Bioconjugation וRadiosynthesis של

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הזיקה, סגוליות, והסלקטיביות יוצאות דופן של נוגדנים להפוך אותם וקטורים בצורה יוצאת דופן אטרקטיביים לרדיואקטיביות PET-ממוקד של גידול. בשל זמן מחצית החיים הביולוגיים רב-היום שלהם, נוגדנים חייבים להיות מסומנים עם radionuclides פולטות פוזיטרונים עם זמן מחצית חי ריקבון פיזי ארוכים יחסית. באופן מסורתי, איזוטופים פולטות פוזיטרונים 124 אני (t 1/2 = 4.18 ד), 86 Y (t 1/2 = 14.7 שעות), ו- 64 Cu (t 1/2 = 12.7 שעות) שימשו לתייג נוגדנים ל ההדמיה PET. לאחרונה, עם זאת, השדה יש עדים עלייה דרמטית בשימוש בradiometal 89 Zr פולטות פוזיטרונים בסוכני הדמיה PET מבוסס נוגדן. 89 Zr הוא רדיו-איזוטופי כמעט אידיאלי להדמית PET עם immunoconjugates, כפי שהיא בעל מחצית פיזית -life (t 1/2 = 78.4 שעות), כי הוא תואם את הפרמקוקינטיקה in vivo של נוגדנים ופולט ENE נמוכה יחסיתפוזיטרונים rgy שמייצר תמונות ברזולוציה גבוהות. יתר על כן, נוגדנים יכולים להיות מתויגים בצורה ישירה עם 89 Zr באמצעות desferrioxamine-נגזר siderophore chelator (DFO). בפרוטוקול זה, J591 נוגדן אנטיגן קרום המיקוד ספציפי לערמונית ישמש כמערכת מודל להמחשה (1) bioconjugation של chelator bifunctional DFO-isothiocyanate לנוגדן, (2) radiosynthesis והטיהור של 89 Zr- radioimmunoconjugate DFO-מב, ו (3) in vivo הדמיה PET עם radioimmunoconjugate ZR-DFO-מב 89 במודל עכברי של הסרטן.

Introduction

בשל רגישותם הראויה לציון, זיקה, וסלקטיביות, נוגדנים כבר מזמן נחשבים וקטורים מבטיחים עבור המשלוח של רדיואיזוטופים לתאים סרטניים. עם זאת, היישום שלהם בטומוגרפיה פליטת פוזיטרונים הדמיה (PET) כבר הקשו על ידי חוסר רדיו-איזוטופי פולטות פוזיטרונים מתאים לתיוג שלהם. 1-3 אחד השיקולים החשובים ביותר בעיצוב של radioimmunoconjugates הוא התאמת הריקבון הפיזי חצי חיים של הרדיו-איזוטופי לin vivo הפרמקוקינטיקה של הנוגדן. באופן ספציפי יותר, לעתים קרובות יש נוגדנים זמן מחצית חיים ביולוגיים ארוכים יחסית, רב היום, ולכן הוא חייב להיות מסומן עם רדיואיזוטופים עם זמן מחצית חיים פיזיים דומים. עבור יישומי הדמיה PET, נוגדנים היו radiolabeled באופן מסורתי עם 64 Cu (t 1/2 = 12.7 שעות), 86 Y (t 1/2 = 14.7 שעות), או 124 אני (t 1/2 = 4.18 ד). 4, 5 עם זאת, כל אחד מרדיואיזוטופים אלה בעל מגבלות משמעותיות שתפגענה בהתאמתם להדמיה קלינית. בעוד radioimmunoconjugates שכותרתו עם 86 Y ו- 64 Cu הוכיח מבטיח בחקירות פרה-קליניים, שני איזוטופים בעלי זמן מחצית חיים פיזיים כי הם קצרים מכדי להיות יעילים עבור הדמיה בבני אדם. 124 אני, לעומת זאת, יש לו זמן מחצית חיים פיזיים כמעט אידיאליים ל הדמיה עם נוגדנים, אבל זה יקר ויש לו מאפייני ריקבון הכי מוצלחים שיובילו לרזולוציה נמוכה יחסית תמונות קליניות. יתר על כן, 124 radioimmunoconjugates שכותרתו אני יכול להיות כפוף לdehalogenation in vivo, תהליך שיכול להוריד את יחסי פעילות גידול לרקע. 6,7

הכונן למצוא רדיו-איזוטופי פולטות פוזיטרונים להחליף 64 Cu, 86 Y, ואני 124 בradioimmunoconjugates הזין את העליות האחרונות במחקר על 89 נוגדני Zr כותרת. 8-12 Tהוא הסיבה להופעתו של 89 Zr היא פשוטה: radiometal בעל כימי כמעט אידיאליים ותכונות פיזיות לשימוש בradioimmunoconjugates PET אבחון 13 89 Zr מופק באמצעות 89 Y (p, n) 89 תגובת Zr על מאיץ חלקיקים באמצעות. זמין מסחרי ויעד Y 89 100% טבעיים בשפע. 14,15 radiometal יש תשואת פוזיטרונים של 23%, דועך עם זמן מחצית חיים של 78.4 שעות, ופולט פוזיטרונים עם האנרגיה נמוכה יחסית של 395.5 keV (איור 1). 13,16,17 זה חשוב לציין כי 89 Zr גם פולט אנרגיה גבוהה, 909 keV γ-ray עם יעילות של 99%. בעוד פליטה זה לא מפריעה במרץ עם 511 פוטונים הנפלטים keV, זה דורש שיקול נוסף בכל קשור לתחבורה, טיפול, וdosimetry. למרות אזהרה זו, מאפיינים אלה ריקבון סופו של דבר אומר שיש 89 Zr h נוח יותר לא רקalf-חיים להדמיה עם נוגדנים מ -86 Y ו- 64 Cu, אלא גם יכול לייצר תמונות ברזולוציה גבוהות יותר מאשר 124 אני, אשר פולט פוזיטרונים עם אנרגיות גבוהות של 687 ו 975 keV כמו גם מספר הפוטונים עם אנרגיות בתוך 100-150 keV של הפוטונים שנוצרו פוזיטרונים 511 קאב. 13 יתר על כן, 89 Zr הוא גם בטוח יותר לטפל, פחות יקר לייצר, וresidualizes בגידולים באופן יעיל יותר מאשר עמיתו יוד רדיואקטיבי. 18,19 אחת הגבלת פוטנציאל של 89 Zr היא שזה לא שיש לי איזוטופולוג טיפולי, למשל, 86 Y (PET) לעומת 90 Y (טיפול). זה מונע את בנייתם ​​של סוכנים זהים מבחינה כימית, פונדקאיות הדמיה שיכולה להיות מועסק כגששים מדי מינון לעמיתים הטיפוליים שלהם. שאמרו, החקירות מצביעות על כך שיש לי פוטנציאלי כממלאי מקום להדמיה 90 א- ו -177 immunoconjugates כותרת Lu 89 נוגדנים Zr שכותרתו.20,21

