מדריך ליצירת וNPCs hiPSC שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

מחקרי ביטוי גנים של תאי עצב הבדיל במבחנה מתאי גזע אנושיים pluripotent מושרה (hiPSCs) על ידינו 1 ואחרים מצביעים על כך שתאי עצב 2,3 hiPSC דומים רקמת מוח עוברית ולא למבוגרים. נכון לעכשיו, מודלים מבוססי hiPSC עשויים להיות מתאימים יותר ללימוד נטייה ל, ולא תכונות מאוחרות של, מחלה נוירולוגית. יש לנו דיווח בעבר כי חלק משמעותי של החתימה הגנטית של תאי עצב שמקורם בhiPSC סכיזופרניה נשמרת בתאי סכיזופרניה הנגזר hiPSC העצביים אב (NPCs), מצביע על כך שNPCs עשוי להיות סוג תא שימושי לחקר המסלולים המולקולריים תורם לסכיזופרניה 1 . אנחנו ואחרים דיווחנו הגירה חריגה, סטרס חמצונים מוגברים ומיני חמצן תגובתי, רגישות ללחצים סביבתיים תת-סף ותפקוד הלקוי של המיטוכונדריה בסכיזופרניה hiPSC NPCs 1,4-6, כמו גם ירידת ג העצביonnectivity ותפקוד הסינפטי בנוירונים hiPSC סכיזופרניה 5,7-10. אם הגורמים המולקולריים תרמו להגירה חריגה ו / או סטרס חמצונים בסכיזופרניה hiPSC NPCs גם בבסיס הקישוריות העצבית המופחתת בתאי עצב שמקורם בhiPSC סכיזופרניה, NPCs יכול להיות אוכלוסייה עצבית חזקה וreplicative מאוד שבה לחקור את המנגנונים אחראים למחלה. יתר על כן, כי אחד יכול במהירות לייצר מספר רב של תאים ולא צריך לחכות שבועות או חודשים להבשלה עצבית, מבחני מבוססי NPC מתאימים למחקר של קבוצות גדולות יותר של משתתפים והם נוחים יותר להקרנת תפוקה גבוהה. אנו מאמינים כי hiPSC NPCs יכול לשמש כמדד למסלולים התפתחותיים שעלולים לתרום להיווצרות מחלה, כפי שכבר הוכיח בהפרעות מגוונות כמו מחלת סכיזופרניה 1 והנטינגטון 11.

להבדיל מNPCs hiPSCs, עצבי ראשוני בduction מושגת על ידי עיכוב כפול הסמאד (0.1mm LDN193189 ו10mm SB431542) 12. על ידי להכעיס BMP וTGF איתות עם מולקולות קטנות אלה, האנדודרם ומפרט mesoderm חסום, האצת בידול עצבי ומובילים להיווצרות של שושנות עצביות גלויות בתוך השבוע של ציפוי אחד. דפוסים עצביים מתרחש בשלב מוקדם בתהליך הזה, ככל הנראה בתקופת היווצרות שושנה עצבית ומייד לאחר מכן. בהיעדר רמזים אחרים, התאים עצביים האלה פרימיטיביים להניח גורל כמו המוח הקדמי-קדמי 13. מייד לאחר היווצרות שושנה עצבית, ומתמשך לאורך הרחבת NPC, NPCs המוח הקדמי בתרבית עם FGF2 8,14. יש להם פוטנציאל שושלת כפול ויכול להיות מובחן לאוכלוסיות עצביות של 70-80% נוירונים III טובולין-חיוביים וחלבון חומצי (GFAP) האסטרוציטים 20-30% גליה fibrillary -positive (איור 1). רוב הנוירונים hiPSC המוח הקדמי הם VGLUT1 חיובי, ולכן הם ככל הנראה glutamatergic, למרות שכ -30% מתאי העצב הם GAD67-חיובי (GABAergic) 8.

NPCs הוא passaged באופן שיגרתי יותר מעשר פעמים במבחנה, תוך שמירה על פרופילי בידול עקביים, וללא צבירת חריגות קריוטיפ. קבוצות דיווחו NPCs passaging יותר מ -40 פעמים 15, לעומת זאת, אנו מוצאים כי מעבר לעשרה קטעים, NPCs להראות גדל נטייה לבידול astrocyte. NPCs גם לסבול הקפאה-מפשיר מרובה ויכול לעבור לגדול כneurospheres פשוט על ידי culturing בצלחות שאינן חסיד. NPCs הם transduced ביעילות על ידי וקטורים ויראליים, המאפשר הערכה מהירה של התוצאות מולקולריות ותאיות של ההפרעות גנטיות, ובקלות להרחבה להניב מספיק חומר למחקרים ביוכימיים. יתר על כן, מכיוון שוקטורים ויראליים להתיר חזק על ביטוי ו / או מציאה של גנים של מחלות-רלוונטיות, בכל שליטה או neur חולה נגזרתאי אל, אחד יכול להשתמש בפלטפורמה זו על מנת לבחון את ההשפעה של רקע גנטי על המניפולציות הללו. למרות שאינו מתאים להסינפטי או מבחני מבוססי פעילות הדורשים תאים בוגרים, NPCs עשוי להיות חלופה מעשית עבור רבים ניתוחים מולקולריים או ביוכימי פשוטים של תאים עצביים המופקת מחולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hiPSC בידול לתאים עצבי אב

  1. לגדול ולהתרחב hiPSCs בתאי גזע עוברי אנושיים תקשורת (הס) (טבלת 1) שיתוף תרבותי על פיברובלסטים עכבר עובריים שכבת מזין עד מושבות גדולות (אבל subconfluent) מוכנות לבידול עצבי באמצעות גוף embryoid (EB) ביניים (MEF) (איור 2). תנאי תרבות hiPSC שגרה מתוארים גם במקומות אחרים 16,17; בקצרה, לגדול hiPSCs בתקשורת הס על שכבת מזין MEF עד מחוברות, מעבר אז אנזימים עם collagenase (1 מ"ג / מיליליטר בDMEM) ולהרחיב כ 1: 3 בכל 7 ימים.
  2. למ"ל להכין צלחות פולי-L-ornithine / laminin מצופים, צלחות מעילים עם 10 גר '/ פולי-L-ornithine במים סטריליים על משטחי פלסטיק (50 גר' / מיליליטר למשטחי זכוכית) ולדגור על RT עבור 3-24 שעות. לשטוף לפחות פעם אחת עם מים סטריליים ולאחר מכן מעיל עם 5G / מיליליטר Laminin בPBS סטרילי ב RT עבור 3-24 שעות.
    הערה: אם עטוף בפלסטיק, צלחות יכולות להיותלאחסן עד שישה חודשים ב -20 ºC.
  3. ביום 1, אנזימים להרים hiPSCs subconfluent (בדרך כלל גדל על MEFs, או hiPSCs גדל בתקשורת מוגדרת כגון 18 TeSR על Matrigel) ממושבות גדולות כמו הצלחת באמצעות 1mg / ml Collagenase IV בDMEM / F12.
    הערה: בעקבות 1-2 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס, מושבות מרחף בצלחת.
  4. לשטוף בעדינות מושבות hiPSC (על ידי שיקוע, לא צנטריפוגה) 1-2x עם DMEM / F12, גלול ב2ml / היטב N2 תקשורת / B27 (טבלת 1) והעברה למאכלים שאינם חסיד 6 היטב (לשלב 3-בארות לתוך 1 "טוב) 19.
    הערה: לילה, מושבות תהווה אשכולות כדוריים צפים מכונה "גופי embryoid" (EBS). מצפה מוות תאי משמעותי.
  5. ביום 2, צלחות הטיה ולאפשר EBS להתיישב. מוציא בזהירות את התקשורת לשטוף פעם אחת עם DMEM / F12 כדי להסיר שאריות. להאכיל עם N2 / B27 תקשורת בתוספת מעכבים כפולים הסמאד (0.1M LDN193189 ו10M SB431542) 12
  6. בימי 3-7, neuralization יתרחש בהקשר של עיכוב הסמאד כפול; לבדוק שEBS הם עגול, אבל לא פיברוזיס. להאכיל את EBS בכל יום שני בתקשורת N2 / B27 בתוספת 0.1M LDN193189 ו10M SB431542.
  7. בימי 7-14, הבא ציפוי של EBS לפולי-L-ornithine / Laminin צלחות מצופים, לבדוק באמצעות מיקרוסקופ brightfield שרוזטות העצבית מתחילה להופיע תוך מספר ימים (מאופיין כאשכולות עגולים של תאי neuroepithelial עם קוטביות apico-בסיס; איור 1). תמשיך להאכיל את EBS חסיד בכל יום שני בתקשורת N2 / B27 בתוספת 0.1M LDN193189, 10M SB431542 ו -1 g / ml laminin.

2. קציר של עצבי רוזטות

הערה: אנו ממליצים שרוזטות העצבית לקצור enzymatically באמצעות העצבי רוזט הבחירה מגיב 20 או מגיב בחירה דומה. למרות רוזטות העצבית ניתן לאסוף באופן ידני לתוך 6-גם צלחת מצופה פולי-L-ornithine / Laminin, thiהמתודולוגיה של לוקחת הכשרה מקיפה להורים, ו, תלוי במיומנות למשתמש, עשוי לדרוש עגול של חיטוט ביום 20 להעשרה נוספת לNPCs ורוקן סוגים שאינם עצביים תא שני.

  1. לבחירה האנזימטית של רוזטות העצבית ביום 14, תקשורת לשאוב מEBS דבק ולהוסיף 1 מיליליטר של מגיב בחירת שושנה עצבי לכל גם לצלחת 6-היטב. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  2. עם pipetman P1000, להסיר בעדינות אנזים מכל טוב. הוסף 1 מיליליטר של DMEM / F12 לכל גם לשטוף.
  3. עם P1000, לאסוף 1 מיליליטר של DMEM / F12 ובמהירות לגרש DMEM / F12 בחזרה לתוך הבאר, ובכך לנתק את רוזטות מהצלחת. לאסוף את רוזטות לתוך צינור בז.
  4. Pipet 1 מיליליטר נוסף של DMEM / F12 ובמהירות לגרש לאותו גם לנתק רוזטות שנותרה. (אל triturate. נסה לא לשבור את אגרגטים שושנה). לאסוף את רוזטות העצבית לתוך הצינור בז.
  5. חזור על שלב 2.4 במידת צורך. אם רוזטות לא לנתק בקלות, להוסיף מומחדש אנזים וחזור על התהליך (שלבים 2.1-2.4)
  6. ספין תאים ב XG 300 במשך 3 דקות. לשאוב לשטוף, ומחדש להשעות רוזטות ב 2 מיליליטר של תקשורת NPC (טבלת 1). תאי העברה (1: 1) לפולי-L-ornithine / Laminin מצופים 6 צלחת גם.
  7. מימי 15-21, רוזטות העצבית תרחיב; רוזטות להאכיל בכל יום שני בתקשורת NPC.
  8. להעריך את האיכות של רוזטות העצבית ולהבטיח שתאים כמו פיברובלסטים-שטוחים אינם מתרחבים בתוך התרבות.
    הערה: אם אינה רוזטות להתמיד, תרבות NPC יכולה לפעמים להציל ידי מסיק ידני, בחירה רק את הטוב ביותר של רוזטות הרימו לתוך Accutase. לנתק את 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. גלולה, לשטוף וצלחת בתקשורת NPC על 24 גם צלחת מצופה פולי-L-ornithine / Laminin.

3. הרחבת תאים עצבי אב

הערה: ניתן לגדל hiPSC NPCs משני Matrigel- או פולי-L-ornithine / Laminin צלחות מצופים. אנחנו בדרך כלל להשתמש Matrigel-צלחות כפי שהם יכולים להיות מוכנים במהירות רבה יותר ובעלות נמוכה יותר.

  1. כדי להכין צלחות Matrigel מצופים, במהירות להפשיר וresuspend aliquot הקפוא 1mg של Matrigel ב 24 מיליליטר DMEM / F12 קר ולהפיץ באופן מיידי 2 מיליליטר היטב כל אחד משני לוחות שישה-היטב. דגירה במשך שעה לפחות 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: Matrigel צריך רק להישאף, לא שטף, מייד לפני השימוש.
  2. להאכיל NPCs בכל יום שני ולשמור על צפיפות גבוהה מאוד, או שהם באופן ספונטני יבדילו לתאי עצב.
    הערה: NPCs למרות מבוסס יותר הם בדרך כלל לפצל 1: 4 בכל שבוע, NPCs מעבר נמוך מאוד ניתן לפצל 1: 2 לעתים רחוקות ככל אחת לשבועיים.
  3. כדי לפצל, תקשורת לשאוב ראשונה ולהוסיף 1 מיליליטר Accutase החם (1X) לכל טוב של 6-גם צלחת. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 10-15 דקות.
  4. בעדינות להעביר תאים מנותקים לתוך צינור המכיל 15 מיליליטר DMEM / F12 עם לחץ מכאני קטן ככל האפשר. אל לכייל תאים ואילו באנזים. תאים גלולה ידי spinning XG ב 1000 במשך 5 דקות.
  5. לשאוב לשטוף, מחדש להשעות NPCs ב~ 1 מיליליטר מדיה NPC בכל טוב המקורי של 6-גם.
    הערה: צפה שליש לו גם מחוברות של צלחת 6-גם 5-10 מיליון תאים; זה יכול להיות מאושר על ידי ספירת aliquot 10L של תאים באמצעות hematocytometer מחדש ציפוי קודם.
  6. בעקבות מחדש השעיה, NPCs מחדש הצלחת כNPCs, תאי עצב או neurospheres. כדי לשמור על NPCs, צלחת כ-1-2 מיליון תאים לכל טוב של 6-גם צלחת. היעילות של היווצרות neurosphere יכולה להשתנות בין ניסויים ושורות תאים, אך בדרך כלל מתרחשת הכי טוב אם בין 200,000 ו 1,000,000 תאי זרע לכל טוב של 6-גם צלחת לא חסיד; אם התקבצות של neurospheres מתרחשת, להפחית את מספר תאי זרע. להבדיל לתאי עצב, צלחת כ -200,000 תאים לכל טוב של 6-גם צלחת, החלפת מדיה NPC עם תקשורת Neuron.
  7. Immunohistochemically לאמת כל שורת NPC הוקמה. Expan מרגע שחומר תאי מספיק כברNPCs טוליפ אין, תווית עם נוגדנים לnestin וSox2. קווי Validated NPC גם צריכים להיות מובחנים לתוך הנוירונים למשך 4-6 שבועות, ושכותרתו עם נוגדנים לIII טובולין וMAP2AB.
    1. תקן תאים בparaformaldehyde 4% PBS ב 4C במשך 10 דקות. Permeabilize NPCs ב RT במשך 15 דקות ב1.0% Triton בPBS, ולאחר מכן לחסום ב 5% חמורים בדם עם 0.1% Triton ב RT למשך 30 דקות.
    2. דגירה עם נוגדן ראשוני ב 5% חמורים בדם עם 0.1% Triton, הלילה בשעה 4C.
      הערה: אנו ממליצים הנוגדנים הבאים: העז נגד Sox2, 1: 200; Nestin עכבר אנטי-אנושי, 1: 200; אנטי-βIII טובולין ארנב, 1: 500; עכבר אנטי-βIII טובולין, 1: 500; העכבר אנטי-MAP2AB, 1: 200. (איור 2).
    3. בעקבות לשטוף עם PBS, דגירה תאי נוגדנים משני עם הנוגדנים משני מצומדות המתאימים לעז, עכבר או ארנבת ב 1: 300, בב 5% חמורים בדם עם 0.1% Triton במשך 1-2 שעות בRT. כדי להמחיש גרעינים, תאי כתם עם 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) ולאחר מכן לעלות עם Vectashield.

4. NPC התמרה

  1. השתמש spinfection (צנטריפוגה של צלחות תרבית תאים בנוכחות הווירוס XG ב 1000 עבור שעה 1) כדי להגדיל את אחוז תאי transfected 21. תקשורת לשאוב ולהחליף עם ביטוי היתר הרלוונטי (או שליטה) lentiviruses (או רטרווירוסים), titered לריבוי הרצוי של זיהום (משרד הפנים) (בדרך כלל 1-10), בדילול מלא בתקשורת NPC. השתמש בכל טוב של 6-גם צלחת 1.5 מיליליטר נפח (או נפח מדורגים בהתאם לסוגים אחרים של צלחות תרבית רקמה). ספין XG ב 1000 ו -37 ºC עבור שעה 1 בצנטריפוגה צלחת.
    הערה: באופן אידיאלי, transduce NPCs עם lentiviral או וקטורי retroviral בתוך 1-2 ימים של פיצול. בין אם באמצעות וירוסים מסחריים או-הכין מעבדה, זה יכול להיות מועיל לtiter כראוי קבוצות של וירוס מראש על ידי דילול סדרתי. (איור 3).
  2. כדי להפחית celמות lular, להחליף תקשורת בתוך 8 שעות של spinfection.
    הערה: שילוב ויראלי וביטוי transgene צריכה להתגלות בתוך 24 שעות על ידי הקרינה גן הכתב. (אם הווירוס חסר כתב ניאון, זה קשה יותר להעריך; transfection המוצלח ביותר יכול להיות מאומת על ידי immunoblot, אימונוהיסטוכימיה או qPCR למוצרי ביטוי יתר.) ביטוי מלא עשוי להימשך 3-7 ימים; spinfections חוזר ונשנה עם וירוס נוסף עשוי להידרש להגדיל את האחוז של תאי transfected. spinfections החוזר יכול להתרחש מדי יום, אך לא צריך להיות כל כך תכוף. באופן אידיאלי, אם באמצעות כתב ניאון,> 80% של תאים צריכים להיות מסומנים.

5. neurosphere ההגירה Assay

הערה: טופס neurospheres באופן ספונטני, בעקבות הניתוק האנזימטית של NPCs (על ידי אופן זהה לזה המשמש בהרחבת NPC - הצעדים 3.3-3.6), אם תאים בתרבית השעיה בתקשורת NPC.

  1. בקצרה, לגדול לנתקNPCs ד בתקשורת NPC במשך 48 שעות בצלחות nonadherent כדי ליצור neurospheres. (איור 4).
  2. להגירת neurosphere, להכין צלחות Matrigel טריות באמצעות תקשורת NPC קרה, ולא DMEM, בצלחת 96-היטב, 1-2 שעות לפני neurosphere קטיף. לא לשאוב Matrigel מהבארות.
  3. כפי שפורסם במקור עבור neurospheres מקורן בתאי הגזע עוברי 22, לבחור באופן ידני neurospheres נגזרת NPC תחת מיקרוסקופ, לאחר שטיפת פעם בתקשורת NPC כדי להסיר פסולת הסלולר. העבר את neurosphere אחד היטב בכל צלחת 96-היטב Matrigel מצופה.
  4. להוסיף 0.5 מ"ג נוסף Matrigel, בדילול מלא בתקשורת NPC הקרה, לneurospheres בכל צלחת 96-היטב.
  5. באופן ידני במרכז כל neurosphere הבודד באמצע גם באמצעות קצה pipet.
    הערה: חשוב לבחור neurospheres בגודל דומה, על מנת לצמצם את השונות בתוצאות.
  6. לאפשר הגירה להתרחש במשך 48 שעות ולאחר מכן לתקן תאי wה- i paraformaldehyde 4% וכתם עם סמני immunohistochemical הרצויים.
  7. אם הגירת רדיאלי היא שיקבע, neurospheres תצלום בהם לחלוטין באמצעות מטרת 4x מיקרוסקופ. תכלול כל neurospheres פנייה קצה טוב או neurosphere שני מהניתוח.
    הערה: אם הגירה מתרחשת למשך זמן ארוך יותר מ -48 שעות, הגירת רדיאלי וכתוצאה מכך צפויה להיות גדולה מדי לתמונה באמצעות אובייקטיבי 4x.
  8. למדוד הגירה ממוצעת מכל neurosphere באמצעות תוכנת NIH ImageJ (איור 5). ניתן לעשות זאת באמצעות כל אחת משיטות הניתוח המפורטות להלן:
    1. הגירת מחוגי:
      1. באופן ידני להתחקות הקצה של התאים הרחוקים הנודד באמצעות כלי הבחירה חופשית ולאחר מכן להשתמש באמצעי הפונקציה (Ctrl + M) כדי לחשב את השטח של הצורה וכתוצאה מכך. לפני מדידת השטח לוודא שהשטח מסומן בחלון מדידות סט נמצא תחת הלשונית לנתח. השתמש בערך של מדידת השטח והמשוואה עבור שטחיו של מעגל (= πr 2) כדי לקבוע את הרדיוס (חיצוני).
      2. עקוב אחר קצה neurosphere המקורי, למדוד את השטח ולחשב את הרדיוס (הפנימי) באותה הדרך. לחשב את הגירת רדיאלי הכוללת כהפרש בין הרדיוסים החיצוניים ופנימיים.
    2. ההגירה סלולרית הגדולה ביותר:
      1. מדוד את המרחק שעבר מחמשת התאים הרחוקים מקצה neurosphere הפנימי באמצעות כלי בחירת קו הישר ואחריו מדוד הפונקציה (Ctrl + M).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן לזהות רוזטות העצבית מורפולוגית, באמצעות מיקרוסקופ brightfield, לפי המראה האופייני שלהם כמקבצים עגולים של תאי neuroepithelial עם קוטביות apico-בסיס (איור 1). למרות NPCs הם בדרך כלל בתרבית בצפיפות תאים גבוהה מאוד, הבא passaging מייד, מעט סומה בצורת הפירמידה ומבנה neurite דו קוטבי הוא גלוי (1D איור). NPCs תוקף להביע nestin וSox2 ברוב המכריע של תאים, אם כי צביעת III טובולין היא גם נראית לעין בכל אוכלוסיות NPC, מעיד על כך שחלקם של NPCs יוזם הבחנה עצבית כל הזמן בתוך התרבות (איור 1F). סמנים של תאי גזע עצביים, כגון Sox2 וPax6, ואבות עצביים המוח הקדמי, כגון TBR2, באים לידי ביטוי גם בNPCs, ואילו סמני המוח התיכון כגון LMX1A וFOXA2 אינם (איור 1G-I). חלק משמעותי של תאים כמו פיברובלסטים-גדולים ושטוחים בתוך אוכלוסיית NPC מצביעה על כך שNPCs באיכות ירודה שנוצר, שאינם צפויים להניב מספר גדול של תאי עצב הבאים הבחנה עצבית (איור 2).

בעקבות התמרה מוצלחת עם lentiviral גבוה כייל או וקטור retroviral, יותר מ -80% מתאים צריכים להיות מסומנים על ידי כתב הניאון כלול בווקטור (איור 3). דור neurosphere אמור להניב אוכלוסייה של neurospheres של גודל הומוגני יחסית (איור 4), אשר, עם האכלה קבועה, יכול להישאר בריאים בתרבות כשבוע. הגירת neurosphere מתרחשת חסונה בneurospheres בריאה (איור 5), וNPCs hiPSC לעבור התמיינות מהירה במהלך assay הגירת neurosphere 1.

איור 1

אוהל "> איור 1. מטופל ספציפי hiPSCs, NPCs ונוירונים. תמונות Brightfield של בידול עצבי hiPSC, מhiPSCs (), לגופי embryoid (B), רוזטות העצבית (C), NPCs (D) ותאי עצב (E) ... 100x, 100 מיקרומטר FI NPCs סרגל קנה המידה hiPSC הם חיוביים למספר תא המוח הקדמי גזע עצבי וסמן תא עצבי, כולל nestin NPC הסמן (הירוק) והסמן העצבי III טובולין (אדום) (F); השעתוק בתאי גזע העצבי גורמי Sox2 (ירוק) וPax6 (אדום) (G); וTBR2 סמן אב המוח הקדמי (אדום) (H), אבל לא LMX1A סמני המוח התיכון (ירוק) וFOXA2 (אדום) (I). גרעינים צבעוניים DAPI (כחול). 100x, סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. J. NPCs יכול להבדיל 70-80% תאי עצב III טובולין-חיובי (ירוק) ו20-30% חלבון חומצי fibrillary גליה (GFAP) האסטרוציטים -positive (אדום). 200x, סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2

איור 2. קווי NPC ממתין לאישור. איכות גבוהה (למעלה משמאל) hiPSC NPCs nestin המפורש (אדום) וSox2 (ירוק). ברוב התאים (גרעיני מגואלות DAPI (כחול)), ואילו באיכות נמוכה NPCs (למטה משמאל) יש כתמים של תאי Sox2-שליליים וnestin-שלילי (מימין). נוירונים 4 שבועות בן נבדלים מNPCs באיכות גבוהה להביע MAP2AB (ירוק) ו- III טובולין (אדום) (למעלה מימין), אבל אלה נבדלים מNPCs באיכות נמוכה לא (מימין למטה). 100x, סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר version של נתון זה.

איור 3

איור 3. התמרה ויראלי של NPCs. Brightfield (למעלה) וניאון GFP (תחתון) תמונות של hiPSC NPCs לפני (משמאל) ואחרי spinfection ויראלי. 100x, סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4

איור 4. neurosphere גיבוש. תמונות Brightfield של NPCs חסיד (משמאל) וneurospheres שהוקמה זה עתה (מימין). 100x, סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן לצפייה בlarגרסת ger של נתון זה.

איור 5

איור 5. neurosphere הגירה. AB. תמונות Brightfield של neurospheres לפני () ואחרי (B) 48 שעות של הגירה בMatrigel. 100x, סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר. CG. ללכוד תמונות מסך הממחישות את המתודולוגיה לניתוח הגירה עצבית רדיאלי באמצעות תוכנת NIH ImageJ. לחץ על "בחירות חופשיים" בסרגל הכלים ImageJ (C). עקוב אחר הקצה של התאים נדדו הרחוק סביב neurospheres (D). ודא כי השטח מסומן בחלון מדידות Set (E). השתמש בפונקצית המדידה (Ctrl + M) (F). עקוב אחר קצה neurospheres המקורית (G) ולהשתמש בפונקצית המדידה (Ctrl + M). לאחר מכן ניתן לייצא ל- Excel מדידות לצורך הניתוח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

תקשורת רכיבים
תקשורת הס DMEM / F12 (Life Technologies # 11,330)
20% החלפת KO-סרום (Life Technologies # 10,828)
1x Glutamax (Life Technologies # 35,050)
1x NEAA (Life Technologies # 11,140)
1x 2-mercaptoethanol (1000x 55mm) (Life Technologies # 21,985-023)
20ng / FGF2 מיליליטר (Life Technologies 13,256-029)
תקשורת N2 / B27 DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17,502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12,587-010)
תקשורת NPC DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17,502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12,587-010)
20 FGF2 מיליליטר / ng (Life Technologies)
1 מ"ג / מיליליטר הטבעי עכבר Laminin (Life Technologies # 23,017-015)
תקשורת Neuron DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17,502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12,587-010)
1 מ"ג / מיליליטר הטבעי עכבר Laminin (Life Technologies)
20 ng / ml BDNF (Peprotech # 450-02)
20 ng / ml GDNF (Peptrotech # 450-10)
500 מיקרוגרם / מיליליטר Dibutyryl מחזורי-AMP (# D0627 Sigma)
200 חומצה אסקורבית L-ננומטר (Sigma # A0278)

טבלה 1. מתכוני Media.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יש לנו תארנו שיטות שבאמצעותו להבחין hiPSCs לNPCs, סוג תא עצבי שבחלק משמעותי של החתימה הגנטית של תאי עצב שמקורם בhiPSC נשמרת ושעשויה לשמש כמדד למסלולים התפתחותיים שעלולים לתרום להיווצרות מחלה 8, 11. בנוסף, כפי שפורטנו, NPCs הוא אוכלוסייה עצבית וחסונה replicative וtransduced בקלות, שאנו מאמינים שעשויות להיות מתאימים למחקרים מולקולריים והביוכימי של נטייה למחלות.

אמנם יש לנו שיטות מפורטות להבדיל וNPCs בדוגמת המוח הקדמי התרבות, הם יכולים להתאים בקלות ליצור NPCs בדוגמת גורלות תא אחרים. לדוגמא, אם הם מטופלים EBS צף ראשון עם 0.5 מ"ג / מיליליטר DKK1, 10 מ"מ SB431542, 0.5 מ"ג / מיליליטר Noggin וcyclopamine 1 המ"מ, NPCs בהיפוקמפוס יופק הניתן להרחבה בתקשורת NPC ומובחן בתקשורת העצבית בתוספת 20 ng / Ml 7 WNT3A 12,23. בהתחשב בכך שפרוטוקולי בידול ביותר תת הסוג ספציפיים עצביים להמשיך באמצעות NESTIN- וSox2-positve ביניים, אנו צופים כי בשיטות דומות עשויות להיות ישימות עבור GABAergic- 2,24 וglutamatergic- 3,25,26 אוכלוסיות NPC ספציפיות.

ישנם מספר צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול הראוי לציון. ראשית, אם או דריסה ביטוי גני אנדוגני להביע מעל, עדיף להשתמש וקטור שליטה לבטא חלבון ניאון מאותו עמוד השדרה ויראלי, כפי שנצפינו הבדלים משמעותיים בתפרחת כאשר הכתבים באים לידי ביטוי מוקטורים בגדלים משתנים (בשל לירידה ביעילות אריזהעם גודל וקטור) או עם יזמי הבדל (בשל הבדלים ביעילות אמרגן). שנית, רצוי שנבצע התמרה ויראלית לפני neurosphere היווצרות, כפי שנצפינו penetrance עניה של וקטורים ויראליים למבנה neurosphere הצפוף. שלישית, ככל שמספר הקטע של עליות NPCs מעבר מעבר עשר, לעתים קרובות אנו מתבוננים הגירה לקויה באופן משמעותי בassay neurosphere. למעשה, בהתחשב בנטייה של NPCs להניב אחוז גבוה יותר של האסטרוציטים עם מעבר, חשוב להתאים את המעבר של קווי NPC בכל ניסוי.

לבסוף, חשוב לשקול את המגבלות ביולוגיות וטכניות של הטכניקות מתוארות. למרות NPCs נראה דומה מורפולוגית לפי העין, שהם אוכלוסייה הטרוגנית המורכבת מתאים מסוגלים לייצר שני נוירונים GABAergic glutamatergic ו. בעוד שאנו רואים דפוסי המוח הקדמי להפליא עקביים של קווי NPC בין אנשים באמצעות metho זהד 1, זה רק כאשר משווה קווי NPC באיכות גבוהה לאמת לגמרי - יש הבדלים משמעותיים בין קווי NPC באיכות טובים וגרועים. בנוסף, תשואות התמרה ויראלית גנטית תאים הטרוגנית, כל אחד עם שילוב של וקטור ויראלי במיקום ייחודי הגנומי; לכן, תאים בודדים ישתנו הן במיקום ומספר אתרי אינטגרציה הגנומי. שינויים עקביים יותר בביטוי גנים תמיד יתרחשו כאשר המניפולציה גנטית היא ממוקדת למיקום מדויק ומוגדר, בין אם זה מתרחש על ידי אצבע אבץ, Talen או אסטרטגיות המבוסס על CRISPR.

ניתן להשתמש NPCs hiPSC נגזר מטופל ללמוד שתי הפרעות הגלובליות ביטוי גנים המתרחשות במחלה נוירולוגית וגם ו / או השפעות סלולריות המולקולריים של מניפולציה גני מועמדים או מיקרו-רנ"א בהקשר של שני תאים עצביים המופקת מחולה בריאים או חולים. בדרך זו, ההשלכות של מניפולציה אחד או יותר מפתחאלל הסיכון (ים) יכול להיות מאופיין בהקשר של רקע גנטי שונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
  3. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
  4. Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
  5. Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18, (10), 1067-1076 (2013).
  6. Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21, (7), 1547-1559 (2012).
  7. Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473, (7346), 221-225 (2011).
  9. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. (2014).
  10. Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. (2014).
  11. An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11, (2), 253-263 (2012).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  14. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
  15. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  17. Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  18. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  19. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
  20. Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
  21. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  22. Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
  23. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  24. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  25. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics