Die Biokonjugation und Radiosynthese

Chemistry

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Zeglis, B. M., Lewis, J. S. The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies. J. Vis. Exp. (96), e52521, doi:10.3791/52521 (2015).

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Abstract

Die außergewöhnliche Affinität, Spezifität und Selektivität der Antikörper machen sie außergewöhnlich attraktive Vektoren für den Tumor gerichtet PET-Radiopharmaka. Aufgrund ihrer mehrtägigen biologische Halbwertszeit muss Antikörper mit Positronen emittierende Radionuklide mit relativ langen physischen Verfall Halbwertszeiten zu kennzeichnen. Traditionell sind die Positronen emittierende Isotope 124 I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 h) und 64 Cu (t 1/2 = 12,7 h) wurden verwendet, um Antikörper zu beschriften PET-Bildgebung. In jüngerer Zeit jedoch hat das Feld eine dramatische Zunahme in der Verwendung der Positronen emittierende Radiometall 89 Zr in Antikörper-basierten PET-Bildgebungsmittel beobachtet. 89 Zr ist ein nahezu ideales Radioisotop für die PET-Bildgebung mit Immunkonjugaten, da sie eine physikalische Halb besitzt -Leben (t 1/2 = 78,4 Stunden), die mit den in-vivo-Pharmakokinetik von Antikörpern kompatibel ist und gibt eine relativ niedrige energy Positronen, die Bilder mit hoher Auflösung produziert. Außerdem Antikörper können unkompliziert mit 89 Zr mit dem Siderophor abgeleitete Chelator Desferrioxamin (DFO) gekennzeichnet werden. Bei diesem Protokoll wird die Prostata-spezifische Membran-Antigen-Targeting-Antikörper J591 als Modellsystem verwendet, um zu veranschaulichen (1) die Biokonjugation des bifunktionellen Chelators DFO-Isothiocyanat an einen Antikörper, (2) die Radiosynthese und Reinigung eines 89 Zr- DFO-mAb Radioimmunkonjugat, und (3) in-vivo-PET mit einem 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugat in einem Mausmodell von Krebs.

Introduction

Aufgrund ihrer bemerkenswerten Empfindlichkeit, Affinität und Selektivität wurden Antikörper langem als vielversprechende Vektoren für die Abgabe von Radioisotopen an Tumorzellen. Jedoch wurde ihre Anwendung in der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) durch das Fehlen eines geeigneten Positronen emittierende Radioisotope für die Etikettierung behindert. 1-3 Einer der kritischsten Aspekte bei der Konzeption der Radioimmunkonjugate wird passend zum physikalischen Zerfall Halb Zeit des Radioisotops für die in vivo Pharmakokinetik des Antikörpers. Genauer gesagt wurden Antikörper oft relativ lang, mehrtägigen biologischen Halbwertszeit und müssen daher mit Radioisotopen mit vergleichbaren physikalischen Halbwertszeit gekennzeichnet sein. Für PET-Imaging-Anwendungen, haben Antikörper traditionell mit radioaktiv markiertem 64 Cu (t 1/2 = 12,7 h), 86 Y (t 1/2 = 14,7 Stunden) oder 124 I (t 1/2 = 4,18 d). 4, 5 jedoch jedediese Radioisotope besitzt erhebliche Einschränkungen, die ihre Eignung für die klinische Bildgebung behindern. Während Radioimmunkonjugate mit 86 Y und 64 Cu beschriftet sind vielversprechend in präklinischen Untersuchungen nachgewiesen, beide Isotope besitzen physikalische Halbwertszeiten, die zu kurz, um effektiv für die Bildgebung beim Menschen sind. 124 I hingegen hat eine nahezu ideale physikalische Halbwertszeit für Bildgebung mit Antikörpern, aber es ist teuer und hat suboptimal Abklingeigenschaften, die relativ geringe Auflösung klinischen Bildern führen. Ferner können 124 I-markiertem Radioimmunkonjugaten Subjekt in vivo Dehalogenierung, ein Verfahren, das Tumor-zu-Hintergrund-Aktivitätsverhältnisse senken kann. 6,7

Der Antrieb, ein Positronen emittierende Radioisotop zu 64 Cu, 86 Y ersetzen zu finden, und 124 I in Radioimmunkonjugate hat den jüngsten Anstieg der Forschung über 89 Zr-markierten Antikörpern angeheizt. 8-12 Ter Grund für die Einführung der 89 Zr ist einfach: das Radiometall besitzt nahezu idealen chemischen und physikalischen Eigenschaften für den Einsatz in diagnostischen PET Radioimmunkonjugate 13 89 Zr wird über die 89 Y (p, n) 89 Zr Reaktion auf ein Zyklotron mit einer produziert. im Handel erhältlich und 100% natürlich reichlich 89 Y Ziel. 14,15 Die Radiometall hat eine Positronen-Ausbeute von 23%, zerfällt mit einer Halbwertszeit von 78,4 Stunden und Positronen emittiert mit der relativ geringen Energie von 395,5 keV (Abbildung 1). 13,16,17 Es ist wichtig zu beachten, dass 89 Zr emittiert ebenfalls eine hohe Energie 909 keV γ-Strahl mit 99% Effizienz. Während dieser Emission nicht energetisch nicht mit den emittierten 511 keV Photonen, erfordert es zusätzliche Überlegung im Hinblick auf Transport, Handling und Dosimetrie. Trotz dieser Einschränkung, diese Zerfallseigenschaften letztlich bedeuten, dass 89 Zr hat nicht nur eine günstigere hAlf-Lebensdauer für die Bildgebung mit Antikörpern als 86 Y und 64 Cu kann aber auch erzeugen Bilder mit höherer Auflösung als 124 I, welche mit Positronen höheren Energien von 687 bis 975 keV und einer Anzahl von Photonen mit Energien innerhalb 100-150 keV emittiert die 511 keV Positronen erzeugt Photonen. 13. Darüber hinaus ist 89 Zr auch sicherer in der Handhabung und weniger teuer herzustellen und residualizes in Tumoren wirksamer als sein Gegenstück Radiojod. 18,19 Eine mögliche Einschränkung von 89 Zr ist, dass es keinen ein therapeutisches Isotopolog zB 86 Y (PET) vs. 90 Y (Therapie). Dies schließt die Konstruktion von chemisch identischen, Surrogat-Bildgebungsmittel, die als dosimetrische scouts für ihre therapeutischen Gegen eingesetzt werden können. Das heißt, Untersuchungen legen nahe, dass 89 Zr-markierten Antikörpern zu tun haben Potenzial als Bild Surrogate für 90 Y und 177 Lu-markierten Immunkonjugate.20,21

Vom chemischen Standpunkt aus als ein Metall der Gruppe IV, besteht 89 Zr als vier Kationen in wässriger Lösung. Die Zr 4+ Ion hoch geladenen, relativ groß (effektive Ionenradius = 0,84 Å), und kann als eine "harte" Kation klassifiziert werden. Als solches weist es eine Präferenz für die Liganden mit bis zu acht Fest anionische Sauerstoffdonatoren. Einfach die häufigste Chelator in 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate verwendete Desferrioxamin (DFO), ein Siderophor-abgeleitete, azyklische Chelator, die drei Hydroxamatgruppen. Der Ligand stabil koordiniert den Zr 4+ Kationen schnell und sauber bei RT bei biologisch relevanten pH-Werten, und das erhaltene Zr-DFO-Komplex bleibt stabil im Laufe mehrerer Tage in Kochsalzlösung, Blutserum und Vollblut. 22 Computational Studien stark darauf hin, dass DFO bildet einen sechsfach koordinierten Komplex mit Zr 4+ in dem das Metallzentrum an die Drei Neut koordiniertral und drei anionische Sauerstoffdonoren des Liganden sowie zwei exogene Wasserliganden (Abbildung 2). 23,24 Die in vivo Verhalten Radioimmunkonjugate Einsatz der 89 Zr-DFO Konjugation Gerüst war im Allgemeinen sehr gut. Jedoch in einigen Fällen, Bildgebung und Biodistribution akuten Studien erhöhten Aktivität in den Knochen von Mäusen mit 89 Zr-markierte Antikörper injiziert wird, Daten, die zeigt, dass die osteophiles 89 Zr 4+ Kation aus der Chelator in vivo freigesetzt und anschließend mineralisiert ergab in den Knochen. 25 Kürzlich, insbesondere Liganden eine Reihe von Untersuchungen über die Entwicklung von neuartigen 89 Zr 4+ Chelatoren mit acht Sauerstoffspender sind in der Literatur erschienen. 24,26,27 Dennoch derzeit DFO ist die am weitesten verbreiteten Chelator mit großem Abstand in 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate. Eine Vielzahl von unterschiedlichenBiokonjugation Strategien wurden angewendet, um den DFO Antikörper binden, einschließlich bioorthogonalen Click-Chemie, die Reaktion von thiolreaktiven DFO Konstrukte mit Cysteine ​​im Antikörper, und die Reaktion des aktivierten Esters tragenden DFO Konstrukte mit Lysinen in den Antikörper. 4,28- 30 leicht die häufigste Strategie jedoch ist die Verwendung von einem Isothiocyanat tragende Derivat von DFO, DFO-NCS (Abbildung 2). 22 Diese kommerziell verfügbaren bifunktionellen Chelator robust und zuverlässig stabile, kovalente Bindungen mit Thioharnstoff Lysine der Formen Antikörper (Abbildung 3).

In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl von 89 Zr-DFO-markierten Radioimmunkonjugaten in der Literatur berichtet worden. Präklinische Untersuchungen haben besonders reichlich gewesen, mit Antikörpern, die von der bekannteren Cetuximab, Bevacizumab und Trastuzumab mehr esoterischen Antikörper wie die CD105-Targeting-TRC105 und fPSA-Targeting 5A10. 30-36 In jüngerer Zeit sind eine geringe Anzahl von frühen Phase der klinischen Studien mit 89 Zr-DFO-markierte Antikörper in der Literatur aufgetaucht. Insbesondere Gruppen in den Niederlanden veröffentlichten Studien beschäftigt 89 Zr-DFO-CMAB U36, 89 Zr-DFO-Ibritumomab-Tiuxetan, und 89 Zr-DFO-Trastuzumab. 21,32,37 Darüber hinaus eine Reihe von weiteren klinischen Studien mit 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate sind derzeit im Gange, einschließlich Untersuchungen hier am Memorial Sloan Kettering Cancer Center mit dem PSMA-Targeting 89 Zr-DFO-J591 für Prostata-Krebs-Bildgebung und die HER2-Targeting 89 Zr-DFO-Trastuzumab bei Brustkrebs Bildgebung. 23, 30 Darüber hinaus, während radiomarkierten Antikörpern bleiben die häufigsten 89 Zr-markierte Radiopharmaka, die Radio auch zunehmend mit anderen Vektoren, einschließlich Peptide, Proteine ​​und Nanomaterialien eingesetzt. 38-43

Die Modularität dieser 89 Zr-DFO Kennzeichnungsmethode ist eine enorme Bereicherung. Das Repertoire der Biomarker-Targeting-Antikörper ist immer größer, und das Interesse an der Durchführung in vivo PET-Bildgebung mit diesen Konstrukten legt kräftig zu. Als Ergebnis, glauben wir, dass die Entwicklung standardisierter Verfahren und Protokolle können Sie das Feld profitieren. Eine ausgezeichnete schriftliche Versuchsprotokoll für DFO-NCS Konjugation und 89 Zr Radiomarkierung wurde bereits von Vosjan veröffentlicht, et al. 22 Wir sind der Meinung, dass die visuelle Demonstration von dieser Arbeit bereitgestellt könnte weiter helfen Ermittler neue zu diesen Techniken. In dem Protokoll bei Seits wird die Prostata-spezifischen Membran-Antigen-Targeting-Antikörper J591 als Modellsystem verwendet, um zu veranschaulichen (1) die Biokonjugation des bifunktionellen Chelators DFO-Isothiocyanat an einen Antikörper, (2) die Radiosynthese und Reinigung des 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugats,und (3) in vivo PET mit 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugat in einem Mausmodell von Krebs. 23,44,45

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Protocol

Alle beschriebenen In-vivo-Tierversuchen wurden nach einer genehmigten Protokoll und unter den ethischen Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt.