מבחינה כימית, כמו מתכת הקבוצה IV, 89 Zr קיים כקטיון +4 בתמיסה מימית. יון 4+ Zr טעון מאוד, (רדיוס אפקטיבי יוני = 0.84 א) גדול יחסית, ויכול להיות מסווג כקטיון "קשה". ככזה, הוא מציג העדפת ligands נושאות עד שמונה תורמי חמצן קשים, אניוני. בקלות chelator הנפוץ ביותר בשימוש בradioimmunoconjugates 89 שכותרתו Zr הוא desferrioxamine (DFO),, chelator אציקליים-נגזר siderophore נושאת שלוש קבוצות hydroxamate. יגנד ביציבות מרכז את קטיון Zr 4+ במהירות ובצורה נקיה ב RT ברמות pH רלוונטיים מבחינה ביולוגית, ומורכב ZR-DFO וכתוצאה מכך נותר יציב במהלך מספר ימים במלח, בסרום דם, וכל דם. 22 מחקרים חישובית ממליצים שDFO טפסים מורכב hexacoordinate עם Zr 4+ בי מרכז המתכת מתואם לneut שלושRAL ושלושה תורמי anionic חמצן של יגנד, כמו גם שתי מולקולות מים אקסוגניים (איור 2). 23,24 ההתנהגות של radioimmunoconjugates העסקת פיגום נטיית 89 ZR-DFO in vivo באופן כללי היה מצוין. עם זאת, במקרים מסוימים, הדמיה ומחקרי biodistribution חריפים חשפו רמות גבוהות פעילות בעצמות של עכברים שהוזרקו עם 89 נוגדני Zr שכותרתו, נתונים שמצביעים על כך שosteophilic 89 Zr 4+ קטיון הוא שוחרר מchelator in vivo ולאחר מכן mineralizes בעצמות. 25 לאחרונה, מספר החקירות לתוך הפיתוח של רומן 89 chelators Zr 4+ במיוחד ligands עם שמונה תורמי חמצן הופיעו בספרות. 24,26,27 עם זאת, כיום, DFO הוא chelator המועסק באופן נרחב ביותר ב -89 ZR-כותרת radioimmunoconjugates בהפרש גדול. מגוון שונהאסטרטגיות bioconjugation להיות מועסקים לצרף DFO לנוגדנים, כוללים כימיה bioorthogonal לחץ, התגובה של DFO תיאול-reactive בונה עם cysteines בנוגדן, והתגובה של מופעל DFO נושאי אסתר בונה עם lysines בנוגדן. 4,28- 30 בקלות את האסטרטגיה הנפוצה ביותר, עם זאת, היו השימוש בנגזרי isothiocyanate נושאות של DFO, DFO-NCS (איור 2). 22 chelator bifunctional זמין מסחרי חסונה זה ובאמינות יוצרת קשרים עם lysines של יציבים, thiourea קוולנטיים נוגדן (איור 3).

במהלך השנים האחרונות, במגוון רחב של 89 radioimmunoconjugates כותרת ZR-DFO דווח בספרות. חקירות פרה-קליניים היו שופעות במיוחד, הכוללות נוגדנים הנעים בין ידוע יותר cetuximab, bevacizumab, וtrastuzumab לנוגדנים אזוטריים יותר כמו T מיקוד CD105RC105 וfPSA מיקוד 5A10. 30-36 לאחרונה, מספר קטן של ניסויים קליניים בשלבים המוקדמים באמצעות 89 נוגדנים שכותרתו ZR-DFO צמחו בספרות. ניסויים באופן ספציפי, קבוצות בהולנד פרסמו העסקת 89 U36 ZR-DFO-cmAb, 89 tiuxetan ZR-DFO-ibritumomab, ו -89 ZR-DFO-trastuzumab. 21,32,37 בנוסף, מגוון רחב של ניסויים קליניים אחרים עם 89 radioimmunoconjugates כותרת ZR כרגע בעיצומו, ובכלל זה חקירות כאן בMemorial Sloan Kettering Cancer Center באמצעות 89 ZR-DFO-J591 PSMA מיקוד הדמיה סרטן הערמונית וZR-89 DFO-trastuzumab מיקוד HER2 הדמיה סרטן השד. 23, 30 בנוסף, בעוד נוגדני radiolabeled יישארו 89 הרדיואקטיביות Zr כותרת הנפוצה ביותר, radiometal גם יותר ויותר הועסק עם וקטורים אחרים, כוללים פפטידים, חלבונים, וננו. 38-43

