Nörolojik Hastalıklar Çalışmaları Yaratma ve Kullanma hiPSC Türetilmiş NPC A Guide

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Bizim 1 insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) in vitro farklılaşmış nöronların ve diğerleri 2,3 Gen ifadesi çalışmaları hiPSC nöronlar fetal ziyade yetişkin beyin dokusu benzer olduğunu göstermektedir. Şu anda, hiPSC-tabanlı modeller yerine geç özellikleri, nörolojik hastalığı dışında, yatkınlık çalışmaları için daha uygun olabilir. Daha önce NPC şizofreni 1 katkıda moleküler yolları araştırılmasında faydalı bir hücre tipi olabileceğini göstermektedir, şizofreni hiPSC türetilen nöron gen imza önemli bir kısmının şizofreni hiPSC türetilmiş sinir progenitör hücrelerinin (NPC) muhafaza edilir bildirmişlerdir . Biz ve diğerleri anormal göç, artmış oksidatif stres ve reaktif oksijen türleri, alt eşik çevresel streslere ve şizofrenide bozulmuş mitokondriyal fonksiyonu hiPSC NPC 1,4-6 hassasiyeti yanı sıra azalmış nöronal c bildirmiştironnectivity ve şizofreni hiPSC nöronlar 5,7-10 sinaptik fonksiyon. Şizofreni hiPSC NPC anormal göç ve / veya oksidatif strese katkıda moleküler faktörler de şizofreni hiPSC kaynaklı nöronlar azalmış nöronal bağlantı temelini ise, NPC hastalıktan sorumlu mekanizmaları incelemek için sağlam ve yüksek replikatif nöral nüfus olabilir. Bir hızla hücrelerin çok sayıda oluşturabilir ve nöronal olgunlaşması için hafta veya ay beklemek gerekmez, çünkü Ayrıca, NPC-tabanlı deneyler daha büyük hasta gruplarını çalışma için uygundur ve yüksek verimli tarama daha yatkındır. Biz zaten şizofreni 1 ve Huntington hastalığı 11 gibi farklı hastalıkların ortaya konmuştur olarak hiPSC NPC, potansiyel hastalık patogenezinde katkıda gelişimsel yollar için bir vekil olarak hizmet verebilir inanıyoruz.

HiPSCs, ilk nöral gelen NPC ayırt etmektim çift SMAD inhibisyon (0.1 mM LDN193189 ve 10 mM SB431542) 12 tarafından gerçekleştirilir. Bu küçük moleküller ile sinyalizasyon BMP ve TGF antagonize ederek, endoderm ve mezoderm özellikleri nöronal farklılaşma hızlandırılması ve kaplama bir hafta içinde görünür nöral rozet oluşumuna yol açan, bloke edilir. Sinir desenlendirme muhtemelen hemen sonra nöral rozet oluşumu ve döneminde, erken bu süreçte oluşur. Diğer ipuçları yokluğunda, bu ilkel nöral hücreler anterior ön beyin-benzeri kaderi 13 varsayıyorum. Hemen nöral rozet oluşumu takip ve NPC genişleme boyunca devam eden, ön beyin NPC FGF2'nin 8,14 ile kültür. Onlar çift soy potansiyeline sahip ve% 70-80 III-tubulin-pozitif nöronlar ve% 20-30 glial fibriler asidik protein (GFAP) pozitif astrositler (Şekil 1) nöral nüfusa ayırt edilebilir. ön-beyin hiPSC nöronlarının çoğunluğu VGLUT1-pozitifNöronların yaklaşık% 30 GAD67 pozitif (GABA) rağmen ve böylece, muhtemelen glutamaterjik 8.

NPC rutin tutarlı farklılaşma profilleri muhafaza ve karyotip anomalileri biriken olmadan iken, in vitro fazla on kez geçişli. Gruplar Pasajlanması NPC'lerin 15, ancak, biz on pasajlar ötesinde, NPC astrosit farklılaşma eğilimini göstermektedir artmış olduğunu bulmak 40'tan fazla kez bildirilmiştir. NPC birden donma-çözülür iyi tolere ve sadece yapışmayan plakalarda kültürleme yoluyla neurospheres olarak büyümeye geçiş yapılabilir. NPC etkili bir biyokimyasal çalışmalar için yeterli malzeme elde etmek için hızlı bir genetik müdahalelerin moleküler ve hücresel sonucu değerlendirmeyi ve kolayca genişletilebilir sağlayan, viral vektörler tarafından iletilir. Ayrıca, çünkü viral vektörler izin sağlam aşırı ekspresyonu kontrolü veya hasta türetilmiş neur birinde ve / veya hastalık-ilgili genlerin demonte,El hücreleri, kimse bu manipülasyonlar genetik kökenli etkisini test etmek için bu platformu kullanabilirsiniz. Sinaptik veya olgun nöronlar gerektiren faaliyet tabanlı deneyleri için uygun olmasa da, NPC hasta kaynaklı sinir hücrelerinin çoğu basit moleküler veya biyokimyasal analizler için pratik bir alternatif olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hiPSC Farklılaşma Sinir Progenitör Hücreler için

  1. Büyümek ve insan embriyonik kök hücre hiPSCs genişletin (HES) medya (Tablo 1) eş-kültüre bir fare embriyonik fibroblast (MEF), büyük (ama SUBCONFLUENT) koloniler bir embriyoid vücudun (EB) ara aracılığıyla nöral farklılaşma için hazır olana kadar besleyici tabaka üzerinde (Şekil 2). Rutin hiPSC kültür koşulları iyi yerde 16,17 tarif edilmiştir; 3 Her 7 gün: kısaca, birbirine karışana kadar bir MEF besleyici tabaka üzerinde HES medyada hiPSCs büyümek, daha sonra enzimatik kollajenaz (DMEM 1mg / ml) ile geçit ve yaklaşık 1 genişletin.
  2. Poli-L-Ornitin (cam yüzeyler için 50 ug / ml), plastik yüzeyler için steril su içinde ml / g, 10 ile Poli-L-Ornitin / laminin kaplanmış plakalar, kaplama plakaları hazırlamak ve 3-24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe etmek. 3-24 saat boyunca oda sıcaklığında steril PBS içerisinde 5 g / mi Laminin steril su ve daha sonra kaplama ile en az bir kez yıkayın.
    NOT: plastik sarılı ise, plakalar olabiliraltı aya kadar -20 ° C 'de saklanır.
  3. 1. Günde enzimatik DMEM / F12 içinde 1 mg / ml kollajenaz IV kullanılarak plaka gibi büyük koloniler (örneğin, Matrigel TeSR 18 olarak tanımlanmış ortamlarda yetiştirilen, genellikle MEF'ler yetiştiler ya da ancak hiPSCs) kaynaşma hiPSCs kaldırın.
    NOT: 37 ºC inkübasyon 1-2 saat sonra koloniler çanak yüzen olacak.
  4. Yavaşça DMEM / F12, 2 ml / yuva N2 / B27 ortamı (Tablo 1) ve yapışkan olmayan 6 oyuklu tabaklara transfer tekrar süspansiyon ile 1-2X (değil santrifüj, çökeltilerek) hiPSC koloniler yıkama (1 içine 3-kuyu kombine eh) 19.
    NOT: Gecelik, koloniler yüzen küresel kümeler oluşturacak "embriyoid organları" (EBS) olarak adlandırılan. Önemli hücresel ölüm bekliyoruz.
  5. Ve Gün 2, eğim plakaları üzerinde EBS yerleşmek için izin verir. Dikkatle ortamı çıkarın ve enkaz kaldırmak için DMEM / F12 ile bir kez yıkayın. N2 ile besleyin / çift SMAD inhibitörleri (0.1M LDN193189 ve 10M SB431542) 12 ile desteklenmiş B27 medya
  6. Gün 3-7, neuralization çift SMAD inhibe bağlamında oluşacak; EBS yuvarlak ama kistik olmadığını kontrol edin. EBS 0.1M LDN193189 ve 10M SB431542 ile desteklenmiş N2 / B27 medya ile her ikinci gün besleyin.
  7. Nöral rozet (apico-bazal kutupları nöroepitelyal hücrelerin yuvarlak kümeleri olarak karakterize bir kaç gün içinde görünmeye başlar ki Günleri 7-14, kaplanmış plakalar Poli-L-Ornithine / Laminin için EBS kaplama izleyen, bir aydınlık mikroskop kullanılarak kontrol edin; Şekil 1). Yapışkan EBS 0.1 M LDN193189, 10M SB431542 ve 1 ug / ml, laminin ile takviye N2 / B27 ortamı ile her iki günde bir beslemeye devam edin.

Sinir rozet 2. Hasat

NOT: Biz nöral rozet enzimatik Sinir Rozet Seçim Reaktif 20 veya benzeri seçim reaktif kullanılarak hasat öneririz. Nöral rozet elle 6-kuyu Poli-L-Ornithine / laminin kaplı levha, thi içine alınabilir rağmenmetodolojisi ayrıca NPC zenginleştirmek ve nöral olmayan hücre tiplerini tüketmek için günde 20 toplama bir ikinci tur gerektirebilir, kullanıcı beceri bağımlı, usta kapsamlı eğitim alır, ve.

  1. 14. günde nöral rozet enzimatik seçimi için, uyulması EBS aspire maddeleri ve 6-delikli plaka için oyuk başına sinir rozet seçimi reaktif 1 ml. 1 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin.
  2. P1000 Pipetman ile, yavaşça her kuyudan enzimi çıkarın. Yıkamak için oyuk başına DMEM / F12 içinde 1 ml ilave edilir.
  3. Bir P1000 ile DMEM / F12 1 ml toplamak ve hızlı bir şekilde, böylece plaka rozet ayrılmakta, iyi geri DMEM / F12 sınırdışı. Bir şahin tüp içine rozetler toplayın.
  4. Pipet başka 1 DMEM / F12 ml ve hızlı kalan rozet ayırmak için aynı kuyunun içine sınırdışı. (Çiğnemek etmeyin. Rozet agrega kırmak için çalışın). Aynı şahin tüp içine sinir rozetler toplayın.
  5. Adımı tekrarlayın gerekli 2.4. Rozetler kolayca ayırmak istemiyorsanız, mo ekleyinenzimi yeniden ve işlemi tekrarlayın (2,1-2,4 adımları)
  6. 3 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri Spin. Aspire yıkama ve NPC medya (Tablo 1) 2 ml rozet yeniden askıya. Aktarım hücreleri (1: 1) ile Poli-L-Ornitin / laminin içine 6 plaka kaplama.
  7. Gün 15-21 itibaren, nöral rozet genişletmek; yem rozet NPC medya ile her ikinci gün.
  8. Nöral rozet kalitesini değerlendirmek ve düz fibroblast benzeri hücreler kültür içinde genişleyen değil emin olun.
    NOT: sigara rozet devam ederse, NPC kültürü bazen Accutase içine aldı rozet sadece en iyi seçerek, manuel toplama ile kurtarılabilir. 37 ºC 15 dakika ayırmak. Pelet, yıkama ve NPC ortam levha 24 oyuklu poli-L-ornitin / laminin kaplanmış plaka üzerine.

Sinir Progenitör Hücreler 3. Genişleme

Not: hiPSC NPC Matrigel- veya Poli-L-Ornitin / laminin kaplanmış plakalar ya da üzerinde yetiştirilir. Biz genellikle Matrige kullanınl-plakalar daha çabuk hazırlanan ve düşük maliyetle edilebilir.

  1. Hızlı Matrigel kaplı plakalar hazırlamak çözülmesi ve 24 ml Matrigel, 1 mg donmuş bir kısım tekrar süspansiyon soğuk DMEM / F12 ve hemen iki altı oyuklu plakaların her bir oyuğuna 2 ml dağıtmak için. 37 ° C'de en az 1 saat süreyle inkübe edin.
    NOT: Matrigel sadece kullanımdan hemen önce, yıkanmış değil, aspire edilmesi gerekiyor.
  2. Ikinci günde NPC Yem ve çok yüksek yoğunlukta korumak veya kendiliğinden nöronlara ayırt edecektir.
    NOT: rağmen daha kurulmuş NPC genellikle 1 split: 2 seyrek olarak bir kez her iki haftada: Her hafta 4, çok düşük geçiş NPC 1 bölünebilir.
  3. , Bölme birinci aspirasyon ortam ve 6-çukurlu plaka içinde çukur başına 1 ml sıcak Accutase (1X) ekleyin. 10-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Yavaşça mümkün olduğu kadar az mekanik stres ile DMEM / F12 ihtiva eden bir 15 ml tüp içine müstakil hücreleri aktarın. Enzim ise hücreleri titre etmeyin. Spinni Pelet hücreleri5 dakika boyunca 1000 x g'de ng.
  5. Yıkama aspire ve özgün kuyu başına ~ 1 ml NPC medyada NPC yeniden askıya 6-iyi.
    NOT: 6-iyi bir çanak bir birleşik kuyu 5-10.000.000 hücreleri vardır ki bekleyin; Bu hematositometre önce yeniden kaplama kullanılarak bir hücre 10l kesir hesabıyla doğrulanabilir.
  6. NPC, nöronlar veya neurospheres olarak yeniden süspansiyon, yeniden plakalı NPC'ler ardından. 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu başına yaklaşık 1-2000000 hücreleri plaka, NPC korumak için. neurosphere oluşumu verimliliği deneyleri ve hücre hatları arasında değişir, ancak 200.000 ila 1.000.000 hücre yapışkan olmayan bir 6-yuvalı plaka içinde çukur başına tohumlanır halinde genellikle en iyi ortaya olabilir; neurospheres topaklanma meydana gelirse, tohumlanmış hücrelerinin sayısını azaltabilir. Nöron ortamı ile NPC ortamı yerine 6-çukurlu plaka içinde çukur başına nöronlara ayırt etmek için, plaka yaklaşık olarak 200,000 hücre.
  7. İmmünohistokimyasal her kurulan NPC hattını doğrulamak. Yeterli miktarda hücre malzemesi olmuştur expanNestin ve Sox2 antikorların Değerlendirme aracı, etiket NPC. Onaylı NPC hatları da 4-6 hafta boyunca nöronların içine farklılaştırılmış ve III-tübülinin ve MAP2AB için antikorlar ile etiketlenmiş olmalıdır.
    1. 10 dakika boyunca 4 ° C'de PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde hücreleri saptamak. PBS içinde% 1.0 Triton, 15 dakika boyunca oda sıcaklığında NPC geçirgenliği ve daha sonra 30 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 Triton ile% 5 eşek serumu içinde engeller.
    2. Gece boyunca 4 ° C'de,% 0.1 Triton ile% 5 eşek serumu, birincil antikor ile inkübe edin.
      Not: Aşağıdaki antikorlar tavsiye: keçi anti-Sox2, 1: 200; Fare anti-insan Nestin, 1: 200; tavşan anti-βIII-tübülin, 1: 500; fare anti-βIII-tübülin, 1: 500; fare anti-MAP2AB, 1: 200. (Şekil 2).
    3. Oda sıcaklığında 1-2 saat süre ile,% 0.1 Triton ile% 5 eşek serumu, 300: PBS ile yıkandıktan sonra, 1 ile keçi, fare ya da tavşan uygun konjuge sekonder antikor ile ikincil antikorlar hücreleri inkübe edin. 0.5 ug / ml DAPI (4 'ile çekirdek, leke hücreleri görselleştirmek için6-diamidino-2-fenilindol sonra) ve Vectashield ile monte edin.

4. NPC İletimi

  1. Transfekte edilmiş hücrelerin 21 yüzdesini arttırmak için (1 saat süre ile 1000 x g de virüsün mevcudiyetinde hücre kültür plakalarının santrifüj) spinfection kullanın. NPC medyada seyreltilmiş enfeksiyon istenen çokluğu (genellikle 1-10) (İB), titre aspire medya ve ilgili aşırı ifadesinin (veya kontrol) lentivirüsler (veya retrovirüsler) ile değiştirin. 1.5 mi, 6-çukurlu plaka içinde çukur başına hacmi (ya da doku kültürü plakaları diğer türleri için, uygun bir şekilde ölçekli hacmi) kullanın. 1000 xg'de Spin ve bir plaka santrifüj içinde 1 saat süre ile 37 ° C.
    NOT: İdeal, bölme 1-2 gün içinde lentiviral veya retroviral vektörlerle NPC transduce. Ticari veya laboratuvar hazırlanan virüsleri kullanarak olsun, uygun seri seyreltme ile önceden virüsün toplu titre etmek yararlı olabilir. (Şekil 3).
  2. Cel azaltmak içinlular ölüm, spinfection 8 saat içinde ortam değiştirin.
    Not: Viral birleştirme ve transgen sentezleme raportör gen floresan ile 24 saat içerisinde tespit edilebilir. (Virüs bir floresan muhabiri eksiği varsa, bu değerlendirmek daha zordur; başarılı transfeksiyon iyi ekspresyonu ürünleri için immünoblot, immünohistokimyada veya qPCR tarafından onaylanmış olabilir.) Tam anlatım 3-7 gün sürebilir; Ek virüs tekrar spinfections transfekte hücrelerin yüzdesini arttırmak için gerekli olabilir. Tekrarlayan spinfections günlük oluşabilir ama çok sık olması gerekmez. İdeal olarak, bir flüoresan raportör kullanılıyorsa,> hücrelerin% 80 etiketlenmelidir.

5. Neurosphere değiştirme tahlili

Not: NPC enzimatik ayrışma ardından kendiliğinden Neurospheres bir şekilde, - hücre NPC ortam içinde süspansiyon halinde kültürlenen ise, (NPC genişleme 'de kullanılana benzer bir şekilde tarafından 3,3-3,6 adım).

  1. Kısaca, ayırmak büyümekneurospheres oluşturmak için yapışkan olmayan plakalar içinde 48 saat için NPC ortam d NPC. (Şekil 4).
  2. Neurosphere geçişi için, bir 96-yuvalı plaka içinde, oldukça DMEM daha çekme Neurosphere önce 1-2 saat soğuk NPC ortamı kullanılarak taze Matrigel plakaları hazırlamak. Kuyulardan Matrigel aspire etmeyin.
  3. Ilk olarak, embriyonik kök hücre-türevli neurospheres 22 için yayınlanan gibi, el, selüler artığın ayrılması için NPC medya içinde bir defa yıkandıktan sonra, mikroskop altında NPC türetilmiş neurospheres al. Bir Matrigel kaplı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna, bir neurosphere aktarın.
  4. Her bir 96-çukurlu plaka içindeki neurospheres soğuk NPC bir ortamda seyreltilir, ek olarak 0.5 mg Matrigel ekleyin.
  5. Elle iyi bir pipet ucu kullanarak ortasında her neurosphere merkezi.
    NOT: Bu sonuçlar değişkenliği azaltmak amacıyla, benzer büyüklükte neurospheres almak önemlidir.
  6. Göç 48 saat için ortaya ve daha sonra w hücreleri düzeltmek için izinistenen immünohistokimyasal işaretleri ile i% 4 paraformaldehid ve leke.
  7. Radyal geçiş bunların tamamen 4x objektif mikroskop kullanarak, fotoğraf neurospheres tespit edilmesi gerekebilir. Kuyunun kenarına veya analiz ikinci bir neurosphere temas herhangi neurospheres hariç.
    NOT: göç daha uzun 48 saat oluşursa, ortaya çıkan radyal göç olasılıkla bir 4x objektif kullanarak görüntü çok büyük olacaktır.
  8. NIH ImageJ yazılımı (Şekil 5) kullanılarak her bir neurosphere ortalama geçiş ölçün. Bu aşağıda tarif edilen analiz yöntemleri kullanılarak yapılabilir:
    1. Radyal göç:
      1. El ile daha sonra oluşan şeklin alanını hesaplamak için ölçün (Ctrl + M) işlevini kullanabilirsiniz serbest seçim aracını kullanarak uzak göç hücrelerin kenarına iz. Ölçme önce alan Alanı Analiz sekmesi altında bulunan Set Ölçümleri penceresinde işaretli olduğundan emin olun. KullanAlan ölçümü ve bir çevreye (A = πr 2) alanı için denklem değeri çapındaki (dış) belirlemek gerekmektedir.
      2. Orijinal neurosphere kenarına Trace alanını ölçmek ve aynı şekilde yarıçapı (iç) hesaplayın. Dış ve iç yarıçapı arasındaki fark olarak toplam radyal göç hesaplayın.
    2. Büyük hücresel göç:
      1. Tedbir (Ctrl + M) işlevi, ardından düz çizgi seçim aracını kullanarak iç neurosphere kenarından beş uzak hücrelerinin hareket mesafeyi ölçün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sinir rozet apico-bazal kutupları (Şekil 1) ile nöroepitelyal hücrelerin yuvarlak kümeleri olarak karakteristik görünüşü, bir aydınlık mikroskop kullanarak, morfolojik tespit edilebilir. NPC çok yüksek hücre yoğunluğu tipik olarak kültürlenir rağmen, hemen gerçekleşen pasajlanmasını da sonra biraz piramit şeklinde soma ve bipolar nörit yapısı görülebilir (Şekil 1D) 'dir. III-tubulin boyama NPC bazı oranı sürekli kültür (Şekil 1F) içinde nöronal farklılaşma başlatan belirten, tüm NPC topluluklarında da görülebilir olsa Doğrulanmış NPC, hücrelerin çoğunda Nestin ve Sox2 ifade eder. Örneğin LMX1A ve FOXA2 olarak orta beyin işaretleri (Şekil 1G-I) bileşimleri ise bu Sox2 ve Pax6, ve TBR2 gibi ön beyin nöron progenitörleri, nöral kök hücre, belirteçleri, aynı zamanda, NPC olarak ifade edilmiştir. Büyük ve düz fibroblast benzeri hücrelerin önemli bir kısmı içinde Bir NPC nüfus kalitesiz NPC nöronal farklılaşma (Şekil 2) Aşağıdaki nöronların çok sayıda elde etmek olası olan, oluşturulan edildiğini gösterir.

Flüoresan raportör vektörü (Şekil 3) yer alan bir yüksek titre lentiviral ya da retroviral vektör ile başarılı iletimi takiben, hücreler% 80'den fazla etiketlenmelidir. Neurosphere üretimi normal besleme ile, yaklaşık bir hafta için kültüre sağlıklı kalabilir nispeten homojen bir boyutu neurospheres (Şekil 4), bir popülasyon elde edilmelidir. Neurosphere göç sağlıklı neurospheres (Şekil 5) de sağlam olur ve hiPSC NPC bir neurosphere göç deneyi 1 boyunca hızlı bir farklılaşma tabi tutulur.

Şekil 1,

çadır "> Şekil 1. Hasta özgü hiPSCs, NPC ve Nöronlar. hiPSC nöral farklılaşma aydınlık görüntüler, embriyoid organları (B), nöral rozet (C), NPC (D) ve nöronlara hiPSCs (A), (E) ... 100x, ölçek çubuğu 100 mikron FI hiPSC NPC NPC işaretleyici Nestin (yeşil) ve nöronal belirteç III-tubulin (kırmızı) (F) de dahil olmak üzere ön beyin nöral kök hücre ve nöral progenitör hücre belirteci bir dizi için pozitif; ancak orta beyin belirteçler LMX1A (yeşil) ve FOXA2 (kırmızı) (I) ve ön beyin progenitör işaretleyici TBR2 (kırmızı) (lH); nöral kök hücre transkripsiyon Sox2 (yeşil) ve Pax6 (kırmızı) (G) faktörüdür. DAPI-lekeli çekirdekleri (mavi). 100x, ölçek çubuğu 100 mikron. J. NPC (% 70-80 III-tubulin-pozitif nöronlar (yeşil) ve% 20-30 glial fibriler asidik protein GFA ayırt edebilirP) pozitif astrositler (kırmızı). 200x, ölçek çubuğu 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,

Şekil 2. doğrulanıyor NPC Hatları. Yüksek kalite (sol üst) hiPSC NPC ekspres Nestin (kırmızı) ve Sox2 (yeşil). Sox2-negatif ve Nestin-negatif hücreler (sağda) yamalar var düşük kaliteli (sol alt) NPC ise çoğu hücreleri (DAPI (mavi) ile boyandı çekirdekleri), içinde. Yüksek kaliteli NPC'ler ayırt 4 haftalık nöronlar MAP2AB (yeşil) ve III-tubulin (kırmızı) (sağ üst) ifade, ancak düşük kaliteli NPC ayırt olanlar (sağ alt) yoktur. 100x, ölçek çubuğu 100 mikron. Bir büyük ziyaretinde görmek için buraya tıklayınızBu rakamın rsion.

Şekil 3,

NPC. Aydınlık (üst) Şekil 3. Viral İletimi ve GFP floresan (alt) önce (solda) ve viral spinfection sonra hiPSC NPC görüntüleri. 100x, ölçek çubuğu 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,

Şekil 4. Neurosphere Formasyonu. Yapışık NPC'ler (solda) ve yeni oluşmuş neurospheres (sağda) aydınlık görüntüler. 100x, ölçek çubuğu 100 mikron. LAR görüntülemek için buraya tıklayınızBu rakamın ger versiyonu.

Şekil 5,

5. Neurosphere Göç Şekil. AB. Aydınlık önce neurospheres görüntüleri (A) ve sonra (B) Matrigel göç 48 saat. NIH ImageJ yazılımı kullanılarak radyal sinir göç analiz etmek için metodoloji gösteren 100x, ölçek çubuğu 100 mikron. CG. Ekran yakalama görüntüleri. ImageJ araç çubuğunda 'serbest seçimler' (C) tıklayın. Neurospheres (D) etrafında uzak göç hücrelerin kenarına Trace. Alan Seti Ölçümleri penceresinden (E) işaretli olduğundan emin olun. Tedbir fonksiyonunu (Ctrl + M) (F) kullanın. ((G) orijinal neurospheres kenarını Trace ve Ölçü işlevini kullanınCtrl + M). Ölçümler daha sonra analiz için Excel'e ihraç edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Medya Bileşenler
HES medya DMEM / F12 (Life Technologies # 11330)
% 20 KO-Serum Yedek (Life Technologies # 10828)
1x Glutamax (Life Technologies # 35050)
1x NEAA (Life Technologies # 11140)
1x 2-merkaptoetanol (55 mm 1000x) (Life Technologies # 21985-023)
20 ng / ml, FGF2 (Life Technologies 13256-029)
N2 / B27 ortamı DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
NPC medya DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
20 ng / ml, FGF2 (Life Technologies)
1 mg / ml doğal fare laminin (Life Technologies # 23017-015)
Nöron medya DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
1 mg / ml doğal fare laminin (Life Technologies)
20 ng / ml BDNF (Peprotech 45.0-02)
20 ng / ml, GDNF (Peptrotech # 450-10)
500 ug / ml dibutiril siklik-AMP (Sigma, # D0627)
200 nM L-askorbik asit (Sigma # A0278)

Tablo 1. Medya tarifleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz, NPC içine hiPSCs, bir sinir hücre tipi olan hiPSC türetilmiş nöronların gen imzası önemli bir kısmı korunur ve bu potansiyel hastalık patogenezinde 8 katkıda gelişimsel yollar için bir vekil olarak hizmet edebilir ayırt etmek ile yöntemler tarif etmişlerdir 11. Biz detaylı gibi Ayrıca, NPC biz hastalık yatkınlık moleküler ve biyokimyasal çalışmalar için uygun olabilir inanıyoruz sağlam Replikatif ve kolayca transdük nöral nüfus vardır.

Biz ayırt etmek için ayrıntılı yöntemler ve kültür ön beyin desenli NPC olmasına rağmen, bunlar kolaylıkla diğer hücre kaderi desenli NPC üretmek üzere adapte edilebilir. Örneğin, yüzen EBS ilk NPC ortam genişletilmiş ve 20 ng ile takviye edilmiş nöronal ortamda ayırt edilebilir, 0.5 mg / ml DKK1'in, 10mM SB431542, 0.5 mg / ml'lik Noggin ve hipokampal NPC oluşturulur, 1 mM Cyclopamine ile muamele edilir, eğer / ml WNT3A 7 12,23 nöronlar. En alt tip spesifik nöronal farklılaşma protokolleri NESTIN- üzerinden devam ve Sox2-positve ara, biz benzer yöntemler GABAergic- 2,24 için uyarlanabilir ve 3,25,26 özel NPC popülasyonlarını glutamatergic- olabileceğini tahmin göz önüne alındığında.

Fazlalaştı protokol kapsamında birçok kritik adımlar vardır. Aşırı ifade veya endojen gen ifadesini aşağı vurma, bu gazetecilere değişken boyutlarda vektörleri gelen ifade edildiğinde biz çiçek açma önemli farklılıklar gözlenmiştir gibi, aynı viral omurgasından bir floresan proteini ifade eden bir kontrol vektörü kullanmak en iyisidir Öncelikle, (nedeniyle azalmış ambalaj verimvektör boyutu ile) ya da fark hızlandırıcılar (promotör verimlilik farklılıkları) nedeniyle ile. İkincisi, biz yoğun neurosphere yapısına viral vektörlerin kötü penetrasyonun gözlemledim gibi viral transdüksiyon öncesinde, oluşumunu Neurosphere için tamamlamanızı tavsiye ederiz. Üçüncü olarak, geçit on ötesinde NPC artar geçiş sayısı, sık sık neurosphere deneyinde büyük ölçüde bozulmuş göç gözlemlemek. Aslında, geçit ile astrosit daha büyük bir yüzdesini elde etmek için NPC eğilimi göz önüne alındığında, her bir deney NPC hatları geçişini eşleştirmek için çok önemlidir.

Son olarak, tarif edilen tekniklerden biyolojik ve teknik sınırlamaları dikkate alınması önemlidir. NPC göz morfolojik olarak benzer olduğu halde, glutamaterjik ve GABAerjik nöronlar hem üretme kabiliyetine sahip olan hücreleri içeren bir heterojen bir gruptur. Bu metho kullanarak bireyler arasında NPC hatları oldukça tutarlı ön beyin desenlendirme izlerkend 1, bu yalnızca tam valide yüksek kaliteli NPC hatları karşılaştıran - İyi ve kötü kaliteli NPC hatları arasında önemli farklılıklar vardır. Ayrıca, viral transdüksiyon verimi genetik olarak heterojen hücreler, benzersiz bir genomik yerde viral vektör bir entegrasyon ile her; Bu nedenle, tek tek hücreler, genomik entegrasyon sitelerinden konumu ve sayısı hem de değişecektir. Genetik manipülasyon o çinko parmak, Talen veya CRISPR-tabanlı stratejilerle oluşup, kesin ve tanımlanmış bir konuma hedeflenen zaman gen ifadesi daha tutarlı değişimler her zaman ortaya çıkar.

Hasta hiPSC türetilmiş NPC nörolojik hastalıkta meydana gelen genel gen sentezleme karışıklık ve sağlıklı veya hastalıklı bir hastada elde edilen nöronal hücrelerin ya da bağlamında aday genleri veya microRNA manipüle moleküler ve / veya hücresel etkileri, hem çalışma için kullanılabilir. Bu şekilde, sonuçları bir veya daha fazla anahtar manipüleRisk alel (ler), çeşitli genetik geçmişlerde bağlamında tanımlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brennand, K., et al. Phenotypic differences in hiPSC NPCs derived from patients with schizophrenia. Mol Psychiatry. (2014).
  2. Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12, 573-586 (2013).
  3. Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 12770-12775 (2012).
  4. Hashimoto-Torii, K., et al. Roles of heat shock factor 1 in neuronal response to fetal environmental risks and its relevance to brain disorders. Neuron. 82, 560-572 (2014).
  5. Robicsek, O., et al. Abnormal neuronal differentiation and mitochondrial dysfunction in hair follicle-derived induced pluripotent stem cells of schizophrenia patients. Mol Psychiatry. 18, (10), 1067-1076 (2013).
  6. Paulsen, B. D., et al. Altered oxygen metabolism associated to neurogenesis of induced pluripotent stem cells derived from a schizophrenic patient. Cell Transplant. 21, (7), 1547-1559 (2012).
  7. Yu, D. X., et al. Modeling hippocampal neurogenesis using human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2, 295-310 (2014).
  8. Brennand, K. J., et al. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature. 473, (7346), 221-225 (2011).
  9. Wen, Z., et al. Synaptic dysregulation in a human iPS cell model of mental disorders. Nature. (2014).
  10. Zhang, L., Song, X., Mohri, Y., Qiao, L. Role pf Inflammation and Tumor Microenvironment in the Development of Gastrointestinal Cancers: What Induced Pluripotent Stem Cells Can Do. Current stem cell research & therapy. (2014).
  11. An, M. C., et al. Genetic Correction of Huntington's Disease Phenotypes in Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 11, (2), 253-263 (2012).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  14. Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143, 527-539 (2010).
  15. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PLoS One. 4, e7630 (2009).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  17. Cowan, C. A., et al. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350, 1353-1356 (2004).
  18. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
  19. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460, 1127-1131 (2009).
  20. Xia, G., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells to model spinocerebellar ataxia type 2 in vitro. Journal of molecular neuroscience : MN. 51, 237-248 (2013).
  21. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).
  22. Delaloy, C., et al. MicroRNA-9 coordinates proliferation and migration of human embryonic stem cell-derived neural progenitors. Cell Stem Cell. 6, 323-335 (2010).
  23. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480, 547-551 (2011).
  24. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  25. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15, 477-486 (2012).
  26. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77, 440-456 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics