उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड का उपयोग माउस भ्रूण में कंट्रास्ट इमेजिंग

Developmental Biology

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Summary

यहाँ, हम जीवन में अल्ट्रासाउंड microbubble विपरीत एजेंटों, पृथक देर हमल चरण murine भ्रूण इंजेक्षन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस विधि छिड़काव मापदंडों की और इसके विपरीत-बढ़ाया उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड इमेजिंग का उपयोग भ्रूण के भीतर संवहनी आणविक मार्कर के अध्ययन के लिए सक्षम बनाता है।

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Denbeigh, J. M., Nixon, B. A., Puri, M. C., Foster, F. S. Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound. J. Vis. Exp. (97), e52520, doi:10.3791/52520 (2015).

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Abstract

Introduction

विपरीत बढ़ाया अल्ट्रासाउंड इमेजिंग कल्पना और संवहनी पर्यावरण चिह्नित करने के लिए microbubble विपरीत एजेंटों का उपयोग करता है। इन एजेंटों microcirculation में, vascularity और हृदय समारोह की noninvasive आकलन कर सकें। इसके अलावा, बुलबुला सतह के संशोधन संभव संवहनी घटनाओं की आणविक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग बनाने एंजियोजिनेसिस, atherosclerosis और सूजन 1,2 के पूर्व नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में प्रदर्शन के रूप में, endothelial बायोमार्कर के लिए बाध्य लक्षित microbubble में परिणाम कर सकते हैं। कंट्रास्ट बढ़ाया अल्ट्रासाउंड इसलिए स्वस्थ और रोगग्रस्त संवहनी राज्यों 3-5 प्रभावित करती है कि जटिल और विविध वातावरण की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

वर्ष के पिछले संख्या में, microbubble इमेजिंग की उपयोगिता में ब्याज बहुमुखी माउस भ्रूण मॉडल के लिए बढ़ा दिया गया है। स्तनधारी विकास का एक मॉडल के रूप में, भ्रूण वाहिका में microbubbles की शुरूआत शारीरिक बढ़ाताविकासशील संचार प्रणाली (उदाहरण के लिए, रक्त प्रवाह, कार्डियक आउटपुट) और ट्रांसजेनिक के मामलों और हृदय रोग 6,7 के लक्षित उत्परिवर्ती माउस मॉडल में, का अध्ययन हृदय समारोह में परिवर्तन कैसे आनुवंशिक कारणों में अंतर्दृष्टि उपज हो सकती है। वास्तव में, मात्रात्मक और गुणात्मक 2D भ्रूण मस्तिष्क वाहिका संरचना का विश्लेषण करती है जो पहले से ही आठ हासिल किया गया है। इसके अलावा, माउस भ्रूण विवो में संवहनी मार्करों के लिए लक्षित microbubbles के बंधन की जांच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल के रूप में प्रस्तुत करता है। Bartelle एट अल। 9, उदाहरण के लिए, Biotag-बीरा ट्रांसजेनिक भ्रूण में बंधन और नाड़ी शरीर रचना की जांच लक्षित आकलन करने के लिए भ्रूण हृदय निलय में avidin microbubbles शुरू की है। क्लिनिक के लिए इस तकनीक का अनुवाद करने में एक महत्वपूर्ण बेंचमार्क - विषमयुग्मजी और समयुग्मक माउस मॉडल की पीढ़ी भी आणविक अल्ट्रासाउंड के मात्रात्मक प्रकृति को परिभाषित करने के लिए लक्ष्य ट्यूमर मॉडल के अध्ययन के लिए एक किराए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

10/08 के माध्यम से अवगत कराया एकल भ्रूण में इंट्रा-हृदय इंजेक्शन के माध्यम से भ्रूण संचलन के लिए पेश कर रहे हैं। utero इंजेक्शन में, हालांकि, अनेक चुनौतियों का सामना करना पड़ता है। ये इंजेक्शन मार्गदर्शन, माँ और exteriorized भ्रूण में गति का मुकाबला करने की जरूरत है, माँ में hemodynamic व्यवहार्यता के रखरखाव और 11 से खून बह रहा की वजह से संज्ञाहरण और जटिलताओं के दीर्घकालिक प्रभावों को संबोधित exteriorized भ्रूण, शामिल हैं। इसलिए, जांच के लक्ष्य को अलग-थलग रहने की देर चरण भ्रूण 12 में microbubbles इंजेक्शन लगाने के लिए एक तकनीक विकसित करने के लिए किया गया था। यह विकल्प इंजेक्शन नियंत्रण और स्थिति, रुकावट के बिना इमेजिंग विमान के reproducibility, और सरल छवि विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के मामले में अधिक स्वतंत्रता प्रदान करता है।

वर्तमान अध्ययन में, हम के लिए रहने वाले murine भ्रूण में microbubbles के इंजेक्शन के लिए एक उपन्यास प्रक्रिया की रूपरेखा तैयारआर microbubble गतिज व्यवहार का अध्ययन करने के लिए और के प्रयोजनों के अंतर्जात endothelial सतह मार्करों के लिए बाध्य microbubble लक्षित का अध्ययन। गैर रेखीय विपरीत विशिष्ट अल्ट्रासाउंड इमेजिंग शिखर वृद्धि (पीई), धोने दर में और समय अलग E17.5 भ्रूण में (टीटीपी) शिखर सहित बुनियादी छिड़काव मापदंडों के एक नंबर के उपाय करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हम यह भी वजह से सक्रिय एंजियोजिनेसिस 13 की साइटों पर संवहनी endothelial कोशिकाओं में अपनी उच्च अभिव्यक्ति के लिए endoglin एक नैदानिक ​​प्रासंगिक लक्ष्य है जहां समारोह ट्रांसजेनिक माउस मॉडल, का एक भ्रूण endoglin नुकसान में आणविक अल्ट्रासाउंड के मात्रात्मक प्रकृति का आकलन करने के लिए भ्रूण मॉडल की वैधता का प्रदर्शन । endoglin-लक्षित, (एमबी ई) चूहा निर्धारण आईजीजी दो नियंत्रण (एमबी सी) और अलक्षित (एमबी यू) microbubbles के आसंजन विषमयुग्मजी endoglin (इंग्लैंड +/-) और समयुग्मक endoglin (इंग्लैंड + / +) व्यक्त भ्रूण में मूल्यांकन किया जाता है। लक्षित बिंदी का विश्लेषणएनजी आणविक अल्ट्रासाउंड endoglin जीनोटाइप के बीच फर्क और quantifiable आणविक अल्ट्रासाउंड स्तर तक रिसेप्टर घनत्व से संबंधित करने में सक्षम है कि पता चलता है।

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Protocol

नोट: इस अध्ययन में प्रदर्शन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं पशु की देखभाल Sunnybrook अनुसंधान संस्थान में समिति (टोरंटो, ओंटारियो, कनाडा) द्वारा अनुमोदित किया गया। पशुओं के मानवीय उपचार के लिए प्रक्रिया सभी समय पर मनाया जाना चाहिए। यह अन्वेषक एक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रणाली की बुनियादी आपरेशन में प्रशिक्षित किया है कि माना जाता है। इस प्रोटोकॉल के दो लोगों के साथ सबसे अच्छा काम करता है।

1. पशु मॉडल

  1. मेट सीडी-एक पुरुष और महिला मस मस्कुलस छिड़काव अध्ययन के लिए जंगली प्रकार भ्रूण प्राप्त करने के लिए।
  2. Bourdeau एट अल। 14 द्वारा वर्णित के रूप में आणविक इमेजिंग अध्ययन के लिए, 129 / ओला मूल के भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का उपयोग मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा इंग्लैंड +/- चूहों उत्पन्न करते हैं।
    1. Backcross B6- इंग्लैंड +/- चूहे, कृपया सीडी-एक पृष्ठभूमि करने के लिए, डॉ मिशेल Letarte से हासिल कर ली। इस्तेमाल की इंग्लैंड +/- सीडी-एक backcrossed भ्रूण है, साथ ही उनके इंग्लैंड + / + littermate सहntrols। मंचन भ्रूण का उत्पादन करने के लिए चूहों दोस्त।

2. प्रायोगिक तैयारी

  1. चूहों के संभोग शुरू करने और दैनिक प्लग की जाँच करें। भ्रूण दिन 0.5 एक योनि प्लग मनाया जाता है दिन के दोपहर के रूप में परिभाषित किया गया है।
  2. 500 के लिए भ्रूण गोजातीय सीरम की 50 मिलीलीटर, 5 1 एम HEPES की मिलीलीटर और पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 मिलीलीटर (10,000 इकाइयों पेनिसिलिन, 10,000 माइक्रोग्राम प्रति स्ट्रेप्टोमाइसिन) जोड़कर भ्रूण मीडिया तैयार मिलीलीटर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम उच्च ग्लूकोज के साथ (DMEM) (4500 मिलीग्राम / एल)। पन्नी में बोतल लपेटें और 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा रखने के लिए।
  3. 20 मिनट के लिए 140 XG पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में अपकेंद्रित्र स्पष्ट अल्ट्रासाउंड जेल। 30 मिलीलीटर सीरिंज में जेल ड्रा। फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और अलग सेट के साथ अतिरिक्त (चिह्नित) 30 मिलीलीटर सीरिंज भरें। भ्रूण के एक कूड़े आम तौर पर अल्ट्रासाउंड जेल के 2-3 सीरिंज और पीबीएस के 4 सीरिंज के बीच की आवश्यकता होगी।
  4. लगभग 30 गिलास सुइयों खींचो और प्लास्टिसिन की एक पट्टी को जकड़ना धीरेएक 100 x 20 मिमी सेल संस्कृति डिश में। यह सुई और अलग से निपटने के दौरान सुरक्षित हैं सुनिश्चित करता है। हीटर 77, उप चुंबक 55, मुख्य चुंबक 70: एक गिलास खींचने का उपयोग, रेशा के साथ 1 एक्स 90 मिमी कांच केशिकाओं पर निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें।
  5. आधार के लिए एजेंट के इलाज के 8 मात्रा अनुपात: एक एक का उपयोग कर, (अपने स्वयं के पकवान प्राप्त होगा एक कूड़े के भीतर प्रत्येक भ्रूण सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त) 10-12 विच्छेदन प्लेटें तैयार करें। एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में आधार के 40 एमएल डालो। 5-6 मिलीलीटर इलाज एजेंट जोड़ें और लकड़ी की छड़ी के साथ हलचल।
    1. लगभग आधा करने के लिए प्रत्येक भरने, 60 x 15 मिमी संस्कृति बर्तन में डालो। स्टैंड हे / एन सेट करने के लिए करते हैं।
  6. (: 0.79 मिमी भीतरी व्यास) polyvinyl क्लोराइड (पीवीसी) ट्यूबिंग के 400 मिमी लंबे टुकड़े करने के लिए महिला LUERS संलग्न। ट्यूबिंग आराम से अल्ट्रासाउंड चरण के लिए सिरिंज पंप से पहुँचना होगा।

3. प्रयोगात्मक सेट अप

  1. एक 3 डी मोटर और रैखिक सरणी 21, महाराष्ट्र के साथ सर्जिकल माइक्रोस्कोप के तहत इमेजिंग मंच की व्यवस्थाZ ट्रांसड्यूसर।
    1. ओरिएंट मंच रेल माउंट इतना है कि माइक्रोस्कोप के नीचे सीधे तैनात मंच के साथ, पर छोड़ दिया है।
    2. मंच का विस्तार देने बांह की गेंद संयुक्त करने के लिए 3 डी मोटर संलग्न। आगे का सामना करना पड़, मोटर पर माउंट जल्दी रिलीज में ट्रांसड्यूसर दबाना की जल्दी रिहाई की पोस्ट पेंच, और कुंडी बन्धन, दबाना में ट्रांसड्यूसर सिर की स्थिति।
    3. गाड़ी के सामने पैनल पर सक्रिय बंदरगाह में ट्रांसड्यूसर कनेक्टर सुरक्षित। मशीन को चालू करें।
  2. आणविक इमेजिंग अध्ययन के लिए 'कार्डियोलॉजी' सेटिंग का चयन, 21 मेगाहर्ट्ज अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर आरंभ, और छिड़काव के अध्ययन के लिए 'सामान्य'। सटीक मध्यम स्थिति को सब समय-लाभ-मुआवजा स्लाइडर्स Shift। आवृत्ति:: 'कंट्रास्ट मोड' के लिए, निम्न मापदंडों सेट 18 मेगाहर्ट्ज, शक्ति संचारित: 30 डीबी, Foci: 4% (0.39 एमपीए), लाभ कंट्रास्ट nonlinear, फट समय: 6 और 10 मिमी, मोड कंट्रास्ट 100% 0.1 परसेकंड, बीम चौड़ाई: वाइड।
  3. विभाज्य 40 मिलीलीटर भ्रूण मीडिया चार 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में प्रत्येक। बर्फ पर रखें।
  4. एक गर्म थाली पर एक दो एल बीकर में पानी की एक एल गरम करें। 45 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। पहले से गरम करने के लिए बीकर के लिए अल्ट्रासाउंड जेल और पीबीएस के एक सिरिंज जोड़ें। हर समय एक थर्मामीटर के साथ निगरानी के द्वारा इस तापमान को बनाए रखें।
  5. बारह 1 मिलीलीटर सीरिंज और microbubbles के इंजेक्शन के लिए दस से 21 बारह जी सुइयों के लिए एक तरफ दस सेट करें।

4. सर्जिकल प्रक्रिया

नोट: सर्जन शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया शुरू करते हुए एक सहायक बुलबुले (चरण 5) तैयार किया है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल Whiteley एट अल से अनुकूलित किया गया है। 15

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था निम्नलिखित गर्भवती महिला माउस से E16.5 या E17.5 भ्रूण लीजिए।
    नोट: भ्रूण पर संज्ञाहरण के प्रभाव को अभी तक विस्तार 16 में अध्ययन नहीं किया गया है। कत्ल सहित अतिरिक्त तरीकों, उचित सेशन हो सकता हैगर्भवती चूहों के बलिदान के लिए माहौल।
    1. गर्भाशय और भ्रूण प्रकट करने के लिए पेट खुले में कटौती। ध्यान से और जल्दी से (डिम्बग्रंथि और गर्भाशय जहाजों विच्छेद) गर्भाशय सींग के सुझावों पर काटने और योनि और मूत्राशय में विच्छेद द्वारा गर्भाशय निकाल दें।
    2. किरच संदंश का प्रयोग, भ्रूण को नुकसान पहुँचाए बिना के रूप में जल्दी संभव के रूप में बर्फ ठंड भ्रूण मीडिया के 40 मिलीलीटर की एक ट्यूब के लिए गर्भाशय हस्तांतरण। माउस शव त्यागें।
  2. माइक्रोस्कोप और मंच को स्थानांतरित। एक 100 x 20 मिमी सेल संस्कृति डिश में गर्भाशय जमा। 50 मिलीलीटर ताजा भ्रूण मीडिया के साथ भरा एक नई डिश में गर्भाशय में स्थानांतरित करें।
  3. धीरे आंसू और एक छोर पर शुरू गर्भाशय की बाहरी झिल्ली दूर खींच, निष्फल (70% इथेनॉल स्प्रे) ठीक संदंश का उपयोग करना। अपरा पतनिका, पार्श्विका जर्दी थैली और अलग और अंतर्निहित आंत की जर्दी थैली से दूर करने के लिए रीचर्ट झिल्ली बेनकाब।
  4. आंत Y रखते हुए एक के बाद एक भ्रूण काटनाolk थैलियों बरकरार है और के रूप में धीरे संभव के रूप में 17 नाल हैंडलिंग। भ्रूण तुरंत बाहर पॉप के रूप में जर्दी थैली का टूटना से बचने के लिए ध्यान रखना।
    1. ताजा भ्रूण मीडिया के साथ बर्फ पर रखा एक और डिश के लिए भ्रूण को स्थानांतरित करने के छिद्रित चम्मच का प्रयोग करें। जब तक जरूरत ठंडा भ्रूण रखें। भ्रूण पकवान में हर 1-1.5 घंटा मीडिया बदलें। इन शर्तों के साथ भ्रूण विच्छेदन के बाद 4 घंटे के लिए सक्षम हैं।

5. Microbubble तैयारी

नोट: दोनों लक्षित और अलक्षित microbubbles का उपयोग कर अल्ट्रासाउंड के साथ आणविक इमेजिंग प्रदर्शन। मैं) एंटीबॉडी लक्षित microbubbles, द्वितीय) नियंत्रण निर्धारण एंटीबॉडी लक्षित microbubbles और तृतीय) अलक्षित microbubbles: एक ही प्रयोग के रूप में कई के रूप में 3 microbubbles की अलग शीशियों की आवश्यकता होती है सकते हैं। इसके विपरीत एजेंट एक सूखे फ्रीज पाउडर के रूप में आता है और इंजेक्शन से पहले नमक के साथ पुनर्गठन किया जाना चाहिए। प्रत्येक अलक्षित microb में ~ 2 एक्स 10 9 microbubbles कर रहे हैंubble शीशी और ~ लक्ष्य तैयार शीशियों में 8.8 एक्स 10 8 microbubbles। microbubbles पुनर्गठन के बाद ऊपर से 3 घंटे के लिए स्थिर रहे हैं।

  1. लक्ष्य तैयार शीशियों के पुनर्गठन
    नोट: लक्ष्य तैयार की तैयारी के उदाहरण: endoglin लक्षित microbubbles (माउस endoglin को biotinylated चूहे एम.जे. 18/07 एंटीबॉडी के साथ एमबी ई,; घर हाइब्रिडोमा सुविधा में); संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (VEGFR2) लक्षित microbubbles (एमबी वी, बायोटिन विरोधी माउस CD309 के साथ); चूहे निर्धारण आईजीजी 2 नियंत्रण एंटीबॉडी लक्षित microbubbles (एमबी सी, बायोटिन चूहे निर्धारण आईजीजी 2 नियंत्रण माउस IgG2a को लक्षित)।
    1. खारा के 1 मिलीलीटर में एंटीबॉडी समाधान (20 माइक्रोग्राम प्रति) (अंतिम मात्रा) पतला। बर्फ पर रखें।
    2. सभी हवाई बुलबुले को दूर करने, 1 मिलीलीटर खारा के साथ सिरिंज भरें। एक 21 जी सुई संलग्न, microbubble शीशी में धीरे-धीरे समाधान इंजेक्षन।
    3. धीरे-धीरे हवा के 1 मिलीलीटर हटाने, सवार को वापस लेने, और सुई वापस ले लें। धीरेआंदोलन। बर्फ पर 5 मिनट खड़े करते हैं।
      नोट: अल्ट्रासाउंड microbubbles उच्च दबाव के वातावरण के तहत नष्ट किया जा सकता है।
    4. बीता हुआ समय के बाद, एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के साथ एक नई सिरिंज भरने के लिए और उचित शीशी में जोड़ें। धीरे आंदोलन। मिश्रण (अब 2 मिलीलीटर) 10 मिनट के लिए खड़े हैं। बर्फ पर रखें। पूरी सतह विकार मानते हुए, microbubbles के लिए बाध्य ligand की औसत संख्या लगभग 18 7600 ligands / माइक्रोन 2 है।
  2. अलक्षित शीशियों के पुनर्गठन
    1. सभी हवाई बुलबुले को दूर करने, 1 मिलीलीटर खारा के साथ सिरिंज भरें। एक 21 जी सुई संलग्न, microbubble शीशी में धीरे-धीरे समाधान इंजेक्षन।
    2. धीरे-धीरे हवा के 1 मिलीलीटर हटाने, सवार को वापस लेने, और सुई वापस ले लें। धीरे आंदोलन। 5 मिनट खड़े करते हैं। ऊपर वर्णित के रूप में, एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर खारा जोड़ें। धीरे आंदोलन और बर्फ पर 10 मिनट खड़े हो जाओ।
  3. कल्टर गिनती
    1. धीरे ~ वांछित microbubble शीशी आंदोलन और आकर्षित21 जी सुई का उपयोग कर एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में समाधान के 50 μl। एक खाली 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में microbubbles इंजेक्षन।
    2. मंदक के 10 एमएल में microbubble शेयर समाधान की एक 10 μl नमूना पिपेट।
    3. कोमल मिश्रण के बाद, कल्टर गिनती (सामग्री की सूची देखें) का उपयोग करके microbubble आबादी की एकाग्रता और आकार वितरण का आकलन करें। एक 30 माइक्रोन एपर्चर का उपयोग कर (शीशी प्रति नमूना) तीन 50 μl माप की एक न्यूनतम गणना।
  4. इंजेक्शन के लिए तैयारी microbubbles
    नोट: 'भ्रूण में microbubbles इंजेक्शन' जब सहायक इस कदम से करता है (चरण 6) शुरू किया है। प्रत्येक भ्रूण प्रत्येक इंजेक्शन के लिए चुना microbubble के प्रकार बेतरतीब ढंग से microbubble के सभी प्रकार के समान रूप से प्रक्रिया भर में वितरित लेकिन एक यादृच्छिक क्रम में दिया जाता है कि इस तरह के सहायक द्वारा चयन किया जाना है, के साथ एक बार इंजेक्शन है। बुलबुला के प्रकार इंजेक्ट किया जा रहा करने के लिए सर्जन अंधा होता है सुनिश्चित करें।
    1. वें निर्धारित बनाने के लिए400 μl की एक मात्रा में एक 10 x 8 एमबी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता का उत्पादन (5.3.3 में मापा शेयर सांद्रता का उपयोग कर मात्रा की गणना) के लिए आवश्यक स्टॉक बुलबुला समाधान की ई की मात्रा। एक खाली microcentrifuge ट्यूब में खारा की इसी मात्रा विभाज्य।
    2. धीरे चयनित microbubble शीशी आंदोलन और 21 जी सुई का उपयोग कर एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में समाधान का (ऊपर गणना की है कि 50 से μl अधिक से अधिक ~) एक अतिरिक्त मात्रा आकर्षित। एक खाली microcentrifuge ट्यूब में microbubbles इंजेक्षन।
    3. Microbubble शेयर समाधान के लिए आवश्यक मात्रा पिपेट और खारा के विभाज्य में जोड़ें। पिपेट की नोक के साथ धीरे सरगर्मी से मिलाएं।
    4. 21 जी सुई का उपयोग कर एक साफ सिरिंज में पतला microbubble समाधान ड्रा। सुई निकाल रहा है, सिरिंज से किसी भी हवाई बुलबुले को खत्म करने और luer और ट्यूबिंग देते हैं। धीरे धीरे किसी भी हवाई बुलबुले उत्पन्न करने के लिए यकीन नहीं कर ट्यूबिंग बनाने के अंत का हल धक्का।
    5. Syrin डालें20 μl की कुल मात्रा के लिए 20 μl / मिनट की दर से microbubbles बांटना करने के लिए सेट एक सिरिंज आसव पंप में जीई। ट्यूबिंग का अंत करने के लिए एक खींच गिलास सुई संलग्न। इंजेक्शन मंच के करीब पंप ले जाएँ।

भ्रूण में microbubbles 6. इंजेक्शन

  1. बेतरतीब ढंग से चयन करें और ठंडा मीडिया पकवान से (छिद्रित चम्मच के साथ) एक भ्रूण को हटा दें। स्टिरियोस्कोप के तहत अल्ट्रासाउंड मंच पर स्थित विच्छेदन डिश में रखें और कम से कम vascularized प्रतीत होता है कि पक्ष (antimesometrial की ओर) से फाड़ / काटना, ठीक संदंश के साथ जर्दी थैली और एमनियोटिक झिल्ली को हटा दें। यह सबसे आसानी से सिर क्षेत्र से सटे एक क्षेत्र भेदी द्वारा हासिल की है।
    1. भीतर से भ्रूण को दूर करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन कोई अधिक काटें। प्लास्टिसिन के छोटे टुकड़े का उपयोग कर विच्छेदन व्यंजन स्थिर।
  2. धीरे भ्रूण के चारों ओर से थैली छल। अपरा के साथ, उसकी तरफ से भ्रूण की स्थिति औरसामने नाल वाहिकाओं। जर्दी थैली नीचे पिन, कीट पिन का उपयोग (4 पिन) की सिफारिश की और आवश्यक के रूप में नाल के किनारों जगह में प्रत्यय। प्रमुख वाहिकाओं से बचें।
  3. भ्रूण जान तक पूर्व गर्म 45 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ भ्रूण धो लें। नाल की नस और उसके संबंधित संवहनी नेटवर्क को पहचानें। इंजेक्शन आराम से किया जा सकता है, ताकि पकवान स्थिति।
    नोट: गरम करने के बाद, भ्रूण में रक्त दिख नाल धमनी में पम्पिंग, प्रवाह शुरू हो जाएगा। प्रवाह पहले शुरू होता है, नसों दोनों जहाजों जल्दी से समान दिखने के में खून के साथ, एक चमकदार लाल हो जाएगा। नाल की नस से उत्पन्न होने वाली शाखाओं आमतौर पर अपरा सतह पर नाल धमनी से उन उपरिशायी।
  4. भ्रूण पुनर्जीवित किया गया है एक बार, नाजुक भ्रूण के चारों ओर से (ठीक संदंश का प्रयोग करके) किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है, पूर्व गर्म अमेरिका जेल के साथ यह (नहीं बल्कि नाल) को कवर किया। पूर्व गर्म पीबीएस के साथ पकवान ऊपर।
    नोट: soluti के स्तर पर नज़र रखेंजरूरत के रूप में और पीबीएस और जेल सीरिंज में हीटिंग बीकर करने के लिए बैकअप सीरिंज जोड़ें।
  5. विच्छेदन पकवान के किनारे पर प्लास्टिसिन की एक बड़ी गेंद पर कांच सुई माउंट और पीबीएस में सुई अंत डालें। के रूप में दूर मुख्य शाखा से, के रूप में उचित अपरा डिस्क की कोरियोनिक सतह पर एक नस का चयन, कैंची का उपयोग आकार को टिप ट्रिम। टिप एक मामूली कोण पर काट रहा है अगर इंजेक्शन के लिए सबसे आसान है। वसंत कैंची की धार का प्रयोग कांच के किसी भी दांतेदार किनारों निकालें।
  6. हवा के सभी सुई की नोक से निष्कासित कर दिया है और microbubbles पीबीएस में स्वतंत्र रूप से प्रवाह को देखा जा सकता है जब तक सिरिंज पंप का उपयोग कर, धीरे-धीरे गिलास सुई में 20 μl / मिनट पर microbubble समाधान इंजेक्षन। पंप बंद करो और 20 μl का एक इंजेक्शन की मात्रा के लिए रीसेट। हवा इंजेक्शन के दौरान भ्रूण की नाड़ी तंत्र में प्रवेश करने की अनुमति न दें।
  7. नाल में धीरे नसों में से एक में कांच सुई टिप डालें और यह स्थिर है सुनिश्चित करते हैं। Stere दूर घुमाओoscope सिर और स्थिति भ्रूण से ऊपर ट्रांसड्यूसर। इमेजिंग आरंभ करें।

7. अल्ट्रासाउंड आण्विक इमेजिंग

नोट: पहले से निर्धारित विपरीत अरेखीय इमेजिंग शर्तों का उपयोग, भ्रूण 6 और 10 मिमी foci के बीच समान रूप से स्थित है इसलिए कि ट्रांसड्यूसर की स्थिति। एक बार तैनात, microbubbles की सांस में इंजेक्शन शुरू करते हैं। इंजेक्शन पूरा हो गया है, टाइमर शुरू करते हैं।

  1. छिड़काव इमेजिंग
    1. अरेखीय विपरीत मोड के लिए तख्ते की अधिकतम संख्या 'अध्ययन प्रबंधन' बटन दबाने और अध्ययन ब्राउज़र के शीर्ष पर 'वरीयता' टैब पर क्लिक करके चुना जाता है सुनिश्चित करें। 'प्राथमिकताएं' विंडो में उपयुक्त बॉक्स की जाँच करें।
    2. अरेखीय इमेजिंग शुरू करके इमेजिंग सेटिंग्स समायोजित करें। नियंत्रण कक्ष पर 'इसके विपरीत मोड' बटन दबाएँ। 'लाभ & # समायोजन करके 2D लाभ को परिष्कृत8217; 30 डीबी के लिए डायल 'शक्ति' डायल का उपयोग कर 4% करने की शक्ति को कम करने, 'आवृत्ति' डायल और विस्तृत रोलर गेंद / माउस का उपयोग करने के लिए बीम चौड़ाई (नीचे बाएँ कोने) सेट का उपयोग कर एक हर्ट्ज आवृत्ति में कमी।
      नोट: सभी नियंत्रण अल्ट्रासाउंड प्रणाली के नियंत्रण कक्ष पर स्थित हैं।
    3. 1 हर्ट्ज की एक फ्रेम दर पर एक 20 मिनट के सिने पाश रिकॉर्डिंग से microbubble सांस की पूरी धोने में और अपव्यय पर कब्जा। प्रेस स्कैन / फ्रीज डाटा अधिग्रहण शुरू करने के लिए।
    4. छवियों से भरा अनुक्रम कब्जा कर लिया गया है, एक बार प्रणाली बफर में छवियों के अनुक्रम को बचाने के लिए नियंत्रण कक्ष पर स्थित 'सिने दुकान' बटन दबाएँ। प्रणाली का अधिग्रहण अरेखीय विपरीत मॉडल डेटा की एक तारीख की मुहर लगी सिने पाश बनाता है।
  2. लक्षित Microbubble इमेजिंग
    1. 'वरीयता' के तहत, 0.1 सेकंड के लिए फट समय निर्धारित किया है। नियंत्रण देस का उपयोग कर उचित इमेजिंग मापदंडों सेटइसके बाद के संस्करण cribed (7.1.2।)।
    2. नियंत्रण कक्ष पर 'इसके विपरीत मोड' बटन दबाकर अरेखीय विपरीत इमेजिंग आरंभ करें। भ्रूण ठीक से ट्रांसड्यूसर के तहत और भ्रूण के माध्यम से microbubble विपरीत एजेंट के प्रवाह अरेखीय विपरीत मोड छवि में दिख रहा है कि स्थित है सुनिश्चित करें।
    3. भ्रूण आणविक इमेजिंग अध्ययन के दौरान बाध्यकारी लक्षित microbubble का आकलन करने के लिए, microbubbles 3 मिनट और इंजेक्शन के पूरा होने के बाद 40 सेकंड के लिए अबाधित प्रसारित करने की अनुमति देते हैं। इस बार परिसंचारी microbubbles की अवधारण की अनुमति है। प्रेस 'स्कैन / फ्रीज' इस समय के दौरान इमेजिंग रोकने के लिए।
    4. 3 मिनट और 40 सेकंड में, फिर से शुरू इमेजिंग भ्रूण पर्याप्त रूप से पीबीएस के साथ कवर किया जाता है, अभी भी दिखाई दे रहा है कि पुष्टि करने के लिए, और microbubbles प्रसारित करने के लिए जारी है। प्रेस 'स्कैन / फ्रीज' इमेजिंग आरंभ करने के लिए।
    5. एक 'पूर्व destruc रिकॉर्डिंग से 3 मिनट और 50 सेकंड के पद इंजेक्शन में व्यवधान / पुनःपूर्ति अनुक्रम मोल29 हर्ट्ज पर tion के 'ध्वनिक प्रतिक्रिया अनुक्रम। प्रेस 'स्कैन / फ्रीज' डाटा अधिग्रहण शुरू करने के लिए। 4 मिनट पद इंजेक्शन 18,19 में, एक 0.1 सेकंड उच्च आवृत्ति ध्वनिक फट आरंभ करें। एक फट लागू करने के लिए 'फट' बटन दबाएँ।
    6. (बफर लाइन भरा हुआ है जब तक) अनुक्रम के शेष के लिए फ्रेम रिकॉर्ड और 'सिने दुकान' दबाकर सिने पाश को बचाने के लिए आगे बढ़ें।
    7. Microbubbles परिसंचारी के एक अतिरिक्त सिने पाश लीजिए। यह बाद में 'पोस्ट-विनाश' इमेजिंग अनुक्रम किरण मंगाया है कि केवल परिसंचारी बुलबुला संकेतों को रोकने के लिए माना जाता है। प्रेस 'स्कैन / फ्रीज' छवियों को इकट्ठा करने के लिए इमेजिंग और 'सिने दुकान' आरंभ करने के लिए।
    8. प्रत्येक भ्रूण इमेजिंग के बाद सिने छोरों लेबल। प्रेस 'अध्ययन प्रबंधन', रोलर गेंद का उपयोग कर फ़ाइल पर प्रकाश डाला और उचित बटन, प्रेस 'छवि लेबल' और 'नाम' चुनें।

    इंजेक्शन के बाद भ्रूण की 8. हैंडलिंग

    1. पोस्ट इमेजिंग, के रूप में वांछित (कत्ल, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था, कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation, या तेजी से ठंड या निर्धारण द्वारा पीछा संज्ञाहरण के माध्यम से), ट्रांसड्यूसर को स्थानांतरित भ्रूण खोल देना और euthanize।
    2. प्रत्येक बाद भ्रूण इंजेक्शन के लिए एक ताजा विच्छेदन पकवान, सुई, सिरिंज और टयूबिंग खंड विच्छेदन और पुनरुद्धार के दौरान microbubble इंजेक्शन समाधान जगह लेने के अगले बैच की तैयारी के साथ, इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
    3. अतिरिक्त विश्लेषण के लिए ऊतक के नमूने (जैसे, पूंछ, मस्तिष्क) सहेजें (जैसे, पृथक पूंछ डीएनए, lacZ धुंधला हो जाना, या पश्चिमी blots 21 का उपयोग कर बायोमार्कर अभिव्यक्ति की अर्द्ध मात्रात्मक उपायों की पीसीआर विश्लेषण द्वारा निर्धारित जीनोटाइपिंग)।

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Representative Results

पूर्व utero माउस भ्रूण में अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंटों के इंजेक्शन इंजेक्शन और संबंधित अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के पाठ्यक्रम पर गर्भाशय और व्यवहार्यता के रखरखाव से रहते हैं, देर-गर्भावधि चरण भ्रूण के सफल अलगाव पर निर्भर है। भ्रूण exteriorized और चित्रा 1 में दिखाया गया है, के रूप में तैनात किया गया है, भ्रूण वाहिका में विपरीत एजेंट से सावधान इंजेक्शन संभव है। एक E17.5 माउस भ्रूण का एक विशिष्ट बी मोड अल्ट्रासाउंड छवि 2A चित्रा में दिखाया गया है। microbubbles के धोने में और इसी वृद्धि अवर रग Cava में, हृदय, मस्तिष्क, और पूरे जानवर में है, जिससे इस तकनीक की व्यवहार्यता का प्रदर्शन, Nonlinear विपरीत इमेजिंग तरीकों का उपयोग कर कब्जा कर लिया जा सकता है। व्यक्तिगत समय बिंदुओं चित्रा 2B में दिखाया गया है और समय के साथ इसके विपरीत में परिवर्तन दिखा रहे हैं।

पूरे धोने में रिकॉर्डिंग और धो-बाहर ओ द्वाराmicrobubble सांस च, यह विभिन्न छिड़काव मापदंडों को मापने के लिए संभव है। एक ऑफ़लाइन विश्लेषण में, इसके विपरीत क्षेत्र का पता लगाने के उपकरण भ्रूण बाएँ और दाएँ मस्तिष्क गोलार्द्धों के हित में 1.5 मिमी दो क्षेत्रों (आरओआई) बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इन ROIs के भीतर औसत संकेत तीव्रता तो समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट और एक सात बिंदु मंझला फिल्टर का उपयोग smoothed किया गया था। (चित्रा -2 में दिखाया गया है) जिसके परिणामस्वरूप विपरीत तीव्रता वक्र से, मस्तिष्क शिखर वृद्धि निर्धारित किया गया था। 10% और अधिकतम चोटी वृद्धि (पीई) का 50% के बीच ढाल के रूप में परिभाषित धोने दर में, यह भी गणना की गई। अंत में, पीक करने के लिए समय (टीटीपी) पीक समय के लिए संकेत वृद्धि की शुरुआत से गणना की गई थी। अलग बुलबुला प्रकार भर मतलब छिड़काव मापदंडों में मतभेद अलग टी परीक्षण 12 का उपयोग कर परीक्षण किया गया। तालिका 1 में संक्षेप ये परिणाम, microbubbles के इंजेक्शन एक valu प्रदान करता है का प्रदर्शनविकासात्मक माउस में महत्वपूर्ण छिड़काव मापदंडों का पता लगाने के लिए सक्षम विधि।

भ्रूण वाहिका में microbubbles का परिचय भी परिभाषित करने और आणविक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के मात्रात्मक क्षमता चिह्नित करने के लिए मॉडल प्रणाली के रूप में माउस भ्रूण का उपयोग सक्षम बनाता है। निम्न उदाहरण में, आनुवंशिक हेरफेर भ्रूण चूहों में endoglin की विषमयुग्मजी और समयुग्मक अभिव्यक्ति पैटर्न उत्पन्न जहां समारोह मॉडल की एक हानि, जीनोटाइप के बीच अंतर करने के लिए आणविक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग की क्षमता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। Microbubble इंजेक्शन और विनाश / पुनःपूर्ति इमेजिंग के कार्यान्वयन के बाद, 'पद-विनाश' दृश्यों के लिए 'पूर्व विनाश' की औसत संकेत तीव्रता के अनुपात (इसके विपरीत बिजली अनुपात मतलब बुलाया CMPR आणविक संकेत का एक उपाय के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया था )। (एकाधिक तुलना के लिए बनाया Bonferroni समायोजन के साथ) एक रेखीय मिश्रित मॉडल डब्ल्यू पता लगाने के लिए प्रदर्शन किया था hether इंग्लैंड / + + या इंग्लैंड +/- भ्रूण (पूंछ नमूनों की पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के माध्यम से पहचान पोस्ट इंजेक्शन) के लिए बाध्य endoglin लक्षित, नियंत्रण और अलक्षित microbubble के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर था। अनुमानित CMPR साधन (मतलब 95% विश्वास अंतराल (सीआई) ±) चित्रा 3 में प्रत्येक microbubble और भ्रूण प्रकार के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं और तालिका 2 में संक्षेप हैं।

इन निष्कर्षों को अलग-थलग रहने वाले भ्रूण में अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंटों के इंजेक्शन प्राप्त किया जा सकता है कि एक ठोस प्रदर्शन प्रदान करते हैं। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल छिड़काव मापदंडों के आकलन की सुविधा और आणविक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग की क्षमताओं को स्पष्ट करने के प्रयास में रोग की भ्रूण मॉडल में बाध्यकारी लक्षित microbubble तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

जेपीजी "/>
चित्रा 1. प्रायोगिक पृथक भ्रूण में microbubbles के इंजेक्शन के लिए सेट अप। एक 20 μl microbubble समाधान के लिए एक गिलास प्रवेशनी का उपयोग कर एक अपरा नस में इंजेक्शन के रूप में एक 21 मेगाहर्ट्ज रैखिक सरणी ट्रांसड्यूसर एक exteriorized रहने E16.5 भ्रूण के ऊपर तैनात है। स्केल बार = 10 मिमी। Denbeigh से, जेएम एट अल। अनुमति के साथ 12। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. exteriorized लिविंग E17.5 भ्रूण की अल्ट्रासाउंड इमेजिंग। (ए) के एक भ्रूण के बी मोड अल्ट्रासाउंड छवि। पहले लक्षित microbubbles (टी = 0 एसईसी) के इंजेक्शन के लिए। (बी) के पहले और microbubbles के इंजेक्शन के बाद भ्रूण की गैर रेखीय विपरीत छवि। Nonlinear विपरीत छवि प्राथमिकया इंजेक्शन (टी = 0 सेकंड) microbubble करने के लिए। केवल दृढ़ता को दर्शाती इंटरफेस (जैसे, हड्डी) मुलायम ऊतकों से कम से कम संकेत के साथ दिखाई दे रहे हैं। नीचे, एक सांस में इंजेक्शन के बाद टी = 50 सेकंड, टी = 120 सेकंड और टी = 420 सेकंड में भ्रूण के भीतर microbubbles के nonlinear विपरीत छवि। कंट्रास्ट हृदय और मस्तिष्क सहित पशु, भर में पाया जाता है। समय तीव्रता से घटता से व्युत्पन्न (सी) छिड़काव मापदंडों। भ्रूण के मस्तिष्क में एक भी आरओआई के भीतर समय के एक समारोह के रूप में microbubbles की तीव्रता साजिश है। छिड़काव मापदंडों शिखर वृद्धि (पीई), धो-इन दर (ढलान), और (टीटीपी) शिखर करने के लिए समय भी शामिल है, ग्राफ पर पहचाने जाते हैं। तीर: आर = पसलियों, हिंदुस्तान टाइम्स = दिल, बीआर = मस्तिष्क। मनमाना इकाइयों, ए.यू.; रॉय, ब्याज के क्षेत्र; सेकंड, सेकंड। स्केल बार = 3 मिमी। यह आंकड़ा Denbeigh से संशोधित किया गया है जेएम एट अल। 12। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े के संस्करण।

चित्र तीन
इंग्लैंड + में (एमबी ई) लक्षित endoglin, नियंत्रण (एमबी सी) और अलक्षित microbubbles (एमबी यू) के लिए चित्रा 3. औसत विपरीत का सारांश मतलब सत्ता अनुपात (CMPR) / + और ​​इंग्लैंड +/- भ्रूण। Endoglin से CMPRs लक्षित microbubbles (चाहे जीनोटाइप की, एक दूसरे से काफी अलग नहीं), (***, पी <0.001) एमबी सी और एम बी यू के लिए एकत्र उन लोगों की तुलना में काफी अधिक थे। एमबी बाध्यकारी की तुलना में इंग्लैंड + / + भ्रूण (अंधेरे मार्कर) में काफी अधिक हो पाया थाइंग्लैंड +/- भ्रूण (प्रकाश मार्कर)। परिणाम मतलब ± 95% विश्वास अंतराल के रूप में प्रस्तुत किया। एन प्रत्येक श्रेणी में अद्वितीय भ्रूण की संख्या को इंगित करता है। Denbeigh से, जेएम एट अल। अनुमति के साथ 22। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Microbubble प्रकार टी परीक्षण
पी मूल्य
छिड़काव पैरामीटर एमबी यू एमबी सी एमबी वी एमबी सी बनाम एमबी यू एमबी वी बनाम एमबी यू एमबी <एमबी वी बनाम उप> सी
पीक संवर्धन, पीई (एयू) 0.427 ± 0.063 0.490 ± 0.079 0.499 ± 0.064 0.19 0.06 0.81
धो-इन दर (एयू / सेक) 0.008 ± 0.002 0.009 ± 0.002 0.011 ± 0.002 0.18 0.01 0.09
पीक, टीटीपी (एसईसी) के लिए समय 53.75 ± 7.96 51.75 ± 4.46 45.00 ± 5.33 0.55 0.03 0.03
# भ्रूण इंजेक्ट 4 4 3

टेबल E17.5 भ्रूण छिड़काव मापदंडों के 1. सारांश। सभी भ्रूण ROIs के लिए समय तीव्रता भूखंडों से निकाली गई ± मानक विचलन (एक मतलब।यू के। = मनमाना इकाइयों)। तालिका अलक्षित के लिए माप (एमबी यू) भी शामिल है, आईजीजी दो नियंत्रण (एमबी सी) को निशाना बनाया और VEGFR2 (एमबी वी) microbubbles को निशाना बनाया। अलग टी परीक्षण समूहों की तुलना करने के लिए प्रदर्शन कर रहे थे। इस तालिका में Denbeigh, जेएम एट अल। 12 से संशोधित किया गया है।

Microbubble प्रकार जीनोटाइप CMPR मीन 95% विश्वास अंतराल
एमबी इंग्लैंड + / + 9.71 9.05, 10.38
इंग्लैंड +/- 5.51 4.87, 6.15
एमबी सी इंग्लैंड + / + 1.42 0.41, 2.43
इंग्लैंड +/- 1.46 0.45, 2.47
एमबी यू इंग्लैंड + / + 1.7 0.65, 2.75
इंग्लैंड +/- 1.76 0.67, 2.84
रैखिक मिश्रित मॉडल: के बीच इस विषय प्रभाव
DF एफ पी मूल्य
जीनोटाइप 1 12.75 <0.001
Microbubble प्रकार 2 147.65 <0.001
जीनोटाइप * Microbubble प्रकार 2 18.29 <0.001

के लिए रेखीय मिश्रित मॉडल विश्लेषण तालिका 2 सारांशmicrobubble एकाधिक तुलना के लिए एक Bonferroni सुधार के साथ, भ्रूण में बाध्यकारी। जीनोटाइप, microbubble प्रकार और संयुक्त बातचीत (जीनोटाइप * microbubble प्रकार) CMPR का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण कारक होना पाया गया है। आजादी के DF = डिग्री। Denbeigh से, जेएम एट अल। अनुमति के साथ 22।

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Discussion

अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंटों देर चरण हमल माउस भ्रूण और nonlinear विपरीत छवियों में इंजेक्शन थे छिड़काव मापदंडों को मापने के लिए अधिग्रहण कर लिया और बाध्यकारी microbubble निशाना बनाया गया। भ्रूण vasculature के भीतर microbubbles के सफल इमेजिंग कारकों की एक संख्या है, पहले की जा रही भ्रूण व्यवहार्यता पर निर्भर था। सभी उपकरण और उपकरण इंजेक्शन के शुरू करने के गर्भाशय से भ्रूण के अलगाव के लिए आवश्यक समय को कम करने के क्रम में पहले से तैयार थे। भ्रूण चूहों पर संज्ञाहरण के लिए एक या कई बार प्रदर्शन के प्रभाव को विस्तार से अध्ययन नहीं किया गया है के बाद से, माँ में संज्ञाहरण का उपयोग करने से पहले बचा 16 बलिदान था। भ्रूण अलगाव के दौरान, यह जर्दी थैली को होने वाले नुकसान को रोकने के लिए और भ्रूण अक्सर ताजा भ्रूण मीडिया में हर समय ठंडा रखा गया था सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण था। इंजेक्शन के लिए पहले और लगाए दौरान भ्रूण exteriorizing है, जब प्रमुख पीतक जहाजों likelihoo को सीमित करने से परहेज कर रहे थेघातक हो सकता है, जो खून बह रहा है, के डी। हम भ्रूण को पुनर्जीवित करते हैं, तो यह पहली बार एक आगे और पीछे गति में भ्रूण अल्ट्रासाउंड जेल लागू करने और संदंश के साथ किसी भी बड़े बुलबुले हटाने से पहले, पीबीएस के साथ नाल और फिर भ्रूण को कवर करने के लिए सबसे अच्छा था कि पाया। पेट्री डिश के शेष तो पीबीएस के साथ भरा हुआ था। जेल और पीबीएस के उपयोग छवि गुणवत्ता पर प्रभाव पड़ सकता है, जो भ्रूण और transducer के बीच हवा जेब की संभावना सीमित है। भ्रूण को पुनर्जीवित के रूप में, खून नाल नसों 23 लाल उज्ज्वल दिखाई दिया, जबकि दिख नाल धमनी में पम्पिंग, प्रवाह करने के लिए शुरू किया। संदर्भ के लिए, नाल की नस से उत्पन्न होने वाली शाखाओं आमतौर पर अपरा सतह पर नाल धमनी से उन उपरिशायी। यह प्रवाह में कमी अपरा खून बह रहा है और venule इंजेक्शन की दिशा में microbubbles इंजेक्शन लगाने, अपरा भूलभुलैया धमनियों में इंजेक्षन करने के लिए संभव हो गया था हालांकि यह भी वें परिसंचारी से पहले भ्रूण के माध्यम से सीधे पारित करने के लिए microbubbles की अनुमति दीकिसी न किसी नाल।

कारण उनकी कमजोरी को, microbubble तैयारी और हैंडलिंग भी देखभाल की आवश्यकता है। अल्ट्रासाउंड microbubbles उच्च दबाव के वातावरण के तहत नष्ट किया जा सकता है। प्रत्येक पुनर्गठन और बुलबुला एकाग्रता प्रयोगात्मक स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए मापा गया था दौरान इसलिए, ठीक उसी प्रक्रिया को दोहराया गया था। Microbubbles की एक एकल शीशी के बारे में 5-7 भ्रूण के लिए आम तौर पर पर्याप्त था। Microbubbles 3 घंटा अप करने के लिए शीशी के भीतर स्थिर रहे हैं के बाद से, कई शीशियों अक्सर एक ही प्रयोग के लिए आवश्यक थे। ऊतक फाड़ से बचने के लिए, यह इंजेक्शन सुई का गिलास टिप के लिए सबसे अच्छा तेज हो सकता है और संभव के रूप में छोटे रूप में एक कोण पर पोत के करीब पहुंच, जबकि एक मामूली कोण पर कटौती करने के लिए किया गया था। एक बार छंटनी की है, सुई की नोक बुलबुले clumping के बिना अंत के माध्यम से आसानी से प्रवाह करने के लिए काफी बड़े होने के लिए था, लेकिन पोत के भीतर आसानी से फिट करने के लिए काफी छोटा। आदर्श आकार आम तौर पर था 100 माइक्रोन <। उपयुक्त पहचानने में कुछ अभ्यासआकार जरूरी हो गया था। टिप भी बड़े कट गया था, या अवरुद्ध हो गया है कि घटना में, एक नए गिलास सुई लागू किया गया था। यह कुछ मामलों में, यह थोड़ा रुकावट से ऊपर सुई ट्रिम करने के लिए संभव था। यह इस पशु की मौत हो सकती थी, के रूप में हवा इंजेक्शन के दौरान भ्रूण की नाड़ी तंत्र में प्रवेश करने की अनुमति नहीं दी है कि महत्वपूर्ण था और हवा के बुलबुले भ्रूण की vasculature में लॉज और अल्ट्रासाउंड छवि में detectable हो सकता है (इमेजिंग के दौरान अवांछनीय था , कृत्रिम रूप से) किसी भी मापा संकेत बढ़ रही है। इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन nonlinear विपरीत इमेजिंग विशेष रूप से छोटे जानवर इमेजिंग (MS250) के लिए बनाया गया रेखीय सरणियों के साथ रखा कला उच्च आवृत्ति (21 मेगाहर्ट्ज) सूक्ष्म अल्ट्रासाउंड प्रणाली (Vevo2100) के एक राज्य का उपयोग किया। सूक्ष्म या उच्च आवृत्ति -ultrasound इस समय, murine भ्रूण और नवजात शिशुओं को 16 रहने की उच्च संकल्प छवियों को प्रदान करने के लिए, सक्षम कुछ तौर-तरीकों में से एक है। इस प्रणाली में 75 माइक्रोन और 165 μ का अक्षीय और पार्श्व प्रस्तावों को प्राप्त कर सकते हैंक्रमश: 15 मिमी के रूप में के रूप में महान गहराई में एम। यह आमतौर पर नैदानिक ​​उपकरणों का उपयोग कर हासिल की है और microbubbles से ध्वनिक संकेत (नाड़ी उलटा और आयाम मॉड्यूलन तकनीकों 24 सहित) अरेखीय विपरीत इमेजिंग तरीकों का उपयोग ऊतक से प्रतिष्ठित किया जा सकता है बहुत अधिक से अधिक प्रस्तावों पर इसलिए छवि पूरे भ्रूण के लिए संभव था। हम यहाँ वर्णित अल्ट्रासाउंड सेटिंग्स के साथ सबसे अच्छी सफलता मिली है, यह इन मानकों करने के लिए कुछ समायोजन भी संतोषजनक परिणाम का उत्पादन होगा कि संभव है। सभी मामलों में, एक कम शक्ति कम फट microbubble जनसंख्या का केवल एक छोटा सा अंश को समाप्त करते हुए, एक पटाखे की दीक्षा से पूर्व microbubbles की अवांछनीय विनाश से बचने के लिए microbubble इमेजिंग के लिए आवश्यक है। अभ्यास के साथ, एक ही भ्रूण के लिए पूरी प्रक्रिया, आणविक अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के पूरा होने से स्थिति से, लगभग 15 मिनट लग गए। हम सफलतापूर्वक में एक कूड़े से 12 भ्रूण के रूप में कई के रूप में इंजेक्ट किया हैएक ही सत्र।

इंजेक्शन प्रयोगों के कारण भ्रूण की सीमित व्यवहार्यता के लिए एक 4 घंटा खिड़की करने के लिए प्रतिबंधित किया गया। Microbubbles के वितरण के भ्रूण में ही के संचलन पर निर्भर था, इंजेक्शन पीतक और नाल परिसंचरण (E9.5) में दिल की धड़कन (E8.5) और पता लगाने योग्य प्रवाह से पहले जगह नहीं ले सकता है 25 स्थापित किया गया था। E14.5 जब तक पूरा नहीं नाल की परिपक्वता के साथ, अपरा भूलभुलैया के माध्यम से विपरीत एजेंटों के इंजेक्शन देर गर्भावधि उम्र के मध्य की भ्रूण तक ही सीमित था। टिप्पणियों के आधार पर, इस शब्द के नजदीक भ्रूण hardier थे और उनके छोटे समकक्षों की तुलना में बेहतर उनकी नाड़ी की मात्रा में वृद्धि का सामना कर सकता। संयुक्त, विकास और वाहिकाजनक वृद्धि के बाद के चरणों के लिए भ्रूण vasculature की विपरीत बढ़ाया अल्ट्रासाउंड इमेजिंग प्रतिबंधित इन कारकों। रिसेप्टर्स के हेरफेर vasc में शामिल इस के बाद से, ट्रांसजेनिक माउस मॉडल की उपलब्धता को प्रभावित कर सकता हैular विकास और रखरखाव (जैसे, VEGFR2, Vcam-1) भ्रूण मारक या विकास में दोष और भ्रूण संचार प्रणालियों 26,27 के नियमन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। फिर भी, प्रासंगिक मॉडल प्रणालियों के एक नंबर अणु-1 31, कहनेवाला आसंजन अणु α 2 β 1 28, α वी β 3 29, प्लेटलेट endothelial सेल आसंजन अणु-1, 30 और नाड़ी कोशिका आसंजन ब्याज सहित संवहनी बायोमार्कर, के लिए उपलब्ध हैं -1 32 और -2 के 33 और पी selectin 34। क्या अधिक है, मस्तिष्क ऊतकजनन संभावना इस ऊतक में वाहिकाजनक मार्करों की अभिव्यक्ति कर रही है और इस तरह आणविक इमेजिंग के मात्रात्मक पहलुओं का आकलन करने के अध्ययन के लिए पारंपरिक ट्यूमर मॉडल के लिए एक शानदार विकल्प उपलब्ध कराने, मध्य हमल 11 के बाद शुरू होता है।

इंजेक्शन के पूर्व vivo प्रकृति कुछ limitatio पेश करता हैएनएस। यह भ्रूण मां और हवा निकाल दी अपरा भूलभुलैया से हटा दिया गया है के बाद, इसे दोहराने इंजेक्शन ऐसा करने के लिए आम तौर पर संभव है (और न ही वांछनीय) नहीं था कि नोट करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, मातृ संचलन से भ्रूण को अलग पोषक तत्वों और ओ 2 की आपूर्ति को सीमित करता है, और भ्रूण के स्वास्थ्य समय के साथ खराब करने की उम्मीद है। यह डरावना और पुनरुद्धार भ्रूण की व्यवहार्यता prolongs है, यह भी हृदय समारोह को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, हम पृथक भ्रूण (डेटा शामिल नहीं, Denbeigh एट अल। 12 को देखें) पहले से विवो 35 में मनाया उन लोगों की तुलना में एक कम दिल की दर थी कि मनाया। यह हृदय शरीर क्रिया विज्ञान का आकलन पढ़ाई सही ढंग से विवो परिस्थितियों में प्रतिबिंबित नहीं करेगा कि इसलिए संभावना है। रह देर चरण माउस भ्रूण में संचार hemodynamics निस्र्पक कुछ अध्ययनों के साथ, तथापि, यह इन प्रयोगात्मक शर्तों ऑल्ट सकता है किस हद तक निश्चितता के साथ कहना मुश्किल हैशारीरिक समारोह एर। एक वैकल्पिक इस दृष्टिकोण चुनौतियों 11 के अपने स्वयं के सेट प्रस्तुत कर सकता है, हालांकि, एक लेप्रोस्कोपिक चीरा 36 के माध्यम से या गर्भवती मां सीधे 37 के पेट के माध्यम से, या तो utero में इंजेक्शन के आचरण है। कुछ उदाहरणों में, भ्रूण के अलगाव और बाह्यीकरण भी जर्दी थैली से महत्वपूर्ण खून बह रहा हो सकता है। हम हम अल्ट्रासाउंड जेल के साथ रक्त के प्रवाह को बाधित कर सकता है पाया है, रक्त का कोई खास नुकसान microbubbles के वितरण और एकाग्रता को प्रभावित कर सकता है, और इन जानवरों के विश्लेषण से बाहर रखा गया था। अलगाव सीमा मातृ और गति की भ्रूण स्रोतों करता है, जबकि अंत में, हृदय गतिविधि से संबंधित आवधिक गति अपरिहार्य है। हम सीधे लक्षित microbubble संकेत पर रिसेप्टर अभिव्यक्ति का प्रभाव है, वास्तविक समय गति मुआवजा विपरीत बढ़ाया अल्ट्रासाउंड इमेजिंग 38 मई की हालांकि कार्यान्वयन की जांच करने के क्रम में छवि को स्थिर मस्तिष्क निर्वाचितअन्य अंगों को इन अध्ययनों का विस्तार।

वर्तमान में रहने वाले विकासशील माउस भ्रूण की नाड़ी परिदृश्य का आकलन करने में सक्षम हैं कि कुछ इमेजिंग आवेदन कर रहे हैं। चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग, संवहनी जंग डाले, microcomputed टोमोग्राफी और ऑप्टिकल प्रक्षेपण टोमोग्राफी 16 शवपरीक्षा लागू किया गया है, जबकि कुछ अध्ययनों से सफलतापूर्वक, डॉपलर बह स्रोत ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी 39,40 का उपयोग करते हुए पूर्व vivo murine भ्रूण में रक्त के प्रवाह के रहते इमेजिंग प्रदर्शन किया है। भ्रूण विकास की इस अवधि के शुरुआती संवहनी विकास और समारोह के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रकट कर सकते हैं, क्योंकि यह दुर्भाग्यपूर्ण है। रहने वाले भ्रूण के भीतर Microbubble इमेजिंग इसलिए विकासात्मक शरीर विज्ञान के बारे में हमारी समझ के लिए योगदान कर सकता है। इस तकनीक के मौजूदा तरीकों को बदलने के लिए की संभावना नहीं है, हालांकि यह भी वास्तविक समय में रहने वाले माउस भ्रूण के पूरे शरीर में बायोमार्कर वितरण कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (सहित ऊतक विज्ञानभ्रूण ऊतक में आणविक संकेत की माप के लिए और फ्लोरोसेंट इमेजिंग)। भ्रूण में जहाजों की तेजी से विकसित जन, हालांकि, बारीकी से ट्यूमर एंजियोजिनेसिस 41,42 में पहचान की एक ही कुंजी रिसेप्टर्स से कई की अभिव्यक्ति के साथ, ट्यूमर के विकास जैसा दिखता है और इसलिए आणविक की मात्रात्मक क्षमताओं की जांच के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट ट्यूमर किराए के रूप में सेवा कर सकता है अल्ट्रासाउंड। इसलिए हम वर्णित विधि से न केवल आकलन करने और कार्यात्मक इमेजिंग के माध्यम से संवहनी स्वास्थ्य और रोग की भ्रूण मॉडल निस्र्पक के लिए उपयोगी हो जाएगा आशा है कि है, लेकिन साथ ही साथ आणविक इमेजिंग की शक्तियों और सीमाओं की खोज के लिए एक अवसर प्रदान करता है। इसका आवेदन भी microbubbles भ्रूण माउस ऊतक 10 नग्न डीएनए देने के एक साधन के रूप में परीक्षण किया गया है, जहां गर्भाशय जीन स्थानांतरण चिकित्सा में शामिल है, जांच के अन्य दिलचस्प क्षेत्रों के लिए विस्तार हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, रहने वाले भ्रूण की 3 डी संवहनी मानचित्रण, यह भी संभव हैजो आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों में रूपात्मक असामान्यताएं के रूप में अमूल्य जानकारी प्रदान कर सकता है। पृथक रहने वाले भ्रूण में अल्ट्रासाउंड विपरीत एजेंटों का परिचय इसलिए क्लिनिक के विपरीत-बढ़ाया अल्ट्रासाउंड अनुप्रयोगों के रोग के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने और अनुवाद के लिए एक और उपकरण हो सकता है।

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Materials

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Reagents
Antibodies (biotinylated, eBioscience) — Antibody choice depends on the experiment
  • rat isotype IgG2 control
eBioscience 13-4321-85 This antibody/microbubble combination is often required as experimental control 
  • biotin anti-mouse CD309
eBioscience 13-5821-85
Biotinylated rat MJ 7/18 antibody to mouse endoglin In house hybridoma Outside antibodies may also be appropriate: we  have used eBioscience (13-1051-85 ) in the past
Distilled water
Embryo media
  • 500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium with high glucose
Sigma D5796
  • 50 ml Fetal Bovine Serum
ATCC 30-2020 lot # 7592456
  • Hepes
Gibco 15630 5 ml, 1 M
  • Penicillin-Streptomycin
Gibco 15140-122 5 ml, 10,000 units Pen., 10,000 μg Strep
Ethanol, 70%
Ice
Paraformaldehyde Sigma 76240 4%
Phosphate Buffered Saline [1x]  Sigma D8537 1x, w/o calcium chloride & magnesium chloride
Pregnant mouse, CD-1 Charles River Laboratories Inc. 
0.9% sodium chloride (saline) Hospira 0409-7984-11
Ultrasound contrast agent, target ready and untargeted MicroMarker; VisualSonics Inc.
Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) CSP Medical 133-1009
Equipment
Cell culture plates (4) :  100 x 20 mm Fisher Scientific 08-772-22
Cell culture plates (12) : 60 x 15 mm Sigma D8054
Centrifuge Sorvall Legend RT centrifuge 
Conical tubes, 50 ml BD Falcon VWR 21008-938
Diluent Beckman Coulter Isoton II Diluent, 8448011
Dissection scissors (Wagner) Fine Science Tools Wagner 14068-12
Forceps (2), Dumont SS (0.10 x 0.06 mm) Fine Science Tools 11200-33
Forceps, splinter VWR 25601-134
Glass beaker, 2 L (Griffin Beaker) VWR 89000-216
Glass capillaries, 1 x 90 mm GD-1 with filament Narishige GD-1
Glass needle puller Narishige PN-30
Gloves Ansell 4002
Gross anatomy probe Fine Science Tools 10088-15
Hot plate VWR 89090-994
Ice bucket Cole Parmer RK 06274-01
Imaging Platform VisualSonics Inc. Integrated Rail System
Light source, fiber-optic Fisher Scientific 12-562-36 Ideally has adjustable arms
Luers (12), polypropylene barbed female ¼-28 UNF thread Cole Parmer 45500-30
Micro-ultrasound system, high-frequency VisualSonics Inc. Vevo2100
Needles, 21 gauge  (1”) VWR 305165
Particle size analyzer Beckman Coulter Multisizer 3 Coulter Counter
Perforated spoon (Moria) Fine Science Tools MC 17 10373-17
Pins (6), black anodized minutien 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Pipettors [2-20 μl, 20-200 μl, 100-1,000 μl] Eppendorf Research Plus  adjustable 3120000038;       3120000054;       3120000062
Pipettor tips [2-200 μl, 50-1,000 μl] Eppendorf epT.I.P.S.                   22491334;             022491351
Scissors
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
Tubing, Tygon laboratory 1/32” x 3/32” VWR 63010-007
Wooden applicator stick (swab, cotton head) VWR CA89031-270
Surgical microscope 5-8X magnification Fisher Scientific Steromaster
Syringes, 1 ml Normject Fisher 14-817-25
Syringes (10), 30 ml VWR CA64000-041
Syringe infusion pump  Bio-lynx  NE-1000
Thermometer, -20-110 °C VWR 89095-598
Timer VWR 33501-418
Tubes, Eppendorf VWR 20170-577
Tube racks (3) VWR 82024-462
Ultrasound transducer, 20 MHz VisualSonics Inc. MS250
Vannas-Tubingen, angled up Fine Science Tools 15005-08

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References

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