המודולריות של המתודולוגיה תיוג ZR-DFO זה 89 היא נכס אדיר. הרפרטואר של נוגדני מיקוד סמן ביולוגי הוא המתרחב, והעניין בביצוע בתחום ההדמיה PET vivo באמצעות המבנים הללו צומח במהירות. כתוצאה מכך, אנו מאמינים כי הפיתוח של יותר שיטות ופרוטוקולים סטנדרטיים יכול להועיל השדה. פרוטוקול ניסוי נכתב מצוין לנטיית DFO-NCS וradiolabeling 89 Zr כבר פורסם על ידי Vosjan, et al. 22 אנו חשים כי ההפגנה החזותית הניתנת על ידי עבודה זו יכולה לעזור לחוקרים חדשים לטכניקות אלה. בפרוטוקול ביד, J591 נוגדן אנטיגן קרום המיקוד ספציפי לערמונית ישמש כמערכת מודל להמחשה (1) bioconjugation של chelator bifunctional DFO-isothiocyanate לנוגדן, (2) radiosynthesis והטיהור של 89 radioimmunoconjugate ZR-DFO-מב,ו- (3) in vivo ההדמיה PET עם radioimmunoconjugate ZR-DFO-מב 89 במודל עכברי של הסרטן. 23,44,45

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים in vivo תיארו בוצעו על פי פרוטוקול שאושר ולפי ההנחיות האתיות של Memorial Sloan Kettering Cancer Center המוסדי הטיפול בבעלי חי ועדת שימוש (IACUC).

1. הצמידה של DFO-NCS לJ591

  1. בצינור microcentrifuge 1.7 מיליליטר, להכין פתרון 2-5 מ"ג / מיליליטר של J591 ב 1 מיליליטר של או מלוח 1x פוספט שנאגרו (pH 7.4) או 0.5 חיץ M HEPES (pH 7.4).
  2. לפזר DFO-NCS בDMSO היבש בריכוז שבין 5-10 מ"מ (3.8-7.6 מ"ג / מיליליטר). Sonicate או מערבולת הפתרון ביסודיות על מנת להקל פירוק מלא.
  3. התאם את ה- pH של תמיסת J591 ל8.8-9.0-ידי הוספת aliquots הקטן (<10 μl) של 0.1 M Na 2 CO 3.
  4. לאחר פתרון הנוגדן הוא בpH הנכון, להוסיף נפח של פתרון DFO-NCS המתאים לעודף טוחנת 3-4 פי של chelator bifunctional.
    1. לבחינהple, להוסיף 4-5 μl של 10 מ"מ פתרון DFO-NCS (40.4 nmol DFO-NCS) (7.6 מ"ג / מיליליטר) עד 1 מיליליטר של 2 מ"ג / מיליליטר פתרון נוגדני J591 (13.3 nmol J591). הסכום של DMSO בתערובת התגובה המימית הסופית לא יעלה על 2% v / v.
  5. דגירה התגובה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בבלוק חימום התססה ב 350 סל"ד.
  6. אחרי שעת 1 ב 37 ° C, לטהר את immunoconjugate וכתוצאה מכך באמצעות טור desalting הדרת גודל חד פעמי ארוז מראש עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי באמצעות 0.5 חיץ M HEPES (pH 7.4) כeluent. צעד זה יניב פתרון 2 מיליליטר של מבנה J591-DFO הושלם.
  7. למדוד את הריכוז של J591-DFO לבנות על ספקטרופוטומטר UV-Vis.
  8. אם ריכוז גבוה יותר של המבנה הוא רצוי, לרכז את פתרון J591-DFO באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי.
  9. אחסן את הפתרון של immunoconjugate J591-DFO הושלם ב -20 ° C בחושך.

2. Radiolabeling J591-DFO עם 89 Zr

זהירות: בשלב זה של הפרוטוקול כרוך הטיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים או ביצוע כל עבודה אחרת עם חוקרי רדיואקטיביות צריכה להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. יש לנקוט את כל הצעדים האפשריים כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת.

הערה: בריבית של שטר שמירת radiochemical הנכונה, את כמות הרדיואקטיביות במדגם יש למדוד באמצעות כיל מינון ונרשמה לפני ואחרי שלבי 2.2-2.13 בפרוטוקול בהמשך. זה יעזור לך עם הקביעה מדויקת של תשואות radiochemical ופעילויות ספציפיות.

  1. הכן פתרון של .5-2.0 מ"ג של J591-DFO ב200 μl של 0.5 חיץ M HEPES, pH 7.5.
  2. פיפטה נפח של <sup> 89 פתרון Zr 4+ מניות (מסופק בדרך כלל ב1.0 M חומצה אוקסלית) מתאים 1.0-6.0 MCI (37-222 MBq) לתוך צינור microcentrifuge 2 מיליליטר פלסטיק בורג יתר. כוון את עוצמת הקול של פתרון זה בסך 300 μl באמצעות חומצה אוקסלית 1.0 M.
  3. התאם את ה- pH של תמיסת 89 Zr 4+ ל6.8-7.5 באמצעות 1.0 M Na 2 CO 3. בגין על ידי הוספת 250 μl של 1.0 M Na 2 CO 3 לZr 89 4+ פתרון ולאחר מכן להוסיף קטן (<10 μl) aliquots של בסיס כדי להשיג את ה- pH הרצוי.
  4. להוסיף את הכמות הרצויה של פתרון מותאם pH 89 Zr 4+ לפתרון J591-DFO מוכן בשלב 2.1.
  5. בדוק את ה- pH של תערובת תגובת radiolabeling כדי לוודא שהוא נופל בטווח הרצוי של 6.8-7.5.
  6. דגירה תגובת radiolabeling במשך 60 דקות ב RT על בלוק חימום התססה ב 350 סל"ד.
  7. לאחר 60 דקות של דגירה, למדוד את radiolabeling תשואה של התגובה באמצעות רדיו-TLC.
    1. לשם כך, במקום 1 μCi של תערובת תגובת radiolabeling על רצועת TLC-ספוג סיליקה. לאפשר aliquot לייבוש, להפעיל את TLC באמצעות eluent של 50 מ"מ DTPA (pH 5.5) ולנתח את רצועת TLC באמצעות סורק הרדיו-TLC. 89 Zr 4+ חייב לבנות J591-DFO יופיע במוצא (R f <0.1), ואילו קטיונים חופשיים 89 Zr 4+ יהיו chelated ידי DTPA וelute עם חזית הממס R> 0.9).
    2. לחשב את תשואת radiolabeling של התגובה על ידי שילוב radiochromatogram, חלוקת השטח מתחת לעקומה מR f 0.0-.1 על ידי השטח הכולל מתחת לעקומה, והכפלה ב -100.
  8. אם תשואת radiolabeling מספיקה (בדרך כלל פעילות ספציפית תיאורטית של> 2 MCI / מ"ג), להרוות את התגובה עם 5 μl של 50 מ"מ DTPA, pH 5.5.
  9. לטהר את USI immunoconjugate וכתוצאה מכךng טור מראש ארז גודל חד פעמי desalting הדרה עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי באמצעות eluent של 0.9% או תמיסת מלח סטרילית עם 5 מ"ג / מיליליטר חומצת gentisic או 0.25 M נתרן אצטט (pH 5.5) עם 5 מ"ג / מיליליטר חומצת gentisic . צעד זה יניב פתרון 2 מיליליטר של radioimmunoconjugate 89 ZR-DFO-J591 הושלם.
  10. לאחר טיהור, לאמת את טוהר radiochemical של 89 ZR-DFO-J591 באמצעות רדיו-TLC כפי שמתואר בשלב 2.7.
  11. לחשב את תשואת radiolabeling הכוללת של התגובה על ידי חלוקת הסך של פעילות בתחילה להוסיף את פתרון הנוגדן על ידי כמות הרדיואקטיביות מבודדת עם radioimmunoconjugate 89 ZR-DFO-J591 המטוהר.
  12. חשב את הפעילות הספציפית הסופית על ידי חלוקת הסך של פעילות מבודדת עם radioimmunoconjugate ZR-DFO-J591 המטוהר 89 על ידי המסה הראשונית של DFO-J591 בתגובת radiolabeling.
  13. אם ריכוז גבוה יותר הוא רצוי, להתרכז הדואר 89 פתרון ZR-DFO-J591 באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי עם חתוך 50,000 משקל מולקולרי.
    הערה: חומצת gentisic משמשת בשלב הטיהור הסופי היא רדיו-מגנה מועסק כדי למזער את ההשפלה של הנוגדן בשל radiolysis 46 בעוד האחסון של radioimmunoconjugate ZR-DFO-J591 89 עד 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס. אפשר, זה לא מומלץ. אם radioimmunoconjugate הוא להיות מאוחסן, השתמש 0.25 M נתרן אצטט (pH 5.5) עם 5 מ"ג / מיליליטר חומצת gentisic כמאגר אחסון על מנת למזער את הסיכון לradiolysis תיווך היפוכלוריט. 47

3. בVivo PET הדמיה עם 89 ZR-DFO-J591

זהירות: כמו בסעיף 2 לפרוטוקול, צעד זה של הפרוטוקול כרוך טיפול ומניפולציה של רדיואקטיביות. לפני ביצוע השלבים הבאים חוקרים צריכים להתייעץ עם מוסד ביתם קרינת מחלקת בטיחות. כל possibיש לנקוט צעדי le כדי לצמצם את החשיפה לקרינה מייננת.

  1. בעכברי זכרי athymic בעירום, שתל תת עורי 5 x 10 תאי סרטן ערמונית LNCaP 6 ולאפשר לגדול אלה לxenograft 100-150 מ"מ 3 (3-4 שבועות לאחר חיסון). 44
  2. לדלל את radioimmunoconjugate 89 ZR-DFO-J591 לריכוז של 1.0 מיליליטר / MCI בשיעור של 0.9% תמיסת מלח סטרילית.
  3. להזריק 200 μl של פתרון 89 ZR-DFO-J591 (200 μCi; 7.4 MBq). לוריד הזנב לרוחב של עכברי נושאי xenograft 48
  4. בנקודת זמן ההדמיה הרצויה (למשל, 12, 24, 48, 72, 96, או 120 שעות שלאחר הזרקה), להרדים את העכבר עם 2% isoflurane: תערובת גז חמצן.
  5. מניחים את העכבר על המיטה של ​​סורק PET בעלי החיים הקטן, ולשמור על הרדמה במהלך הסריקה באמצעות isoflurane 1%: תערובת גז חמצן. לפני הצבת בעלי החיים על מיטת הסורק, ודא הרדמה בשיטת הבוהן הקמצוץ וApplהמשחה y העיניים לעיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות במהלך הרדמה. 49
  6. לרכוש נתונים PET לעכבר באמצעות סריקת סטטי עם מינימום של 40 מיליון אירועים חופפים באמצעות חלון אנרגיה של 350-700 קאב וחלון תזמון מקרי של 6 NSEC. 50
  7. לאחר השלים הרכישה של התמונה, לא עוזב את העכבר ללא השגחה ולא למקם אותו בכלוב עם עכברים אחרים עד שהוא חזר להכרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הצעד הראשון בפרוטוקול זה נטיה של DFO-NCS לנוגדן הוא בדרך כלל די חזק ואמין. באופן כללי, ניתן לקבל immunoconjugate המטוהר,-שונה chelator בתשואה> 90%, ובאמצעות 3 שווה טוחנת של DFO-NCS בתגובת נטיה הראשונית תניב דרגה של תיוג של chelator של כ 1.0-1.5 DFO / מב. 89 Zr צעדי radiolabeling וטיהור של ההליך הם גם פשוטים. בריכוזים המפורטים בפרוטוקול לעיל, תשואות radiolabeling של> 80% ופעילויות כך ספציפיות של> 2.0 MCI / מ"ג אופייני לאחר 60 דקות ב RT. Chromatogram הרדיו-TLC של תערובת radiolabeling הגולמי צפוי לחשוף כמה 89 Zr מחויב-DTPA 4+ שelutes בחזית הממס (איור 4 א). עם זאת, לאחר מרווה התגובה עם DTPA ומטהר את 89 ZR-DFO-מב לבנות באמצעות כרומטוגרפיה הדרת גודל, radiocטוהר hemical של המצומד המטוהר, המבודד 89 ZR-DFO-מב צריך להיות> 95% (איור 4). במקרה שטוהר radiochemical של המצומד-DFO-מב Zr המבודד 89 הוא פחות מ -95%, הליך הטיהור יש לחזור לפני ביצוע כל במבחנה או בניסויי vivo.

על מנת להזיז את ניסויי in vivo, בפרוטוקול שתואר לעיל, עכברים בעירום athymic נושאות PSMA להביע, xenografts סרטן ערמונית LNCaP הועסק לחקור את התנהגותם של 89 ZR-DFO-J591 in vivo. שני biodistribution החריף וניסויים ההדמיה PET גילו כי 89 ZR-DFO-J591 בבירור משרטט את xenografts סרטן הערמונית עם ניגודיות תמונה מעולה ויחס גבוה של גידול לרקע פעילות (איור 5). הספיגה של radioimmunoconjugate בגידול ניכרה כבר בשעה 24 (20.9% ± 5.6% ID / g), והפעילותריכוזיות בעליות הגידול למקסימום של 57.5% ± 5.3% ID / g בלאחר הזרקה 96 שעות. כאופייני לradioimmunoconjugates, ריכוז גבוה יחסי של radiotracer נמצא בדם בנקודות זמן מוקדם (9.1% ± 5.3% ID / g בקצב של 24 שעות), ואחריו ירידה איטית בכמות הרדיואקטיביות בדם מעל במהלך הניסוי. רקמת היעד הלא עם ריכוז הפעילות הגבוה ביותר הייתה העצם, אשר מוצג ערכי ספיגה של כ -10% ID / g לאורך כל הניסוי, ככל הנראה כתוצאה משחרור in vivo של קטיון osteophilic 89 Zr 4+. כל האיברים אחרים, כוללים לב, ריאות, כבד, טחול, קיבה, מעי דק וגס, כליות, ושרירים המוצגים ריכוזי פעילות נמוכים יחסית, לעתים קרובות גם מתחת ל -5% ID / g. כביקורת, עוקבה נוספת של עכברים הוזרקה 300 מיקרוגרם DFO-J591 ללא תווית-הזריק שיתוף על מנת להרוות את אנטיגן ובכך להמחיש חסימה סלקטיבית. Criti מבחינה, ניסוי חסימת הוריד ספיגה של radioimmunoconjugate בגידול מ48.9% ± 9.3% ID / g ל 23.5% ± 11.1% ID / g בלאחר הזרקה 72 שעות, מראה בבירור כי 89 ZR-DFO-J591 באופן סלקטיבי ביעדיה אנטיגן.

איור 1
איור 1. (א) תכנית פשוטה ריקבון ו( B) כמה מאפיינים בולטים של ריקבון 89 Zr 13,16,17 IT = מעבר isomeric.; EC = לכידת אלקטרון. השתנה והודפס מחדש באישור מדרעי, et al. רפואה גרעינית וביולוגיה. 40, 3-14 (2013). לוחצים כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מחדש 2 "src =" / קבצים / ftp_upload / 52,521 / 52521fig2highres.jpg "width =" 700px "/>
איור 2. (א) המבנה של DFO-NCS עם אטומי חמצן התיאום בצבע אדום; מבנה נגזר DFT של קומפלקס ZR-DFO (B). השתנה והודפס מחדש באישור מדרעי, et al. כתב עת לכימיה תרופתית. 57, 4,849-4,860 (2014). כל הזכויות שמורות 2,014 האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3

תכנית 3. איור של bioconjugation וradiolabeling של 89 ZR-DFO-J591.et = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. chromatograms הרדיו-TLC נציג של תערובת radiolabeling הגולמי () ומוצר מטוהר (B) של 89 ZR-DFO-J591. הרדיו-TLCs היה לרוץ על רצועות סיליקה באמצעות eluent של 50 מ"מ DTPA, pH 5.0. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. תמונות העטרה PET של 89 ZR-DFO-J591 (11.1-12.9 MBq [300-345 μCi] מוזרק באמצעות וריד זנב ב200 μl 0.9% תמיסת מלח סטרילית) בעכברי עירום athymic נושאים תת-עורי, PSMA להביעxenografts סרטן ערמונית LNCaP (חצים לבנים) בין 24 ו -120 שעות לאחר הזרקה. השתנה והודפס מחדש באישור מZeglis, et al. Bioconjugate כימיה. 24, 1057-1067 (2013). כל הזכויות שמורות 2,013 האגודה האמריקנית לכימיה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעוד בניית radioimmunoconjugates, הנקרא-ZR-DFO radiolabeling, וההדמיה של 89 הוא בדרך כלל הליך ולא פשוט, זה חשוב לשמור על כמה שיקולים מרכזיים במוח במהלך כל שלב של התהליך. לדוגמא, אולי הסיבה הסבירה ביותר לדאגה במהלך שלב נטיה של ההליך היא הצבירה של הנוגדן בתגובה הצמידה. בעיה זו היא לרוב תוצר של ערבוב הלקוי של תגובת נטיה לאחר התוספת של פתרון מניות DFO-NCS. 22 כאשר זה קורה, ההפצה שאינה הומוגנית של DFO-NCS יכולה לגרום לרמות גבוהות מדי של תגובה המקומית ב נוגדן, שיכול בתורו יוביל לצבירה. בעיה זו ניתן לעקוף בקלות יחסית על ידי הוספת פתרון מניות DFO-NCS בaliquots הקטן (<μl 5), ערבוב את תערובת התגובה ביסודיות לאחר התוספת של DFO-NCS, ומתסיס את תערובת התגובה על temperaturמבוקר אלקטרוני שייקר. בנוסף, לאחר נטיה והטיהור של מבנה DFO-מב, חשוב לקבוע את מספר DFO המוצמד לכל מב בדיוק. האפיון המלא של מספר chelates DFO לנוגדן יכול להיות מושגים באמצעות ניסויי דילול רדיומטרי איזוטופי דומים לאלה שבוצעו על ידי הולנד, et al. ואנדרסון, אל. למרות ספקטרומטר מסת MALDI-TOF הוא אלטרנטיבה et, בת-קיימא. 14,23 , 30,51,52 במהלך שלב radiolabeling, בקלות את הבעיה הנפוצה ביותר היא תשואות radiolabeling מהתחזיות נמוכות יותר. אם תשואות באופן בלתי צפוי נמוכות להתרחש למרות השקידה הבאה בפרוטוקול לעיל, שלוש אסטרטגיות לפתרון בעיות שונות זמינות: (1) דוגרים תגובת radiolabeling לכמויות זמן ארוכים יותר (לדוגמא, 2-3 שעות); (2) חזרה על תגובת radiolabeling באמצעות ריכוז גבוה יותר של נוגדנים; או (3) חוזר על תגובת נטיה הראשונית DFO-NCS באמצעות עודף טוחנות גבוהה יותר של הchelator bifunctional דואר.

בעוד נטיית DFO-NCS היא קלילה וחזקה, אחת מחולשותיו מוטלת בספק שלה הוא שזה לא ספציפי לאתר: DFO-NCS יוצר קשרים עם thiourea lysines זמין בנוגדן ללא קשר לעמדתם. כתוצאה מכך, ייתכן שchelators עשוי להיות מצורף לאזור מחייב אנטיגן של הנוגדן, ובכך להשפיע לרעה על immunoreactivity של המצומד כותרת ZR-DFO 89. לכן, איזון עדין יש פגע בבנייה של 89 radioimmunoconjugates כותרת Zr: מספרים גבוהים יותר של נוגדנים לchelators להקל על פעילויות ספציפיות גבוה יותר, אבל תארים גבוהים של תיוג גם להגביר את הסיכון לפגיעה בimmunoreactivity של המבנה. בסופו של המטרה היא פשוטה: לצרף chelators לפי צורך מבלי להתפשר על immunoreactivity. לאחר קבלת radioimmunoconjugate 89 ZR-DFO-מב המטוהר, זה קריטי כדי לקבוע את in vivo. לשם כך, אנו ממליצים להשתמש בשיטות במבחנה פורסמו על ידי Lindmo, et al. 53,54 אם immunoreactivity של המבנה הוא נמוך יותר מאשר 80-90%, זה עשוי להיות נחוץ כדי לחזור לתגובת נטיה ולצרף moieties DFO פחות לנוגדן. לחלופין, אם immunoreactivity של 89 ZR-DFO-מב המטוהר הוא גבוה (> 90%) ופעילות ספציפית גבוה יותר הן רצויה, ייתכן שניתן לצרף יותר chelators לנוגדן ללא ירידת immunoreactivity.

לבסוף, את התנהגותם של נוגדני 89 ZR-כותרת DFO in vivo היא, כמובן, תלויה במידה רבה בשני את זהותו של הנוגדן ומודל הגידול המועסק. במערכת המודל שהוצגה כאן, ערך הספיגה המקסימאלי בגידול מגיע לכ 60% מזהה / g; עם זאת, מדווח בספרות לגידול מרבי v ספיגהalues ​​נע בין נמוך כמו 15-20% ID / g לגבוה ככל 80-90% ID / g 33,44,55-57 כמו כן, הסכום של ספיגה ברקמות היעד הלא -. בפרט הכבד והטחול - יכול להשתנות במידה רבה בהתאם לנחקרת מערכת הנוגדן / אנטיגן. הפעילות הספציפית של 89 שכותרתו הנוגדן-ZR-DFO היא שיקול חשוב עבור ניסויי in vivo. ערכי ספרות לפעילות הספציפית של 89 ZR-DFO-בז נעים בדרך כלל 1-6 MCI / מ"ג (37-222 mBq / מ"ג). 8,10 אופן כללי, פעילות ספציפית גבוה יותר עדיפה, כפי שהם יקטינו את הסבירות לשוגג הרוויה של אנטיגן (כלומר, חסימה עצמית). זה הופך להיות נכון במיוחד במערכות עם ביטוי אנטיגן רמות נמוכות יותר. ללא קשר למערכת הנוגדן / אנטיגן, אין חקירת in vivo סוכן הדמיה שכותרתו ZR-DFO 89 של שלמה בלי הפגנה של הסלקטיביות. זו יכולה להיות מושגת באמצעות חסימת ניסויים באמצעותכמויות גדולות של biomolecule ללא תווית או השימוש בשורת תאים שאינו מבטא את האנטיגן בשאלה. בהליך המתואר במסמך זה, לשעבר הועסק, אבל את הסלקטיביות של 89 ZR-DFO-J591 גם הודגמה באמצעות xenografts סרטן ערמונית PC3 PSMA-שלילי. 23