1. Konjugation von DFO-NCS bis J591

  1. In einem 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine 2-5 mg / ml-Lösung von J591 in 1 ml von entweder 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) oder 0,5 M HEPES-Puffer (pH 7,4).
  2. Löse DFO-NCS in trockenem DMSO in einer Konzentration zwischen 5-10 mM (3,8 bis 7,6 mg / ml). Mit Ultraschall oder Wirbel die Lösung sorgfältig durch, um eine vollständige Auflösung zu erleichtern.
  3. Den pH-Wert der Lösung auf 8,8-9,0 J591 durch Zugabe kleiner Aliquots (<10 & mgr; l) von 0,1 M Na 2 CO 3.
  4. Nachdem die Antikörperlösung in der richtigen pH, einen Volumen des DFO-NCS-Lösung entsprechend einem 3-4-fachen molaren Überschuß des bifunktionellen Chelators.
    1. Zur Prüfungweise hinzuzufügen 4-5 ul einer 10 mM (7,6 mg / ml) DFO-NCS-Lösung (40,4 nmol DFO-NCS) zu 1 ml einer 2 mg / ml J591 Körperlösung (13,3 nmol J591). Die Menge an DMSO im fertigen wäßrigen Reaktionsmischung sollte 2% v / v nicht übersteigen.
  5. Inkubieren der Reaktion für 30 Minuten bei 37 ° C auf einem Heizblock Rühren bei 350 Upm.
  6. Nach 1 h bei 37 ° C, Reinigen des resultierenden Immunkonjugat mit einem vorverpackten Einweg Grßenausschluß Entsalzungssäule mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off unter Verwendung von 0,5 M HEPES-Puffer (pH 7,4) als Elutionsmittel. Mit diesem Schritt wird eine 2 ml Lösung des fertigen J591-DFO Konstrukt ergeben.
  7. Messung der Konzentration des J591-DFO Konstrukt auf einem UV-Vis-Spektrophotometers.
  8. Wenn eine höhere Konzentration des Konstrukts gewünscht wird, konzentrieren die J591-DFO Lösung unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off.
  9. Bewahren Sie die Lösung des fertigen J591-DFO Immunkonjugat bei -20 ° C im Dunkeln.

2. Radiomarkierung J591-DFO mit 89 Zr

VORSICHT: Dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte oder bei anderen Arbeiten mit Radioaktivität Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle möglichen Schritte unternommen werden sollten, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren.

HINWEIS: Im Interesse einer ordnungsgemäßen radiochemische Hinweis Haltung, sollte die Menge an Radioaktivität in der Probe unter Verwendung einer Dosiskalibrator gemessen und aufgezeichnet werden vor und nach den Schritten von 2,2 bis 2,13 in der folgenden Protokoll. Dies wird mit der genauen Bestimmung der radiochemischen Ausbeuten und spezifischen Aktivitäten zu helfen.

  1. Es wird eine Lösung von 0,5-2,0 mg J591-DFO in 200 ul 0,5 M HEPES-Puffer, pH 7,5.
  2. Pipettieren Volumen des <sup> 89 Zr 4+ Stammlösung (in der Regel in 1,0 M Oxalsäure im Lieferumfang enthalten), entsprechend 1,0 bis 6,0 mCi (37-222 MBq) in ein 2-ml-Plastik Schraubverschluss Reaktionsgefäß. Stellen Sie die Lautstärke dieser Lösung auf insgesamt 300 ul mit 1,0 M Oxalsäure.
  3. Den pH-Wert des 89 Zr 4+ Lösung auf 6,8-7,5 unter Verwendung von 1,0 M Na 2 CO 3. Beginnen durch Zugabe von 250 ul 1,0 M Na 2 CO 3 zu dem 89 Zr 4+ Lösung und anschließend Hinzufügen kleiner (<10 ul) Aliquots von Base, um den gewünschten pH zu erreichen.
  4. Fügen Sie die gewünschte Menge des pH-eingestellten 89 Zr 4+ Lösung der J591-DFO-Lösung in Schritt 2.1 vorbereitet.
  5. Der pH-Wert des Radiomarkierungsreaktionsgemisch zu gewährleisten, dass sie innerhalb des gewünschten Bereichs von 6,8-7,5 fällt.
  6. Inkubieren der Radiomarkierungsreaktion 60 Minuten lang bei RT auf einer Rührwerkskugelmühle Heizblock bei 350 Umdrehungen pro Minute.
  7. Nach 60 min Inkubation, messen Sie den radiolabeling Ausbeute der Reaktion mit radio TLC.
    1. Hierzu Spot 1 uCi Radiomarkierungsreaktionsmischung auf einem Kieselsäure-TLC imprägnierten Streifen. Lassen Sie den aliquoten trocknen, führen Sie den TLC unter Verwendung eines Elutionsmittels von 50 mM DTPA (pH 5,5) und analysieren die TLC Streifen mit Hilfe eines Radio-TLC-Scanner. 89 Zr 4+ mit dem J591-DFO Konstrukt gebunden wird am Ursprung angezeigt (R f <0.1), während die freien 89 Zr 4+ Kationen werden von DTPA Chelat werden und wird mit der Lösungsmittelfront (Rf eluieren> 0,9).
    2. Berechnen der Radiomarkierungsausbeute der Reaktion durch Integrieren des Radiochromatogramm, indem die Fläche unter der Kurve von R f 0,0-0,1 durch die gesamte Fläche unter der Kurve, multipliziert mit 100.
  8. Wenn die Radiomarkierungsausbeute ausreicht (typischerweise eine theoretische spezifische Aktivität von> 2 mCi / mg) Die Reaktion wird mit 5 ul 50 mM DTPA, pH 5,5.
  9. Man reinige den resultierenden Immunkonjugat using eine vorverpackte Einweg Grßenausschluß Entsalzungssäule mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off unter Verwendung eines Elutionsmittels von entweder 0,9% sterile Kochsalzlösung mit 5 mg / ml Gentisinsäure oder 0,25 M Natriumacetat (pH 5,5) mit 5 mg / ml Gentisinsäure . Mit diesem Schritt wird eine 2 ml Lösung des fertigen 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugats ergeben.
  10. Nach der Reinigung, überprüfen Sie die radiochemische Reinheit der 89 Zr-DFO-J591 mit Radio-TLC wie in Schritt 2.7 beschrieben.
  11. Berechnen der Gesamtradiomarkierungsausbeute der Reaktion durch Dividieren der Menge an Aktivität zu Beginn auf die Antikörperlösung durch die Menge an Radioaktivität mit dem gereinigten 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat getrennt zugegeben.
  12. Berechnen Sie die endgültige spezifische Aktivität durch Dividieren der Menge an Aktivität mit dem gereinigten 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat isoliert von der Ausgangsmasse der DFO-J591 in der Radiomarkierungsreaktion.
  13. Wenn eine höhere Konzentration gewünscht wird, konzentrieren the 89 Zr-DFO-J591 Lösung unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off.
    HINWEIS: Die Gentisinsäure im letzten Reinigungsschritt verwendet wird, ein radioSchutz verwendet, um den Abbau des Antikörpers durch Radiolyse minimieren 46 Während die Speicherung des 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat für bis zu 48 Stunden bei 4 ° C. möglich ist, ist es nicht empfehlenswert. Wenn das Radioimmunkonjugat gespeichert werden soll, zu verwenden 0,25 M Natriumacetat (pH 5,5) mit 5 mg / ml Gentisinsäure als Pufferspeicher, um das Risiko von Hypochlorit-vermittelte Radiolyse minimieren. 47

3. In-vivo-PET-Bildgebung mit 89 Zr-DFO-J591

ACHTUNG: Wie in Protocol Abschnitt 2 dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle possible Schritte sollten unternommen werden, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren.

  1. Bei männlichen athymischen Nacktmäusen subkutan Implantat 5 x 10 6 LNCaP-Prostatakrebszellen und lassen diese zu einem 100-150 mm 3 Xenograft (3-4 Wochen nach der Beimpfung) wachsen. 44
  2. Verdünne das 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat auf eine Konzentration von 1,0 mCi / ml in 0,9% steriler Kochsalzlösung.
  3. Injizieren 200 ul des 89 Zr-DFO-J591-Lösung (200 & mgr; Ci; 7.4 MBq). In die laterale Schwanzvene der Xenotransplantat-tragenden Mäusen 48
  4. Bei der gewünschten Abbildungs ​​Zeitpunkt (zB 12, 24, 48, 72, 96 oder 120 h post-Injektion), betäuben die Maus mit einer 2% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch.
  5. Platzieren Sie die Maus auf dem Bett des Kleintier-PET-Scanner, und Aufrechterhaltung einer Narkose bei der Untersuchung mit einem 1% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch. Vor Inbetriebnahme des Tieres auf das Scanner-Bett, überprüfen Anästhesie mit dem Zehe-Pinch-Methode und apply Augensalbe für die Augen der Maus, um das Trocknen während einer Narkose zu verhindern. 49
  6. Erwerben die PET-Daten für die Maus über einen statischen Abtastung mit einem Minimum von 40 Millionen koinzident Ereignisse unter Verwendung eines Energiefensters 350-700 keV und eine Koinzidenzzeitfenster von 6 nsec. 50
  7. Nach Abschluss der Akquisition des Bildes, darf die Maus nicht unbeaufsichtigt zu lassen, und stellen Sie sie nicht in einem Käfig mit anderen Mäusen, bis sie wieder zu sich kam.

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Representative Results

Der erste Schritt bei diesem Protokoll die Konjugation DFO-NCS an den Antikörper ist typischerweise ziemlich robust und zuverlässig. Im Allgemeinen kann die gereinigte Chelator modifizierten Immunkonjugat in> 90% Ausbeute erhalten werden, und unter Verwendung von 3 Moläquivalenten DFO-NCS in der Anfangs Konjugationsreaktion wird eine Anpassungsgrad-Markierung der Chelatbildner von etwa 1,0-1,5 DFO zu erhalten / mAb. Die 89 Zr radioaktiven Markierung und Reinigungsschritte des Verfahrens sind ebenfalls einfach. Bei Konzentrationen im Protokoll skizzierten Radiomarkierungsausbeuten von> 80% und somit spezifische Aktivitäten von> 2,0 mCi / mg sind typisch nach 60 min bei RT. Die radio TLC Chromatogramm des rohen Radiomarkierungsgemisch wird wahrscheinlich offenbaren einige DTPA-gebundenen 89 Zr 4+, die in der Lösungsmittelfront (4A) eluiert. Jedoch nach dem Abschrecken der Reaktion mit DTPA und Reinigen des 89 Zr-DFO-mAb Konstrukt über Grßenausschlußchromatographie die radiochemische Reinheit des gereinigten, isoliert 89 Zr-DFO-mAb Konjugat sollte> 95% (4B) sein. In dem Fall, dass die radiochemische Reinheit der isolierten 89 Zr-DFO-mAb-Konjugat weniger als 95%, sollte das Reinigungsverfahren vor der Durchführung von in vitro oder in vivo-Experimente wiederholt werden.

Nun zu den in vivo Experimenten, in dem oben beschriebenen Protokoll athymischen Nacktmäusen mit PSMA-exprimierende LNCaP-Prostatakrebs Xenotransplantate wurden verwendet, um das in vivo Verhalten des 89 Zr-DFO-J591 zu untersuchen. Akute Bioverteilung und PET-Bildgebung Experimente zeigten, dass 89 Zr-DFO-J591 deutlich die Prostatakrebs-Xenotransplantaten mit hervorragenden Bildkontrast und eine hohe Tumor-zu-Hintergrundaktivität Verhältnisse (Abbildung 5) abgrenzt. Die Aufnahme von Radioimmunkonjugats im Tumor ist offensichtlich bereits nach 24 h (20,9% ± 5,6% ID / g), und die AktivitätKonzentration in den Tumor erhöht sich auf ein Maximum von 57,5% ± 5,3% ID / g bei 96 h nach der Injektion. Als typisch für Radioimmunkonjugate ist, eine relativ hohe Konzentration an Radiotracer im Blut zu frühen Zeitpunkten (9,1% ± 5,3% ID / g bei 24 h), gefolgt von einer langsamen Abnahme der Menge an Radioaktivität im Blut, das Verlauf des Experiments. Die Nicht-Zielgewebe mit dem höchsten Aktivitätskonzentration war der Knochen, welche die Aufnahme-Werte um 10% ID / g des gesamten Experiments dargestellt, vermutlich als Ergebnis der in vivo Freisetzung des osteophiles Kationen 89 Zr 4+. Alle anderen Organe, einschließlich Herz, Lunge, Leber, Milz, Magen, Dick- und Dünndarm, Niere, Muskel angezeigt relativ niedrige Aktivitätskonzentrationen, oft deutlich unter 5% ID / g. Als Kontrolle wurden eine zusätzliche Gruppe von Mäusen coinjiziert 300 ug unmarkiertem DFO-J591, um das Antigen zu sättigen und so erläutern selektive Blockierung injiziert. Criti tisch, senkte die Blockier Experiment Aufnahme des Radioimmunkonjugat im Tumor von 48,9% ± 9,3% ID / g auf 23,5% ± 11,1% ID / g bei 72 h nach der Injektion deutlich darauf hinweist, dass 89 Zr-DFO-J591 selektiv auf ihrer Antigen.

Figur 1
Abbildung 1. (A) Ein vereinfachtes Zerfallsschema und (B) einige hervorstechende Zerfallseigenschaften von 89 Zr 13,16,17 IT = isomeren Übergang. EC = Elektroneneinfang. Modifizierte und mit Genehmigung von Deri, et al nachgedruckt. Nuklearmedizin und Biologie. 40, 3-14 (2013). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 2. (A) Die Struktur der DFO-NCS mit der koordinierenden Sauerstoffatome rot gefärbt; (B) eine DFT-abgeleiteten Struktur der Zr-DFO-Koordinationskomplex. Modifizierte und mit Genehmigung von Deri, et al nachgedruckt. Journal of Medicinal Chemistry. 57, 4849 bis 4860 (2014). Copyright 2014 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Biokonjugation und Radiomarkierung von 89 Zr-DFO-J591.et = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4
Abbildung 4. Repräsentative radio TLC Chromatogramme der rohen Radiomarkierungsgemisch (A) und gereinigten Produkts (B) von 89 Zr-DFO-J591. Radio TLCs wurden auf Silica-Streifen unter Verwendung eines Elutionsmittels aus 50 mM DTPA, pH 5,0, ausgeführt. Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Koronare PET-Bilder von 89 Zr-DFO-J591 (11,1-12,9 MBq [300-345 & mgr; Ci] über die Schwanzvene in 200 ul 0,9% steriler Kochsalzlösung injiziert) in athymischen Nacktmäusen, die subkutane, PSMA-exprimierendenLNCaP Prostatakrebs Xenotransplantaten (weiße Pfeile) zwischen 24 und 120 Stunden nach der Injektion. Modifizierte und mit Genehmigung von Zeglis et al nachgedruckt. Bioconjugate Chemistry. 24, 1057-1067 (2013). Copyright 2013 American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Discussion

Während die Konstruktion, radioaktive Markierung, und Abbildung 89 Zr-DFO-beschriftet Radioimmunkonjugate ist in der Regel ein ziemlich einfaches Verfahren, ist es wichtig, ein paar wichtige Überlegungen bei jedem Schritt des Prozesses zu halten. Beispielsweise, wenn die wahrscheinlichste Ursache für Bedenken während der Konjugation Schritt der Prozedur ist die Aggregation des Antikörpers während der Konjugationsreaktion. Dieses Problem ist häufig ein Produkt von schlechter Vermischung der Konjugationsreaktion nach der Zugabe des DFO-NCS-Stammlösung. 22. Wenn dies geschieht, kann die nicht-homogene Verteilung des DFO-NCS übermßig hohe lokale Reaktion mit der Ursache Antikörper, die wiederum um die Aggregation führen kann. Dieses Problem kann relativ einfach durch Zugabe des DFO-NCS-Stammlösung in kleinen Teilmengen (<5 ul), Durchmischung des Reaktionsgemisches nach der Zugabe des DFO-NCS, und Rühren der Reaktionsmischung auf einem temperatur umgangenE-Schüttler. Darüber hinaus wird nach der Konjugation und Reinigung des DFO-mAb-Konstrukt ist es wichtig, die Anzahl der DFO jedem mAb, konjugiert genau zu bestimmen. Die vollständige Charakterisierung der Anzahl von DFO Chelate pro Antikörper können unter Verwendung radiometrischer Isotopenverdünnung Experimenten ähnlich den von Holland gesteigert, et al., Und Anderson, et al., Obwohl MALDI-TOF-Massenspektrometrie ist eine brauchbare Alternative. 14,23 , 30,51,52 während der Radiomarkierungsschritt, einfach das häufigste Problem ist niedriger als erwartet Radiomarkierungsausbeuten. Wenn unerwartet niedrigen Renditen trotz gewissenhaft nach dem Protokoll über auftreten, sind drei verschiedene Fehlersuchstrategien zur Verfügung: (1) Inkubation der Radiomarkierungsreaktion für längere Zeitspannen (zB 2-3 Stunden); (2) Wiederholen der Radiomarkierungsreaktion unter Verwendung einer höheren Konzentration des Antikörpers; oder (3) Wiederholen des anfänglichen DFO-NCS Konjugationsreaktion mit einem höheren molaren Überschuß von the bifunktionellen Chelator.

Während die DFO-NCS Konjugation ist leicht und robust, ist eine ihrer unbestreitbaren Schwächen, dass es nicht ortsspezifisch: DFO-NCS bildet Thioharnstoff Verbindungen zu Verfügung Lysine in den Antikörper unabhängig von ihrer Position. Als ein Ergebnis ist es möglich, dass die Chelatoren können hängt, um die Antigen-bindende Region des Antikörpers zu werden, wodurch die Immunreaktivität des 89 Zr-DFO-markiertes Konjugat zu beeinträchtigen. Daher muss eine feine Balance in den Bau von 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate gefunden werden: höhere Anzahl von Chelatoren pro Antikörper erleichtern höhere spezifische Aktivitäten, aber höheren Graden der Kennzeichnung auch das Risiko der Beeinträchtigung der Immunreaktivität des Konstrukts zu erhöhen. Am Ende ist das Ziel einfach: legen so viele Chelatoren wie nötig, ohne dabei Immunreaktivität. Nach dem Erhalt des gereinigten 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugat, ist es entscheidend, die bestimmen, in-vivo-Experimente. Zu diesem Zweck empfehlen wir die Verwendung der von Lindmo veröffentlicht in vitro-Methoden, et al. 53,54 Wenn die Immunreaktivität des Konstrukts ist niedriger als 80-90%, kann es notwendig sein, um die Konjugationsreaktion zurück und hängen weniger DFO-Einheiten pro Antikörper. Alternativ, wenn die Immunreaktivität des gereinigten 89 Zr-DFO-mAb ist hoch (> 90%) und höhere spezifische Aktivitäten gewünscht werden, kann es möglich sein, mehr Chelatoren an den Antikörper ohne Verringerung Immunreaktivität befestigen.

Schließlich ist die in vivo-Verhalten einer 89 Zr-DFO-markierter Antikörper ist natürlich in hohem Maße sowohl von der Identität des Antikörpers und des Tumormodell verwendet. Im Modellsystem hier vorgestellten die maximale Aufnahmewert im Tumor erreicht rund 60% ID / g; jedoch Berichte in der Literatur für eine maximale Tumoraufnahme values ​​Bereich von so niedrig wie 15-20% ID / g bis so hoch wie 80-90% ID / g 33,44,55-57 Ebenso die Höhe der Aufnahme in Nicht-Zielgeweben. - insbesondere der Leber und der Milz - kann in Abhängigkeit von der Antikörper / Antigen-System untersucht, variieren. Die spezifische Aktivität des 89 Zr-DFO-markierte Antikörper ist ein wichtiger Gesichtspunkt für die in vivo-Experimenten. Literaturwerte für die spezifischen Aktivitäten des 89 Zr-DFO-mAbs typischerweise im Bereich 1-6 mCi / mg (von 37 bis 222 MBq / mg). 8,10 Allgemeinen sind höhere spezifische Aktivitäten zu bevorzugen, da sie die Wahrscheinlichkeit der unbeabsichtigten vermindern Sättigung des Antigens (dh Selbstblockierung). Dies wird vor allem in Anlagen mit niedrigeren Antigen-Expression. Unabhängig von dem Antikörper / Antigen-System ist kein in vivo Untersuchung einer 89 Zr-DFO-markierten bildgebenden Mittels ohne einen Nachweis der Selektivität. Dies kann über Blockierungsexperimente erreicht werden durchgroße Mengen an unmarkiertem Biomolekül oder die Verwendung einer Zelllinie, die nicht die betreffende Antigen nicht exprimiert. Bei dem hier beschriebenen Verfahren wurde die erstere verwendet wird, jedoch ist die Selektivität von 89 Zr-DFO-J591 wurde auch unter Verwendung PSMA-negative PC3 Prostatakrebs-Xenotransplantaten demonstriert. 23

Es ist wichtig zu beachten, dass trotz seiner klaren Vorteile, das ist DFO-NCS-basierten Synthesemethoden nicht perfekt. Wie wir besprochen haben, ist DFO keine ideale Chelator für 89 Zr 4+, und die nicht-ortsspezifische Art der Konjugationsreaktion was schwierig sein kann. Um diese Probleme zu umgehen, um aufregende neue Anstrengungen Chelatoren für die Entwicklung von 89 Zr 4+ und ortsspezifische Radiomarkierungsmethoden sind derzeit im Gange, aber diese neuen Technologien müssen noch optimiert und in Labor und Klinik validiert werden. 24,26,27, 29,44 Letztlich ist das DFO-NCS Methodik für den Bau89 Zr-DFO-markierte Antikörper hat sich als ein äußerst leistungsfähiges Werkzeug für die Synthese von Radioimmunkonjugaten und das Potential hat, verwendet, um eine Vielzahl von klinisch nützlichen Radiopharmazeutika zu erzeugen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Die Autoren danken Prof. Thomas Reiner, Dr. Jacob Houghton, und Dr. Serge Lyaschenko für hilfreiche Gespräche.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
p-SCN-Bn-DFO Macrocyclics B-705 Store at -80 °C
[89Zr]Zr-oxalate Various, including Perkin-Elmer Caution: Radioactive material
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare 17-0851-01  Store at room temperature
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units EMD Millipore UFC805024 Store at room temperature
Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper Agilent Technologies SGI0001 Cut into strips 0.5 cm wide

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