Un guide pour générer et utiliser hiPSC PNJ dérivés pour l'étude des maladies neurologiques

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Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (96), e52495, doi:10.3791/52495 (2015).

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Abstract

Introduction

des études d'expression génique de neurones différenciés in vitro à partir de cellules souches pluripotentes d'origine humaine (les) hiPSCs par nous et d'autres 1 2,3 indiquent que les neurones hiPSC ressemblent foetal plutôt que le tissu cérébral adulte. À l'heure actuelle, les modèles fondés sur hiPSC peuvent être plus appropriées pour l'étude de prédisposition à, plutôt que de caractéristiques tardive de la maladie neurologique. Nous avons précédemment rapporté que une fraction significative de la signature de gène de neurones hiPSC dérivé schizophrénie est conservée dans les cellules de la schizophrénie de hiPSC dérivé progénitrices neurales (CNP), indiquant que CPN peut être un type cellulaire utile pour étudier les mécanismes moléculaires qui contribue à la schizophrénie 1 . Nous et d'autres avons signalé la migration aberrante, augmentation du stress oxydatif et les espèces réactives de l'oxygène, la sensibilité à la sous-seuil stress environnementaux et la fonction mitochondriale altérée dans la schizophrénie hiPSC PNJ 1,4-6, ainsi qu'une diminution de c neuronaleonnectivit é et la fonction synaptique dans les neurones de la schizophrénie hiPSC 5,7-10. Si les facteurs moléculaires contribuent à la migration aberrante et / ou le stress oxydatif dans la schizophrénie hiPSC PNJ sous-tendent également la connectivité neuronale réduite dans les neurones hiPSC dérivés schizophrénie, PNJ pourraient être une population de neurones robuste et très réplicative avec lequel pour étudier les mécanismes responsables de la maladie. En outre, parce que l'on peut générer rapidement un grand nombre de cellules et ne doivent pas attendre des semaines ou des mois pour la maturation neuronale, tests basés sur PNJ sont adaptés pour l'étude de cohortes de patients plus importants et sont plus disposés à criblage à haut débit. Nous croyons que hiPSC PNJ peut servir comme un proxy pour les voies de développement susceptibles de contribuer à la pathogenèse de la maladie, comme cela a déjà été démontré dans de troubles aussi divers que la schizophrénie 1 et la maladie de Huntington 11.

Pour différencier les PNJ de se hiPSCs, neurale initialela production est réalisée par double inhibition SMAD (0,1 mM et 10 mM LDN193189 SB431542) 12. En se opposant BMP et TGF signalisation avec ces petites molécules, l'endoderme et du mésoderme spécification est bloquée, ce qui accélère la différenciation neuronale et conduisant à la formation de rosettes de neurones visibles dans la semaine de placage. Neural motif se produit au début de ce processus, probablement au cours de la période de la formation de rosettes de neurones et immédiatement après. En l'absence d'autres indices, ces cellules nerveuses primitives supposent un cerveau antérieur comme le destin antérieure-13. Immédiatement après la formation de rosettes de neurones, et continue tout au long de l'expansion de l'APN, PNJ cerveau antérieur sont cultivées avec FGF2 8,14. Ils ont le potentiel de la lignée double et peuvent être différenciés aux populations de neurones de 70-80% neurones III-tubuline-positifs et de 20 à 30% protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) astrocytes -positifs (Figure 1). La majorité des neurones du cerveau antérieur hiPSC sont VGLUT1 positif, Et sont donc vraisemblablement glutamatergique, même si environ 30% des neurones sont GAD67 positif (GABAergique) 8.

PNJ sont régulièrement soumises à des passages plus de dix fois in vitro, tout en maintenant des profils de différenciation cohérentes et sans accumuler des anomalies du caryotype. Groupes ont rapporté PNJ de passages plus de 40 fois 15, cependant, nous constatons que plus de dix passages, PNJ montrent propension accrue à la différenciation des astrocytes. PNJ bien tolérer plusieurs gel-dégel et peut être la transition de croître comme neurosphères simplement en culture dans des plaques non-adhérentes. PNJ sont efficacement transduites par des vecteurs viraux, permettant l'évaluation rapide des conséquences moléculaires et cellulaires de la perturbation génétique et facilement extensible pour obtenir suffisamment de matériel pour les études biochimiques. En outre, en raison des vecteurs viraux permettent robuste sur-expression et / ou inactivation de gènes responsables de maladies concerné, soit le contrôle ou le patient dérivée neural cellules, on peut utiliser cette plateforme pour tester l'effet de fond génétique sur ces manipulations. Bien que ne convient pas pour synaptique ou tests basés sur les activités nécessitant neurones matures, PNJ peut être une alternative pratique pour de nombreuses analyses moléculaires ou biochimiques simples de cellules neurales provenant de patients.

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Protocol

1. hiPSC différenciation de cellules progénitrices neurales

  1. Grandir et se développer hiPSCs dans les cellules souches embryonnaires humaines (HES) médias (tableau 1) co-cultivées sur une fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) de couche d'alimentation jusqu'à ce que les grandes (mais subconfluentes) colonies sont prêts pour la différenciation neuronale via un corps embryoïdes (EB) intermédiaire (Figure 2). Conditions de culture de routine hiPSC sont bien décrits ailleurs 16,17; brièvement, grandir hiPSCs dans les médias HES sur une couche nourricière MEF jusqu'à la confluence, puis le passage par voie enzymatique avec de la collagénase (1 mg / ml dans DMEM) et étendre environ 1: 3 tous les 7 jours.
  2. Pour préparer des plaques revêtues de poly-L-ornithine / laminine, des plaques de revêtement de 10 g / ml de poly-L-ornithine dans de l'eau stérile pour les surfaces en plastique (50 g / ml pour les surfaces de verre) et incuber à température ambiante pendant 3-24 heures. Laver au moins une fois avec de l'eau stérile, puis enrober de 5g / ml laminine dans du PBS stérile à température ambiante pendant 3 à 24 h.
    NOTE: Si enveloppés dans du plastique, les plaques peuvent êtrestockée jusqu'à six mois à -20 ºC.
  3. Le Jour 1, soulevez enzymatique hiPSCs subconfluentes (généralement cultivées sur des MEF, ou hiPSCs cultivés dans des milieux définis tels que REET 18 sur Matrigel) de la plaque que les grandes colonies en utilisant 1 mg / ml collagénase IV dans du DMEM / F12.
    NOTE: Après 1-2 heures d'incubation à 37 ° C, les colonies sera flottant dans le plat.
  4. Lavez délicatement colonies hiPSC (par décantation, la centrifugation pas) 1-2x avec DMEM / F12, remettre en suspension dans 2 ml / puits de N2 / médias B27 (tableau 1) et le transfert aux plats non adhérent 6 puits (combiner trois puits dans une eh bien) 19.
    REMARQUE: Pendant la nuit, les colonies formeront flottants grappes sphériques appelé «corps embryoïdes" (EbS). Attendez-vous à une mort cellulaire importante.
  5. Le Jour 2, les plaques d'inclinaison et de permettre de régler EB. Retirez délicatement les médias et laver une fois avec DMEM / F12 pour enlever les débris. Nourrissez-le avec N2 / B27 milieux supplémentés avec des inhibiteurs SMAD double (0,1 M LDN193189 et 10M SB431542) 12
  6. Sur Jours 3-7, neuralisation se produira dans le cadre de la double inhibition SMAD; vérifier que EB sont ronds mais pas kystique. EB nourrir tous les deux jours avec les médias N2 / B27 complété avec 0,1 M LDN193189 et 10M SB431542.
  7. Sur Jours 7-14, à la suite du dépôt EBS pour Poly-L-ornithine / laminine plaques revêtues, consultez l'aide d'un microscope à fond clair que rosettes neurones commencent à apparaître dans quelques jours (caractérisé comme des grappes de cellules rondes neuroépithéliales avec apico-basale polarité; figure 1). Continuer à alimenter EB adhérentes chaque seconde de jour avec N2 / B27 médias complété avec 0,1 M de LDN193189, 10M SB431542 et 1 g / ml laminine.

2. Récolte de Neural rosettes

NOTE: Nous recommandons que rosettes neuronaux être récoltées en utilisant enzymatique Réactif de Sélection Neural Rosette 20 ou réactif de sélection similaire. Bien rosettes de neurones peuvent être récoltés manuellement dans 6 puits Poly-L-ornithine / laminine plaque revêtue, this méthodologie prend une formation approfondie pour maître, et, en fonction de l'utilisateur compétences, peuvent nécessiter un second tour de la cueillette à jour 20 pour enrichir encore plus pour les PNJ et épuiser types de cellules non-neuronales.

  1. Pour la sélection enzymatique de rosettes de neurones au jour 14, les médias aspirer de EB adhéré et ajouter 1 ml de neurones réactif de sélection de la rosette par puits pour une plaque à 6 puits. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
  2. Avec un Pipetman P1000, retirez délicatement enzyme de chaque puits. Ajouter 1 ml de DMEM / F12 par puits pour se laver.
  3. Avec un P1000, recueillir les 1 ml de DMEM / F12 et rapidement expulser le DMEM / F12 dans le puits, détachant ainsi les rosettes de la plaque. Recueillir les rosettes dans un tube de faucon.
  4. Pipet encore 1 ml de DMEM / F12 et rapidement expulser dans le même puits pour détacher rosettes restants. (Ne pas triturer. Essayez de ne pas casser les agrégats de la rosette). Recueillir les rosettes de neurones dans un même tube de faucon.
  5. Répétez l'étape 2.4 si nécessaire. Si rosettes ne se détachent pas facilement, ajouter more enzyme et répétez le processus (étapes 2.1 à 2.4)
  6. Spin cellules à 300 g pendant 3 min. Aspirer le lavage, et remettre en suspension dans 2 ml rosettes des médias PNJ (tableau 1). cellules de transfert (1: 1) dans un poly-L-ornithine / laminine revêtus 6 plaque bien.
  7. De 15 à 21 jours, les rosettes de neurones augmenteront; rosettes d'alimentation à chaque seconde de jour avec le PNJ médias.
  8. Évaluer la qualité des rosettes de neurones et de se assurer que les cellules de fibroblastes plats ne se développent pas dans la culture.
    NOTE: Si les non-rosettes persistent, la culture PNJ peut parfois être récupéré par cueillette manuelle, en sélectionnant seulement le meilleur des rosettes cueillies dans Accutase. Dissocier 15 min à 37 ° C. Pellet, laver et plaque dans PNJ support sur 24 puits Poly-L-ornithine / laminine plaque revêtue.

3. expansion des cellules progénitrices neurales

Remarque: NPC hiPSC peut être cultivé sur navigateur Matrigel- ou poly-L-ornithine / laminine plaques revêtues. Nous utilisons généralement MatrigeL-plats, car ils peuvent être préparés plus rapidement et à moindre coût.

  1. Pour préparer des plaques enduites de Matrigel, décongeler rapidement et remettre en suspension une portion aliquote congelée de 1 mg dans 24 ml de Matrigel froid DMEM / F12 et distribuer immédiatement 2 ml à chaque puits de deux plaques à six puits. Incuber pendant au moins 1 heure à 37 ºC.
    NOTE: Matrigel a seulement besoin d'être aspiré, pas lavé, immédiatement avant l'utilisation.
  2. Nourrir PNJ tous les deux jours et maintenir à très haute densité ou ils spontanément se différencier pour les neurones.
    REMARQUE: Bien que les PNJ plus établis sont généralement divisées 1: 4 chaque semaine, les PNJ de passage très faibles peuvent être répartis 1: 2 comme peu souvent qu'une fois toutes les deux semaines.
  3. Pour diviser, premier média aspirer et ajouter 1 ml chaude Accutase (1X) par puits de plaque de 6 puits. Incuber à 37 ° C pendant 10-15 min.
  4. Transférer en douceur les cellules individuelles dans un tube de 15 ml contenant du DMEM / F12 avec aussi peu de contraintes mécaniques que possible. Ne pas titrer cellules tout en enzyme. Cellules granules par Spinning à 1000 g pendant 5 min.
  5. Aspirer le lavage, et remettre en suspension les PNJ dans ~ 1 ml PNJ médias par puits original de 6 puits.
    REMARQUE: Attendez que le puits de confluence d'un plat à 6 puits a 5-10000000 cellules; Ceci peut être confirmé par le comptage d'un aliquote de 10 litres de cellules en utilisant un hémocytomètre avant de re-placage.
  6. Après remise en suspension, PNJ re-plaque comme PNJ, ou neurones neurosphères. Pour maintenir PNJ, la plaque d'environ 1-2 millions de cellules par puits d'une plaque à 6 puits. L'efficacité de la formation de neurosphères peut varier entre les expériences et les lignées cellulaires, mais se produit généralement préférable que entre 200.000 et 1.000.000 cellules sont ensemencées par puits d'une plaque à 6 puits non adhérente; si l'agglutination des neurosphères se produit, réduire le nombre de cellules ensemencées. Pour différencier les neurones, plaque environ 200 000 cellules par puits d'une plaque à 6 puits, remplaçant médias NPC avec les médias neurone.
  7. Immunohistochimique valider chaque ligne PNJ établie. Une fois que suffisamment de matériel cellulaire a été expanDED, des PNJ d'étiquettes avec des anticorps pour la nestine et SOX2. Validé lignes PNJ devraient également être différenciées en neurones pendant 4-6 semaines, et marquées avec des anticorps pour III-tubuline et MAP2AB.
    1. Fixer les cellules dans 4% de paraformaldehyde dans du PBS à 4 ° C pendant 10 min. Perméabiliser PNJ à température ambiante pendant 15 min dans 1,0% de Triton dans du PBS, puis bloquer dans le sérum de l'âne de 5% avec 0,1% de Triton à température ambiante pendant 30 min.
    2. Incuber avec l'anticorps primaire dans le sérum de l'âne de 5% avec 0,1% de Triton, une nuit à 4 ° C.
      NOTE: Nous vous recommandons les anticorps suivants: chèvre anti-Sox2, 1: 200; de souris anti-nestine humaine, 1: 200; de lapin anti-BIII-tubuline, 1: 500; anti-BIII-tubuline de souris, 1: 500; anti-MAP2AB souris, 1: 200. (Figure 2).
    3. Après un lavage avec du PBS, les cellules incuber des anticorps secondaires avec l'anticorps secondaire approprié conjugué à de chèvre, de souris ou de lapin à 1: 300, en en 5% de sérum de âne avec 0,1% de Triton pendant 1-2 heures à température ambiante. Pour visualiser les noyaux, les cellules de coloration avec 0,5 ug / ml de DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole) puis monter avec Vectashield.

4. PNJ transduction

  1. Utilisation spinfection (centrifugation de plaques de culture de cellules en présence de virus à 1000 x g pendant 1 heure) pour augmenter le pourcentage de cellules transfectées 21. Aspirer le milieu et remplacer par la surexpression pertinentes (ou de contrôle) ou lentivirus (rétrovirus), titrés à la multiplicité désirée d'infection (MOI) (typiquement 1-10), diluée dans les médias NPC. Utiliser 1,5 ml de volume par puits d'une plaque à 6 puits (ou un volume à l'échelle appropriée pour d'autres types de plaques de culture de tissus). Spin à 1000 xg et 37 ºC pendant 1 heure dans une centrifugeuse de la plaque.
    REMARQUE: Idéalement, la transduction PNJ avec lentiviral ou vecteurs rétroviraux dans les 1-2 jours de fractionnement. Que l'on utilise des virus commerciales ou préparés en laboratoire, il peut être utile pour titrer appropriée lots de virus à l'avance par dilution en série. (Figure 3).
  2. Pour réduire cellular mort, remplacer le support dans les 8 h de spinfection.
    REMARQUE: l'intégration virale et l'expression du transgène doit être détectable dans les 24 heures par fluorescence d'un gène rapporteur. (Si le virus manque d'un rapporteur fluorescent, ce est plus difficile à évaluer; transfection réussie peut être mieux validée par immunoblot, immunohistochimie ou qPCR pour les produits de surexpression.) Pleine expression peut prendre 3-7 jours; spinfections répétés avec le virus supplémentaires peuvent être nécessaires pour augmenter le pourcentage de cellules transfectées. Spinfections récurrentes peuvent se produisent quotidiennement, mais pas besoin d'être si fréquent. Idéalement, si vous utilisez un rapporteur fluorescent,> 80% des cellules doit être étiqueté.

5. Migration Neurosphère Assay

REMARQUE: Neurosphères forme spontanément, suite à la dissociation enzymatique de PNJ (par une manière identique à celle utilisée dans l'expansion PNJ - étapes 3/3 à 3/6), si les cellules sont cultivées en suspension dans PNJ médias.

  1. Brièvement, grandir dissocierPNJ dans les médias d NPC pour 48 h dans des plaques non adhérentes afin de générer neurosphères. (Figure 4).
  2. Pour la migration de neurosphère, préparer des plaques Matrigel frais en utilisant les médias NPC froid, plutôt que DMEM, dans une plaque de 96 puits, 1-2 heures avant neurosphère cueillette. Ne pas aspirer les puits de Matrigel.
  3. Tel que publié pour souches embryonnaires neurosphères dérivées de cellules 22, choisissez manuellement neurosphères NPC dérivés sous un microscope, après avoir lavé une fois dans les médias NPC pour éliminer les débris cellulaires. Transférer une neurosphère à chaque puits d'une plaque de 96 puits Matrigel revêtu.
  4. Ajouter un montant supplémentaire de 0,5 mg Matrigel, dilué dans les médias NPC froides, les neurosphères dans chaque plaque de 96 puits.
  5. Centrer manuellement chaque neurosphère individuelle au milieu du puits en utilisant une pipette.
    NOTE: Il est important de choisir neurosphères de taille similaire, afin de réduire la variabilité dans les résultats.
  6. Permettre la migration de se produire pendant 48 heures et ensuite fixer les cellules wième paraformaldéhyde 4% et les taches avec des marqueurs immunohistochimiques souhaités.
  7. Si la migration radiale doit être déterminée, neurosphères de photographie dans leur entièrement en utilisant un objectif 4x microscope. Exclure des neurosphères en contact avec le bord du puits ou une seconde neurosphères à partir de l'analyse.
    NOTE: Si la migration se produit pendant plus de 48 heures, la migration radiale résultante sera probablement trop grand pour l'image en utilisant un objectif 4x.
  8. Mesurer la migration moyenne de chaque neurosphère l'aide du logiciel NIH ImageJ (figure 5). Ceci peut être réalisé en utilisant l'une des méthodes d'analyse décrites ci-dessous:
    1. La migration Radial:
      1. Tracer manuellement le bord des cellules les plus éloignées de la migration à l'aide de l'outil de sélection à main levée puis utilisez la fonction (Ctrl + M) Mesure pour calculer l'aire de la forme obtenue. Avant de mesurer la zone assurez-vous que la région est cochée dans la fenêtre Définir les mesures trouve sous l'onglet Analyser. Utilisez leLa valeur de la mesure de surface et l'équation de la surface d'un cercle (A = πr 2) pour déterminer le rayon (externe).
      2. Tracer le bord de la neurosphère origine, mesurer la surface et de calculer le rayon (intérieure) de la même manière. Calculer la migration radiale totale comme étant la différence entre les rayons externe et interne.
    2. Greatest migration cellulaire:
      1. Mesurer la distance parcourue des cinq cellules les plus éloignées du bord de la neurosphère intérieure en utilisant l'outil de sélection en ligne droite suivie par la fonction (Ctrl + M) Mesure.

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Representative Results

Rosettes de neurones peuvent être identifiées morphologiquement en utilisant un microscope à fond clair, par leur aspect caractéristique en tant que clusters de cellules neuro-épithéliales rondes avec polarité apico-basale (Figure 1). Bien que les PNJ sont généralement cultivées à très haute densité cellulaire, immédiatement après repiquage, légèrement soma forme pyramidale et la structure bipolaire neurites est visible (figure 1D). PNJ validées expriment la nestine et SOX2 dans la majorité des cellules, si III-tubuline coloration est également visible dans toutes les populations NPC, indiquant qu'une partie des PNJ sont constamment initie la différenciation neuronale dans la culture (figure 1F). Les marqueurs de cellules souches neurales, comme PAX6 et SOX2, du cerveau antérieur et de progéniteurs neuronaux, tels que TBR2, sont également exprimés dans NPC, alors que des marqueurs tels que Lmx1a mésencéphale et ne sont pas FOXA2 (figure 1G-I). Une proportion importante de cellules larges et plats dans les fibroblastes une population NPC indique que les PNJ de mauvaise qualité ont été générés, qui sont peu susceptibles de rapporter un grand nombre de neurones suivants différenciation neuronale (Figure 2).

Après transduction succès avec un lentivirus titre élevé ou vecteur rétroviral, plus de 80% des cellules doit être étiqueté par le rapporteur fluorescent inclus dans le vecteur (Figure 3). Neurosphère génération devrait donner une population de neurosphères de taille relativement homogène (figure 4), qui, avec une alimentation régulière, peuvent rester en bonne santé dans la culture pendant environ une semaine. La migration Neurosphère produit robuste en neurosphères sains (Figure 5), et les PNJ hiPSC subir différenciation rapide au cours d'une migration test de neurosphère 1.

Figure 1

tente "> Figure 1. spécifique au patient hiPSCs, des PNJ et les neurones. images fond clair de hiPSC différenciation neurale, de hiPSCs (A), à corps embryoïdes (B), rosettes neural (C), les PNJ (D) et les neurones (E) ... 100x, barres d'échelle 100 um FI hiPSC PNJ sont positifs pour un certain nombre de cerveau antérieur de neurones cellules souches et le marqueur de cellules souches neurales, y compris le marqueur nestine PNJ (vert) et le marqueur neuronal III-tubuline (rouge) (F); la transcription de la cellule souche neurale facteurs SOX2 (vert) et PAX6 (rouge) (G) et le TBR2 marqueur cerveau antérieur progénitrices (rouge) (H), mais pas les marqueurs mésencéphale Lmx1a (vert) et FOXA2 (rouge) (I). noyaux DAPI colorées (bleu). 100x, barre d'échelle de 100 um. J. PNJ peuvent se différencier à 70-80% neurones III-tubuline-positive (vert) et de 20 à 30% protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) -positif des astrocytes (en rouge). 200x, barre d'échelle de 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2

Figure 2. Valider NPC Lines. De haute qualité (en haut à gauche) hiPSC PNJ Nestin express (rouge) et SOX2 (vert). dans la plupart des cellules (noyaux colorés avec du DAPI (bleu)), alors qu'une faible qualité (à gauche en bas) PNJ ont des taches de cellules SOX2-négatifs et Nestin négatif (à droite). 4 semaines vieux neurones différenciés des PNJ de haute qualité expriment MAP2AB (vert) et III-tubuline (rouge) (en haut à droite), mais ceux qui sont différenciés des PNJ de faible qualité ne le font pas (en bas à droite). 100x, barre d'échelle de 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Figure 3

Figure 3. transduction virale de PNJ. Brightfield (en haut) et la GFP fluorescente (en bas) images de hiPSC PNJ avant (à gauche) et après spinfection virale. 100x, barre d'échelle de 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4

Figure 4. Formation Neurosphère. Images fond clair de PNJ adhérentes (à gauche) et neurosphères nouvellement formés (à droite). 100x, barre d'échelle de 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une larversion ger de ce chiffre.

Figure 5

Figure 5. Neurosphère migrations. AB. Images fond clair de neurosphères avant (A) et (B) après 48 heures de la migration dans le Matrigel. 100x, barre d'échelle de 100 um. CG. Images de capture d'écran montrant la méthodologie d'analyse la migration neuronale radiale en utilisant le logiciel NIH ImageJ. Cliquez sur 'sélections à main levée »sur la barre d'outils ImageJ (C). Tracez le bord des cellules plus loin migré autour des neurosphères (D). Assurez-vous que la région est cochée dans la fenêtre Définir les mesures (E). Utilisez la fonction de mesure (Ctrl + M) (F). Tracez le bord des neurosphères originaux (G) et utiliser la fonction de mesure (Ctrl + M). Les mesures peuvent ensuite être exportées vers Excel pour l'analyse. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Médias Composants
Médias HES DMEM / F12 (Life Technologies # 11330)
20% KO-Sérum remplacement (Life Technologies # 10828)
1x Glutamax (Life Technologies # 35050)
1x NEAA (Life Technologies # 11140)
1x 2-mercaptoéthanol (55mM 1000x) (Life Technologies # 21985-023)
20 ng / ml FGF2 (Life Technologies 13256-029)
Médias N2 / B27 DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
Médias NPC DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
20 FGF2 ng / ml (Life Technologies)
1 mg / ml naturel souris laminine (Life Technologies # 23017-015)
Médias Neuron DMEM / F12 (Life Technologies # 10565)
1x N2 (Life Technologies # 17502-048)
1x B27-RA (Life Technologies # 12587-010)
1 mg / ml naturel souris laminine (Life Technologies)
20 ng / ml de BDNF (Peprotech # 450-02)
20 ng / ml GDNF (Peptrotech # 450-10)
500 pg / ml dibutyryl AMP cyclique (Sigma # D0627)
200 nM d'acide L-ascorbique (Sigma # A0278)

Tableau 1. médias recettes.

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Discussion

Nous avons décrit les méthodes permettant de différencier hiPSCs dans PNJ, un type de cellules neurales dans laquelle une fraction importante de la signature génétique des neurones hiPSC dérivés est conservée et que peuvent servir comme un proxy pour les voies de développement susceptibles de contribuer à la maladie pathogenèse 8, 11. En outre, comme nous l'avons précisé, les PNJ sont une population de neurones robuste réplicative et facilement transduites, qui nous croyons peut être approprié pour les études moléculaires et biochimiques de la prédisposition à la maladie.

Bien que nous ayons des méthodes détaillées pour différencier et culture PNJ du cerveau antérieur à motifs, ils peuvent être facilement adaptés pour générer PNJ motifs à d'autres destins cellulaires. Par exemple, si EB flottantes sont d'abord traités avec 0,5 mg / ml DKK1, mM SB431542 10, 0,5 mg / ml et Noggin cyclopamine 1 mM, l'hippocampe PNJ seront générés qui peut être étendue dans les médias NPC et différencié dans les médias neuronales supplémenté avec 20 ng / 7 ml Wnt3a 12,23 neurones. Étant donné que les protocoles de différenciation neuronales spécifiques du sous-type plus procéder via un NESTIN- et SOX2-positve intermédiaire, nous prévoyons que des méthodes similaires peuvent être adaptable pour GABAergic- 2,24 et glutamatergic- 3,25,26 populations NPC spécifiques.

Il ya plusieurs étapes critiques dans le protocole à noter. Premièrement, si, il est préférable surexprimant ou abattre expression du gène endogène d'utiliser un vecteur témoin exprimant une protéine fluorescente de la même squelette viral, comme nous l'avons observé des différences substantielles dans floraison lorsque les journalistes sont exprimés à partir de vecteurs de tailles variables (en raison de diminution de l'efficacité d'emballageavec la taille de vecteur) ou avec des promoteurs de différence (en raison de différences d'efficacité du promoteur). Deuxièmement, nous proposons de terminer transduction virale avant neurosphère formation, comme nous l'avons observé pauvres pénétrance de vecteurs viraux dans la structure de neurosphère dense. Troisièmement, comme le nombre de passage des PNJ augmente au-delà de dix passage, nous observons souvent altérée sensiblement la migration dans le dosage de neurosphère. En fait, étant donné la propension des PNJ pour obtenir un plus grand pourcentage des astrocytes avec passage, il est crucial de faire correspondre le passage des lignes NPC dans chaque expérience.

Enfin, il est important de tenir compte des limites biologiques et techniques des techniques décrites. Bien NPC semblent être morphologiquement similaires à l'oeil nu, ils constituent une population hétérogène constituée de cellules capables de générer à la fois glutamatergique et les neurones GABAergiques. Alors que nous observons remarquablement cohérent cerveau antérieur motifs de lignes NPC entre les individus utilisant cette méthod 1, ce ne est que lorsque l'on compare les lignes de NPC entièrement validées de haute qualité - il existe des différences substantielles entre les bonnes et les mauvaises lignes NPC de qualité. En outre, le rendement de transduction des cellules virales génétiquement hétérogènes, chacun avec une intégration du vecteur viral à un emplacement génomique unique, par conséquent, les cellules individuelles peuvent varier à la fois à l'emplacement et le nombre de sites d'intégration génomique. Des changements plus cohérentes dans l'expression des gènes seront toujours se produire lorsque la manipulation génétique est destiné à un endroit précis et défini, si elle se produit par le doigt de zinc, TALEN ou stratégies fondées CRISPR.

HiPSC dérivé NPC patient peuvent être utilisés pour étudier à la fois les perturbations de l'expression des gènes globaux qui se produisent dans les maladies neurologiques ainsi que les effets moléculaires et / ou cellulaires de la manipulation de gènes candidats ou des micro-ARN dans le cadre de l'utilisation de cellules neurales saines ou malades provenant de patients. De cette manière, les conséquences de la manipulation d'un ou plusieurs cléallèle (s) de risque peut être caractérisée dans le cadre de diverses origines génétiques.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Life Technologies #11330 for HES media
DMEM/F12 Life Technologies #10565 for neural media
KO-Serum Replacement Life Technologies #10828 Needs to be lot tested
Glutamax Life Technologies #35050
NEAA Life Technologies  #11140
N2 Life Technologies  #17502-048 Needs to be lot tested
B27-RA Life Technologies  #12587-010 Needs to be lot tested
FGF2 Life Technologies #13256-029 Resuspend in PBS + 1% BSA
LDN193189 Stemgent #04-0074
SB431542 Stemgent #04-0010
BDNF Peprotech #450-02 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
GDNF  Peprotech  #450-10 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
Dibutyryl cyclic-AMP Sigma  #D0627 Resuspend in PBS + 0.1% BSA
L-ascorbic acid Sigma #A0278 Resuspend in H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent Stemcell Technologies  #05832
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104
Collagenase IV Life Technologies #17104019
CF1 mEFs Millipore #PMEF-CF
Poly-L-Ornithine Sigma P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg Life Technologies #23017-015
BD Matrigel BD #354230 Resuspend on ice in cold DMEM at 10 mg/ml, use 1 mg per two 6-well plate equivalent
Tissue culture treated 6-well plates Corning 3506
Ultra low attachment 6-well plates Corning 3471
goat anti-Sox2  Santa Cruz sc­17320 use at 1:200
mouse anti-human Nestin Millipore MAB5326 use at 1:200
rabbit anti-βIII-tubulin Covance PRB­435P use at 1:500
mouse anti-βIII-tubulin Covance MMS­435P use at 1:500
mouse anti-MAP2AB Sigma M1406 use at 1:200
Plate centrifuge Beckman Coulter Beckman Coulter Allegra X-14 (with SX4750 plate carrier)

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References

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