חשוב לציין כי למרות היתרונות ברורים שלה, מתודולוגיה סינתטית מבוססת DFO-NCS זה לא מושלמת. כפי שכבר דנו, DFO אינו chelator אידיאלי עבור 89 Zr 4+, ואינו בעלת אופי האתר ספציפי של תגובת נטיה יכול להוכיח מסורבל. כדי לעקוף בעיות אלה, מאמצים מרגשים לפתח chelators החדש 89 Zr 4+ ומתודולוגיות radiolabeling ספציפי לאתר מתבצעות בימים אלה, עדיין טכנולוגיות חדשות הללו עדיין צריכה להיות מותאמות ומאומתים בשתי המעבדה ומרפאת. 24,26,27, 29,44 סופו של דבר, את המתודולוגיה DFO-NCS לבניית89 נוגדנים שכותרתו ZR-DFO הוכיחו להיות כלי רב עצמה לסינתזה של radioimmunoconjugates ויש לו הפוטנציאל לשמש ליצירת מגוון רחב של רדיואקטיביות שימושית קליני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים פרופ 'תומס ריינר, ד"ר יעקב Houghton, וסרג' ד"ר Lyaschenko לשיחות מועילות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, (1), 2-5 (2009).
  2. Wu, A. M., Olafsen, T. Antibodies for molecular imaging of cancer. Cancer Journal. 14, (3), 191-197 (2008).
  3. Wu, A. M., Senter, P. D. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnology. 23, (9), 1137-1146 (2005).
  4. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40, (23), 6168-6195 (2011).
  5. Zalutsky, M. R., Lewis, J. S. Handbook of Radiopharmaceuticals. Welc, M. J., Redvanly, C. S. 24, Wiley. New York, NY. 685-714 (2003).
  6. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52, (8), 1173-1180 (2011).
  7. Divgi, C. R., et al. Preoperative characterisation of clear-cell renal carcinoma using iodine-124-labelled antibody chimeric G250 (124I-cG250) and PET in patients with renal masses: a phase I trial. The Lancet Oncology. 8, (4), 304-310 (2007).
  8. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. Zr-89 radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 7, (5), 389-394 (2012).
  9. Nayak, T. K., Brechbiel, M. W. Radioimmunoimaging with longer-lived positron-emitting radionuclides: potentials and challenges. Bioconjugate Chemistry. 20, (5), 825-841 (2009).
  10. Vugts, D. J., Van Dongen, G. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today. 8, (2), e53-e61 (2011).
  11. Dongen, G. A. M. S., Visser, G. W. M., de Hooge, M. N. L. ub-, de Vries, E. G., Perk, L. R. Immuno-PET: a navigator in monoclonal antibody development and applications. Oncologist. 12, (12), 1379-1389 (2007).
  12. Deri, M. A., Zeglis, B. M., Francesconi, L. C., Lewis, J. S. PET imaging with 89Zr: From radiochemistry to the clinic. Nuclear Medicine and Biology. 40, (1), 3-14 (2013).
  13. Holland, J. P., Williamson, M. J., Lewis, J. S. Unconventional nuclides for radiopharmaceuticals. Molecular Imaging. 9, (1), 1-20 (2010).
  14. Holland, J. P., Sheh, Y. C., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36, (7), 729-739 (2009).
  15. Meijs, W. E., et al. Production of highly pure no-carrier added 89Zr for the labelling of antibodies with a positron emitter. Applied Radiation and Isotopes. 45, (12), 1143-1147 (1994).
  16. Vugts, D. J., van Dongen, G. A. M. S. 89Zr-labeled compounds for PET imaging guided personalized therapy. Drug Discovery Today: Technologies. 8, (2-4), e53-e61 (2011).
  17. Severin, G. W., Engle, J. W., Barnhart, T. E., Nickles, R. J. 89Zr radiochemistry for positron emission tomography. Medicinal Chemistry. 11, (7), 389-394 (2011).
  18. Perk, L. R., et al. Quantitative PET imaging of Met-expressing human cancer xenografts with 89Zr-labelled monoclonal antibody DN30. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 35, (10), 1857-1867 (2008).
  19. Knowles, S. M., et al. Quantitative immunoPET of prostate cancer xenografts with Zr-89- and I-124-labeled anti-PSCA A11 minibody. Journal of Nuclear Medicine. 55, (3), 452-459 (2014).
  20. Rizvi, S. F., et al. radiation dosimetry and scouting of 90Y-ibritumomab tiuxetan therapy in patients with relapsed B-cell non-Hodgkin's lymphoma using 89Zr-ibritumomab tiuxetan and PET. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39, (3), 512-520 (2012).
  21. Perk, L. R., et al. Preparation and evaluation of Zr-89-Zevalin for monitoring of Y-90-Zevalin biodistribution with positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33, (11), 1337-1345 (2006).
  22. Vosjan, M., et al. Conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for PET imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine. Nature Protocols. 5, (4), 739-743 (2010).
  23. Holland, J. P., et al. Zr-89-DFO-J591 for ImmunoPET of prostate-specific membrane antigen expression in vivo. Journal of Nuclear Medicine. 51, (8), 1293-1300 (2010).
  24. Deri, M. A., et al. Alternative chelator for (89)Zr-radiopharmaceuticals: Radiolabeling and evaluation of 3,4,3-(LI-1,2-HOPO). Journal of Medicinal Chemistry. 57, (11), 4849-4860 (2014).
  25. Abou, D. S., Ku, T., Smith-Jones, P. M. In vivo biodistribution and accumulation of 89Zr in mice. Nuclear Medicine and Biology. 38, (5), 675-681 (2011).
  26. Guerard, F., Lee, Y. S., Brechbiel, M. W. Rational design, synthesis, and evaluation of tetrahydroxaminc acid chelators for stable complexation of zirconium(IV). Chemistry: A European Journal. 20, (19), 5584-5591 (2014).
  27. Guerard, F., et al. Investigation of Zr(IV) and 89Zr(IV) complexation with hydroxamates: progress towards designing a better chelator than desferrioxamine B for immuno-PET imaging. Chemical Communications. 49, (10), 1002-1004 (2013).
  28. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22, (10), 2048-2059 (2011).
  29. Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37, (3), 289-297 (2010).
  30. Holland, J. P., et al. Measuring the pharmacodynamic effects of a novel Hsp90 inhibitor on HER2/neu expression in mice using Zr-89-DFO-trastuzumab. PLoS ONE. 5, (1), (2010).
  31. Aerts, H., et al. Disparity between in vivo EGFR expression and Zr-89-labeled cetuximab uptake assessed with PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, (1), 123-131 (2009).
  32. Nagengast, W. B., et al. Zr-89-Bevacizumab PET of early antiangiogenic tumor response to treatment with HSP90 inhibitor NVP-AUY922. Journal of Nuclear Medicine. 51, (5), 761-767 (2010).
  33. Nagengast, W. B., et al. In vivo VEGF imaging with radiolabeled bevacizumab in a human ovarian tumor xenograft. Journal of Nuclear Medicine. 48, (8), 1313-1319 (2007).
  34. Dijkers, E. C. F., et al. Development and characterization of clinical-grade Zr-89-trastuzumab for HER2/neu immunoPET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50, (6), 974-981 (2009).
  35. Ulmert, D., et al. Imaging androgen receptor signaling with a radiotracer targeting free prostate-specific antigen. Cancer Discovery. 2, (4), 320-327 (2012).
  36. Hong, H., et al. Positron emission tomography imaging of CD105 expression with 89Zr-Df-TRC105. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 39, (1), 138-148 (2012).
  37. Dijkers, E. C., et al. Biodistribution of Zr-89-trastuzumab and PET omaging of HER2-positive lesions in patients with metastatic breast cancer. Clinical Pharmacolog., & Therapeutics. 87, (5), 586-592 (2012).
  38. Heneweer, C., Holland, J. P., Divilov, V., Carlin, S., Lewis, J. S. Magnitude of enhanced permeability and retention effect in tumors with different phenotypes: Zr-89-abumin as a model system. Journal of Nuclear Medicine. 52, (4), 625-633 (2011).
  39. Holland, J. P., et al. Annotating MYC status with 89Zr-transferrin imaging. Nature Medicine. 18, (10), 1586-1591 (2012).
  40. Jacobson, O., et al. MicroPET imaging of integrin avB3 expressing tumors using 89Zr-RGD peptides. Molecular Imaging and Biology. 13, (6), 1224-1233 (2011).
  41. Keliher, E. J., et al. 89Zr-labeled dextran nanoparticles allow in vivo macrophage imaging. Bioconjugate Chemistry. 22, (12), 2383-2389 (2011).
  42. Abou, D. S., et al. 89Zr-labeled paramagnetic octreotide-liposomes for PET-MR imaging of cancer. Pharmaceutical Research. 30, (3), 878-888 (2013).
  43. Miller, L., et al. Synthesis, characterization, and biodistribution of multiple 89Zr-labeled pore-expanded mesoporous silica nanoparticles for PET. Nanoscale. 6, (9), 4928-4935 (2014).
  44. Zeglis, B. M., et al. An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 24, (6), 1057-1067 (2013).
  45. Nanus, D. M., et al. Clinical use of monoclonal antibody HuJ591 therapy: targeting prostate specific membrane antigen. Journal of Urology. 170, (6 Pt 2), S84-S88 (2003).
  46. Joshi, R., Gangabhagirathi, R., Venu, S., Adhikari, S., Mukherjee, T. Antioxidant activity and free radical scavenging reactions of gentisic acid: in vitro and pulse radiolysis studies. Free Radical Research. 46, (1), 11-20 (2012).
  47. Saran, M., Bors, W. Radiation chemistry of physiological saline reinvestigated: evidence that chloride-derived intermediates play a key role in cytotoxicity. Radiation Research. 147, (1), 70-77 (1997).
  48. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Prichett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  49. Collier, H., Warner, B. T., Skerry, R. Multiple toe-pinch method for testing analgesic drugs. British Journal of Pharmacology and Chemotherapeutics. 17, 28-40 (1961).
  50. Zanzonico, P. Positron emission tomography: a review of basic principles, scanner design and performance, and current systems. Seminars in Nuclear Medicine. 34, (2), 87-111 (2004).
  51. Anderson, C. J., et al. Copper-64-labeled antibodies for PET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 33, (9), 1685-1691 (1992).
  52. Anderson, C. J., et al. Preparation, biodistribution and dosimetry of copper-64-labeled anti-colorectal carcinoma monoclonal antibody fragments 1A3-F(ab')2. Journal of Nuclear Medicine. 36, (5), 850-858 (1995).
  53. Lindmo, T., Boven, E., Cuttitta, F., Fedorko, J., Bunn, P. A. Determination of the immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear extrapolation to binding at infinite antigen excess. Journal of Immunological Methods. 72, (1), 77-89 (1984).
  54. Lindmo, T., Bunn, P. A. Determination of the true immunoreactive fraction of monoclonal antibodies after radiolabeling. Methods in Enzymology. 121, (1), 678-691 (1986).
  55. Cohen, R., et al. Inert coupling of IRDye800CW to monoclonal antibodies for clinical optical imaging of tumor targets. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 1, (1), 31-43 (2011).
  56. Ruggiero, A., et al. Targeting the Internal Epitope of Prostate-Specific Membrane Antigen with Zr-89-7E11 Immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 52, (10), 1608-1615 (2011).
  57. Nayak, T. K., Garmestani, K., Milenic, D. E., Brechbiel, M. W. PET and MRI of Metastatic Peritoneal and Pulmonary Colorectal Cancer in Mice with Human Epidermal Growth Factor Receptor 1-Targeted Zr-89-Labeled Panitumumab. Journal of Nuclear Medicine. 53, (1), 113-120 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics