Avaliando Encefalopatia Espongiforme Transmissível Espécies Barreiras com uma

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Johnson, C. J., Carlson, C. M., Morawski, A. R., Manthei, A., Cashman, N. R. Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay. J. Vis. Exp. (97), e52522, doi:10.3791/52522 (2015).

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Abstract

Introduction

Encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET, doenças de príon) são um grupo de doenças neurodegenerativas fatais com longos períodos de incubação que afetam uma variedade de animais e seres humanos. O agente etiológico da EET putativo é composto por um isómero enrolamento incorrecto da proteína prião de acolhimento (PrP), que é capaz de se auto-propagação por conversão baseada em modelos da forma celular normal da PrP (PrP C) para uma doença infecciosa, doença associada formulário (PrP TSE) que se acumula nos tecidos do sistema nervoso central do hospedeiro infectado 1. Príons infecciosos mamíferos geralmente transmitem a partir de-host-to anfitrião de uma forma específica da espécie, o que deu origem ao conceito da "barreira das espécies TSE" limitando eventos de transmissão entre espécies 2. Os determinantes biológicos da barreira das espécies de prião não são bem compreendidos. Similaridade de sequência de aminoácidos entre o infecciosa PrP TSE eo anfitrião PrP C cum influenciam fortemente se a conversão ocorre 3-5, mas continua a ser insuficiente para explicar todos os eventos de transmissão de prion observados in vivo 6,7.

Assim, a caracterização da barreira de espécie TSE foi amplamente invocado estudos de provocação em animais: exposição dos animais ingênuos de uma determinada espécie de prions de outro e medindo o tempo de incubação resultante para o início da doença e taxa de ataque como indicadores de eficiência de transmissão. Ratos que expressam PrP C a partir de espécies heterólogas são também utilizados para este tipo de estudo de 8. Os custos associados à produção de camundongo transgênico e bioensaios prião prolongadas, bem como considerações éticas do uso de animais, são obstáculos para a investigação experimental de espécies TSE barreiras. Avaliação da barreira da espécie humana às TSE conta com ratos geneticamente modificados para expressar humano PrP C. Estes ratos exigem longos períodos de incubação de sucumbir às TSE humanos ou modificações a Tele humana molécula PrP C para início rápido da doença 9. Os períodos de incubação das EET não humana nesses camundongos pode estender-se para além do tempo de vida normal do mouse dificultando a interpretação dos resultados negativos desafiadoras. Os primatas não humanos também têm sido utilizados como proxies para estudar barreiras espécie humana, mas estes estudos são preocupantes com os mesmos desafios que outros tipos de experimentos com animais e primatas não-humanos não podem recapitular precisa da doença, uma vez que prossegue no hospedeiro humano.

Bioensaios em animais continuam a ser o método "padrão ouro" para medir a susceptibilidade de uma espécie para a TSE, mas os obstáculos, custos e ética destes estudos em animais vivos têm obrigado investigação sobre alternativas. Um certo número de ensaios in vitro, com base na avaliação da conversão da PrP C hospedeiro para uma proteinase K (PK) estado -resistente (res PrP) quando semeadas por PrP TSE, foram desenvolvidos e utilizados para investigar TSE spECIES barreiras 10-12. Exemplos de ensaios in vitro incluem ensaios livres de células de conversão, proteína misfolding amplificação cíclica (CMAP), e o índice de eficiência de conversão (CER) ensaio 10-14. Embora nenhum destes ensaios de levar em conta fatores periféricos envolvidos em barreiras das espécies após a infecção natural, tudo pode ser útil para identificar os anfitriões potencialmente sensíveis para as EET.

Aqui apresenta-se o protocolo para o ensaio de CER, em que dois substratos desnaturados PrP C derivadas de homogenatos cerebrais normais são utilizados em reacções de conversão de topo de bancada de prião (Figura 1) 13. PrP C no substrato desnaturada a pH 7,4 só pode ser convertido em res PrP por PrP TSE semeadas em a reacção na ausência de uma barreira 14 espécies. Em contraste, a desnaturação da PrP C no outro substrato a pH 3,5 permite que seja convertido ao PrP res após incubaçãocom PrP TSE de quaisquer espécies e serve como um controlo para a conversão. A proporção de conversão da PrP C e PrP no res de pH 7,4 em relação ao substrato que o substrato de pH 3,5 dá uma medida da barreira das espécies. Descobrimos que o ensaio CER prediz conhecido espécies barreiras de ratos de laboratório para vários EET e ter usado o ensaio em esforços para prever a barreira das espécies de numerosas espécies de mamíferos, incluindo carneiros selvagens, a doença debilitante crônica (CWD) e outras EET 14, 15. Os investigadores interessados ​​em uma ferramenta que permite a verificação rápida de espécies TSE barreiras ou avaliação da conversão PrP C -para-PrP res vai encontrar esta metodologia útil.

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Protocol

Trabalho animal realizado no USGS Centro Nacional de Saúde da Vida Selvagem foi realizada de acordo com o Escritório de NIH diretrizes Laboratory Animal Welfare e sob cuidados com os animais institucional e comissão uso protocolo # EP080716. Os tecidos de animais colhidas-caçadores estavam presentes do Wisconsin ou Michigan Departamentos de Recursos Naturais.

1. Preparação de Solução

NOTA: As soluções listados abaixo são necessários para a preparação do substrato ensaio CER na Seção 2 abaixo. Preparar cada uma destas soluções a partir de soluções de estoque de concentração mais elevados; concentrações recomendadas para soluções de estoque será dada entre parênteses após cada respectivo nome químico listado. Prepare todas as soluções frescas sobre a preparação do substrato e armazenar a 4 ° C até ser utilizado.

  1. Para tampão de lise, prepare uma solução de o seguinte em 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5 solução estoque recomendado): 100 mm scloreto de ódio (NaCl, 1 M de solução de estoque), 10 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, EDTA 500 mM, pH 8,0, solução de estoque), NP-40 (solução de reserva a 10%) 0,5%, 0,5% de desoxicolato (DOC, solução estoque de 10% ).
  2. Para conversão tampão, preparar uma solução de dodecil sulfato de sódio a 0,05% (SDS, solução de estoque a 10%) e 0,5% de Triton X-100 (solução a 10% de estoque) em solução salina tamponada com fosfato 1 (PBS, 10, pH 7,4 solução estoque).
  3. Para soluções caotr�icas, preparar dois 3 M soluções de guanidina (GdnHCl, 8 M de ações) em 1x PBS (solução estoque 10x). Ajustar o pH de uma das soluções a 3,5 ± 0,05 utilizando ácido clorídrico concentrado (HCl). Verificar se o pH da segunda solução se mantém a um pH de 7,4 ± 0,05 e ajustar usando HCl concentrado ou hidróxido de sódio (NaOH), se necessário.

2. Prepare Pairs CER ensaio de substrato

  1. Obter, o tecido cerebral não-TSE-infectado saudável a partir de espécies de interesse e preparar um volume peso-por-10%(W / v) homogeneizado em tampão de lise utilizando qualquer um dos seguintes métodos: Dounce, grânulo-moinho, ou homogeneização almofariz e pilão. Refinar resultando homogeneizados submetendo-os a seringa e agulha homogeneização, utilizando agulhas de aumento de calibre até substrato pode ser aspirado e expulso com facilidade através de uma seringa de agulha 27 G.
    1. Para substratos preparados a partir de roedores e outros pequenos mamíferos, homogeneizar cérebro inteiro (s); para substratos preparados a partir de mamíferos maiores, usar óbex (tronco cerebral) para preparar homogenatos de tecido. Ao seleccionar a quantidade de homogenato de cérebro, preparar não mais do que 50% da capacidade da centrifugadora usada para a precipitação de proteína no passo 2.6.
    2. Se a qualidade do tecido cerebral adquirida é questionável, avaliar os níveis de PrP C por SDS-PAGE e imunotransferência 16 17 antes da preparação do substrato.
  2. Divida homogeneizado de cérebro em dois volumes iguais em tubos cônicos separados rotulados de plástico. Adicionar GdnHCl (3 M em soluções de 1 PBS) a pH 3,5 ou 7,4 ou a cada tubo em uma proporção de 1: 1 de volume de homogenato de cérebro.
  3. Verificar os valores de pH das duas soluções. Ajustar o pH a pH 3,5 ± substrato a pH 0,05 utilizando ácido clorídrico concentrado. Certifique-se de que o pH do outro substrato permanece a um pH de 7,4 ± 0,05 e ajustar o pH, se necessário, com HCl ou NaOH, conforme necessário. Evite ultrapassar os valores de pH pela adição criterioso de ácido ou base.
  4. Rodar soluções em um misturador de extremidade-a-extremidade, à temperatura ambiente (TA) durante 5 h.
  5. Precipitar a proteína por adição de quatro volumes de metanol para as soluções de substrato em cada tubo cónico, vortex para misturar bem e incuba-se a -20 ° C durante 16-18 horas.
  6. As amostras de sedimento por centrifugação a 13.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Cuidadosamente decantar e descartar os sobrenadantes e permitir que o metanol se evaporar a partir dos peletes. Use aplicadores com ponta de algodão para ajudar na absorção de metanol agarrado no interior do tubo. Não permita pelotas para o excesso de dry e uma vez que o metanol não é mais visível, passe para a próxima etapa.
  7. Pelotas de proteína Ressuspender em tampão de conversão. Usar uma quantidade igual de tampão de conversão para a quantidade de material de partida homogenato de cérebro distribuído por cada tubo no passo 2.2.
    NOTA: É importante que o tampão de conversão utilizado para ressuspender peletes de proteína a partir de tanto um pH de 3,5 e preparações de substrato 7,4-tratados é a solução definido no passo 1.2 acima (o qual contém níveis baixos de detergentes e um pH fisiológico).
  8. Soluções Resumidamente sonicate substrato num sonicator cuphorn (10 seg a ~ 30% de potência máxima), alíquota em 0,5-1,0 ml volumes em rotulados 1,5 ml microtubos. Realizar uma imunotransferência de controlo de qualidade (passo 2.9), numa alíquota de cada substrato. Guarde outras alíquotas a -80 ° C até que esteja pronto para realizar ensaio CER (Seção 4).
  9. Executar o controlo de qualidade sobre os pares de substratos CER antes da utilização (Figura 2). Estas medidas asseguram que os substratos CER provide ótimos resultados em estudos de conversão.
    1. Certifique-se de quantidades comparáveis ​​de PrP C em dois substratos. Comparar os níveis de PrP em 10-25 mL de cada substrato por SDS-PAGE 16 e 17 de immunoblotting. Se os níveis de proteína em que o pH 7,4 e 3,5 são substratos dentro de ~ 10% uma da outra, os pares de substratos são apropriados para utilização em estudos de CER.
      NOTA: Os immunoblots PrP não devem mostrar evidências de uma forte degradação PrP C. A imunorreactividade da PrP devem ser principalmente> 20 kDa. Bandas inferiores a essa massa molecular podem ser produtos de degradação. Padrões de bandas deve ser mais ou menos equivalente entre os pares de substrato.
    2. À medida que a PrP C em ambos os substratos devem ser sensíveis PK, tratar 10-25 ul de cada substrato com PK a uma concentração final de 100 ug / ml e digerir as amostras a 1000 rpm a 37 ° C durante 1 h na termo-agitador. Avaliar qualquer sinal PrP restante por SDS-PAGE 16 e 17 de immunoblotting.Substratos com res PrP não são apropriados para utilização em estudos de CER.

3. Prepare Seeds TSE Agente

  1. Obter tecido cerebral TSE-infectados a partir de espécies de interesse e preparar a 10% (w / v) homogeneizado em 1x PBS pH 7,4, utilizando os métodos listados na etapa 2.1 acima.
    NOTA: As sementes também podem ser produzidos a partir de outros tecidos infectados com EET fora do sistema nervoso central, no entanto, a eficiência de conversão de substratos cerebrais derivadas de sementes derivadas de tecidos periféricos infectadas por EET ainda não foi experimentalmente avaliada na literatura publicada.
  2. Aliquota homogenato resultante (s) em 100-300 ul volumes de 0,5 ml em tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C até estar pronto para executar o ensaio de CER.

4. CER Assay

NOTA: O ensaio CER envolve a adição de uma quantidade relativamente pequena de PrP TSE (fornecido no "semente") a partir de uma espécieem um excesso relativo de PrP C (fornecida no cérebro infectado "substrato") a partir de uma outra espécie que foi parcialmente desnaturada a pH 3,5 ou 7,4 ou. Após um período de incubação prolongado agitação, a conversão baseada em modelos de PrP C por PrP TSE em cada reacção é avaliada pelo sinal densitométrica da PrP remanescente após a digestão res PK e detecção de imunotransferência. Comparando os níveis res PrP nos substratos previamente desnaturadas a pH 3,5 versus 7,4 fornece uma medida da barreira das espécies. Uma visão geral experimental deste procedimento de ensaio é fornecida na Figura 1.

  1. Lentamente descongelar pares substrato CER não infectados (ensaio requer volumes iguais de substratos previamente desnaturado, tanto pH 3,5 e 7,4) e soluções de sementes TSE-infectadas, colocando-os em cima de uma cama de gelo (cerca de 1 hr tempo degelo).
  2. Uma vez completamente descongelado, e depois aspirado expulsar cada solução através de um substrato27 g de agulhas de seringa várias vezes para homogeneizar re-lo. Resumidamente sonicate cada solução semente TSE-infectados por 10 s em ~ 30% da potência máxima. Mantenha todas as soluções em gelo enquanto se prepara reações de conversão.
  3. Etiqueta 5 individuais baixa ligação, de paredes finas tubos de PCR por agente TSE está sendo testado.
  4. Prepare reacções de conversão em destes tubos por adição de 5 uL de solução de sementes infectadas por EET 10% a 95 ul de (a) substrato CER preparados a pH 7,4 e (b) substrato CER preparado a pH 3,5.
    1. Para cada amostra experimental, prepare reações paralelas em pares substrato CER previamente desnaturado, tanto a pH 3,5 e 7,4.
    2. Otimizar os rácios de sementes agente TSE para substrato cérebro não infectado através da determinação empírica. Semente comum: rácios de substrato empregues manter um volume de reacção total de 100 uL e incluem ul 1:99, 2:98 e 5:95 ul ul. Para a maioria das aplicações, a semente 5:95 ul: proporção em volume de substrato e é apropriado é o que é apresentado no thé protocolo.
  5. Preparar três amostras de controlo por agente da EET serem testados como se segue: (a) adicionam-se 5 ml de solução de sementes infectadas por EET 10% a conversão de 95 ul de tampão como um controlo para a entrada res PrP; adicionar 5 uL de tampão de conversão de 95 ul de substrato preparada em (b) pH 3,5 e (c) a pH 7,4 como controlos para a conversão não-específico, não modelada.
  6. Resumidamente vortex cada amostra em seu tubo de PCR fechado para misturar sementes e substrato bem. Siga com um pulso momentânea numa baixa velocidade de topo de bancada de mini-centrifugadora para remover qualquer volume da mistura de reacção preso na tampa do tubo de PCR.
  7. Amostras de Carga em tubos de PCR-rotulados individualmente em cima da bancada thermo-shaker equipados para aceitar tubos PCR. Agitar as amostras a 1000 rpm a 37 ° C durante 24 horas.
  8. Após agitação, adicionar sarcosil a uma concentração final de 2% (w / v) e PK a uma concentração final de 100 ug / ml. Digest amostras a 1000 rpm a 37 ° C durante 1 h na termo-agitador.
    NOTA: A adição de sarcosil a amostras auxiliares pós-conversão na digestão PK de PrP C. Sinais positivos falsos em amostras unseeded (passo 4.5) são praticamente eliminadas pela adição de Sarkosyl.
  9. Adicionar tampão de amostra de SDS-PAGE, as amostras de calor a 95 ° C durante 5 minutos e res PrP resolver restantes em cada amostra por SDS-PAGE 16 seguida de imunotransf erência 17.
    NOTA: Após a adição de tampão de amostra e de aquecimento, as amostras podem ser processadas imediatamente ou amostras podem ser armazenadas a -20 ° C ou -80 ° C antes da imunomancha. Todos os dados aqui apresentados foram obtidos usando os sistemas de gel e de transferência Novex NuPAGE. As amostras individuais de ensaio CER foram tratadas com tampão de amostra e o agente redutor de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram, subsequentemente, aquecida a 95 ° C durante 5 min e 30 ul de cada amostra foi carregada em 12% Bis-Tris géis pré-moldados.
  10. Calcule o índice de eficiência de conversão (CER) como uma medidade barreira das espécies. Avalie os níveis de res PrP por densitometria 17 e dividir a densidade total da amostra pH 7,4 por que do pH 3,5 amostra. Multiplique por 100 para produzir uma porcentagem.
  11. Compilar dados de réplicas experimentais independentes para gerar uma média CER ± desvio-padrão para uma espécie com um determinado agente TSE.

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Representative Results

A utilização bem sucedida do ensaio CER é em grande parte dependente da qualidade dos pares de substratos utilizados em reacções de conversão. Por esta razão, de acordo com procedimentos para preparar pares de substrato CER, uma imunotransferência de controlo de qualidade deve ser realizado (Figura 2). Para ambos substratos, ensaio 10-25 ul por imunotransferência. PrP C deve ser facilmente detectável em cada substrato e os níveis de PrP C deve ser aproximadamente a mesma entre os dois. A imunorreactividade será visível principalmente acima de 20 kDa, mas as bandas mais pequenas podem também ser evidente. Em nossa experiência, a presença de bandas menores é espécies dependentes. Se os produtos de baixa massa molecular são observados, sua presença deve ser confirmada nos dois pares de substrato.

É importante assegurar que os substratos CER são livres de PrP res endógenos por tratamento de substratos com PK (Figura 2). Se res PrP está presente, o animal utilizado para a substpreparação taxa pode ter sido TSE-infectados ou subclinically-infectados. Alternativamente, a PrP C no substrato pode ter misfolded para um estado resistente a PK durante os procedimentos de precipitação ou desnaturação. Independente da razão, CER substrato contendo res PrP não é aceitável para uso no ensaio de conversão.

Camundongos de laboratório são um dos animais mais frequentemente utilizados experimentais em pesquisa TSE; como tal, a sua suscetibilidade a mais EET é bem caracterizado 8, proporcionando um ponto de referência in vivo contra a qual testar a fidelidade do ensaio CER. Figura 3A apresenta resultados de conversão ensaio CER de PrP C de rato (CD1 cepa) substrato para PrP res por 1), a tensão RML de scrapie passadas-rato, um agente adaptado ao hospedeiro rato 18, 2) carneiros domésticos scrapie clássica, um agente que pode transmitir para ratos após um período de incubação longo de 18 anos e 3) whiveados te-atado (Odocoileus) CWD e 263K estirpe de scrapie passadas-hamster, agentes para que os ratos são minimamente ou não suscetíveis 19,20. Níveis resultantes foram res PrP variável entre substratos rato desnaturada a pH 7,4 e semeada com os vários agentes da EET enquanto res PrP foi encontrada em todos os substratos desnaturada a pH 3,5 e semeado com um agente da EET. Razões de conversão comparando os níveis da PrP no res de pH 7,4 e 3,5 substratos foram calculados de forma independente, pelo menos, três vezes e médias ± SD são apresentadas na Figura 3B. Para as reacções semeadas pela RML, taxas de conversão entre pH 7,4 e 3,5 substratos eram aproximadamente 100%. Para aqueles semeadas por tremor epizoótico, a conversão do substrato em pH 7,4 foi de aproximadamente 75% do que a pH 3,5 em substrato. CWD ou conversão induzida por 263K do substrato a pH 7,4 foi mínima. Uma análise unidireccional da variância não podia distinguir a diferença nas proporções de conversão de RML e scrapie ou CWD e 263K, no entanto, os rácios de conversão de RML e scrapie foram significativamente diferentes daqueles de CWD e 263K.

O ensaio CER pode ser adaptado para uso com tecidos humanos ou animais com espécies onde bioensaios são demasiado difícil ou não produção ética e de rato transgénico não é desejado. Temos vindo a utilizar este ensaio para caracterizar a susceptibilidade de várias espécies de animais selvagens para CWD. Como um exemplo da utilização deste ensaio, apresentam-se alguns resultados preliminares na Figura 4. Cérebros de linces preso-Hunter (Lynx rufus) Verificou-se que ainda contêm níveis detectáveis ​​de PrP C e PrP produtos de degradação não eram grande, o que sugere que estes tecidos pode ser uma fonte para o substrato aceitável CER (Figura 4A). Pares de substrato gerados a partir de bobcat cérebro mostrou PrP immunoreactivity de um peso molecular apropriado e não continha res PrP endógenos (Figura 4B). Quando os pares de substratos lince CER gerados a partir de dois animais diferentes foram incubadas com a mesma veados de cauda branca agente CWD usado no ensaio do rato CER descrito na Figura 3, verificou-se substratos preparados a pH 7,4 tinha níveis de res PrP em comparação com substratos preparados a pH 3,5 (Figura 4C), indicativo de uma espécie de barreira mínima de lince PrP C a conversão por CWD. O CER para a conversão de veados de cauda branca PrP C pelo mesmo CWD isolado usado para converter bobcat PrP C aqui, como um controle positivo, foi previamente relatado como 95,2 ± 18,4% em Morawski et al. (2013) 15.

Figura 1
Figura 1:. Resumo do ensaio experimental CER Dois substratos de ensaio são preparadas por desnaturar parcialmente a PrP C em não-tecido cerebral infectado prião wsoluções om caotr�icas em qualquer pH 3,5 ou pH 7.4. Substratos são semeados com PrP TSE de agente de prion de interesse e amostras experimentais são submetidos a 24 horas de incubação com agitação para permitir PrP C à conversão PrP TSE em ambos pH 3,5 e 7,4 substratos. Após a incubação, a conversão é avaliada por SDS-PAGE e imunotransferência. Densidades de sinal são lidos por densitometria e CER é calculada pela relação de pH 7,4 para pH 3,5 densidades de sinal para cada amostra experimental.

Figura 2
Figura 2: O controle de qualidade em substratos de RCEs. (A) Antes da sua utilização no ensaio de CER, substratos de rato preparado em qualquer pH 7,4 ou 3,5 por imunotransf erência foram testadas no 1) ausência de tratamento com PK para avaliar o conteúdo de PrP C de cada par substrato (níveis PrP C deve ser equivalente entre pH 7,4 e 3,5 substra tes para utilização no ensaio de CER) e 2) presença de PK (100? g / ml) para testar para o tratamento de pré-existente res PrP em tecidos utilizados para preparar substratos (quaisquer substratos que exibem res PrP pré-existentes não são adequados para utilização em o ensaio RCE). (B) Para testar a formação não específica PrP res durante o ensaio de conversão, substratos rato PrP C são preparados a pH 7,4 ou 3,5 ou são semeadas com tampão de conversão, agitou-se durante 24 horas a 1000 rpm, 37 ° C e, subsequentemente, tratadas com PK (100? g / ml) e ensaiadas para res PrP por imunotransferência (para a direita duas vias). Não abalada, substratos não-PK tratados rato representam conteúdo total de PrP C em reações de ensaio (esquerda duas pistas). Para (B), pistas irrelevantes foram cortadas para maior clareza, mas cada painel de imunotransferência deriva do mesmo gel, e a exposição da membrana. Imunotransferência em todos os painéis utilizado anticorpo monoclonal SAF 83.

"> Figura 3
Figura 3:. Ensaio CER utilizando substrato rato de laboratório substrato ensaio (A) Rato CER preparado em qualquer pH de 7,4 ou 3,5 foi incubado com RML scrapie adaptou-rato, doméstico scrapie clássica, veados de cauda branca doença debilitante crônica (CWD) ou 263K cepa de scrapie adaptadas-hamster no ensaio CER. As amostras de controlo (identificado como "none") continha apenas uma quantidade igual de agente infeccioso e sem substrato mouse. As amostras foram analisadas para a presença da proteína prião resistente PK (res PrP) por imunotransferência com valores densitométricos anticorpo monoclonal 83. SAF-primas para cada amostra são apresentadas abaixo de cada pista. (B) O gráfico de barras que indica as razões médias (± desvio padrão) entre pH 7,4 e 3,5 substratos rato para cada agente infeccioso com base em pelo menos três passos do ensaio independentes. Letras minúsculas referem-se estatisticamentesubconjuntos homogêneos (análise de variância com o método de Tukey-Kramer diferenças de significância mínimo; p <0,05). Este valor foi modificado a partir Morawski et al. 2013 15.

Figura 4
Figura 4: Exemplo de utilização do ensaio CER para investigar a susceptibilidade lince CWD lince homogenato de cérebro (A) e ensaio de substrato CER (B) foi testada por imunotransferência na ausência e na presença de PK (100? G / mL) para avaliar a PrP C existente. níveis e a presença de res PrP pré-existentes, respectivamente. (C) lince substratos foram semeados com tampão de conversão e ensaiados no ensaio CER para avaliar a formação de PrP não específica res (duas pistas esquerda). Não abalada, substratos lince não-PK tratados representam conteúdo total de PrP C em reações de ensaio (direita duas pistas).Substrato (D) Bobcat preparado em qualquer pH de 7,4 ou 3,5 foi incubada com o branco de cauda CWD veados utilizando o ensaio CER. A amostra de controlo (identificado como "none") continha uma quantidade igual de agente CWD mas nenhum substrato bobcat. Valores densitométricos-primas para cada amostra são exibidas abaixo de cada pista. Imunotransferência em todos os painéis de anticorpo monoclonal utilizado 3F4, que reage com a proteína de prião felino 21.

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Discussion

Para a conclusão deste protocolo, a atenção deve ser dada aos níveis de PrP C no tecido cerebral infectado utilizado para a preparação do substrato (passo 2.1.2) e as sementes ao substrato razão para reações de conversão (etapa 4.4.2). Na nossa experiência, o cérebro pode ser extraída para uso como substrato CER depois de um período substancial de pós-mortem, enquanto a PrP C está presente por imunotransferência (Figura 4). Na verdade, alguns autólise foi observada nos cérebros dos linces utilizados para estudos de RCEs. No entanto, a incubação de substratos derivados destes cérebros ainda resultou na formação de PrP res. Especula-se que, em parte, a robustez do ensaio CER é derivado da desnaturação de substratos CER em 1,5 M GdnHCl, que vai inactivar muitas proteases.

Semente ao substrato rácios pode precisar de ser determinada empiricamente para obter sinal PrP aceitável res por immunoblotting. Muito ou lres PrP ittle para realizar a densitometria, alta fundo níveis res PrP em amostras de controlo sem substrato e os rácios de conversão inconsistentes são todas as razões para otimizar semente: rácios de substrato. Variações manter um volume de reacção total de 100 uL e incluem ul 1:99, 2:98 e 5:95 ul ul. Em quase todas as ocasiões, verificou-se que sementes de 5:95 ul: volume do substrato é óptima. Não importa o que razão, as quantidades iguais de agente TSE são utilizados e o ensaio é internamente consistente. No entanto, a concentração de sementes do homogenato de cérebro infectado por prião utilizado para reacções de molde susceptíveis afecta o resultado do ensaio em que os títulos CER semente ou diluições diferentes pode resultar em diferentes níveis de conversão da PrP C -para-PrP res. Este efeito foi demonstrado em outros em ensaios in vitro de conversão de prião 22 e pode complicar a comparação dos diferentes isolados de prião. Para abordar esta no ensaio CER, sementes could ser titulada em cada substrato PrP C preparados em pH 3,5 e 7,4 para identificar uma gama de diluições que modelo de conversão PrP C. Diluições de sementes ideal evitar a saturação da solução com excesso de priões de sementes e ainda fornecer informações sobre a sensibilidade da reacção de conversão. Em alternativa, a conversão da PrP C -para-PrP res em reacções de ensaio CER poderia ser medido em múltiplos, pontos de tempo regulares durante toda a duração do ensaio e plotados como da velocidade de conversão de curvas, semelhantes às leituras em tempo real para a reacção em cadeia da polimerase ( qPCR) 23 e em tempo real tremendo conversão induzida (RT-QuIC) 24 ensaios. Tais leituras pode permitir interpretações mais abrangentes de barreiras de espécies e são um foco interessante do futuro desenvolvimento da metodologia.

No protocolo apresentado aqui, usamos uma fraca ligação, tubos de PCR de parede fina, mas nós também têm utilizado padrão tubos de 1,5 ml em uma termo-shaker equipado paraeste tipo de tubo. Nenhuma outra variação do protocolo são necessários para usar os tubos de maior porte. Em nossa experiência, no entanto, tivemos uma produção mais PrP res e resultados mais reprodutíveis em tubos de ligação baixos de PCR em comparação com tubos de 1,5 ml. Enquanto explicações para o melhor desempenho do ensaio em tubos de PCR são apenas especulativo, neste momento, com base nos resultados que indicam que a interface ar-água é fundamental para a PrP fibrillization 25, temos a hipótese de que os tubos menores fornecer uma tensão superficial mais ideal para PrP conversão.

Talvez a principal limitação para utilização do ensaio CER está na compreensão de que os rácios de conversão representam em termos de in vivo barreiras das espécies determinantes, como a penetrância doença ou da duração do período de incubação. Embora atualmente desconhecida, tradução entre in vitro e in vivo fatores barreira das espécies deve tornar-se mais clara com o uso continuado do ensaio CER em testes additional TSE espécies barreiras que já foram estabelecidos in vivo e vai ajudar a qualificar os resultados em espécies onde os dados de bioensaios não estão disponíveis. Uma vantagem do ensaio de comparação com CMAP CER é a presença de um controlo interno para a conversão da PrP, ou seja, o substrato de pH 3,5, o qual pode ser convertido por qualquer agente da EET. Este controle é de valor quando não está claro que, se houver, os agentes da EET deve causar misfolding de de um hospedeiro exótico PrP C. A incapacidade de um determinado substrato de acolhimento para amplificar um agente específico TSE em PMCA poderia ser interpretado como evidência de uma barreira entre espécies ou pode ser devido a falhas técnicas. Desvantagens do ensaio CER comparação com PMCA incluem ampliação de res PrP, etapas adicionais no preparo do substrato CER e sem infecciosidade conhecido nos res PrP produzidos por reações CER limitado. É de notar que em um estudo anterior, no entanto, encontramos o ensaio CER resultou em um padrão semelhante de res PrP formação como a de PMCA 15. Os resultados aqui apresentados também indicam que o ensaio CER prevê corretamente as barreiras das espécies para a transmissão de vários TSE para ratos de laboratório (Figura 3) e sugerem que pode ter linces susceptibilidade à CWD (Figura 4), ​​de acordo com relatos de que os gatos domésticos (Felis catus) pode adquirir a doença priônica após CWD experimental desafio 26,27. Estudos utilizando o ensaio CER poderia elogiar os esforços de seqüenciamento PrP para compreender a susceptibilidade dos animais selvagens para CWD 28.

O ensaio CER permite o rápido, de baixo custo, avaliação fiável da barreira de espécie TSE in vitro. Embora não seja um substituto completo para o "padrão ouro" de bioassay animal, o ensaio CER pode ser usado como uma avaliação inicial da existência de uma barreira de espécies TSE que podem justificar ou prevenir novos estudos em animais vivos. Por esta razão, e porque o ensaio baseia-se apenassobre o tecido cerebral que pode ser adquirido a partir de animais não-experimentais, a CER está em consonância com os esforços para substituir, reduzir e aperfeiçoar os procedimentos experimentais em animais 29. Além de avaliar barreiras das espécies, o ensaio de CER também pode fornecer uma plataforma simplificada com a qual para investigar os mecanismos de definir o acontecimento fundamental da biologia da doença priónica: a conversão do normal, a PrP C funcional para uma forma mal dobrada.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Bis-Tris SDS-PAGE gels Life Technologies NP0342
0.5 mm Zirconium oxide beads Next Advance ZROB05 Other varieties of beads are also effective
Antibodies various suppliers Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest
Bead homogenizer Next Advance BBY24M
Centrifuge Beckman Coulter 369434 High speed with temperature control
Conical tubes any brand
Cotton-tipped applicator Uline S-18991
Cuphorn sonicator Heat Systems-Ultrasonics W-380 Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC
Densitometry software program UVP Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software Other programs, such as NIH ImageJ, will also work
Dounce homogenizer Kimble Chase 885300
End-over-end mixer Labnet International H5600
Ethylenediaminetetra acetic acid Boston Bioproducts P-770 Hazardous chemical: eye irritation
Guanidine hydrochloride, 8 M Thermo Fisher Scientific 24115 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation
Heating block Fisher Scientific 11-718
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 435570 Hazardous chemical: strong acid
Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x Life Technologies NP0008 Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid
Microcentrifuge tubes any brand
Mini-centrifuge Labnet International C1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) Sigma-Aldrich  L-5125 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage
Nonidet P-40 Amresco M158 Hazardous chemical: skin irritation, eye damage
SDS-PAGE gel system Life Technologies NuPAGE electrophoresis system Other SDS-PAGE systems will also work
PCR tubes (low-binding) Axygen PCR-02-L-C
Pestle homogenizer Fisher Scientific 03-392-106
pH meter Sentron SI600
Polyvinyldifluoride membrane Millipore IPVH00010
Proteinase K Promega V3021 Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity
Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x Life Technologies NP0009
Sodium chloride Fisher Scientific 7647-14-5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich  D6750 Hazardous chemical: acute toxicity
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 28364 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Hazardous chemical; strong base
Syringe BD Biosciences various Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized
Syringe needles BD Biosciences various
Thermoshaker (PCR tube shaker) Hangzhou All Sheng Instruments MS-100
Tris base Bio Basic 77-86-1 Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation
Triton X-100 Integra Chemical Company T756.30.30 Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation
Vortexer Fisher Scientific 12-812

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