הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Johnson, C. J., Carlson, C. M., Morawski, A. R., Manthei, A., Cashman, N. R. Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay. J. Vis. Exp. (97), e52522, doi:10.3791/52522 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

"ספגות מוח מדבק (TSEs, מחלות פריון) הוא קבוצה של מחלות ניווניות קטלניות עם תקופות דגירה ממושכות המשפיעות על מגוון רחב של בעלי חיים ובני אדם. סוכן etiological המשוער של TSEs מורכב מהאיזומר misfolded של חלבון פריון מארח (PRP), כי הוא מסוגל התפשטות עצמית על ידי המרה מונעת תבנית של הטופס הסלולרי הרגיל של PRP (PRP C) ל, הקשורים למחלות זיהומיות טופס (PRP TSE) המצטבר ברקמות מערכת עצבים מרכזיות של המארח הנגוע 1. פריונים יונקים זיהומיות בדרך כלל להעביר ממארח ​​למארח באופן מינים ספציפיים, דבר שהוביל לרעיון של "מחסום מיני TSE" הגבלת אירועי שידור interspecies 2. הגורמים הביולוגיים של מחסום מיני פריון אינם מובנה היטב. דמיון רצף חומצות האמיניות בין PRP TSE זיהומיות והמארח ג PRP Cמאוד משפיע אם הגיור מתקיים 3-5, אבל נשאר מספיק כדי להסביר את כל אירועי שידור הפריון נצפו in vivo 6,7.

לפיכך, אפיון חסמי מיני TSE הסתמך במידה רבה על מחקרים בבעלי החיים אתגר: חשיפת בעלי חיים תמימים ממין נתון לפריונים מאחרים ומדידת זמן דגירה וכתוצאה מכך להתפרצות מחלה ושיעור התקפת כאינדיקטורים של יעילות העברת. עכברים להביע PRP C ממיני Heterologous משמשים גם לסוג זה של מחקר 8. העלויות כרוכות בייצור מהונדס עכבר וbioassays פריון הממושך, כמו גם שיקולים אתיים של שימוש בבעלי חיים, הם מכשולים בדרך לחקירה ניסויית של מחסומי מיני TSE. הערכה של מכשול המין האנושי לTSEs מסתמכת על עכברים שהונדסו אדם PRP C. עכברים אלה דורשים תקופות דגירה ארוכות להיכנע לTSEs או שינויים כדי לא אנושייםהוא מולקולת PRP C בבני אדם למחלה מהירה תחילת 9. תקופות דגירה לTSEs לא אנושי בעכברים אלה עשויות להאריך את תוחלת החיים מעבר לעכבר הרגיל עושה פרשנות של תוצאות שליליות מאתגרות. פרימטים שאינם בני אדם יש גם שימשו כשליחים ללימוד מחסומי מין אנושיים, אך מחקרים אלה הם טומנים בחובה אותם האתגרים כמו סוגים אחרים של ניסויים בבעלי חיים וקופים שאינם בני אדם עשוי שלא בדיוק לשחזר מחלה כפי שהוא ממשיך במארח האנושי.

bioassays בעלי החיים יישאר בשיטה "תקן זהב" למדידת הרגישות של מינים לTSE, אבל המכשולים, העלויות והאתיקה של מחקרים בבעלי החיים חיים אלה אילצו את חקירת חלופות. מספר מבחני במבחנה, המבוססים על הערכת ההמרה של מארח PRP C לproteinase K (PK) מדינת -resistant (מיל PRP) כאשר שנזרעו על ידי PRP TSE, פותחו ושימוש כדי לחקור sp TSEמחסומי ecies 10-12. דוגמאות למבחנים במבחנה כוללות מבחני תא ללא המרה, חלבון misfolding הגברה מחזורית (PMCA), ויחס יעילות המרת assay (CER) 10-14. למרות שאף אחד ממבחנים אלה לקחת בחשבון גורמים היקפיים המעורבים במחסומי מינים לאחר הדבקה טבעית, כולם יכולים להיות שימושיים כדי לזהות מארחים פוטנציאליים רגישים לTSEs.

כאן אנו מציגים את הפרוטוקול עבור assay CER, שבו שני מצעי PRP C מפוגלים נגזרים מhomogenates המוח הנורמלית משמשים בתגובות המרת פריון העליונה ספסל (איור 1) 13. PRP C במצע המפוגל ב- pH 7.4 ניתן להמיר רק למיל PRP ידי PRP TSE זורעים לתוך התגובה בהיעדר מחסום מינים 14. בניגוד לכך, denaturation של PRP C במצע האחר ב- pH 3.5 מאפשר לה להיות מומר לדגירה הבאה מיל PRPעם PRP TSE מכל מינים ומשמש כביקורת לגיור. יחס ההמרה של PRP C למיל PRP בpH 7.4 ביחס מצע לזה של מצע 3.5 pH מספק מדד של מחסום המינים. מצאנו כי assay CER מנבא ידוע מחסומי מינים של עכברי מעבדה לTSEs השונים והשתמש assay במאמצים כדי לחזות את מחסום המינים של מינים רבים של יונקים, כוללים איל בר, למחלה כרונית לבזבז (CWD) וTSEs האחר 14, 15. חוקרים מעוניינים בכלי המאפשר סינון מהיר של מחסומים או הערכה של המרת PRP C מיל -כדי-PRP מיני TSE ימצא מתודולוגיה זו שימושית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עבודה בבעלי חיים שנערכו במרכז בטבע הלאומי USGS הבריאות בוצעה בהתאם להנחיות משרד NIH של בעלי החיים במעבדת רווחה ותחת טיפול בבעלי חיים מוסדי ו# פרוטוקול EP080716 ועדת שימוש. רקמות מבעלי החיים שנקטפו-צייד היו מתנות ומיסקונסין או מישיגן מחלקות משאבי טבע.

1. פתרון הכנה

הערה: הפתרונות המפורטים להלן נדרשות להכנת מצע assay CER בסעיף 2 להלן. הכן כל אחד מפתרונות אלה מפתרונות מניות ריכוז גבוהים יותר; ריכוזים מומלצים עבור פתרונות מניות יינתנו בסוגריים אחרי כל שם כימי המתאים מופיע ברשימה. הכן את כל הפתרונות הטריים על הכנת מצע ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד שימוש.

  1. למאגר תמוגה, להכין פתרון מאלה ב 10 מ"מ טריס, pH 7.5 (1 M טריס, פתרון 7.5 pH המניה מומלץ): 100 מ"מ שלכלוריד גנות (NaCl, פתרון מניות 1 M), חומצת ethylenediaminetetraacetic 10 מ"מ (EDTA, 500 mM EDTA, pH פתרון מניות 8.0), 0.5% NP-40 (פתרון מניות 10%), deoxycholate 0.5% (DOC, פתרון מניות 10% ).
  2. לחיץ המרה, להכין פתרון של סולפט 0.05% dodecyl נתרן (SDS, 10% מניות פתרון) ו 0.5% Triton X-100 (פתרון 10% מניות) בתמיסת מלח 1 פוספט (PBS, 10, pH פתרון מניות 7.4).
  3. לפתרונות chaotropic, להכין שני 3 M פתרונות של hydrochloride guanidine (GdnHCl, 8 M מלאי) ב1x PBS (פתרון המניות 10x). התאם את ה- pH של אחד מהפתרונות ל -3.5 ± 0.05 באמצעות חומצה מרוכזת הידרוכלורית (HCl). בדוק שpH של התמיסה השנייה נשאר בpH 7.4 ± 0.05 ולהתאים באמצעות הידרוקסיד מרוכז HCl או נתרן (NaOH) במידת צורך.

2. הכן זוגות CER Assay מצע

  1. להשיג רקמה בריאה, שאינו נגועה TSE-מוח ממינים של ריבית ולהכין 10% נפח משקל לכל(W / v) homogenate במאגר תמוגה באמצעות אחת מהשיטות הבאות: dounce, חרוז-טחנה, או הומוגניזציה מכתש ועלי. לחדד עוד וכתוצאה מכך homogenates על ידי חשיפתם להומוגניזציה מזרק ומחט, באמצעות מחטים של מד הגדלת עד מצע יכול להישאף וגורש בקלות באמצעות מחט מזרק G 27.
    1. למצעים שהוכנו ממכרסמים ויונקים קטנים אחרים, homogenize מוח כולו (ים); למצעים שהוכנו מיונקים גדולים יותר, להשתמש OBEX רקמה (גזע המוח) להכין homogenates. בעת בחירת כמות homogenate המוח, להכין לא יותר מ -50% מהקיבולת של צנטריפוגות משמשת למשקעי חלבון בשלב 2.6.
    2. אם האיכות של רקמת המוח רכשה מוטלת בספק, להעריך את רמות PRP C על ידי SDS-PAGE 16 וimmunoblot 17 הכנה מוקדמת למצע.
  2. לחלק homogenate המוח לשני כרכים שווים בצינורות חרוטי נפרדים שכותרתו פלסטיק. להוסיף GdnHCl (3 M פתרונות ב1 PBS) בשני pH 3.5 או 7.4 לכל צינור ביחס של 1: 1 נפח לhomogenate המוח.
  3. בדקו את ערכי ה- pH של שני פתרונות. התאם את ה- pH של pH 3.5 המצע לpH ± 0.05 באמצעות HCl המרוכז. להבטיח את ה- pH של המצע האחר נשאר בpH 7.4 ± 0.05 ולהתאים את ה- pH במידת צורך עם HCl או NaOH במידת הצורך. הימנע מהחטאת ערכי pH על ידי תוספת מושכלת של חומצה או בסיס.
  4. סובב פתרונות במיקסר הסוף-over-הסוף בטמפרטורת חדר (RT) במשך 5 שעות.
  5. לזרז חלבון על ידי הוספת ארבעה כרכים של מתנול לפתרונות מצע בכל צינור חרוטי, מערבולת לערבב היטב, דגירה ב -20 ° C ל16-18 שעות.
  6. דגימות משקעים על ידי צנטריפוגה ב× גרם 13,000 למשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. למזוג בזהירות וזורקי supernatants ולאפשר מתנול להתאדות מהכדורים. השתמש בהחלה מכותנה שקצה כדי לסייע בקליטת מתנול נצמד לחלק הפנימי של הצינור. אל תאפשר כדורים ליותר מ-dry ופעם מתנול הוא כבר לא נראה לעין, להמשיך לשלב הבא.
  7. כדורי חלבון Resuspend במאגר המרה. השתמש בכמות של חיץ ההמרה שווה לכמות חומר התחלת homogenate המוח לוותר לתוך צינור אחד בשלב 2.2.
    הערה: זה קריטי, כי המאגר משמש להמרת resuspend כדורי חלבון משני pH 3.5 והכנות מצע שטופלו 7.4 הוא הפתרון המוגדר בשלב 1.2 לעיל (המכיל רמות נמוכות של חומרי ניקוי וpH פיסיולוגי).
  8. פתרונות בקצרה sonicate מצע בsonicator cuphorn (10 שניות ב ~ 30% כוח מרבי), aliquot לתוך 0.5-1.0 מיליליטר כרכים בצינורות 1.5 מיליליטר microcentrifuge שכותרת. בצע immunoblot בקרת איכות (שלב 2.9) על aliquot של כל מצע. אחסן aliquots האחר ב -80 ° C עד מוכן לבצע assay CER (סעיף 4).
  9. לבצע בקרת איכות על זוגות מצע CER לפני השימוש (איור 2). צעדים אלה להבטיח כי מצעי CER יהיו providתוצאות אופטימליות דואר בלימודי גיור.
    1. להבטיח כמויות דומות של PRP C בשני מצעים. להשוות רמות PRP ב10-25 μl של כל מצע על ידי SDS-PAGE 16 וimmunoblotting 17. אם רמות החלבון בpH 7.4 ו -3.5 מצעים נמצאים ב~ 10% של כל אחד אחר, זוגות המצע מתאימים לשימוש במחקרי CER.
      הערה: immunoblots PRP לא צריך להראות ראיות של השפלה PRP C הנרחבת. Immunoreactivity PRP צריך להיות בעיקר> 20 kDa. להקות פחות ממסה מולקולרית זה יכול להיות מוצרים פגומים. דפוסי פסים צריכים להיות שווי ערך פחות או יותר בין זוגות מצע.
    2. כC PRP בשני מצעים צריך להיות PK רגיש, טיפול 10-25 μl של כל מצע עם PK בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ולעכל דגימות ב 1000 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בתרם-אכר. להעריך כל אות PRP שנותר על ידי SDS-PAGE 16 וimmunoblotting 17.מצעים עם מיל PRP אינם מתאימים לשימוש במחקרי CER.

3. להכין זרעי TSE סוכן

  1. להשיג רקמת מוח נגוע TSE ממינים של ריבית ולהכין 10% (w / v) homogenate ב1x PBS pH 7.4 באמצעות השיטות מפורטות בשלב 2.1 לעיל.
    הערה: זרעים גם יכולים להיות מיוצרים מרקמות נגועים TSE אחרות מחוץ למערכת העצבים המרכזית, לעומת זאת, יעילות ההמרה של מצעי המוח מפיק זרעים נגזרים מרקמות היקפי נגועים TSE טרם הוערכה באופן ניסיוני בספרות שפורסמה.
  2. Aliquot וכתוצאה מכך homogenate (ים) לתוך 100-300 כרכי μl בצינורות 0.5 מיליליטר microcentrifuge וחנות ב -80 ° C עד מוכן לבצע את assay CER.

Assay 4. CER

הערה: assay CER כרוך תוספת של כמות קטנה יחסית של PRP TSE (הניתנת ב" הזרע ") ממין אחדלעודף יחסי של PRP C (הניתן במוח נגוע "המצע") ממין אחר שכבר מפוגל באופן חלקי בשני pH 3.5 או 7.4. בעקבות תקופת דגירה ממושכת רועדת, המרה מונעת תבנית של PRP C על ידי PRP TSE בכל תגובה מוערכת על ידי אות densitometric של PRP מיל שנותר לאחר עיכול PK וזיהוי immunoblot. השוואת רמות מיל PRP במצעים המפוגלים בעבר ב- pH 3.5 לעומת 7.4 מספקת מדד של מחסום המינים. סקירה ניסיונית של הליך assay זה מסופקת באיור 1.

  1. לאט להפשיר זוגות מצע CER נגוע (assay דורש כמויות שווה של מצעים המפוגלים בעבר בשני pH 3.5 ו -7.4) ופתרונות זרע TSE נגועים על ידי הצבת אותם על גבי מצע של קרח (כ זמן הפשרה 1 שעה).
  2. ברגע שהפשיר באופן מלא, ולאחר מכן לשאוב לגרש כל פתרון מצע דרך27 כמה פעמים מחט מזרק G מחדש homogenize זה. בקצרה sonicate כל פתרון זרע נגוע TSE במשך 10 שניות ב ~ 30% כוח מקסימאלי. שמור את כל הפתרונות על קרח בעת הכנת תגובות המרה.
  3. תווית 5 צינורות בודדים נמוכים מחייב, דק דופן PCR לסוכן TSE נבדק.
  4. הכן תגובות גיור בצינורות אלה על ידי הוספת 5 μl של 10% פתרון זרע TSE נגוע עד 95 μl של (א) מצע CER מוכן בpH 7.4 ו- (ב) מצע CER מוכן ב- pH 3.5.
    1. עבור כל דגימת ניסוי, להכין תגובות מקבילות בזוגות מצע CER המפוגלים בעבר בשני pH 3.5 ו -7.4.
    2. לייעל יחסים של זרע סוכן TSE למצע מוח נגוע באמצעות קביעה אמפירית. Common זרעים: יחסי מצע המועסקים לשמור על סך נפח תגובה של 100 μl וכוללים 1:99 μl, 2:98 μl ו5:95 μl. עבור מרבית היישומים, זרע 5:95 μl: יחס מצע הנפח מתאים והוא מה שמוצג בההוא פרוטוקול.
  5. הכן שלוש דגימות בקרה לסוכן TSE נבדקות באופן הבא: (א) להוסיף 5 μl של 10% פתרון זרע TSE הנגוע לחיץ המרה 95 μl כביקורת למיל PRP קלט; להוסיף למאגר המרה 5 μl 95 מצע μl מוכן בpH (ב) 3.5 pH ו( ג) 7.4 כפקדים לגיור שאינו ספציפי, שאינה בתבניות.
  6. בקצרה מערבולת מדגם זה בצינור PCR הסגור שלה כדי לערבב זרע ומצע היטב. פעל עם דופק רגעי במיני-צנטריפוגה גבי ספסל במהירות נמוכה כדי להסיר כל נפח של תערובת התגובה לכודה במכסה צינור PCR.
  7. דגימות טען בצינורות PCR בנפרד כותרת לתרם-אכר העליון ספסל מצויד לקבל צינורות PCR. Shake דגימות ב 1000 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  8. בעקבות טלטול, להוסיף sarkosyl לריכוז סופי של 2% (w / v) וPK לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר. דגימות Digest ב 1000 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בתרם-אכר.
    NOTE: תוספת של sarkosyl לדגימות עזרים שלאחר המרה בעיכול PK של PRP C. אותות חיוביים כוזבים בדגימות unseeded (שלב 4.5) בוטלו כמעט על ידי תוספת של sarkosyl.
  9. הוסף חוצץ מדגם SDS-PAGE, דגימות חום עד 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולפתור מיל PRP שנותר בכל דגימה על ידי SDS-PAGE 16 ואחרי 17 immunoblotting.
    הערה: לאחר תוספת של חיץ מדגם וחימום, דגימות עשויה להיות מעובד או ניתן לאחסן דגימות ב -20 ° C או -80 ° C לפני immunoblotting מייד. כל הנתונים שהוצגו כאן היו שנוצרו באמצעות מערכות ג'ל והעברת Novex NuPAGE. דוגמאות בודדות מassay CER טופלו במאגר מדגם וצמצום סוכן על פי הוראות יצרן. דגימות היו מחוממות לאחר מכן ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו -30 μl של כל דגימה היה עמוסה לג'לי טרומי bis-טריס 12%.
  10. לחשב את יחס יעילות המרה (CER) כאמצעישל מחסום מינים. רמות מדד מיל PRP על ידי צפיפות 17 ולחלק את הצפיפות הכוללת של מדגם pH 7.4 ידי שמדגם 3.5 pH. להכפיל ב -100 לייצר אחוז.
  11. לאסוף נתונים ממשכפל ניסיוני עצמאי כדי ליצור CER סטיית תקן ממוצע ± למינים עם סוכן TSE נתון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שימוש מוצלח של assay CER תלוי במידה רבה על האיכות של זוגות המצע המשמשים בתגובות המרה. מסיבה זו, בעקבות הליכים להכין זוגות מצע CER, immunoblot בקרת איכות צריכה להתבצע (איור 2). עבור שני מצעים, assay 10-25 μl על ידי immunoblotting. PRP C צריך להיות בקלות לזיהוי בכל מצע ורמות PRP C חייבת להיות בערך באותו בין שתיים. Immunoreactivity יהיה בעיקר נראה מעל 20 kDa, אבל להקות קטנות יותר יכולות להיות גם ברורות. מניסיוננו, הנוכחות של להקות קטנות יותר היא מין תלוי. אם מוצרי משקל מולקולריים נמוכים הם נצפו, הנוכחות שלהם צריכה להיות מאושרת בשני זוגות המצע.

חשוב לוודא שמצעי CER חופשיים ממיל PRP אנדוגני על ידי טיפול מצעים עם PK (איור 2). אם מיל PRP הוא הווה, בעלי החיים המשמשים לsubstהכנת שיעור ייתכן שנגועה TSE או subclinically נגוע. לחלופין, C PRP במצע אולי misfolded למצב PK-עמיד בנהלי denaturation או משקעים. עצמאי מהסיבה, המצע המכיל CER מיל PRP אינו מקובל לשימוש בassay ההמרה.

עכברי מעבדה הם אחד מבעלי החיים הניסיוניים הנפוצות ביותר בשימוש במחקר TSE; ככזה, הרגישות שלהם ביותר TSEs היא מאופיינת היטב 8, מתן benchmark in vivo שכנגד על מנת לבחון את הנאמנות של assay CER. איור 3 א מציג תוצאות המרת assay CER של PRP C מעכבר (זן CD1) מצע לPRP מיל מתח RML של scrapie-passaged עכבר על ידי 1), סוכן מותאם למארח העכבר 18, 2) scrapie הכבשים המקומיים קלאסי, סוכן שיכול לשדר לעכברים הבאים תקופת דגירה ארוכה 18, ו -3 WHI)CWD צבי זנב-טה (virginianus האייל פרדי) ומתח 263K של scrapie-passaged אוגר, סוכנים שהעכברים הם מינימאלי או לא רגיש 19,20. רמות מיל PRP וכתוצאה מכך היו משתנים על פני מצעי עכבר מפוגלים ב- pH 7.4 וזורעים עם סוכני TSE השונים תוך מיל PRP נמצא בכל מצעים מפוגלים ב- pH 3.5 וזורעים עם סוכן TSE. יחסי המרת השוואת רמות מיל PRP בpH 7.4 ו -3.5 מצעים חושבו באופן עצמאי לפחות שלוש פעמים ואומרים ± SD מוצגים באיור 3. לתגובות שנזרעו על ידי RML, יחסי המרה בין pH 7.4 ו -3.5 מצעים היו כ -100%. לאלו שנזרעו על ידי scrapie, גיור במצע pH 7.4 היה כ -75% מזה במצע 3.5 pH. CWD או המרה הנוצר על-263K של מצע pH 7.4 היה מינימאלי. ניתוח חד-סטרי של שונות לא יכל להבחין הבדל ביחסי ההמרה של RML ויםcrapie או CWD ו263K, אולם יחסי המרה של RML ומרוסק היו שונים באופן משמעותי מאלה של CWD ו263K.

Assay CER יכול להיות מותאם לשימוש עם רקמות אדם או עם בעלי חיים שבו bioassays מאתגר או לא ייצור עכבר אתי ומהונדס אינו רצוי מדי. אנחנו משתמשים assay זה לאפיין את הרגישות של מיני חיות בר שונים לCWD. כדוגמא לשימוש של assay זה, אנו מציגים תוצאות ראשוניות באיור 4. מוח מחתולי בר-לכוד צייד (רופוס Lynx) נמצאו עדיין להכיל רמות לגילוי של PRP תוצרי פירוק PRP C ולא היו נרחב, המצביעים על כך אלה רקמות יכולות להיות מקור מקובל למצע CER (איור 4 א). זוגות מצע שנוצרו ממוח חתול בר הראו immunoreactivity PRP של משקל מולקולרי מתאים ולא הכילו מיל PRP אנדוגני (איור 4). כאשר זוגות מצע CER החתול הבר שנוצרו משתי חיות נפרדות הודגרו עם אותו הצבי לבן זנב סוכן CWD משמש assay CER העכבר מתואר באיור 3, מצאנו מצעים מוכנים בpH 7.4 שרמות של מיל PRP בהשוואה למצעים מוכנים בpH 3.5 (איור 4C), מעידים על גדר מינימאלית מינים של החתול בר PRP C להמרה על ידי CWD. CER להמרה של צבי לבן זנב PRP C על ידי אותו CWD לבודד המשמש להמרת חתול בר PRP C כאן, כביקורת חיובית, דווח בעבר כ95.2 ± 18.4% במורווסקי et al. (2013) 15.

איור 1
איור 1:. סקירה ניסויית של assay CER שני מצעי assay שהוכנו על ידי באופן חלקי denaturing PRP C שבאינו נגוע פריון רקמת המוח wפתרונות chaotropic ה- i באו pH 3.5 או pH 7.4. מצעים הם זורעים עם PRP TSE מסוכן פריון של ריבית ודגימות ניסוי נתונים לדגירת 24 שעות עם הרעד לאפשר PRP C להמרת PRP TSE בשני pH 3.5 ו -7.4 מצעים. לאחר דגירה, המרה הוערכה על ידי SDS-PAGE וimmunoblotting. צפיפות אות נקראות על ידי צפיפות וCER מחושב על ידי היחס של pH 7.4 לpH 3.5 צפיפויות אות עבור כל דגימת ניסוי.

איור 2
איור 2: בקרת איכות על מצעי CER. (א) לפני השימוש בם בassay CER, מצעי עכבר מוכנים באו pH 7.4 או 3.5 הם assayed ידי immunoblot בהעדר 1) לטיפול PK להעריך תוכן PRP C של כל זוג מצע (רמות PRP C צריכה להיות שווה ערך בין substra pH 7.4 ו -3.5 tes לשימוש בassay CER) ו- 2) נוכחות של PK (100 מיקרוגרם / מיליליטר) טיפול לבדיקה קיים מראש מיל PRP ברקמות המשמשות להכנת מצעים (כל מצעים המציגים מיל PRP קיים מראש אינו מתאים לשימוש ב assay CER). (ב) כדי לבדוק היווצרות מיל PRP אינו ספציפית במהלך assay ההמרה, מצעי העכבר PRP C הוכנו בבית או pH 7.4 או 3.5 הם זורעים עם חיץ המרה, מזועזעים למשך 24 שעות ב 1000 סל"ד, 37 ° C , ולאחר מכן טופל ב- PK (100 מיקרוגרם / מיליליטר) וassayed למיל PRP ידי immunoblotting (מימין שני נתיבים). -מזועזע עישון, מצעי עכבר הלא-PK טופלו מייצגים תוכן PRP C הכולל בתגובות assay (משמאל שני נתיבים). ל( B), נתיבים בלתי רלוונטיים קצוצים לבהירות, אבל כל לוח immunoblot נובע מאותו ג'ל, הקרום והחשיפה. Immunoblots בכל הלוחות המשמש נוגדן חד שבטי SAF 83.

"> איור 3
איור 3:. Assay CER באמצעות מצע עכבר המעבדה מצע assay () העכבר CER הכין בבית או pH 7.4 או 3.5 הודגרה עם scrapie RML מותאם עכבר, scrapie הקלאסי כבשים מקומיים, מחלה ממארת כרוני צבי לבן זנב (CWD) או 263K זן של scrapie מותאם אוגר בassay CER. דגימות בקרה (שכותרתו "אף אחד") הכילו כמות שווה של רק גורם מדבק ולא מצע עכבר. דגימות נותחו לנוכחות חלבון PK עמיד פריון (מיל PRP) על ידי immunoblot עם ערכי densitometric נוגדן חד שבטי SAF 83. גלם לכל דגימה מוצגות מתחת לכל נתיב. גרף (B) בר המציין את היחס הממוצע (± סטיית תקן) בין pH 7.4 ו -3.5 מצעי עכבר לכל גורם מזהם המבוסס על לפחות 3 ריצות assay עצמאיות. אותיות קטנות מתייחסות לסטטיסטיותתת הומוגנית (ניתוח שונות עם שיטת הבדלי משמעות מינימום Tukey-Kramer; p <0.05). נתון זה שונה ממורווסקי et al. 2,013 15.

איור 4
איור 4: שימוש לדוגמא של assay CER לחקור רגישות חתול ברה לCWD homogenate ובקט המוח () ומצע assay CER (B) נבדק על ידי immunoblotting בהעדר והנוכחות של PK (100 מיקרוגרם / מיליליטר) כדי להעריך קיימים PRP C. רמות ואת הנוכחות של מיל PRP קיים מראש, בהתאמה. מצעים בובקט (C) היו זורעים עם חיץ המרה ומאושר בassay CER להעריך היווצרות מיל PRP שאינו ספציפי (משמאל שני נתיבים). -מזועזע עישון, מצעי חתול ברים שאינו PK טופלו מייצגים תוכן PRP C הכולל בתגובות assay (מימין שני נתיבים).מצע ובקט (D) שהוכן בבית או pH 7.4 או 3.5 הודגרה עם CWD צבי לבן זנב באמצעות assay CER. מדגם השליטה (שכותרתו "אף אחד") הכיל כמות שווה של סוכן CWD אבל אין מצע חתול בר. ערכי densitometric גלם עבור כל דגימה מוצגים מתחת לכל נתיב. Immunoblots בכל לוחות נוגדן חד שבטי המשמש 3F4, שמגיב עם חלבון הפריון החתולי 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לסיום מוצלח של פרוטוקול זה, יש לשים לב לרמות PRP C ברקמות מוח נגוע משמשות להכנת מצע (שלב 2.1.2) והזרע למצע יחס לתגובות המרה (שלב 4.4.2). מניסיוננו, ניתן לחלץ את המוח לשימוש כמצע CER לאחר נתיחה שלאחר מות תקופה משמעותית, כל עוד PRP C נמצא על ידי immunoblotting (איור 4). למעשה, כמה autolysis נצפה במוחם של חתולי הבר המשמשים למחקרי CER. אף על פי כן, דגירה של מצעים נגזרים מהמוחין האלה עדיין הביאה להיווצרות של מיל PRP. אנו משערים כי, בחלקו, על חוסנו של assay CER נגזר מdenaturation של מצעי CER 1.5 M GdnHCl, אשר להשבית פרוטאזות רבות.

זרע למצע יחסים ייתכן שיהיה צורך לקבוע באופן אמפירי לקבל אות מיל PRP המקובל על ידי immunoblotting. יותר מדי או יותר מדי lמיל PRP ittle לבצע צפיפות, רמות מיל PRP גבוה רקע בדגימות שליטה חסרת מצע ויחסי המרה עולים בקנה אחד הם כל הסיבות כדי לייעל את זרעים: יחסי מצע. וריאציות לשמור כולל נפח תגובה של 100 μl וכוללות 1:99 μl, 2:98 μl ו5:95 μl. על כמעט כל הזדמנויות, מצאנו כי 5:95 זרע μl: יחס מצע נפח הוא אופטימלי. לא משנה מה יחס מועסק, כמויות שווה של סוכן TSE משמשות וassay הוא עקביות פנימית. עם זאת, ריכוז זרע של homogenate המוח נגוע בפריון המשמש לתגובות תבנית צפויה משפיע על התוצאה של assay CER שבtiters הזרע משתנה או דילולים עלולה לגרום לרמות משתנות של המרה PRP C מיל -כדי-PRP. השפעה זו באה לביטוי במבחנים אחרים בהמרת פריון מבחנה 22 ועלולה לסבך את ההשוואה של פריון שונה מבודד. כדי לטפל בזה בassay CER, ג זרעיםולד להיות טיטרציה בכל מצע PRP C הוכן ב- pH 3.5 ו -7.4 לזהות מגוון של דילולים שתבנית המרת PRP C. דילולים זרע אידיאליים להימנע להרוות את הפתרון עם פריונים זרע עודפים ועדיין לספק תובנות לגבי הרגישות של תגובת ההמרה. לחלופין, המרת PRP C מיל -כדי-PRP בתגובות assay CER ניתן הייתה למדוד במספר, נקודתי זמן קבועות לכל האורך assay ולהתוות כמו עקומות, ריבית של המרה דומות לקריאות לתגובת השרשרת של פולימראז בזמן אמת ( qPCR) 23 וזמן אמת רועדת המרה מושרה (RT-quic) 24 מבחני. readouts כזה יכול לאפשר פרשנויות מקיפות יותר של מחסומי מינים והם מוקד מעניין של פיתוח עתידי של מתודולוגיה זו.

בפרוטוקול המובא כאן, אנו משתמשים בצינורות נמוכים מחייב, דק דופן PCR, אבל גם יש לנו להשתמש צינורות 1.5 מיליליטר סטנדרטיים בתרם-אכר המצויד לסוג זה של צינור. אין וריאציות אחרות לפרוטוקול יש צורך להשתמש בצינורות בגודל גדולים יותר. מניסיוננו, לעומת זאת, היו לנו יותר ייצור מיל PRP ותוצאות לשחזור יותר בצינורות PCR מחייב נמוכים בהשוואה לצינורות 1.5 מיליליטר. בעוד הסברים לביצועים המשופרים של assay בצינורות PCR הם רק ספקולטיבי בשלב זה, המבוסס על תוצאות מצביעים על כך שממשק אוויר המים הוא קריטי עבור PRP fibrillization 25, אנו משערים כי הצינורות הקטנים יותר לספק מתח פנים אופטימליים יותר לPRP המרה.

אולי המגבלה הראשית לשימוש בassay CER היא בהבנה מה יחסי המרה מייצגים במונחים של גורמי מחסומי מיני in vivo, כגון חדירות מחלה או אורך תקופת דגירה. בעוד לא ידוע כרגע, תרגום בין במבחנה ובגורמי מחסום מיני vivo צריך להיות ברור יותר עם ​​המשך שימוש של assay CER בaddit בדיקותמיני מחסומי ional TSE שכבר הוקמו בvivo ויעזרו להעפיל תוצאות במינים שבם נתונים המבדק אינם זמינים. יתרון של assay CER לעומת PMCA הוא נוכחותם של בקרה פנימית להמרת PRP, כלומר מצע pH 3.5, הניתן להמרה כל סוכן TSE על ידי. שליטה זו היא בעלת ערך כאשר לא ברור איזה, אם בכלל, סוכני TSE צריכים לגרום misfolding של מארח של אקזוטי PRP C. חוסר היכולת של מצע מארח ניתנו כדי להגביר סוכן TSE ספציפי בPMCA יכול להתפרש כעדות למחסום מינים או יכולה להיות בגלל כישלונות טכניים. כוללים חסרונות של assay CER לעומת PMCA הגברה של מיל PRP, צעדים נוספים בהכנת מצע CER ולא infectivity ידוע במיל PRP שנוצר בתגובות CER מוגבלים. זה יצוין, כי במחקר קודם, לעומת זאת, מצאנו את assay CER הביא דפוס דומה של מיל PRP foדע כמו זה של 15 PMCA. התוצאות שהוצגו כאן גם מצביעות על כך שassay CER כראוי צופה מחסומי מינים להעברת TSEs השונים לעכברי מעבדה (איור 3) ומצביעות על כך שייתכן שיש לי חתולים בר רגישות לCWD (איור 4), בהסכם עם דיווחים על כך שחתולי בית (Felis catus) יכול לרכוש מחלה פריון לאחר אתגר CWD הניסיוני 26,27. מחקרים באמצעות assay CER יכולים להחמיא מאמצי רצף PRP להבין את רגישות חיות בר לCWD 28.

Assay CER מאפשר בעלות נמוכה מהירה,, הערכה אמינה של מחסומי מיני TSE במבחנה. אמנם לא תחליף מלא ל" תקן הזהב "של המבדק בעלי חיים, assay CER יכול לשמש כהערכה ראשונית לקיומו של מחסום מיני TSE העשויים להצדיק או לייתר מחקרים נוספים בבעלי חיים. מסיבה זו, וכי assay מסתמך רקעל רקמת המוח שניתן לרכוש מבעלי החיים שאינם ניסיוניים, CER עולה בקנה אחד עם מאמצים להחליף, לצמצם ולמקד את הליכי ניסוי בבעלי חיים 29. בנוסף להערכת מחסומי מינים, assay CER יכול גם לספק פלטפורמה פשוטה שבה לחקור את המנגנונים של האירוע המהותי הגדרת ביולוגיה מחלה פריון: המרה של נורמלי, פונקציונלי PRP C לטופס misfolded.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Bis-Tris SDS-PAGE gels Life Technologies NP0342
0.5 mm Zirconium oxide beads Next Advance ZROB05 Other varieties of beads are also effective
Antibodies various suppliers Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest
Bead homogenizer Next Advance BBY24M
Centrifuge Beckman Coulter 369434 High speed with temperature control
Conical tubes any brand
Cotton-tipped applicator Uline S-18991
Cuphorn sonicator Heat Systems-Ultrasonics W-380 Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC
Densitometry software program UVP Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software Other programs, such as NIH ImageJ, will also work
Dounce homogenizer Kimble Chase 885300
End-over-end mixer Labnet International H5600
Ethylenediaminetetra acetic acid Boston Bioproducts P-770 Hazardous chemical: eye irritation
Guanidine hydrochloride, 8 M Thermo Fisher Scientific 24115 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation
Heating block Fisher Scientific 11-718
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 435570 Hazardous chemical: strong acid
Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x Life Technologies NP0008 Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid
Microcentrifuge tubes any brand
Mini-centrifuge Labnet International C1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) Sigma-Aldrich  L-5125 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage
Nonidet P-40 Amresco M158 Hazardous chemical: skin irritation, eye damage
SDS-PAGE gel system Life Technologies NuPAGE electrophoresis system Other SDS-PAGE systems will also work
PCR tubes (low-binding) Axygen PCR-02-L-C
Pestle homogenizer Fisher Scientific 03-392-106
pH meter Sentron SI600
Polyvinyldifluoride membrane Millipore IPVH00010
Proteinase K Promega V3021 Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity
Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x Life Technologies NP0009
Sodium chloride Fisher Scientific 7647-14-5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich  D6750 Hazardous chemical: acute toxicity
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 28364 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Hazardous chemical; strong base
Syringe BD Biosciences various Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized
Syringe needles BD Biosciences various
Thermoshaker (PCR tube shaker) Hangzhou All Sheng Instruments MS-100
Tris base Bio Basic 77-86-1 Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation
Triton X-100 Integra Chemical Company T756.30.30 Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation
Vortexer Fisher Scientific 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (1), a006833 (2011).
  2. Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
  3. Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59, (5), 847-857 (1989).
  4. Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
  5. Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
  6. Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389, (6650), 448-450 (1997).
  7. Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9, (3), e89722 (2014).
  8. Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39, (4), 32 (2008).
  9. Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (8), 4784-4789 (2003).
  10. Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (9), 3923-3927 (1995).
  11. Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19, (7), 4425-4430 (2000).
  12. Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3, (4), 220-223 (2009).
  13. Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277, (46), 43942-43947 (2002).
  14. Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364, (4), 796-800 (2007).
  15. Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157 (2013).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  17. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
  18. Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1, (7191), 1378-1379 (1961).
  19. Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78, (23), 13345-13350 (2004).
  20. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51, (1), 135-144 (1987).
  21. Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5, (4), 401-413 (1999).
  22. Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, (5), 757-768 (2008).
  23. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5, (3), 150-153 (2011).
  25. Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9, (6), e98753 (2014).
  26. Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87, (4), 1947-1956 (2013).
  27. Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. (2014).
  28. Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7, (12), e50623 (2012).
  29. Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. Methuen. (1959).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics