Eine Anleitung zum Erstellen und Verwenden von hiPSC Abgeleitet NPCs für das Studium der Neurologische Erkrankungen

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Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

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Abstract

Introduction

Genexpressionsstudien von Neuronen in vitro aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) von uns 1 differenziert und andere 2,3 zeigen, dass hiPSC Neuronen ähnlich fetalen anstatt Erwachsenen Hirngewebe. Derzeit kann hiPSC basierte Modelle geeigneter für das Studium der Prädisposition statt später Merkmale, neurologischen Erkrankungen. Wir haben bereits berichtet, dass ein signifikanter Anteil der Gen-Signatur von Schizophrenie hiPSC abgeleiteten Neuronen bei Schizophrenie hiPSC neurale Vorläuferzellen (NPC) konserviert, was darauf hinweist, dass NPC eine nützliche Zelltyp für die Untersuchung der molekularen Wege beiträgt, Schizophrenie 1 sein . Wir und andere haben anomale Migration, erhöhten oxidativen Stress und reaktive Sauerstoffspezies, Sensibilität für Unterschwellenumweltbelastungen und einer Beeinträchtigung der Funktion der Mitochondrien bei der Schizophrenie hiPSC NPCs 1,4-6, sowie verringerte neuronale c berichtetVernetzungsoptionen und synaptische Funktion in der Schizophrenie hiPSC Neuronen 5,7-10. Wenn die molekularen Faktoren, die aberrant Migration und / oder oxidativer Stress bei Schizophrenie hiPSC NSC ebenfalls Grundlage der reduzierten neuronalen Konnektivitäts bei Schizophrenie hiPSC abgeleiteten Neuronen könnte NSC ein robustes und hoch replikativen neuronalen Population mit denen die Mechanismen der Erkrankung verantwortlich studieren. Darüber hinaus, weil man schnell erzeugen große Mengen von Zellen und müssen warten nicht Wochen oder Monate für die neuronale Reifung sind NPC basierte Assays geeignet für die Untersuchung von größeren Patientenkohorten und sind empfänglicher für Hochdurchsatz-Screening. Wir glauben, dass hiPSC NPCs können als Näherungswert für die Entwicklungswege potenziell einen Beitrag zur Pathogenese der Erkrankung dienen, wie bereits in so unterschiedlichen Erkrankungen wie Schizophrenie 1 und Huntington-Krankheit 11 gezeigt.

Um NPCs aus hiPSCs, erste neuronale Differenzierung inProduktion von Dual-SMAD Hemmung (0,1 mM und 10 mM LDN193189 SB431542) 12 durchgeführt. Durch Antagonisierung BMP und TGF-Signalisierung mit dieser kleinen Moleküle wird Endoderm und Mesoderm Spezifikation blockiert, die Beschleunigung der neuronalen Differenzierung und die zur Bildung von sichtbaren neuronalen Rosetten innerhalb einer Woche nach Beschichtung. Neuronale Muster tritt früh in diesem Prozess, die vermutlich während der Periode des neuronalen Rosettenbildung und unmittelbar danach. In Ermangelung anderer Hinweise, diese primitiven Nervenzellen gehen von einer vorderen Stirnhirn ähnlichen Schicksal 13. Unmittelbar nach neuronalen Rosettenbildung und während NPC zu beobachtende Erweiterung sind Vorderhirn NPCs mit FGF2 8,14 kultiviert. Sie verfügen über Dual-Linie Potenzial und kann zu neuronalen Populationen von 70-80% III-Tubulin-positiven Neuronen und 20-30% saure Gliafaserprotein (GFAP) -positiven Astrozyten (Abbildung 1) zu unterscheiden. Der Großteil der Vorderhirn hiPSC Neuronen VGLUT1-positiveUnd so sind vermutlich glutamatergen, obwohl etwa 30% der Neuronen GAD67-positive (GABA) 8.

NPCs werden regelmäßig mehr als zehnmal in vitro passagiert und gleichzeitig die konsistente Differenzierung Profile und ohne anfall Karyotyp Anomalien. Gruppen Passagieren NPCs mehr als 40-mal 15, aber wir finden, dass über zehn Passagen, NPCs zeigen eine erhöhte Neigung zu Astrozyten Differenzierung ausgewiesen. NPCs gut vertragen mehrere gefrier taut und wechselte als Neurosphären, indem Sie einfach die Kultivierung in nicht-haftenden Platten wachsen werden. NPCs werden effizient durch virale Vektoren transduziert und ermöglicht eine schnelle Auswertung der molekularen und zellulären Konsequenzen der genetischen Störung und einfach erweiterbar, um ausreichend Material für biochemische Untersuchungen ergeben. Darüber hinaus, da virale Vektoren erlauben robuste Überexpression und / oder Zuschlagskrankheitsrelevanter Gene, entweder Kontroll- oder Patienten gewonnen neural Zellen, kann man diese Plattform nutzen, um die Wirkung der genetischen Hintergrund auf diesen Manipulationen zu testen. Obwohl nicht für die synaptische oder aktivitätsbasierten Assays erfordern ausgereifte Neuronen geeignet, kann NPCs eine praktische Alternative für viele einfache molekulare oder biochemische Analysen von Patienten stammende Nervenzellen sein.

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Protocol

1. hiPSC Differenzierung zu neuronalen Vorläuferzellen

  1. Wachsen und zu expandieren hiPSCs in menschlichen embryonalen Stammzellen (HES) Medien (Tabelle 1) co-kultiviert auf einem embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Schicht, bis große (aber subkonfluente) Kolonien über eine Embryoidkörper (EB) Zwischen bereit für neuronale Differenzierung (Abbildung 2). Routine hiPSC Kulturbedingungen sind an anderer Stelle beschrieben, 16,17; kurz, wachsen hiPSCs in HES Medien auf einem MEF Feeder-Schicht bis zur Konfluenz, dann enzymatisch Gang mit Kollagenase (1 mg / ml in DMEM) und erweitern etwa 1: 3 alle 7 Tage.
  2. Um Poly-L-Ornithin / Laminin beschichteten Platten, Kleider Platten mit 10 in sterilem Wasser für Kunststoffoberflächen (50 g / ml für Glasoberflächen) vorzubereiten g / ml Poly-L-Ornithin und Inkubation bei Raumtemperatur für 3-24 Stunden. Mindestens einmal für 3-24 h Waschen mit sterilem Wasser und anschließend mit 5 g / ml Laminin in sterilem PBS bei RT.
    HINWEIS: Wenn in Plastik verpackt, Platten kannfür bis zu sechs Monate bei -20 ° C gelagert.
  3. An Tag 1, enzymatisch heben subkonfluenten hiPSCs (im allgemeinen auf MEFs aufgezogen oder hiPSCs in definierten Medien wie TeSR 18 auf Matrigel gezüchtet) von der Platte als große Kolonien mit 1 mg / ml Collagenase IV in DMEM / F12.
    HINWEIS: Nach 1-2 h Inkubation bei 37 ºC wurden Kolonien werden in die Schüssel zu schweben.
  4. Behutsam hiPSC Kolonien (durch Absetzen, nicht Zentrifugation) 1-2x mit DMEM / F12, Resuspension in 2 ml / Vertiefung von N2 / B27 Medien (Tabelle 1) und die Übertragung auf nicht-haftenden Schalen mit 6 Vertiefungen (kombinieren 3-Brunnen in 1 -gut) 19.
    HINWEIS: Über Nacht wird Kolonien schwebenden sphärischen Cluster zu bilden als "Embryoid Bodies" (EVG). Erwarten erhebliche Zelltod.
  5. Am Tag 2, Neigung Platten und ermöglichen EVG zu begleichen. Medien vorsichtig heraus und einmal abwaschen mit DMEM / F12, um Schmutz zu entfernen. Vorschub mit N2 / B27 Medien mit Dual SMAD-Hemmer (0,1 M LDN193189 und 10M SB431542) 12 ergänzt
  6. An den Tagen 3-7, wird neuralization im Rahmen der dualen SMAD Inhibierung auftreten; überprüfen Sie, ob EVG sind rund, aber nicht zystische. Futter EVG jeden zweiten Tag mit N2 / B27 Medien mit 0,1 M LDN193189 und 10M SB431542 ergänzt.
  7. An den Tagen 7-14 nach Beschichtung von EVG an Poly-L-Ornithin / Laminin beschichteten Platten, überprüfen Sie mit einem Hellfeldmikroskop, dass neuronale Rosetten beginnen, innerhalb von wenigen Tagen erscheinen (gekennzeichnet als runde Clustern Neuroepithelzellen mit apikal-basal Polarität; Abbildung 1). Weiter zur adhärenten EVG jeden zweiten Tag mit N2 / B27 Medien mit 0,1 M LDN193189, 10M SB431542 und 1 g / ml Laminin ergänzt ernähren.

2. Harvest of Neural Rosetten

HINWEIS: Wir empfehlen, dass neuronale Rosetten enzymatisch unter Verwendung von Neural Rosette Selektionsreagenz 20 oder ähnliche Selektionsreagenz geerntet werden. Obwohl neuronale Rosetten manuell in 6-Well-Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete Platte, thi abgeholt werdens Methode nimmt eine umfassende Ausbildung zu meistern, und, abhängig von Benutzer Geschick, kann eine zweite Runde der Kommissionierung am Tag 20 zu bereichern für NPCs und Abbau nicht-neuronalen Zelltypen erfordern.

  1. Für enzymatische Auswahl an neuronalen Rosetten am Tag 14, absaugen Medien aus halten EVG und 1 ml neuronalen Rosette Selektionsreagenz pro Vertiefung für eine 6-Well-Platte. Bei 37 ° C für 1 Stunde.
  2. Mit einem Pipetman P1000, entfernen Enzym aus jeder Vertiefung. 1 ml DMEM / F12 pro Napf waschen.
  3. Mit P1000, sammeln Sie die 1 ml DMEM / F12 und schnell vertreiben die DMEM / F12 zurück in den Brunnen, damit Lösen der Rosetten von der Platte. Sammeln Sie die Rosetten in ein Falcon-Röhrchen.
  4. Pipette weitere 1 ml DMEM / F12 und schnell in derselben Wanne auszustoßen, um verbleibende Rosetten abzulösen. (Verreiben Sie nicht. Versuchen Sie, nicht zu brechen Rosette Aggregate). Sammeln Sie die neuronale Rosetten in gleichen Falcon-Röhrchen.
  5. Wiederholen Sie Schritt 2.4 wie nötig. Wenn Rosetten nicht leicht zu lösen, fügen moWieder Enzym und wiederholen Sie den Vorgang (Schritte 2,1 bis 2,4)
  6. Spin-Zellen bei 300 xg für 3 min. Saugen Sie die Wäsche, und wieder auszusetzen Rosetten in 2 ml NPC Medien (Tabelle 1). Übertragungszellen (1: 1) in eine Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete 6-Well-Platte.
  7. Von 15 bis 21 Tagen werden die neuronalen Rosetten zu erweitern; Feed Rosetten jeden zweiten Tag mit NPC Medien.
  8. Bewerten Sie die Qualität der neuronalen Rosetten und sicherzustellen, dass Flach Fibroblasten-ähnlichen Zellen nicht in der Kultur erweitert.
    HINWEIS: Wenn nicht-Rosetten bestehen bleiben, kann der NPC Kultur manchmal durch manuelle Kommissionierung geborgen werden, die Auswahl nur die besten der aufgenommenen Rosetten in Accutase. Distanzieren 15 min bei 37 ° C. Pellet, waschen und Platte in NPC Medien auf 24-Well-Poly-L-Ornithin / Laminin beschichtete Platte.

3. Ausbau der neuronalen Vorläuferzellen

HINWEIS: hiPSC NSC können entweder Matrigel- oder Poly-L-Ornithin / Laminin beschichteten Platten gezüchtet werden. Wir verwenden in der Regel Matrigel-Platten, da sie schneller und bereit sein zu geringeren Kosten.

  1. Auf Matrigel-beschichteten Platten herzustellen, schnell auftauen und Resuspendieren eine 1mg gefrorenes Aliquot Matrigel in 24 ml kaltes DMEM / F12 und sofort verteilen 2 ml zu jeder Vertiefung der zwei Sechs-Well-Platten. Inkubieren für wenigstens 1 Stunde bei 37 ºC.
    HINWEIS: Matrigel muss nur angesaugt werden, nicht gewaschen, unmittelbar vor der Verwendung.
  2. Feed-NPCs jeden zweiten Tag und zu warten mit sehr hoher Dichte oder sie spontan zu Neuronen zu differenzieren.
    HINWEIS: Obwohl etablierten NPCs werden in der Regel im Verhältnis 1: 4 pro Woche kann sehr niedrigen Durchgang NPCs aufgeteilt werden 1: 2 so selten wie einmal alle zwei Wochen.
  3. So teilen Sie zunächst absaugen Medien und 1 ml warmem Accutase (1X) pro Vertiefung 6-Well-Platte. Bei 37 ° C für 10-15 min.
  4. Abgelösten Zellen übertragen Sie leicht in ein 15 ml Röhrchen mit DMEM / F12 mit so wenig mechanischer Belastung wie möglich. Zellen titriert niemals während der Enzym. Pellet-Zellen durch Spinning bei 1.000 × g für 5 min.
  5. Saugen Sie das Waschen und resuspendieren NPCs in ~ 1 ml NPC Medien pro Original auch der 6-Well.
    HINWEIS: Erwarten Sie, dass ein konfluenter Vertiefung einer 6-Well-Gericht hat 5-10 Million Zellen; Dies kann durch Zählen einer 10l Aliquot von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers vor dem Wiederbeschichtungs bestätigt werden.
  6. Nach Resuspension, Wiederplatte NPCs als NPCs, Neuronen oder Neurosphären. Um NPCs halten Platte etwa 1-2 Millionen Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. Die Effizienz der Neurosphären-Bildung zwischen den Experimenten und Zelllinien variieren, aber im allgemeinen erfolgt am besten, wenn die zwischen 200.000 und 1.000.000 Zellen pro Loch einer nicht-haftenden Platte mit 6 Vertiefungen ausgesät; wenn Verklumpung der Neurosphären, reduzieren die Anzahl der Zellen ausgesät. Um zu Neuronen zu differenzieren, Platte etwa 200.000 Zellen pro Vertiefung einer 6-Well-Platte ersetzt NPC Medien mit Neuron Medien.
  7. Immunhistochemisch validieren jede etablierte NPC Linie. Sobald genügend Zellmaterial wurde expanded, Label NPCs mit Antikörpern für NESTIN und SOX2. Geprüftes NPC Leitungen sollten auch in Neuronen für 4-6 Wochen differenzieren und mit Antikörpern für III-Tubulin-und MAP2ab markiert.
    1. Fix Zellen in 4% Paraformaldehyd in PBS bei 4 ° C für 10 min. Permeabilisieren NSC bei RT für 15 min in 1,0% Triton in PBS, und dann wird der Block in 5% Eselserum mit 0,1% Triton bei RT für 30 min.
    2. Inkubation mit dem primären Antikörper in 5% Eselserum mit 0,1% Triton, über Nacht bei 4 ° C.
      HINWEIS: Wir empfehlen folgende Antikörper: Ziegen-Anti-Sox2, 1: 200; Maus-anti-Mensch-Nestin, 1: 200; Kaninchen-anti-βIII-Tubulin, 1: 500; Maus-Anti-βIII-Tubulin, 1: 500; Maus-Anti-MAP2ab, 1: 200. (Abbildung 2).
    3. Nach einem Waschen mit PBS, inkubiert Sekundärantikörper Zellen mit der entsprechenden konjugierten Sekundärantikörper, um Ziege, Maus oder Kaninchen bei 1: 300, im in 5% Eselserum mit 0,1% Triton für 1-2 Stunden bei Raumtemperatur. Um Kerne, Flecken Zellen mit 0,5 & mgr; g / ml DAPI (4 'visualisieren, 6-Diamino-2-phenylindol) und montieren Sie mit Vectashield.

4. NPC Transduction

  1. Verwenden spinfection (Zentrifugation von Zellkulturplatten in Gegenwart von Virus bei 1.000 × g für 1 Stunde), um den Prozentsatz der transfizierten Zellen 21 erhöhen. Absaugen Medien und ersetzen mit dem entsprechenden Überexpression (oder Kontrolle) Lentiviren (oder Retroviren), auf die gewünschte Multiplizität der Infektion (MOI) (in der Regel 1 bis 10), in NPC Medien verdünnt titriert. Verwenden von 1,5 ml pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen (oder eines geeignet skalierten Volumen für andere Typen von Gewebekulturplatten). Spin bei 1.000 xg und 37 ° C für 1 Stunde in einer Plattenzentrifuge.
    HINWEIS: Im Idealfall transduzieren NPCs mit lentiviralen oder retroviralen Vektoren in 1-2 Tagen der Spaltung. Ob mit kommerziellen oder Labor vorbereitet Viren, kann es hilfreich sein, entsprechend titrieren Chargen des Virus im Voraus durch serielle Verdünnung ist. (Abbildung 3).
  2. Um cel reduzierenzellulären Tod ersetzen Medien innerhalb von 8 h spinfection.
    HINWEIS: Viral Integration und Expression des Transgens sollte innerhalb von 24 Stunden nach Reportergen Fluoreszenz nachweisbar sein. (Wenn der Virus fehlt ein fluoreszierendes Reporter, das ist schwieriger zu beurteilen; erfolgreiche Transfektion kann am besten durch Immunoblot, Immunhistochemie oder qPCR zur Überexpression Produkte überprüft werden.) Voll Ausdruck kann 3-7 Tage; wiederholt spinfections mit zusätzlichen Virus benötigt, um den Prozentsatz der transfizierten Zellen erhöhen. Wiederkehrende spinfections kann täglich erfolgen, muss aber nicht so häufig. Im Idealfall, wenn mit einer fluoreszierenden Reporter,> 80% der Zellen sollten gekennzeichnet werden.

5. Neurosphere Migration Assay

HINWEIS: Neurospheres spontan bilden, nach der enzymatischen Spaltung von NPC (durch eine Art und Weise identisch zu der in NPC Expansion verwendet - Schritte 3,3-3,6), wenn die Zellen in Suspension in NPC Medien kultiviert werden.

  1. Kurz gesagt, wachsen distanzierend NPCs in NPC Medien für 48 Stunden in nichthaftende Platten, um Neurosphären zu erzeugen. (Abbildung 4).
  2. Für Neurosphäre Migration, bereiten Sie frisches Matrigel Platten mit kaltem NPC Medien, anstatt DMEM, in einer 96-Well-Platte, 1-2 Stunden vor der Neurosphäre sammeln. Matrigel saugen Sie nicht aus den Vertiefungen.
  3. Wie ursprünglich für embryonale Stammzellen abgeleiteten Neurosphären 22 veröffentlicht wurde, manuell NPC-derived Neurosphären holen unter dem Mikroskop nach einmaligem Waschen in NPC Medien, um Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen eines Neurosphäre zu jeder Vertiefung einer Matrigel-beschichtete 96-Well-Platte.
  4. Hinzufügen eines zusätzlichen 0,5 mg Matrigel, in kaltem NPC Medium verdünnt, um die Neurosphären in jeder 96-Well-Platte.
  5. Manuell Zentrierung jeder einzelnen Neurosphären in der Mitte des Bohrlochs unter Verwendung einer Pipettenspitze.
    HINWEIS: Es ist wichtig, Neurosphären von ähnlicher Größe wählen, um die Variabilität der Ergebnisse zu reduzieren.
  6. Lassen Sie die Migration auf 48 Stunden auftreten und dann fix Zellen with 4% Paraformaldehyd und Fleck mit gewünschten immunhistochemischen Markern.
  7. Wenn radiale Migration zu bestimmen ist, fotografieren Neurosphären in ihrer ganz mit einem 4x Mikroskopobjektiv. Schließen alle Neurospheres Kontaktieren der Kante des Bohrlochs oder eine zweite Neurosphäre aus der Analyse.
    HINWEIS: Bei der Umlagerung für länger als 48 Stunden, wird der resultierende radiale Migration wahrscheinlich zu groß, um sein Bild mit einem 4-fach Objektiv.
  8. Messen durchschnittlichen Migration von jeder Neurosphären mit NIH ImageJ Software (Abbildung 5). Dies kann entweder unter Verwendung der unten beschriebenen Analyseverfahren durchgeführt werden:
    1. Radial-Migration:
      1. Manuelles Spuren den Rand der am weitesten wandernden Zellen mit dem Freihandauswahlwerkzeug verwenden Sie dann die Maßnahme (Strg + M) Funktion, um den Bereich der sich ergebende Form zu berechnen. Vor der Messung der Bereich, um sicherzustellen, dass Area liegt in der Set-Messungen Fenster unter der Registerkarte Analysieren finden überprüft. Verwenden Sie dieWert der Bereichsmessung und der Gleichung für die Fläche eines Kreises (A = & pgr; r 2), um den Radius (äußeren) bestimmen.
      2. Verfolgen Sie die Kante des Originals Neurosphäre, messen Sie den Bereich und die Berechnung der Radius (innen) in der gleichen Weise. Berechne den radialen Migration als die Differenz zwischen dem äußeren und inneren Radien.
    2. Greatest Zellmigration:
      1. Messen Sie den Abstand von den fünf am weitesten Zellen bewegt von der Kante der inneren Neurosphären mit dem geradlinigen Auswahlwerkzeug, gefolgt von der Maßnahme (Strg + M) Funktion.

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Representative Results

Neural Rosetten können morphologisch durch ihre charakteristische Aussehen als runde Clustern Neuroepithelzellen mit apikal-basal Polarität (Abbildung 1) identifiziert werden, mit einem Hellfeldmikroskop. Obwohl NPCs sind in der Regel bei sehr hohen Zelldichte kultiviert, unmittelbar im Anschluss an Passagieren, leicht pyramidenförmige Soma und Neuriten bipolare Struktur sichtbar (Abbildung 1D). Validiert NSC exprimieren NESTIN und SOX2 in der Mehrzahl der Zellen, jedoch III-Tubulin-Färbung ist auch sichtbar in allen NPC Populationen, die anzeigen, dass Teil der NSC kontinuierlich Initiierung neuronale Differenzierung in der Kultur (1F). Marker für neurale Stammzellen, wie SOX2 und PAX6 und Vorderhirn neuronalen Vorläufern wie tbr2, sind ebenfalls in NPC exprimiert, während Hirn Marker wie LMX1A und FOXA2 nicht (1G-I). Ein wesentlicher Anteil der großen und flachen fibroblastenartigen Zellen innerhalb ein NPC Bevölkerung zeigt, dass schlechte Qualität NPCs erzeugt wurden, bei denen es unwahrscheinlich, eine große Anzahl von Neuronen folgende neuronale Differenzierung (Abbildung 2) zu erhalten sind.

Nach der erfolgreichen Transduktion mit einem hohen Titer lentiviralen oder retroviraler Vektor, sollte mehr als 80% der Zellen markiert werden, indem die Fluoreszenzreporter in den Vektor (Abbildung 3) enthalten. Neurogeneration sollte eine Bevölkerung von Neurosphären der relativ homogene Größe (Abbildung 4), die mit regelmäßigen Ernährung, gesunde in Kultur für etwa eine Woche bleiben erhalten. Neurosphäre Migration tritt kräftig in gesunden Neurosphären (Abbildung 5) und hiPSC NPCs unterziehen schnelleren Differenzierung im Laufe eines Neurosphäre Migrationstest 1.

Figur 1

Zelt "> Abbildung 1. Patientenspezifische hiPSCs, NPCs und Neuronen. Hell Bilder hiPSC neuronale Differenzierung von hiPSCs (A), um Embryoidkörpern (B), neuronale Rosetten (C), NPCs (D) und Neuronen (E) . 100x sind Maßstab 100 um FI hiPSC NPCs positiv für eine Reihe von Vorderhirn neurale Stammzellen und neuronale Vorläuferzellmarker, einschließlich der NPC Marker NESTIN (grün) und der neuronalen Marker III-Tubulin (rot) (F)..; das neuronale Stammzellen Transkriptionsfaktoren SOX2 (grün) und PAX6 (rot) (G), und das Vorderhirn Vorläufermarker tbr2 (rot) (H); aber nicht die Mittelhirn Marker LMX1A (grün) und FOXA2 (rot) (I). DAPI-gefärbten Zellkerne (blau). 100x, Maßstabsbalken 100 um. J. NPCs können zu 70-80% III-Tubulin-positiven Neuronen (grün) und 20-30% saure Gliafaserprotein unterscheiden (GFAP) -positiven Astrozyten (rot). 200x, Maßstabsbalken 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2

Abbildung 2. Validierung NPC Lines. Hohe Qualität (oben links) hiPSC NPCs ausdrückliche NESTIN (rot) und SOX2 (grün). in den meisten Zellen (Kerne mit DAPI (blau) gefärbt), während niedrige Qualität (unten links) NPCs haben Flecken von SOX2-negative und NESTIN-negativen Zellen (rechts). 4 Wochen alte Neuronen aus hochwertigem NPCs differenziert ausdrücken MAP2ab (grün) und III-Tubulin (rot) (oben rechts), nicht aber die von geringer Qualität NPCs differenziert zu tun (unten rechts). 100x, Maßstabsbalken 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere version dieser Figur.

Figur 3

Abbildung 3. Virale Transduktion von NPCs. Hellfeld (oben) und GFP-Fluoreszenz (unten) Bilder hiPSC NPCs vor (links) und nach der viralen spinfection. 100x, Maßstabsbalken 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4

Abbildung 4. Neurosphere Formation. Hell Bilder von adhärenten NPCs (links) und neu gegründete Neurosphären (rechts). 100x, Maßstabsbalken 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine lar anzuzeigenger Version dieser Figur.

Abbildung 5

Abbildung 5. Neurosphere Migration. AB. Hellfeldbilder von Neurosphären vor (A) und nach (B) 48 h der Migration in Matrigel. 100x, Maßstabsbalken 100 um. CG. Bilder des Bildschirmdrucks Demonstration der Methodik zur Analyse Radial neuronalen Migration mit NIH ImageJ Software. Klicken Sie auf "Freihandauswahl" auf ImageJ Symbolleiste (C). Verfolgen Sie den Rand der am weitesten migrierten Zellen um die Neurosphären (D). Stellen Sie sicher, dass Area liegt in der Set-Messungen Fenster (E) überprüft. Verwenden Sie die Funktion Messen (Strg + M) (F). Verfolgen Sie die Kante der ursprünglichen Neurosphären (G) und verwenden Sie die Funktion Messen (Strg + M). Die Messungen können dann in Excel zur Analyse exportiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Medien Components
HES Medien DMEM / F12 (Life Technologies # 11330)
20% KO-Serumersatz (Life Technologies # 10828)
1x Glutamax (Life Technologies # 35050)
1x NEAA (Life Technologies # 11140)
1x 2-Mercaptoethanol (55 mM 1000x) (Life Technologies # 21.985-023)
20 ng / ml FGF2 (Life Technologies 13.256-029)
N2 / B27 Medien DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17.502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12.587-010)
NPC Medien DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17.502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12.587-010)
20 ng / ml FGF2 (Life Technologies)
1 mg / ml Naturmaus Laminin (Life Technologies # 23.017-015)
Neuron Medien DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17.502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12.587-010)
1 mg / ml Natürliches Maus Laminin (Life Technologies)
20 ng / ml BDNF (Peprotech # 450-02)
20 ng / ml GDNF (Peptrotech # 450-10)
500 ug / ml Dibutyryl cyclisches-AMP (Sigma # D0627)
200 nM L-Ascorbinsäure (Sigma # A0278)

Tabelle 1 Medien Rezepte.

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Discussion

Wir haben Methoden, mit denen zu unterscheiden hiPSCs in NPCs, ein neuronales Zelltyp, in dem ein erheblicher Anteil der Gen-Signatur von hiPSC abgeleiteten Neuronen erhalten bleibt und das kann als Näherungswert für die Entwicklungswege potenziell einen Beitrag zur Pathogenese der Erkrankung dienen 8 beschrieben, 11. Darüber, wie wir detailliert haben, sind NPCs ein robust replikativen und einfach transduzierten neuronalen Bevölkerung, die unserer Meinung nach für molekulare und biochemische Untersuchungen der Krankheit Veranlagung sein.

Obwohl wir detaillierte Methoden zur Differenzierung und Kultur Vorderhirn-gemusterten NPCs, können sie leicht an NPCs zu anderen Zellschicksale gemusterten erzeugen. Wenn beispielsweise schwimm EBs werden zuerst mit 0,5 mg / ml DKK1, 10 mM SB431542, 0,5 mg / ml Noggin und 1 mM Cyclopamin hippocampalen NSC erzeugt, das in NPC Medien erweitert und in neuronalen Medium mit 20 ng unterschieden werden können behandelt / ml Wnt3a 7 12,23. Da die meisten Subtyp spezifische neuronale Differenzierung Protokolle gelangen über eine NESTIN- und SOX2-positve Zwischen erwarten wir, dass ähnliche Methoden können anpassungsfähig für GABAergic- 2,24 und glutamatergic- 3,25,26 bestimmten NPC Bevölkerung.

Es gibt mehrere kritische Schritte in dem Protokoll erwähnenswert. Erstens, wenn die Überexpression oder umzuwerfen endogenen Genexpression ist es am besten, einen Steuervektor mit einem fluoreszierenden Protein exprimieren, aus demselben viralen Rückgrat, wie wir erhebliche Unterschiede in Fluoreszenz beobachtet, wenn Reporter von Vektoren der variablen Größen ausgedrückt (wegen verminderte Packungswirksamkeitmit Vektor-Format) oder mit Unterschied Veranstalter (aufgrund unterschiedlicher Promotoreffizienz). Zweitens empfehlen wir Abschluss virale Transduktion vor der Bildung Neurosphäre, wie wir armen Penetranz viraler Vektoren in die dichte Neurosphäre Struktur beobachtet. Drittens ist der Durchgang Anzahl der NPCs über Durchgang zehn erhöht, wir beobachten häufig Migration in der Neurosphäre Assay wesentlich beeinträchtigt. In der Tat, da die Neigung von NSC, einen größeren Prozentsatz von Astrozyten mit dem Durchgang zu erhalten, ist es entscheidend, den Durchgang von NPC Leitungen in jedem Experiment überein.

Schließlich ist es wichtig, die biologischen und technischen Grenzen der beschriebenen Techniken zu berücksichtigen. Obwohl NSC erscheinen dem Auge morphologisch ähnlich zu sein, sie sind eine heterogene Population von Zellen, die zur Erzeugung von sowohl Glutamat und GABA-erge Neuronen besteht. Während wir zwischen Individuen beobachten bemerkenswert konsistent Vorderhirn Strukturierung NPC Linien mit dieser method 1, das ist nur beim Vergleich vollständig validiert hochwertigen NPC Linien - gibt es große Unterschiede zwischen guten und schlechten Qualität NPC Linien. Zusätzlich genetisch heterogenen Zellen virale Transduktion Ausbeuten, die jeweils mit einer Integration des viralen Vektors in einer einzigartigen genomischen Stelle; Daher werden einzelne Zellen sowohl in der Lage und Anzahl der genomischen Integrationsstellen variieren. Konsequenter Veränderungen in der Genexpression besteht immer dann, wenn die genetische Manipulation an eine präzise und definierte Stelle gezielt, ob es von Zinkfinger, TALEN oder CRISPR basierte Strategien auftritt.

Patient hiPSC abgeleitet NSC können sowohl die globale Genexpression Störungen der neurologischen Erkrankung auftretenden und auch die molekularen und / oder zellulären Effekte der Manipulation Kandidatengene oder mikroRNAs im Kontext entweder gesunden oder kranken Patienten stammende neurale Zellen zu untersuchen. Auf diese Weise werden die Folgen der Manipulation eines oder mehrere SchlüsselwörterRisiko-Allel (e) kann im Zusammenhang mit verschiedenen genetischen Hintergründen auszeichnen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

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References

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