य का उपयोग करने में, तस्वीर neurospheres निर्धारित किया जा रहा है। अच्छी तरह के किनारे या विश्लेषण से एक दूसरे neurosphere से संपर्क करने के लिए किसी भी neurospheres के बाहर निकालें।
    नोट: माइग्रेशन अब से 48 घंटे के लिए होता है, जिसके परिणामस्वरूप रेडियल प्रवास की संभावना एक 4x उद्देश्य का उपयोग छवि के लिए बहुत बड़ा हो जाएगा।
  8. एनआईएच ImageJ सॉफ्टवेयर (चित्रा 5) का उपयोग करते हुए प्रत्येक neurosphere से औसत प्रवास उपाय। यह नीचे वर्णित विश्लेषण विधियों का भी उपयोग किया जा सकता है:
    1. रेडियल माइग्रेशन:
      1. स्वयं तो जिसके परिणामस्वरूप आकार के क्षेत्र की गणना करने के उपाय करें (Ctrl + एम) समारोह का उपयोग मुक्तहस्त चयन उपकरण का उपयोग कर दूर पलायन कोशिकाओं के किनारे का पता लगा। मापने से पहले क्षेत्र के क्षेत्र का विश्लेषण टैब के नीचे पाया सेट माप विंडो में जाँच की है कि सुनिश्चित करें। यूज़क्षेत्र माप और एक चक्र (एक = πr 2) के क्षेत्र के लिए समीकरण के मूल्य त्रिज्या (बाहरी) निर्धारित करने के लिए।
      2. मूल neurosphere के किनारे ट्रेस क्षेत्र मापने के लिए और एक ही रास्ते में त्रिज्या (आंतरिक) की गणना। बाहरी और भीतरी त्रिज्या के बीच अंतर के रूप में कुल रेडियल प्रवास की गणना।
    2. महानतम सेलुलर प्रवास:
      1. उपाय (Ctrl + एम) समारोह के द्वारा पीछा सीधी लाइन चयन उपकरण का उपयोग आंतरिक neurosphere के किनारे से पांच दूर कोशिकाओं के लिए ले जाया गया दूरी को मापने।

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Representative Results

तंत्रिका rosettes के apico-बेसल ध्रुवीयता (चित्रा 1) के साथ neuroepithelial कोशिकाओं के दौर समूहों के रूप में उनकी विशेषता उपस्थिति से, एक brightfield माइक्रोस्कोप का उपयोग, आकृति विज्ञान पहचाना जा सकता है। NPCs के बहुत उच्च घनत्व सेल में आम तौर पर संवर्धित कर रहे हैं, हालांकि तुरंत passaging के बाद, थोड़ा पिरामिड के आकार का सोमा और द्विध्रुवी neurite संरचना दिखाई दे (चित्रा -1) है। तृतीय ट्यूबिलिन धुंधला NPCs के कुछ अनुपात लगातार संस्कृति (चित्रा 1F) के भीतर neuronal भेदभाव की शुरुआत कर रहे हैं यह दर्शाता है कि सभी एनपीसी आबादी में भी दिखाई दे रहा है, हालांकि पुष्टि NPCs, कोशिकाओं के बहुमत में nestin और Sox2 व्यक्त करते हैं। ऐसे LMX1A और FOXA2 रूप मध्यमस्तिष्क मार्कर (चित्रा 1G-आई) नहीं कर रहे हैं, जबकि इस तरह के Sox2 और Pax6, और इस तरह के TBR2 के रूप में अग्रमस्तिष्क न्यूरोनल पूर्वज के रूप में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं, के मार्कर, इसके अलावा, NPCs में व्यक्त कर रहे हैं। बड़े और फ्लैट तंतुप्रसू कोशिकाओं की तरह का एक महत्वपूर्ण अनुपात के भीतर एक एनपीसी आबादी गरीब गुणवत्ता NPCs के neuronal भेदभाव (चित्रा 2) निम्नलिखित न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या को उपज की संभावना नहीं है, जो उत्पन्न किया गया है कि इंगित करता है।

फ्लोरोसेंट संवाददाता वेक्टर (चित्रा 3) में शामिल करके एक उच्च अनुमापांक lentiviral या रेट्रोवायरल वेक्टर के साथ सफल पारगमन के बाद, कोशिकाओं का अधिक से अधिक 80% से लेबल किया जाना चाहिए। Neurosphere पीढ़ी नियमित खिलाने के साथ, लगभग एक सप्ताह के लिए संस्कृति में स्वस्थ रह सकता है, जो अपेक्षाकृत समरूप आकार के neurospheres (चित्रा 4), की आबादी उपज चाहिए। Neurosphere प्रवास स्वस्थ neurospheres (चित्रा 5) में मजबूती के साथ होता है, और hiPSC NPCs के एक neurosphere प्रवास परख 1 के दौरान तेजी से भेदभाव से गुजरना।

चित्र 1

तम्बू "> चित्रा 1. रोगी विशेष hiPSCs, NPCs और न्यूरॉन्स। hiPSC तंत्रिका भेदभाव की Brightfield छवियों, embryoid निकायों (बी), तंत्रिका धब्बे (सी), NPCs (डी) और न्यूरॉन्स के लिए hiPSCs (ए) से (ई) ।।। 100x, पैमाने बार 100 माइक्रोन वित्तीय संस्था hiPSC NPCs के एनपीसी मार्कर nestin (हरा) और neuronal मार्कर तृतीय ट्यूबिलिन (लाल) (एफ) सहित अग्रमस्तिष्क तंत्रिका स्टेम सेल और तंत्रिका पूर्वज सेल मार्कर के एक नंबर, के लिए सकारात्मक रहे हैं; लेकिन नहीं मध्यमस्तिष्क मार्करों LMX1A (हरा) और FOXA2 (लाल) (आई), और अग्रमस्तिष्क पूर्वज मार्कर TBR2 (लाल) (एच), तंत्रिका स्टेम सेल प्रतिलेखन Sox2 (हरा) और Pax6 (लाल) (जी) कारकों। DAPI के दाग नाभिक (नीला)। 100x, पैमाने बार 100 माइक्रोन। जे। NPCs (70-80% तृतीय ट्यूबिलिन पॉजिटिव न्यूरॉन्स (हरा) और 20-30% glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन को GFA अंतर कर सकते हैंपी) -positive astrocytes (लाल)। 200x, पैमाने बार 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2

चित्रा 2. मान्य एनपीसी लाइन्स। उच्च गुणवत्ता (ऊपर बाएं) hiPSC NPCs एक्सप्रेस nestin (लाल) और Sox2 (हरा)। Sox2 नकारात्मक और nestin नकारात्मक कोशिकाओं (दाएं) के धब्बे है कम गुणवत्ता (नीचे बाएं) NPCs जबकि सबसे कोशिकाओं (DAPI (नीला) के साथ दाग नाभिक), में। उच्च गुणवत्ता NPCs से भेदभाव कर चार सप्ताह पुराने न्यूरॉन्स MAP2AB (हरा) और तृतीय ट्यूबिलिन (लाल) (शीर्ष सही) एक्सप्रेस, लेकिन कम गुणवत्ता NPCs से भेदभाव उन (ठीक नीचे) नहीं है। 100x, पैमाने बार 100 माइक्रोन। एक बड़ा ve देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के rsion।

चित्र तीन

NPCs। Brightfield (ऊपर) चित्रा 3. वायरल पारगमन और GFP फ्लोरोसेंट (नीचे) से पहले (बाएं) और वायरल spinfection के बाद hiPSC NPCs के चित्र। 100x, पैमाने बार 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4

चित्रा 4. neurosphere गठन। पक्षपाती NPCs (बाएं) और नवगठित neurospheres (दाएं) की Brightfield छवियों। 100x, पैमाने बार 100 माइक्रोन। एक Lar देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े की प्रासंगिकता संस्करण।

चित्रा 5

5. neurosphere प्रवासन चित्रा। अटल बिहारी। Brightfield पहले neurospheres की छवियों (ए) और बाद में (बी) Matrigel में माइग्रेशन के 48 घंटा। एनआईएच ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रेडियल तंत्रिका प्रवास का विश्लेषण करने के लिए कार्यप्रणाली का प्रदर्शन 100x, पैमाने बार 100 माइक्रोन। तटरक्षक। स्क्रीन छवियों पर कब्जा। ImageJ उपकरण पट्टी पर 'मुक्तहस्त चयन' (सी) पर क्लिक करें। Neurospheres (डी) के चारों ओर दूर माइग्रेट कोशिकाओं की बढ़त ट्रेस। क्षेत्र निर्धारित माप खिड़की (ई) में जाँच की है कि सुनिश्चित करें। उपाय समारोह में (Ctrl + एम) (एफ) का प्रयोग करें। ((जी) मूल neurospheres के किनारे का पता लगाने और उपाय समारोह का उपयोगकंट्रोल + एम)। माप तो विश्लेषण के लिए एक्सेल में निर्यात किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मीडिया अवयव
HES मीडिया DMEM / F12 (जीवन टेक्नोलॉजीज # 11,330)
20% को-सीरम रिप्लेसमेंट (जीवन टेक्नोलॉजीज # 10,828)
1x Glutamax (जीवन टेक्नोलॉजीज # 35,050)
1x NEAA (जीवन टेक्नोलॉजीज # 11,140)
1x 2-मर्केप्टोइथेनाल (55mm 1000x) (जीवन टेक्नोलॉजीज # 21985-023)
20ng / एमएल FGF2 (जीवन टेक्नोलॉजीज 13256-029)
एन 2 / B27 मीडिया DMEM / F12 (जीवन टेक्नोलॉजीज # 10,565)
1x एन 2 (जीवन टेक्नोलॉजीज # 17502-048)
1x B27-आरए (जीवन टेक्नोलॉजीज # 12587-010)
एनपीसी मीडिया DMEM / F12 (जीवन टेक्नोलॉजीज # 10,565)
1x एन 2 (जीवन टेक्नोलॉजीज # 17502-048)
1x B27-आरए (जीवन टेक्नोलॉजीज # 12587-010)
20 एनजी / एमएल FGF2 (जीवन टेक्नोलॉजीज)
1 मिलीग्राम / एमएल प्राकृतिक माउस Laminin (जीवन टेक्नोलॉजीज # 23017-015)
न्यूरॉन मीडिया DMEM / F12 (जीवन टेक्नोलॉजीज # 10,565)
1x एन 2 (जीवन टेक्नोलॉजीज # 17502-048)
1x B27-आरए (जीवन टेक्नोलॉजीज # 12587-010)
1 मिलीग्राम / एमएल प्राकृतिक माउस Laminin (जीवन टेक्नोलॉजीज)
20 एनजी / एमएल BDNF (Peprotech # 450-02)
20 एनजी / एमएल GDNF (Peptrotech # 450-10)
500 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / Dibutyryl चक्रीय एएमपी (सिग्मा # D0627)
200 एनएम एल ascorbic एसिड (सिग्मा # A0278)

तालिका 1. मीडिया व्यंजनों।

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Discussion

हम NPCs में hiPSCs, एक तंत्रिका कोशिका प्रकार जिसमें hiPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की जीन हस्ताक्षर का एक महत्वपूर्ण अंश संरक्षित है और कहा कि संभावित रोग रोगजनन 8 के लिए योगदान विकास के रास्ते के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा कर सकता है अंतर करने के लिए है जिसके द्वारा विधियों का वर्णन किया है 11। हम विस्तृत है के रूप में इसके साथ ही, NPCs हम रोग गड़बड़ी की आणविक और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए उपयुक्त हो सकता है का मानना ​​है कि जो एक विवेकशीलतापूर्वक replicative और आसानी से transduced तंत्रिका जनसंख्या, कर रहे हैं।

हम अंतर करने के लिए विस्तृत तरीके और संस्कृति अग्रमस्तिष्क नमूनों NPCs के पास हैं, वे आसानी से अन्य सेल भाग्य के लिए नमूनों NPCs उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, अस्थायी ईबीएस पहले एनपीसी मीडिया में विस्तार किया है और 20 एनजी के साथ पूरक न्यूरोनल मीडिया में भेदभाव किया जा सकता है, जो 0.5 मिलीग्राम / एमएल DKK1, 10 मिमी SB431542, 0.5 मिलीग्राम / एमएल नोगिन और, हिप्पोकैम्पस NPCs उत्पन्न हो जाएगा 1mm cyclopamine के साथ व्यवहार कर रहे हैं अगर / एमएल WNT3A 7 12,23 न्यूरॉन्स। सबसे उप प्रकार विशिष्ट neuronal भेदभाव प्रोटोकॉल एक NESTIN- के माध्यम से आगे बढ़ना है और Sox2-positve मध्यवर्ती, हम इसी तरह के तरीकों GABAergic- 2,24 के लिए अनुकूलनीय होना चाहिए और 3,25,26 विशिष्ट एनपीसी आबादी glutamatergic- सकता है का अनुमान है कि यह देखते हुए कि।

ध्यान देने योग्य प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। अधिक व्यक्त या अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति नीचे दस्तक, यह संवाददाताओं चर आकार के वैक्टर से व्यक्त कर रहे हैं जब हम पुष्पन में काफी अंतर देखा है, के रूप में एक ही वायरल रीढ़ की हड्डी से एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त एक नियंत्रण वेक्टर उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है अगर पहले, (कारण कमी आई पैकेजिंग दक्षता के लिएवेक्टर आकार के साथ) या फर्क प्रवर्तकों (प्रमोटर दक्षता में मतभेद) के कारण के साथ। दूसरा, हम हम घने neurosphere संरचना में वायरल वैक्टर के गरीब अंतर्वेधन मनाया के रूप में वायरल पारगमन पहले, गठन neurosphere को पूरा करने की सलाह देते हैं। तीसरा, पारित होने के दस से परे NPCs के बढ़ जाती है के पारित होने के संख्या के रूप में, हम अक्सर neurosphere परख में काफी बिगड़ा प्रवास निरीक्षण करते हैं। वास्तव में, बीतने के साथ astrocytes की एक प्रतिशत अधिक उपज के लिए NPCs की प्रवृत्ति को देखते हुए यह एक प्रयोग में एनपीसी लाइनों के पारित होने के मैच के लिए महत्वपूर्ण है।

अंत में, यह वर्णित तकनीकों के जैविक और तकनीकी सीमाओं पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। NPCs के आंखों से आकृति विज्ञान के समान होने के लिए दिखाई देते हैं, वे glutamatergic और GABAergic न्यूरॉन्स दोनों पैदा करने में सक्षम कोशिकाओं के शामिल एक विषम आबादी हैं। हम इस metho का उपयोग व्यक्तियों के बीच एनपीसी लाइनों की उल्लेखनीय लगातार अग्रमस्तिष्क patterning के निरीक्षण जबकिडी 1, यह है केवल जब पूरी तरह से पुष्टि उच्च गुणवत्ता एनपीसी लाइनों की तुलना - अच्छे और खराब गुणवत्ता एनपीसी लाइनों के बीच काफी मतभेद रहे हैं। इसके अतिरिक्त, वायरल पारगमन की पैदावार आनुवंशिक रूप से विषम कोशिकाओं, एक अद्वितीय जीनोमिक स्थान पर वायरल वेक्टर के एकीकरण के साथ प्रत्येक; इसलिए, व्यक्ति की कोशिकाओं जीनोमिक एकीकरण साइटों के स्थान और संख्या दोनों में अलग अलग होंगे। आनुवंशिक हेरफेर यह जस्ता उंगली, talen या CRISPR आधारित रणनीतियों से होता है, चाहे वह एक सटीक और परिभाषित स्थान पर लक्षित है जब जीन अभिव्यक्ति में अधिक सुसंगत परिवर्तन हमेशा घटित होगा।

रोगी hiPSC व्युत्पन्न NPCs के न्यूरोलॉजिकल बीमारी में होने वाली वैश्विक जीन अभिव्यक्ति perturbations और भी स्वस्थ या रोगग्रस्त रोगी व्युत्पन्न तंत्रिका कोशिकाओं को या तो के संदर्भ में उम्मीदवार जीन या microRNAs जोड़ तोड़ की आणविक और / या सेलुलर प्रभाव दोनों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह, के परिणामों के एक या एक से अधिक कुंजी जोड़ तोड़जोखिम एलील (एस) के विविध आनुवंशिक पृष्ठभूमि के संदर्भ में लक्षण वर्णन किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

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References

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  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

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