التباين التصوير في أجنة الفئران عن طريق الموجات فوق الصوتية عالية التردد

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لحقن الموجات فوق الصوتية وكلاء microbubble التباين في المعيشة، معزولة في وقت متأخر من الحمل أجنة الفئران المرحلة. تمكن هذه الطريقة دراسة المعلمات نضح والواسمات الجزيئية الأوعية الدموية داخل الجنين باستخدام عالية التردد التصوير بالموجات فوق الصوتية على النقيض محسنة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

التصوير بالموجات فوق الصوتية على النقيض محسنة يجعل من استخدام وكلاء microbubble خلافا لتصور وتميز البيئة الأوعية الدموية. هذه العوامل تمكن من إجراء تقييم موسع للدوران الأوعية الدقيقة، الأوعية الدموية وظيفة القلب والأوعية الدموية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تعديل سطح الفقاعة يؤدي إلى microbubble المستهدف ملزمة لالمؤشرات الحيوية البطانية، كما هو موضح في التطبيقات قبل السريرية من الأوعية الدموية، وتصلب الشرايين والتهاب 1،2 مما يجعل من التصوير بالموجات فوق الصوتية الجزيئي للأحداث الأوعية الدموية الممكنة. بالتالي يمكن استخدامها على النقيض تعزيز الموجات فوق الصوتية لتحديد بيئات معقدة ومتنوعة التي تؤثر على الدول السليمة والمريضة الأوعية الدموية 3-5.

في عدد من السنوات الماضية، امتد الاهتمام فائدة التصوير microbubble إلى تنوعا نموذج الفأر الجنين. كنموذج للتنمية الثدييات، وإدخال microbubbles في الأوعية الدموية الجنينية يعزز الفسيولوجية دراسة الدورة الدموية تطوير (على سبيل المثال، وتدفق الدم، خرج القلب) وفي حالات المعدلة وراثيا ونماذج الماوس متحولة المستهدفة من أمراض القلب 6،7، قد تسفر نظرة ثاقبة كيف العوامل الوراثية تغيير وظيفة القلب والأوعية الدموية. في الواقع، ويحلل 2D الكمي والنوعي لالجنينية الأوعية الدموية في الدماغ وقد تم بالفعل تحقيق 8. وعلاوة على ذلك، يقدم جنين الفأر نموذجا ممتازا لدراسة الربط من microbubbles تستهدف علامات الأوعية الدموية في الجسم الحي. Bartelle وآخرون على سبيل المثال، أدخلت microbubbles أفيدين إلى الجنين البطينين في القلب لتقييم استهدفت ملزمة في Biotag-البيرة الأجنة وراثيا ودراسة علم التشريح الأوعية الدموية. توليد نماذج الماوس متخالف ومتماثل يمكن أيضا أن تستخدم كبديل للدراسات نموذج الورم تهدف إلى تحديد طبيعة كمية الموجات فوق الصوتية الجزيئي - معيارا هاما في ترجمة هذه التقنية إلى العيادة.

الحمار = "jove_content"> يتم في معظم الأحيان أدخلت Microbubbles إلى الدورة الدموية الجنينية عن طريق الحقن داخل القلب في الأجنة واحدة يتعرض من خلال فتح البطن 8-10. وفي الحقن داخل الرحم، ومع ذلك، تواجه عددا من التحديات. وتشمل هذه التوجيهات الحقن، والحاجة لمواجهة الحركة في الأم والجنين exteriorized، والحفاظ على حيوية الدورة الدموية في الأم والأجنة exteriorized، ومعالجة الآثار طويلة الأجل للتخدير والمضاعفات الناجمة عن النزيف 11. لذلك، كان الهدف من التحقيق لتطوير تقنية لحقن microbubbles في المعيشة عزل الأجنة في مرحلة متأخرة 12. يوفر هذا الخيار مزيدا من الحرية من حيث السيطرة الحقن وتحديد المواقع، واستنساخ الطائرة التصوير دون إعاقة، وتحليل الصور مبسط والكمي.

في هذه الدراسة، فإننا الخطوط العريضة لإجراء جديدا لحقن microbubbles في العيش أجنة الفئران FOص أغراض دراسة السلوك الحركي microbubble ودراسة microbubble ملزمة لعلامات سطح البطانية الذاتية المستهدفة. يستخدم غير الخطية التصوير بالموجات فوق الصوتية معين المقابل لقياس عدد من المعلمات نضح الأساسية بما في ذلك تعزيز الذروة (PE)، ويغسل في معدل والوقت إلى الذروة (TTP) في الأجنة E17.5 معزولة. نحن أيضا تدليل على صحة الجنين نموذج لتقييم طبيعة كمية الموجات فوق الصوتية الجزيئي في خسارة endoglin الجنينية من نموذج الفأر وظيفة المعدلة وراثيا، حيث endoglin هو هدف ذات الصلة سريريا بسبب التعبير عنها ارتفاع في خلايا بطانة الأوعية الدموية في مواقع الأوعية الدموية النشطة 13 . يتم تقييم التصاق (MB E)، التي تستهدف endoglin نمط إسوي الفئران مفتش 2 التحكم (MB C) وتشتته (MB U) microbubbles في endoglin متخالف (المهندس +/-) وendoglin متماثل (المهندس + / +) معربا عن أجنة. تحليل بيندي المستهدفةنانوغرام يكشف عن أن الموجات فوق الصوتية الجزيئي قادر على التمييز بين الأنماط الجينية endoglin والمتعلقة كثافة مستقبلات إلى مستويات الموجات فوق الصوتية الجزيئية للقياس الكمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية التي أجريت في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية الحيوان في معهد بحوث سونيبروك (تورونتو، أونتاريو، كندا). يجب مراعاة إجراءات المعاملة الإنسانية للحيوانات في جميع الأوقات. ومن المفترض أن المحقق هو يتدرب في العملية الأساسية لنظام التصوير بالموجات فوق الصوتية. هذا البروتوكول يعمل بشكل أفضل مع شخصين.

1. نماذج حيوانية

  1. ماتي CD-1 الذكور والإناث المصحف العضلة للحصول على الأجنة نوع البرية للدراسات الارواء.
  2. للدراسات التصوير الجزيئي، وتوليد الفئران المهندس +/- قبل إعادة التركيب مثلي باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية من 129 / علا الأصل كما وصفها Bourdeau وآخرون. 14.
    1. الفئران تزاوج تبادلي B6- المهندس +/-، يرجى الحصول عليها من الدكتور ميشيل Letarte، إلى الخلفية CD-1. استخدام المهندس +/- CD-1 الأجنة backcrossed، وكذلك من المهندس + / + littermate التعاونntrols. تزاوج الفئران لإنتاج أجنة مراحل.

2. إعداد التجريبية

  1. بدء التزاوج من الفئران وتحقق من المقابس يوميا. ويعرف اليوم الجنينية 0.5 كما ظهر من اليوم لوحظ المكونات المهبلية.
  2. إعداد وسائل الاعلام الجنين بإضافة 50 مل من مصل بقري جنيني، 5 مل من 1 M HEPES و 5 مل من البنسلين، الستربتوميسين (10،000 وحدة البنسلين، 10،000 ميكروغرام الستربتوميسين) إلى 500 مل معدلة المتوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) مع ارتفاع نسبة الجلوكوز (4،500 ملغ / L). التفاف زجاجة في احباط والحفاظ مبردة عند 4 درجات مئوية.
  3. الطرد المركزي واضح هلام الموجات فوق الصوتية في أنابيب مخروطية 50 مل في 140 x ج لمدة 20 دقيقة. رسم هلام تصل إلى 30 مل الحقن. ملء (علامة) 30 مل المحاقن إضافية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتوضع جانبا. وسيكون أحد القمامة من الأجنة تتطلب عادة بين 2-3 المحاقن من هلام الموجات فوق الصوتية و 4 الحقن من برنامج تلفزيوني.
  4. سحب ما يقرب من 30 الإبر والزجاج، وربط بلطف إلى شريط من البلاستيسينفي 100 × 20 مم طبق ثقافة الخلية. هذا يضمن أن الإبر يتم فصل وآمنة أثناء المناولة. باستخدام مجتذب الزجاج، واستخدام الإعدادات التالية في 1 × 90 ملم الزجاج الشعيرات الدموية مع خيوط: سخان 77، 55 الفرعي المغناطيس، المغناطيس الرئيسي 70.
  5. إعداد 11:50 لوحات تشريح (ما يكفي لضمان كل جنين داخل القمامة سوف تتلقى طبق خاص بها)، وذلك باستخدام نسبة 1: 8 حجم وكيل علاج للقاعدة. صب 40 مل من قاعدة في أنبوب مخروطي 50 مل. إضافة 5-6 مل كيل علاج ويقلب مع عصا خشبية.
    1. تصب 60 × 15 مم أطباق الثقافة، وملء كل إلى ما يقرب من نصف. اسمحوا الوقوف O / N لتعيين.
  6. إرفاق luers الإناث إلى 400 ملم قطعة طويلة من البولي فينيل كلورايد (PVC) أنابيب (القطر الداخلي: 0.79 مم). الأنابيب يجب أن تصل من ضخ حقنة لمرحلة الموجات فوق الصوتية بشكل مريح.

3. التجريبية مجموعة المتابعة

  1. ترتيب منصة التصوير تحت المجهر الجراحي مع محرك 3D ومجموعة الخطي 21 MHمحول ض.
    1. المشرق منصة بحيث السكك الحديدية جبل على اليسار، مع المرحلة وضعه مباشرة تحت المجهر.
    2. إرفاق محرك 3D لكرة مشتركة للذراع تمتد من المنصة. المسمار الافراج عن آخر سريعة من المشبك محول إلى الإفراج السريع جبل على المحرك، تواجه الأمام، وموقف رئيس محول في المشبك، الربط المزلاج.
    3. تأمين محول موصل في ميناء نشط على اللوحة الأمامية من العربة. تحويل الجهاز على.
  2. بدء الموجات فوق الصوتية محول 21 ميغا هرتز، واختيار الإعداد "القلب" للدراسات التصوير الجزيئي، و "عام" للدراسات الارواء. تحول جميع المتزلجون الوقت كسب التعويض إلى موقف وسط بالضبط. ل 'وضع التباين "، تعيين المعلمات التالية: التردد: 18 ميغاهيرتز، نقل الطاقة: 4٪، (0.39 ميجا باسكال)، على النقيض من كسب: 30 ديسيبل، بؤر: 6 و 10 مم، على النقيض من الوضع: غير الخطية، والوقت انفجر: 100٪ عند 0.1ثانية، شعاع العرض: على نطاق واسع.
  3. قسامة 40 مل سائل الإعلام الجنين كل إلى أربعة أنابيب مخروطية 50 مل. ضع على الجليد.
  4. تسخين 1 لتر من الماء في كوب 2 L على طبق ساخن. الحفاظ على 45 ° C. إضافة حقنة واحدة من هلام الموجات فوق الصوتية وPBS إلى الكأس لتسخين. الحفاظ على درجة الحرارة هذه من خلال رصد مع ميزان حرارة في جميع الأوقات.
  5. جانبا 11:50 1 مل المحاقن و11:50 21 الإبر G لحقن microbubbles.

4. إجراء العمليات الجراحية

ملاحظة: هل لديك مساعد إعداد فقاعات (المرحلة 5)، في حين الجراح يبدأ الإجراء الجراحي. وقد تم تكييف البروتوكول الموصوفة هنا من وايتلي وآخرون (15).

  1. جمع E16.5 أو E17.5 أجنة من الماوس الإناث الحوامل التالية خلع عنق الرحم.
    ملاحظة: لم يتم بعد دراسة تأثير التخدير على الأجنة بالتفصيل 16. طرق إضافية، بما في ذلك قطع الرأس، قد يكون المرجع المناسبستعقد للتضحية من الفئران الحوامل.
    1. خفض فتح البطن للكشف عن الرحم والأجنة. بعناية وبسرعة إزالة الرحم عن طريق قطع على نصائح من قرون الرحم (قطع الأوعية المبيض والرحم)، وقطع في المهبل والمثانة.
    2. باستخدام ملقط منشقة، ونقل الرحم إلى أنبوب 40 مل من الجليد الباردة وسائل الإعلام الجنين في أسرع وقت ممكن دون الإضرار الأجنة. تجاهل الذبيحة الماوس.
  2. الانتقال إلى المجهر والمرحلة. إيداع الرحم إلى 100 × 20 مم طبق ثقافة الخلية. نقل الرحم في طبق جديد مليئة 50 مل سائل الإعلام الجنين الطازجة.
  3. باستخدام المعقمة (70٪ رذاذ الايثانول) ملقط غرامة، المسيل للدموع بلطف وسحب بعيدا الأغشية الخارجية للالرحم بدءا من نهاية واحدة. فضح الساقط المشيمة، الجداري الكيس المحي وغشاء رايخرت لفصل وإزالة من الأساسي الحشوية الكيس المحي.
  4. تشريح خارج الأجنة واحدا تلو الآخر، والحفاظ على ذ الحشويةالحويصلات OLK سليمة والتعامل مع المشيمة كما بلطف ممكن 17. الحرص على تجنب تمزق الكيس المحي كما الأجنة البوب ​​على الفور.
    1. استخدام ملعقة مثقوبة لنقل الأجنة إلى طبق آخر أبقت على الجليد مع وسائل الإعلام الجنين جديدة. الحفاظ على الأجنة المبردة لحين الحاجة إليها. تغيير وسائل الإعلام في الطبق الجنين كل 1-1.5 ساعة. مع هذه الظروف أجنة قابلة للبقاء لمدة تصل إلى 4 ساعات بعد تشريح.

5. إعداد Microbubble

ملاحظة: إجراء التصوير الجزيئي باستخدام الموجات فوق الصوتية باستخدام كل microbubbles المستهدفة وتشتته. وهناك تجربة واحدة يمكن أن تتطلب ما لا يقل عن 3 قوارير منفصلة من microbubbles: microbubbles ط) الأجسام المضادة التي تستهدف microbubbles، والثاني) استهدفت السيطرة الضد isotype والثالث) microbubbles تشتته. يأتي عامل تباين على شكل مسحوق جاف للتجمد ويجب إعادة تشكيل بمحلول ملحي قبل حقن. هناك ~ 2 × 10 9 microbubbles في كل microb تشتتهقارورة ubble و~ 8.8 × 10 8 microbubbles في الهدف قارورة جاهزة. وmicrobubbles مستقرة لمدة تصل إلى 3 ساعات بعد إعادة.

  1. إعادة تشكيل الهدف جاهزة قوارير
    ملاحظة: أمثلة على الهدف الاستعدادات جاهزة: endoglin microbubbles المستهدفة (MB مع الفئران المعقدة البيروكسيديز MJ 7/18 الأجسام المضادة إلى الماوس endoglin، في منزل منشأة هجين)؛ عامل النمو البطاني الوعائي مستقبلات 2 (VEGFR2) microbubbles المستهدفة (MB مع البيوتين مكافحة الماوس CD309)؛ نمط إسوي الفئران مفتش 2 مراقبة الأجسام المضادة microbubbles المستهدفة (MB نمط إسوي الفئران البيوتين مفتش 2 السيطرة استهداف الماوس IgG2a).
    1. تمييع الحل الضد (20 ميكروغرام) في 1 مل (الحجم النهائي) من المياه المالحة. الحفاظ على الجليد.
    2. ملء المحاقن مع 1 مل المالحة، وإزالة جميع فقاعات الهواء. ربط 21 G الإبرة، وحقن الحل ببطء في قارورة microbubble.
    3. سحب ببطء الغطاس، وإزالة 1 مل من الهواء، وسحب الإبرة. بلطفتستنهض الهمم. اسمحوا الوقوف 5 دقائق على الجليد.
      ملاحظة: يمكن تدميرها microbubbles الموجات فوق الصوتية في بيئات عالية الضغط.
    4. بعد الوقت المنقضي، وملء حقنة جديدة مع تخفيف الأجسام المضادة وإضافة إلى القارورة المناسبة. تستنهض الهمم بلطف. السماح للخليط (الآن 2 مل) يقف لمدة 10 دقيقة. الحفاظ على الجليد. على افتراض الكامل اقتران السطح، ومتوسط ​​عدد يجند المنضم لmicrobubbles ما يقرب من 18 7،600 بروابط / ميكرون 2.
  2. إعادة تشكيل غير مستهدفة قوارير
    1. ملء المحاقن مع 1 مل المالحة، وإزالة جميع فقاعات الهواء. ربط 21 G الإبرة، وحقن الحل ببطء في قارورة microbubble.
    2. سحب ببطء الغطاس، وإزالة 1 مل من الهواء، وسحب الإبرة. تستنهض الهمم بلطف. اسمحوا الوقوف 5 دقائق. إضافة 1 مل إضافية المالحة، كما هو موضح أعلاه. تستنهض الهمم بلطف واسمحوا الوقوف 10 دقيقة على الجليد.
  3. كولتر العد
    1. تستنهض الهمم بلطف القارورة microbubble المطلوب ورسم ~50 ميكرولتر من الحل في حقنة 1 مل باستخدام إبرة 21 G. حقن microbubbles إلى 2 مل فارغة أنبوب microcentrifuge.
    2. ماصة عينة 10 ميكرولتر من محلول المخزون microbubble إلى 10 مل من مخفف.
    3. بعد خلط لطيف، وتقييم التركيز وحجم التوزيعات من السكان microbubble باستخدام العد كولتر (قائمة المواد نرى). عدد لا يقل عن ثلاثة قياسات 50 ميكرولتر (لكل عينة قارورة) باستخدام 30 ميكرون الفتحة.
  4. إعداد Microbubbles للحقن
    وبدأ ينفذ مساعد هذه الخطوة عندما 'حقن Microbubbles إلى الأجنة "(الخطوة 6): ملاحظة. يتم حقن كل جنين مرة واحدة، مع نوع من microbubble المختارة لكل الحقن التي سيتم اختيارها عشوائيا من قبل مساعد مثل أن جميع أنواع microbubble توزع بالتساوي في جميع أنحاء الداخلي ولكن نظرا في ترتيب عشوائي. ضمان الجراح أعمى لنوع من فقاعة حقنها.
    1. تحديد الحجم البريد من حل فقاعة الأسهم المطلوبة لإنتاج تركيز النهائي من 1 × 10 8 MB ​​/ مل في حجم 400 ميكرولتر (حساب حجم باستخدام تركيزات الأسهم تقاس 5.3.3). قسامة حجم المقابلة من المياه المالحة إلى أنبوب microcentrifuge فارغة.
    2. تستنهض الهمم بلطف القارورة microbubble المختارة ورسم حجم الفائض (~ 50 ميكرولتر أكبر من أن يحسب أعلاه) من الحل في حقنة 1 مل باستخدام إبرة 21 G. حقن microbubbles إلى أنبوب microcentrifuge فارغة.
    3. ماصة حجم ضروري من حل الأسهم microbubble وإضافة إلى قسامة من المياه المالحة. مزيج من قبل اثارة بلطف مع غيض من ماصة.
    4. رسم الحل microbubble المخفف في حقنة نظيفة باستخدام إبرة 21 G. إزالة الإبرة، والقضاء على أي فقاعات الهواء من الحقنة وإرفاق بالتركيبة والأنابيب. دفع ببطء الحل لنهاية صنع أنابيب تأكد من عدم توليد أي فقاعات الهواء.
    5. أدخل syrinجنرال الكتريك في ضخ حقنة التسريب تعيين في صرف microbubbles بمعدل 20 ميكرولتر / دقيقة لحجم الكلي لل20 ميكرولتر. نعلق إبرة الزجاج انسحبت إلى نهاية الأنبوب. نقل مضخة قريبة من مرحلة الحقن.

6. حقن Microbubbles في الأجنة

  1. عشوائيا تحديد وإزالة (مع ملعقة مثقوبة) جنين واحد من الطبق وسائل الإعلام المبردة. ضع في طبق تشريح تقع على المسرح الموجات فوق الصوتية تحت المجسام وإزالة الكيس المحي والأغشية الذي يحيط بالجنين مع ملقط غرامة، وقطع / تمزق من الجانب الذي يظهر الأقل أوعية دموية (الجانب antimesometrial). ويتحقق ذلك بسهولة عن طريق اختراق منطقة مجاورة لمنطقة الرأس.
    1. قطع يكفي لإزالة الجنين من الداخل، ولكن ليس أكثر. استقرار أطباق تشريح باستخدام قطع صغيرة من البلاستيسين.
  2. مناورة بلطف الكيس من مختلف أنحاء الجنين. وضع الجنين على جانبها، مع المشيمة والأوعية الدموية السرية في الجبهة. باستخدام دبابيس الحشرات، وماهيتها الكيس المحي (4 دبابيس أوصت) وحواف من المشيمة عند الضرورة لتركيب في المكان. تجنب الأوعية الكبرى.
  3. غسل الجنين مع حرارة ما قبل 45 ° C PBS حتى ينعش الجنين. التعرف على الوريد السري وشبكة الأوعية الدموية المرتبطة بها. ضع الطبق بحيث يمكن أن يتم حقن مريح.
    ملاحظة: تحسنت مرة واحدة، والدم في الجنين يبدأ في التدفق، ضخ واضح في الشريان السري. عندما تبدأ تدفق أولا، سوف الأوردة يكون أحمر مشرق، مع الدم في كل السفن الظهور بسرعة متطابقة. الفروع الناشئة من الوريد السري عادة تراكب تلك من الشريان السري على سطح المشيمة.
  4. مرة واحدة وقد أحيت الجنين، تغطية ذلك (ولكن ليس المشيمة) مع هلام الولايات المتحدة قبل تحسنت، ويجري التأكد من إزالة بدقة أي فقاعات هواء (باستخدام ملقط غرامة) من جميع أنحاء الجنين. ملأ الطبق مع برنامج تلفزيوني قبل تحسنت.
    ملاحظة: إبقاء العين على مستوى solutiعلى في برنامج تلفزيوني وهلام الحقن والمحاقن إضافة النسخ الاحتياطي إلى دورق التدفئة حسب الحاجة.
  5. جبل الإبرة الزجاج على كرة كبيرة من البلاستيسين على حافة الطبق تشريح وإدراج نهاية الإبرة في برنامج تلفزيوني. اختيار الوريد على سطح المشيمي من القرص المشيمة، بقدر من الفرع الرئيسي معقولة كما، وتقليم طرف إلى حجم باستخدام المقص. حقن هو أسهل إذا تم قطع رأس في زاوية طفيف. إزالة أي حواف خشنة من الزجاج باستخدام حافة مقص الربيع.
  6. عن طريق ضخ حقنة، حقن ببطء الحل microbubble في 20 ميكرولتر / دقيقة في إبرة الزجاج حتى يتم طرد كل الهواء من طرف الإبرة ويمكن أن ينظر إليه microbubbles لتتدفق بحرية في برنامج تلفزيوني. وقف ضخ وإعادة تعيين لحجم حقن 20 ميكرولتر. لا سماح للهواء بالدخول إلى نظام الأوعية الدموية للجنين أثناء الحقن.
  7. إدراج طرف زجاج الإبرة بلطف إلى واحدة من الأوردة في المشيمة وضمان أنها قادرة على الحركة. تأرجح بعيدا الستير متر مكعبرئيس oscope وموقف محول فوق الجنين. بدء التصوير.

7. التصوير بالموجات فوق الصوتية الجزيئية

ملاحظة: استخدام التباين ظروف التصوير غير الخطية تعيينها مسبقا، ضع محول بحيث الجنين يقع بالتساوي بين البؤر في 6 و 10 ملم. وضعه مرة و، بدء حقن البلعة من microbubbles. عندما حقن كاملة، بدء موقت.

  1. نضح التصوير
    1. تأكد من تحديد الحد الأقصى لعدد الإطارات لوضع التباين غير الخطية عن طريق الضغط على زر "إدارة دراسة" والنقر على علامة التبويب "بادئات" في أعلى المتصفح الدراسة. ضع علامة في المربع المناسب في إطار "التفضيلات".
    2. ضبط إعدادات التصوير من خلال البدء التصوير غير الخطية. اضغط على زر 'وضع التباين "على لوحة التحكم. حدد الربح 2D عن طريق ضبط "مكاسب & #8217؛ الاتصال الهاتفي إلى 30 ديسيبل، والحد من القدرة على 4٪ باستخدام "القوة" الاتصال الهاتفي، انخفاض وتيرة إلى 1 هرتز باستخدام 'تردد' الاتصال الهاتفي وتعيين عرض شعاع (أسفل الزاوية اليسرى) إلى جميع أنحاء باستخدام الكرة الدوارة / الماوس.
      ملاحظة: وتقع جميع الضوابط على لوحة التحكم لنظام الموجات فوق الصوتية.
    3. القبض على كامل غسيل في وتبديد للالبلعة microbubble عن طريق تسجيل 20 دقيقة سينمائية حلقة في معدل الإطار من 1 هرتز. الصحافة مسح / تجميد لبدء الحصول على البيانات.
    4. مرة واحدة وقد تم القبض على تسلسل كامل من الصور، اضغط على زر 'متجر سينمائية "الموجود على لوحة التحكم لحفظ سلسلة من الصور في المخزن المؤقت النظام. النظام يخلق سينمائية حلقة ختم تاريخ البيانات نموذج النقيض غير الخطية المكتسبة.
  2. استهدفت Microbubble التصوير
    1. تحت عنوان "بادئات، ضبط الوقت انفجر إلى 0.1 ثانية. تعيين المعلمات التصوير المناسبة باستخدام عناصر التحكم ديسcribed فوق (7.1.2).
    2. بدء التصوير النقيض غير الخطية عن طريق الضغط على زر 'وضع التباين "على لوحة التحكم. ضمان يقع الجنين بشكل صحيح تحت محول وأن تدفق عامل تباين microbubble من خلال الجنين مرئيا في صورة غير الخطية وضع التباين.
    3. لتقييم microbubble المستهدف ملزمة خلال دراسات التصوير الجزيئي الجنينية، والسماح للmicrobubbles أن يعمم دون عائق لمدة 3 دقائق و 40 ثانية بعد الانتهاء من الحقن. هذا الوقت هو السماح الإبقاء على microbubbles المنتشرة. اضغط على "مسح / التجميد" لوقف التصوير خلال هذا الوقت.
    4. في 3 دقائق و 40 ثانية، والتصوير السيرة الذاتية للتأكيد على أن الجنين لا تزال واضحة، وتغطي بشكل كاف مع برنامج تلفزيوني، والتي microbubbles يواصل تعميم. اضغط على "مسح / التجميد" لبدء التصوير.
    5. الحصول على تسلسل تعطيل / التجديد في 3 دقائق و 50 ثانية حقن آخر عن طريق تسجيل "قبل destrucنشوئها "تسلسل استجابة الصوتية في 29 هرتز. اضغط على "مسح / التجميد" لبدء الحصول على البيانات. في 4 دقائق بعد حقن 18،19، الشروع في 0.1 ثانية عالية التردد الصوتية انفجار. اضغط على زر 'انفجار' لتنفيذ انفجار.
    6. الاستمرار في تسجيل إطارات للفترة المتبقية من تسلسل (حتى خط المخزن المؤقت الكامل) وحفظ حلقة سينمائية عن طريق الضغط على "متجر سينمائية.
    7. جمع حلقة سينمائية إضافية تعميم microbubbles. ويفترض هذا 'بعد تدمير' تسلسل التصوير لاحقة لاحتواء تعميم فقط إشارات فقاعة التي تتجدد شعاع. اضغط على "مسح / التجميد" لبدء التصوير و "متجر سينمائية على جمع الصور.
    8. تسمية حلقات سينمائية بعد تصوير كل جنين. "إدارة دراسة" الصحافة، وتسليط الضوء على ملف باستخدام الكرة الدوارة و'اختر' زر، اضغط على "تسمية الصورة" واسم مناسب.

    8. التعامل مع الأجنة بعد الحقن

    1. التصوير بعد، نقل محول، بفصل الجنين والموت ببطء (عن طريق قطع الرأس، خلع عنق الرحم، وثاني أكسيد الكربون الاختناق، أو التخدير تليها تجميد السريع أو التثبيت) كما تريد.
    2. لكل حقن الجنين اللاحقة يجب أن تستخدم شريحة طبق التشريح، والإبرة، والمحاقن وأنابيب جديدة، مع إعداد الدفعة التالية من حقن microbubble جني حل مكان خلال تشريح وإحياء.
    3. حفظ عينات الأنسجة (على سبيل المثال، وذيل، والدماغ) للتحليلات إضافية (على سبيل المثال، التنميط الجيني الذي يحدده تحليل PCR من الحمض النووي معزولة الذيل، lacz تلطيخ، أو تدابير نصف الكمية من العلامات البيولوجية التعبير باستخدام البقع الغربية 21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

حقن عوامل التباين الموجات فوق الصوتية في السابق الرحم أجنة الفئران يعتمد على العزلة الناجحة المعيشة والأجنة المرحلة في وقت متأخر من الحمل من الرحم وصيانة جدوى على مدى الحقن والتصوير بالموجات فوق الصوتية ذات الصلة. مرة واحدة وقد تم exteriorized الجنين وضعه، كما هو مبين في الشكل (1)، والحقن الدقيق لعامل تباين في الأوعية الدموية الجنينية هو ممكن. ويرد B-وضع صورة الموجات فوق الصوتية نموذجية للجنين E17.5 الماوس في الشكل 2A. لفي غسل من microbubbles وتعزيز المقابلة في الوريد الأجوف السفلي، والقلب، الدماغ، وفي الحيوان كله يمكن الحصول عليها باستخدام طرق التصوير النقيض غير الخطية، مما يدل على جدوى هذا الأسلوب. وصفت نقاط زمنية الفردية في الشكل 2B وإظهار التغيير في تناقض مع مرور الوقت.

من خلال تسجيل كامل في غسل وغسل التدريجي سو البلعة microbubble، فمن الممكن لقياس مختلف المعلمات الارواء. في تحليل حاليا، تم استخدام أداة التتبع المنطقة المقابل لخلق 1.5 مم 2 المناطق ذات الاهتمام (ROI) في نصفي الكرة الأرضية الجنينية الدماغ الأيمن والأيسر. متوسط ​​كثافة إشارة داخل هذه رويس ثم تآمر بوصفها وظيفة من الزمن وتلطيف باستخدام فلتر متوسط ​​سبع نقاط. من الناتج منحنى شدة التباين (كما هو موضح في الشكل 2C)، تم تحديد تعزيز الذروة الدماغ. معدل غسل في، الذي يعرف بأنه المنحدر بين 10٪ و 50٪ من ذروة الحد الأقصى لتعزيز (PE)، وحسبت أيضا. وأخيرا، تم احتساب الوقت لالذروة (TTP) من بداية تعزيز إشارة إلى وقت الذروة. تم اختبار الاختلافات في المعلمات نضح المتوسط ​​عبر أنواع مختلفة باستخدام فقاعة منفصلة تي الاختبارات 12. هذه النتائج، ملخصة في الجدول رقم 1، تثبت أن حقن microbubbles يوفر VALUطريقة قادرة على التأكد من المعلمات نضح الهامة في الماوس التنموي.

مقدمة من microbubbles في الأوعية الدموية الجنينية يمكن أيضا استخدام أجنة الفئران كما نظم نموذج لتحديد وتوصيف قدرات الكمية من التصوير بالموجات فوق الصوتية الجزيئي. في المثال التالي، وفقدان نموذج وظيفة، حيث التلاعب الجيني إنشاء أنماط التعبير متخالف ومتماثل من endoglin في الفئران الجنينية، وكان يستخدم لاختبار قدرة التصوير بالموجات فوق الصوتية الجزيئي للتمييز بين الأنماط الجينية. بعد الحقن microbubble وتنفيذ التصوير تدمير / التجديد، تم استخدام نسبة من متوسط ​​كثافة إشارة من 'قبل تدمير "لمتواليات" بعد تدمير "لإنتاج مقياسا للإشارة الجزيئية تسمى النقيض يعني نسبة الطاقة (CMPR ). وأجريت النموذج المختلط الخطي (مع تعديلات Bonferroni المقدمة للمقارنات متعددة) للتأكد ث hether كان هناك أي فرق كبير بين endoglin المستهدفة والرقابة وmicrobubble تشتته ملزمة إلى Eng + / + أو الأجنة المهندس +/- (حددت حقن الوظيفة عن طريق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) للعينات الذيل). وسائل CMPR المقدرة (يعني ± 95٪ الثقة الفاصل الزمني (CI)) يتم عرض لكل microbubble والجنين نوع في الشكل (3) وتتلخص في الجدول 2.

وتوفر هذه النتائج مظاهرة الملموسة التي حقن عوامل التباين الموجات فوق الصوتية في الأجنة الحية معزولة لا يمكن أن يتحقق. وعلاوة على ذلك، فإن هذا البروتوكول يسهل تقييم المعلمات التروية، ويمكن استخدامه لمقارنة microbubble المستهدفة الملزمة في نماذج الجنين من أمراض الأوعية الدموية في محاولة لإلقاء الضوء على قدرات التصوير بالموجات فوق الصوتية الجزيئي.

.JPG "/>
انشاء الشكل 1. التجريبية لحقن microbubbles في الأجنة معزولة. يتم وضع A 21 ميغاهيرتز مجموعة خطية محول فوق لexteriorized E16.5 المعيشة الجنين كما يتم حقن 20 ميكرولتر حل microbubble في الوريد المشيمة باستخدام قنية الزجاج. شريط النطاق = 10 ملم. من Denbeigh، JM وآخرون 12 بإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. التصوير بالموجات فوق الصوتية من Exteriorized المعيشة E17.5 الأجنة. (A) B-وضع صورة بالموجات فوق الصوتية للجنين. وقبل حقن microbubbles المستهدفة (ر = 0 ثانية). (ب) تباين الصورة غير الخطية من الجنين قبل وبعد حقن microbubbles. على النقيض غير الخطية صورة الحزب الثوري المؤسسيأو لmicrobubble حقن (ر = 0 ثانية). فقط واجهات يعكس بقوة (على سبيل المثال، العظام) واضحة، مع إشارة الحد الأدنى من الأنسجة الرخوة. أدناه، على النقيض من الصورة غير الخطية من microbubbles داخل الجنين في ر = 50 ثانية، ر = 120 ثانية و t = 420 ثانية بعد حقن البلعة. يتم الكشف عن المقابل في جميع أنحاء الحيوان، بما في ذلك القلب والدماغ. المعلمات (C) الإرواء المستمدة من وقت منحنيات كثافة. مؤامرة كثافة microbubbles بوصفها وظيفة من الوقت داخل ROI واحد في الدماغ الجنينية. ويتم تحديد المعلمات نضح على الرسم البياني، بما في ذلك تعزيز الذروة (PE)، ويغسل في معدل (المنحدر)، والوقت إلى الذروة (TTP). النصال: R = أضلاعه، حزب التحرير = القلب، برازيلي = الدماغ. الاتحاد الافريقي، وحدات التعسفي. العائد على الاستثمار، والمنطقة في المصالح؛ ثانية، ثواني. شريط مقياس = 3 مم. تم تعديل هذا الرقم من Denbeigh، JM وآخرون. 12. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. ملخص التباين متوسط ​​يعني نسب الطاقة (CMPR) لendoglin المستهدفة (MB E)، والسيطرة (MB C) وmicrobubbles تشتته (MB U) في المهندس + / + والأجنة المهندس +/-. CMPRs من endoglin المستهدفة كان microbubbles أعلى بكثير (***، P <0.001) من تلك التي جمعت لMB C وMB (لا تختلف كثيرا عن بعضها البعض، بغض النظر عن التركيب الوراثي). تم العثور على MB E ملزمة أن تكون أعلى بكثير في المهندس + / + الأجنة (علامات داكنة) مقارنةالأجنة المهندس +/- (علامات الضوء). النتائج المعروضة كما يعني فاصل الثقة ± 95٪. ن يشير إلى عدد من الأجنة فريدة من نوعها في كل فئة. من Denbeigh، JM وآخرون 22 بإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Microbubble نوع T-الاختبارات
ف القيمة
نضح معلمة MB U MB C MB V MB U مقابل MB C MB U مقابل MB V MB <فرعية> C مباراة MB V
ذروة تعزيز، PE (الاتحاد الافريقي) 0.427 ± 0.063 0.490 ± 0.079 0.499 ± 0.064 0.19 0.06 0.81
يغسل في معدل (AU / ثانية) .008 .002 ± 0.009 ± .002 0.011 ± .002 0.18 0.01 0.09
الوقت إلى الذروة، TTP (ثانية) 53.75 ± 7.96 51.75 ± 4.46 45.00 ± 5.33 0.55 0.03 0.03
# الأجنة حقن 4 4 3

الجدول 1. ملخص E17.5 المعلمات نضح الجنينية. يعني ± الانحرافات المعيارية المستمدة من المؤامرات كثافة الوقت لجميع رويس الجنين (أ.ش. = وحدات التعسفي). ويتضمن جدول القياسات لغير مستهدفة (MB U)، مفتش 2 السيطرة المستهدفة (MB C) وVEGFR2 المستهدفة (MB V) microbubbles. وأجريت منفصلة تي اختبارات لمقارنة المجموعات. تم تعديل هذا الجدول من Denbeigh، JM وآخرون. 12.

نوع Microbubble النمط الجيني CMPR المتوسط فاصل الثقة 95٪
MB E المهندس + / + 9.71 9.05، 10.38
المهندس +/- 5.51 4.87، 6.15
MB C المهندس + / + 1.42 0.41، 2.43
المهندس +/- 1.46 0.45، 2.47
MB U المهندس + / + 1.7 0.65، 2.75
المهندس +/- 1.76 0.67، 2.84
الخطية نموذج مختلط: بين-تخضع الآثار
DF F قيمة ص
النمط الجيني 1 12.75 <0.001
نوع Microbubble 2 147.65 <0.001
راثى * نوع Microbubble 2 18.29 <0.001

الجدول 2. ملخص الخطي تحليل النموذج المختلط لتم العثور على microbubble ملزمة في الأجنة، مع تصحيح Bonferroni للمقارنات متعددة. راثى، نوع microbubble والتفاعل مجتمعة (النمط الجيني * نوع microbubble) لتكون عوامل هامة في تحديد CMPR. مدافع = درجات الحرية. من Denbeigh، JM وآخرون 22 بإذن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم حقن عوامل التباين الموجات فوق الصوتية في مرحلة متأخرة من الحمل الأجنة الماوس وعلى النقيض من الصور غير الخطية تم الحصول عليها لقياس المعلمات نضح وهادفة microbubble ملزمة. كان التصوير الناجح لmicrobubbles داخل الأوعية الدموية الجنينية يعتمد على عدد من العوامل، أولها بقاء الجنين. تم إعداد كافة المعدات والأجهزة في وقت مبكر من أجل تقليل الوقت اللازم لعزل الأجنة من الرحم إلى بداية الحقن. منذ لم تدرس آثار التعرض مرة واحدة أو المتكررة لتخدير على الفئران الجنينية في التفاصيل، وتجنب استخدام التخدير في الأم قبل تضحي 16. خلال الجنين العزلة، كان من المهم لمنع الأضرار التي لحقت الكيس المحي وكفالة الأجنة أبقى فتور في جميع الأوقات، في وسائل الإعلام الجنين منتعشة بشكل متكرر. عندما exteriorizing الجنين قبل الحقن وخلال تعلق، وتجنب السفن المحي الرئيسية للحد من likelihooد النزيف، والتي يمكن أن تكون قاتلة. وجدنا أنه عندما إحياء الجنين، فإنه من الأفضل لتغطية أول المشيمة ثم الجنين مع PBS، قبل تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية لجنين في ذهابا وإيابا الحركة وإزالة أي فقاعات كبيرة مع ملقط. ثم شغل ما تبقى من طبق بتري مع برنامج تلفزيوني. استخدام الجل وPBS تقتصر إمكانية جيوب هوائية بين الجنين ومحول، والتي يمكن أن تؤثر على جودة الصورة. كما الجنين إحياء، وبدأ الدم في التدفق، ضخ واضح في الشريان السري في حين ظهرت الأوردة السري الأحمر 23 مشرق. للإشارة، فإن الفروع الناشئة من الوريد السري عادة تراكب تلك من الشريان السري على سطح المشيمة. على الرغم من أنه كان من الممكن حقن في الشرايين متاهة المشيمة، حقن microbubbles في اتجاه تدفق انخفاض المشيمة النزيف وحقن الوريد يسمح أيضا microbubbles لتمرير مباشرة من خلال الجنين قبل تعميم عشرالخام المشيمة.

نظرا لهشاشتها، وإعداد microbubble والتعامل معها يتطلب أيضا الرعاية. يمكن تدمير microbubbles الموجات فوق الصوتية في بيئات عالية الضغط. ولذلك، وتكررت نفس الإجراء المحدد أثناء تم قياس كل إعادة وفقاعة تركيز لضمان الاتساق التجريبية. وكان من قنينة واحدة من microbubbles عادة ما يكفي لحوالي 5-7 أجنة. منذ microbubbles مستقرة داخل القارورة لمدة تصل إلى 3 ساعات، وغالبا ما يتطلب قوارير متعددة لتجربة واحدة. لتجنب تمزق الأنسجة، وكان من الأفضل للطرف الزجاج إبرة الحقن لتكون حادة وقطع على زاوية طفيف في حين تقترب السفينة في صغيرة زاوية ممكن. مرة واحدة قلص، وكان رأس الإبرة إلى أن تكون كبيرة بما فيه الكفاية لفقاعات بالتدفق بسهولة من خلال نهاية دون تراكمها، ولكن صغيرة بما يكفي لتناسب بسهولة داخل السفينة. وكان حجم المثالي عموما <100 ميكرون. بعض الممارسات في الحكم المناسبكان حجم ضروريا. في حال أن تم قطع رأس كبير جدا، أو أصبحت مسدودة، تم تطبيق إبرة زجاجية جديدة. انها بعض الحالات، كان من الممكن لخفض الإبرة أعلى قليلا من الانسداد. ومن الأهمية بمكان أن الهواء لا يسمح لدخول نظام الأوعية الدموية للجنين أثناء الحقن، لأن ذلك قد يؤدي إلى موت الحيوان، وكان غير مرغوب فيه أثناء التصوير (فقاعات الهواء من تقديم في الأوعية الدموية للجنين ويكون كشف في صورة الموجات فوق الصوتية ، وزيادة مصطنعة أي إشارة المقاسة). التصوير النقيض غير الخطية التي أجريت في هذا البروتوكول يستخدم الدولة من الفن عالية التردد (21 ميغاهيرتز) النظام الصغيرة الموجات فوق الصوتية (Vevo2100) يقترن مع المصفوفات الخطية التي صممت خصيصا لتصوير الحيوانات الصغيرة (MS250). الصغرى أو عالية -ultrasound تردد هي واحدة من عدد قليل من طرائق قادرة، في هذا الوقت، لتوفير صور عالية الدقة من الذين يعيشون أجنة الفئران والأطفال حديثي الولادة 16. يمكن هذا النظام يحقق قرارات محورية والجانبية من 75 ميكرون و 165 μم على التوالي في أعماق كبيرة مثل 15 مم. وبالتالي كان من الممكن لصورة الجنين بأكمله في دقة أعلى بكثير من تحقيقه عادة باستخدام أدوات السريرية وإشارة صوتية من microbubbles يمكن تمييزها عن الأنسجة باستخدام أساليب التصوير النقيض غير الخطية (بما في ذلك انعكاس النبض وتقنيات الترميز السعة 24). على الرغم من أن كان لدينا أفضل النجاح مع إعدادات الموجات فوق الصوتية وصفها هنا، فمن الممكن أن بعض التعديل لهذه المعايير سوف تنتج أيضا نتائج مرضية. في جميع الحالات، لا بد من طاقة منخفضة للتصوير microbubble لتجنب تدمير غير مرغوب فيه من microbubbles قبل الشروع في انفجار، في حين أن انفجار قصيرة يلغي سوى جزء صغير من السكان microbubble. مع الممارسة، فإن الإجراء بأكمله لجنين واحد، من تحديد المواقع لاستكمال التصوير بالموجات فوق الصوتية الجزيئي، استغرق حوالي 15 دقيقة. قمنا بضخ بنجاح ما لا يقل عن 12 الأجنة من القمامة واحد فيجلسة واحدة.

اقتصرت التجارب الحقن لنافذة 4 ساعة نظرا لقابلية محدودة من الأجنة. وبما أن توزيع microbubbles يعتمد على تداول الجنين نفسه، يمكن أن الحقن لا تجري قبل ضربات القلب (E8.5) وتدفق كشفها في المحي والسري تداول (E9.5) تأسست 25. مع نضوج المشيمة لم تكتمل حتى E14.5، وحقن عوامل التباين من خلال متاهة المشيمة اقتصر على الأجنة من منتصف إلى أواخر العمر الحملي. بناء على الملاحظات، كانت الأجنة أقرب إلى مصطلح أكثر صلابة، ويمكن أن تحمل الزيادات في حجمها الأوعية الدموية أفضل من نظرائهم الأصغر سنا. مجتمعة، هذه العوامل المقيدة النقيض تعزيز التصوير بالموجات فوق الصوتية الأوعية الدموية الجنينية إلى مراحل لاحقة من تطور ونمو عائية. وهذا قد يؤثر على توافر نماذج الماوس المعدلة وراثيا، منذ التلاعب مستقبلات تشارك في VASCتطوير الجزيئية والصيانة (على سبيل المثال، VEGFR2، VCAM-1) قد يؤدي إلى الفتك الجنينية أو عيوب في تطوير وتنظيم الدورة الدموية الجنينية 26،27. ومع ذلك، هناك عدد من الأنظمة النموذجية ذات الصلة المتاحة لمؤشرات حيوية الأوعية الدموية في المصالح، بما في ذلك α β 2 1 28، α ضد β 3 29، الصفائح الدموية التصاق الخلايا البطانية جزيء-1 30، والتصاق الخلايا الوعائية جزيء-1 31، بين الخلايا جزيء التصاق -1 32 و -2 33 و ف selectin 34. ما هو أكثر من ذلك، يبدأ تكون الأنسجة الدماغ بعد منتصف الحمل 11، مما يجعل من التعبير عن علامات عائية في هذا النسيج المحتمل وبالتالي توفير بديل ممتاز للنموذج الورم التقليدي للدراسات تقييم الجوانب الكمية للتصوير الجزيئي.

طبيعة خارج الحي من الحقن التي تتيحها بعض limitatioنانوثانية. من المهم أن نلاحظ أن بعد إزالة الأجنة من الأم ومتاهة المشيمة ثقب، كان من عادة غير ممكن (ولا مرغوب فيه) للقيام تكرار الحقن. وبالإضافة إلى ذلك، عزل الجنين من التداول الأمهات يحد من المعروض من المواد الغذائية وO ومن المتوقع الصحية الجنينية في التدهور مع مرور الوقت. في حين تقشعر لها الأبدان وإحياء يطيل من بقاء الأجنة، قد تؤثر أيضا وظيفة القلب. على سبيل المثال، لاحظنا أن الأجنة المعزولة كان لها انخفاض معدل ضربات القلب (بيانات غير المدرجة، راجع Denbeigh وآخرون. 12) مقارنة مع تلك التي لوحظت من قبل في الجسم الحي 35. ولذلك فمن المرجح أن دراسات تقييم فسيولوجيا القلب والأوعية الدموية لن تعكس بدقة في ظروف الجسم الحي. مع قليل من الدراسات التي تميز ديناميكا الدم في الدورة الدموية في الحي الجنين أواخر مرحلة الماوس، ومع ذلك، فمن الصعب أن نقول على وجه اليقين مدى هذه الظروف التجريبية قد ALTإيه وظيفة فسيولوجية. بديل واحد هو إجراء الحقن في الرحم، إما من خلال شق بالمنظار 36 أو من خلال بطن الأم الحامل مباشرة 37، على الرغم من أن هذا النهج قد تقدم مجموعتها الخاصة من تحديات 11. في بعض الحالات، والعزلة وأمور ظاهرية من الجنين قد يؤدي أيضا إلى نزيف كبير من الكيس المحي. على الرغم من أن وجدنا أننا يمكن أن تمنع تدفق الدم مع هلام الموجات فوق الصوتية، يمكن لأي خسائر كبيرة في الدم تؤثر على تسليم وتركيز microbubbles، واستبعدت هذه الحيوانات من التحليل. وأخيرا، في حين العزلة تفعل الأمهات حد ومصادر الجنينية من الحركة، والحركة الدورية المتعلقة بالنشاط القلب أمر لا مفر منه. انتخبنا لصورة الدماغ ثابت من أجل دراسة تأثير مباشر على مستقبلات التعبير على استهداف إشارة microbubble، ولكن تنفيذ في الوقت الحقيقي الحركة تعويض محسنة المقابل الموجات فوق الصوتية التصوير قد 38تمديد هذه الدراسات إلى أعضاء أخرى.

هناك عدد قليل من تطبيقات التصوير التي هي حاليا قادرة على تقييم المشهد الأوعية الدموية الأحياء تطوير الماوس الجنين. وقد أجريت بعض الدراسات بنجاح التصوير الحي من تدفق الدم في السابق أجنة الفئران الحية باستخدام دوبلر اجتاحت مصدر التماسك البصري التصوير المقطعي 39،40، في حين أن التصوير بالرنين المغناطيسي، ويلقي تآكل الأوعية الدموية، والتصوير المقطعي والتصوير المقطعي microcomputed الإسقاط الضوئية قد نفذت بعد الوفاة 16. وهذا أمر مؤسف، لأن هذه الفترة من النمو الجنيني يمكن أن تكشف عن معلومات مهمة بشأن مبكرة تطوير الأوعية الدموية وظيفة. وبالتالي يمكن أن التصوير Microbubble داخل الأجنة الحية تسهم في فهمنا لعلم وظائف الأعضاء التنموي. ويمكن أيضا استخدامه لتصور توزيع العلامات البيولوجية في الجسم كله الجنين الماوس المعيشة في الوقت الحقيقي، على الرغم من أن هذه التقنية غير المرجح أن تحل محل الطرق الحالية (بما في ذلك الأنسجةوالتصوير الفلورسنت) لقياس إشارة الجزيئية في الأنسجة الجنينية. كتلة التطور السريع للسفن في الأجنة، ومع ذلك، يشبه نمو الورم، مع التعبير عن الكثير من نفس مستقبلات الرئيسية المحددة في ورم الأوعية الدموية 41،42، وبالتالي قد تكون بمثابة بديل ممتاز للورم الدراسات دراسة قدرات الكمية للالجزيئي الموجات فوق الصوتية. وبالتالي فإننا نتوقع أن الأساليب المذكورة ستكون مفيدة ليس فقط لتقييم وتوصيف نماذج الجنينية للصحة الأوعية الدموية والمرض من خلال التصوير وظيفية، لكنه لم يقدم وسيلة لاستكشاف نقاط القوة والضعف في التصوير الجزيئي كذلك. قد يمتد تطبيقه أيضا على مجالات أخرى مثيرة للاهتمام من التحقيق، بما في ذلك في الرحم العلاج نقل الجينات حيث تم اختبارها microbubbles كوسيلة لإيصال الدنا العاري إلى الجنين الماوس الأنسجة 10. بدلا من ذلك، 3D رسم الخرائط الأوعية الدموية للجنين العيش من الممكن أيضا،والتي قد توفر معلومات لا تقدر بثمن بالنسبة لتشوهات شكلية في الفئران المعدلة وراثيا. ولذلك يمكن إدخال عوامل التباين الموجات فوق الصوتية في الأجنة الحية معزولة يكون أداة أخرى لزيادة فهمنا للأمراض الأوعية الدموية وترجمة تطبيقات الموجات فوق الصوتية على النقيض محسنة إلى العيادة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48, (2), 92-97 (2009).
  2. Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47, (8), 875-882 (2009).
  3. Cosgrove, D., Lassau, N. Imaging of perfusion using ultrasound. European Journal Of Nuclear Medicine And Molecular Imaging. 37, (S1), 65 (2010).
  4. Williams, R., et al. Dynamic microbubble contrast-enhanced US to measure tumor response to targeted therapy: A proposed clinical protocol with results from renal cell carcinoma patients receiving antiangiogenic therapy. Radiology. 260, (2), 581 (2011).
  5. Burns, P. N., Wilson, S. R. Focal liver masses: Enhancement patterns on contrast-enhanced Images - Concordance of US scans with CT scans and MR images. Radiology. 242, (1), 162 (2006).
  6. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. 40 MHz doppler characterization of umbilical and dorsal aortic Blood flow in the early mouse embryo. Ultrasound. In Medicine And Biology. 26, (8), 1275-1283 (2000).
  7. Phoon, C. K. L., Aristizabal, O., Turnbull, D. H. Spatial velocity profile in mouse embryonic aorta and doppler-derived volumetric flow: A preliminary model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H908-H916 (2002).
  8. Aristizábal, O., Williamson, R., Turnbull, D. H. 12A-4 in vivo 3D contrast-enhanced imaging of the embryonic mouse vasculature. Paper presented at Ultrasonics Symposium. IEEE. New York, NY. (2007).
  9. Bartelle, B. B., et al. Novel genetic approach for in vivo vascular imaging in mice. Circ.Res. 110, (7), 938-947 (2012).
  10. Endoh, M., et al. Fetal gene transfer by intrauterine injection with microbubble-enhanced ultrasound. Molecular Therapy. 5, (5), 501-508 (2002).
  11. Yamada, M., Hatta, T., Otani, H. Mouse exo utero development system: Protocol and troubleshooting. Congenital Anomalies. 48, (4), 183-187 (2008).
  12. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Hudson, J. M., Purin, M. C., Foster, F. S. VEGFR2-targeted molecular imaging in the mouse embryo: An alternative to the tumor model. Ultrasound in medicine and biology. 40, (2), 389-399 (2014).
  13. Paauwe, M., Dijke, ten, P,, Hawinkels, L. J. A. C. Endoglin for tumor imaging and targeted cancer therapy. Expert Opinion On Therapeutic Targets. 17, (4), 421-435 (2013).
  14. Bourdeau, A., Faughnan, M. E., Letarte, M. Endoglin-deficient mice, a unique model to study hereditary hemorrhagic telangiectasia. Trends Cardiovasc. Med. 10, (7), 279-285 (2000).
  15. Whiteley, K. J., Adamson, S. L., Pfarrer, C. D. Vascular corrosion casting of the uteroplacental and fetoplacental vasculature in mice. Placenta And Trophoblast: Methods And Protocols. 121, (121), Humana Press. Totowa, NJ. 371-392 (2006).
  16. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47, (2), 103-10 (2006).
  17. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. 85, (2014).
  18. Willmann, J. K., et al. Targeted contrast-enhanced ultrasound imaging of tumor angiogenesis with contrast microbubbles conjugated to integrin-binding knottin peptides. The Journal of Nuclear Medicine. 51, (3), 433-440 (2010).
  19. Deshpande, N., Ren, Y., Foygel, K., Rosenberg, J., Willmann, J. K. Tumor angiogenic marker expression levels during tumor growth: Longitudinal assessment with molecularly targeted microbubbles and US imaging. Radiology. 258, (3), 804-811 (2011).
  20. Lyshchik, A., et al. Molecular imaging of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression using targeted contrast-enhanced high-frequency ultrasonography. Journal Of Ultrasound In Medicine. 26, (11), 1575-1586 (2007).
  21. Jerkic, M., et al. Endoglin regulates nitric oxide-dependent vasodilatation. The FASEB Journal. 18, (3), 609-611 (2004).
  22. Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Lee, J. J. Y., et al. Contrast-Enhanced Molecular Ultrasound Differentiates Endoglin Genotypes in Mouse Embryos. Angiogenesis. Press. (2014).
  23. Adamson, S. L., Lu, Y., Whiteley, K. J., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250, 358-35 (2002).
  24. Needles, A., et al. Nonlinear contrast imaging with an array-based micro-ultrasound system. Ultrasound. Medicine Biology. 36, (12), 2097 (2010).
  25. Watson, E. D., Cross, J. C. Development of structures and transport functions in the mouse placenta. Physiology. 20, (3), 180-193 (2005).
  26. Shalaby, F., Rossant, J., Yamaguchi, T. P., et al. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. Nature. 376, 62-66 (1995).
  27. Kwee, L., Baldwin, H. S., Shen, H. M., et al. Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice. Development. 121, (1995).
  28. Mercurio, A. M. Lessons from the α2 integrin knockout mouse. The American journal of pathology. 161-163 (2002).
  29. Hodivala-Dilke, K. αvβ3 integrin and angiogenesis: a moody integrin in a changing environment. Curr Opin Cell Biol. 20, 514-519 (2008).
  30. Pysz, M. A., Gambhir, S. S., Willmann, J. K. Molecular imaging: current status and emerging strategies. Clinical radiology. 65, 500-516 (2010).
  31. Cybulsky, M. I., Iiyama, K., Li, H., et al. A major role for VCAM-1, but not ICAM-1, in early atherosclerosis. J Clin Invest. 107, 1255-1262 (2001).
  32. Xu, H., Gonzalo, J. A., St Pierre,, Y,, et al. Leukocytosis and resistance to septic shock in intercellular adhesion molecule 1-deficient mice. J Exp Med. 180, 95-109 (1994).
  33. Gerwin, N., Gonzalo, J. A., Lloyd, C., et al. Prolonged eosinophil accumulation in allergic lung interstitium of ICAM-2-deficient mice results in extended hyperresponsiveness. Immunity. 10, 9-19 (1999).
  34. Johnson, R. C., Mayadas, T. N., Frenette, P. S., et al. Blood cell dynamics in P-selectin-deficient mice. Blood. 86, 1106-1114 (1995).
  35. Corrigan, N., Brazil, D., McAuliffe, F. High-frequency ultrasound assessment of the murine heart from embryo through to juvenile. Reproductive Sciences. 17, (2), 147-14 (2010).
  36. Turnbull, D. H., Bloomfield, T. S., Baldwin, H. S., Foster, F. S., Joyner, A. L. Ultrasound backscatter microscope analysis of early mouse embryonic brain development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 2239-2243 (1995).
  37. Greco, A., Mancini, M. L., Gargiulo, S., et al. Ultrasound Biomicroscopy in Small Animal Research: Applications in Molecular and Preclinical Imaging. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, (2012).
  38. Pysz, M. A., Guracar, I., Foygel, K., Tian, L., Willmann, J. K. Quantitative assessment of tumor angiogenesis using real-time motion-compensated contrast-enhanced ultrasound imaging. Angiogenesis. 15, 433-442 (2012).
  39. Larina, I. V., et al. Live imaging of blood flow in mammalian embryos using doppler swept-source optical coherence tomography. J.Biomed.Opt. 13, (6), 060506-06 (2008).
  40. Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Live imaging of mouse embryos. 4, (4), Cold Spring Harbor. 104-10 (2011).
  41. Teichert, A., et al. Endothelial nitric oxide synthase gene expression during murine embryogenesis. Commencement of expression in the embryo occurs with the establishment of a unidirectional circulatory system. Circulation Research. 103, (1), 24-33 (2008).
  42. Walls, J. R., Coultas, L., Rossant, J., Henkelman, R. M. Three-dimensional analysis of vascular development in the mouse embryo. PLoS One. 3, (8), (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics