Die Beurteilung Transmissible Spongiforme Enzephalopathie Artgrenzen mit ein

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Johnson, C. J., Carlson, C. M., Morawski, A. R., Manthei, A., Cashman, N. R. Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay. J. Vis. Exp. (97), e52522, doi:10.3791/52522 (2015).

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Abstract

Introduction

Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE, Prionenerkrankungen) sind eine Gruppe von tödlichen neurodegenerativen Erkrankungen mit verlängerten Inkubationszeiten, die eine Vielzahl von Tieren und Menschen zu beeinflussen. Die mutmaßliche ätiologische Agens von TSE besteht aus einer fehlgefalteten Isomer der Host Prionprotein (PrP), die in der Lage zur Selbstausbreitung von vorlagengesteuerten Umwandlung der normalen zellulären Form PrP (PrP C) in ein infektiöses, krankheitsassoziierte ist umfasste Formular (PrP TSE), die im zentralen Nervensystem Gewebe des infizierten Wirts 1 ansammelt. Infektiöse Prionen übertragen Säugetier Allgemeinen von Host-zu-Host in einem artenspezifisch, was zu dem Begriff der "TSE Artengrenze" Begrenzung Wirtsartwechsels Ereignisse 2 gegeben hat. Die biologischen Determinanten des Prion-Spezies-Barriere sind nicht gut verstanden. Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit zwischen der infektiösen PrP TSE und dem Host-PrP C cein stark beeinflussen, ob die Umwandlung erfolgt 3-5, bleibt aber nicht aus, um alle in vivo 6,7 beobachtet Prionenübertragung Ereignisse erklären.

Somit hat die Charakterisierung von TSE Artschranken weitgehend von Tierexpositionsstudien herangezogen: Belichten naiven Tieren aus einer bestimmten Art von Prionen von einer anderen und durch Messen der resultierenden Inkubationszeit zu Beginn der Erkrankung und Erkrankungsrate als Indikator für die Übertragungseffizienz. Mäuse, die PrP C von heterologen Spezies werden auch für diese Art von Untersuchung 8 verwendet. Die Kosten im Zusammenhang mit transgenen Maus Produktion und langwierigen Prion Biotests sowie ethischen Überlegungen der Tiernutzung verbunden sind, sind Hindernisse für die experimentelle Untersuchung von TSE Artgrenzen. Bewertung der menschlichen Spezies-Barriere auf TSE vertraut auf Mäuse entwickelt, um menschliche PrP C auszudrücken. Diese Mäuse erfordern langen Inkubationszeiten, um die menschliche TSE oder Modifikationen an t erliegener menschlichen PrP-C-Molekül für eine schnelle Krankheitsbeginn 9. Inkubationszeiten für nicht-menschlichen TSE bei diesen Mäusen kann über die normale Maus Lebensdauer machen Interpretation der negativen Ergebnissen anspruchs erweitern. Nichtmenschliche Primaten sind auch als Stellvertreter für das Studium der menschlichen Spezies Barrieren verwendet worden, aber diese Studien behaftet mit den gleichen Herausforderungen wie andere Arten von Tierversuchen und nicht-menschlichen Primaten nicht genau rekapitulieren Krankheit, wie es in den menschlichen Wirt geht.

Tier Biotests bleiben der "Goldstandard" Verfahren zur Messung der Anfälligkeit einer Spezies auf eine TSE, aber die Hürden, Kosten und Ethik dieser Live-Tierstudien Untersuchung Alternativen gezwungen. Eine Reihe von in vitro-Tests, basierend auf der Beurteilung der Umwandlung von Wirts PrP C zu einer Proteinase K (PK) beständigen Zustand (PrP res), wenn sie von PrP TSE ausgesät, wurden entwickelt und verwendet, um zu untersuchen TSE spECIES Barrieren 10-12. Beispiele für in-vitro-Tests sind zellfreie Umwandlung Assays PMCA (PMCA) und die Umwandlungseffizienz-Verhältnis (CER) Assay 10-14. Während keiner dieser Tests in Betracht periphere Faktoren Artgrenzen nach einer natürlichen Infektion beteiligt zu nehmen, kann sinnvoll sein, alle potenziell anfälligen Wirten für TSE zu identifizieren.

Hier präsentieren wir das Protokoll für die CER-Test, bei dem zwei denaturiert PrP C Substrate von normalen Hirnhomogenaten abgeleitet sind in Tisch Prion Umwandlungsreaktionen verwendet (Abbildung 1) 13. PrP C in der bei pH 7,4 denaturiert Substrat kann nur an PrP res von PrP TSE umgewandelt werden ausgesät in die Umsetzung in Abwesenheit eines Speziesbarriere 14. Demgegenüber Denaturierung von PrP C in dem anderen Substrat bei pH 3,5 erlaubt es, an PrP res nach Inkubation umgewandelt werdenmit PrP TSE von irgendeiner Spezies und dient als Kontrolle für die Konvertierung. Das Verhältnis der Umwandlung von PrP C zu PrP res in pH 7,4 Substrats relativ gegenüber der pH 3,5 Substrat liefert ein Maß für die Artenbarriere. Wir haben festgestellt, dass die CER-Test prognostiziert bekannten Arten Barrieren der Labormäuse, verschiedene TSE und haben den Test bei den Bemühungen um die Artengrenze zahlreicher Säugetierarten, einschließlich Dickhornschafe, Chronic Wasting Disease (CWD) und anderen TSE 14 vorherzusagen, 15. Ermittler an einer Werkzeug ermöglicht ein schnelles Screening von TSE Artgrenzen oder Bewertung von PrP C to-PrP res Konvertierung wird diese Methode nützlich.

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Protocol

Tier Arbeit an der USGS National Wildlife Health Center durchgeführt wurde, in Übereinstimmung mit der NIH Office of Laboratory Animal Welfare Richtlinien und unter institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschussprotokoll # EP080716 geführt. Gewebe von Jäger und geerntet Tiere waren Geschenke von der Wisconsin und Michigan Abteilungen für Naturressourcen.

1. Herstellung der Lösung

HINWEIS: Die unten aufgeführten Lösungen sind für die Vorbereitung der CER-Assay-Substrat in Abschnitt 2 unten erforderlich. Planen jeder dieser Lösungen von höherer Konzentration Stammlösungen; empfohlene Konzentration für Stammlösungen werden in Klammern nach jeder jeweiligen chemischen Bezeichnung aufgeführt erhalten. Bereiten Sie alle Lösungen frisch auf Untergrundvorbereitung und bei 4 ° C bis zur Verwendung.

  1. Für Lysepuffer, bereiten eine Lösung der folgenden in 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5, Stammlösung empfohlen): 100 mM sOdium Chlorid (NaCl, 1 M Stammlösung), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 Stammlösung), 0,5% NP-40 (10% Stammlösung), 0,5% Desoxycholat (DOC, 10% Stammlösung ).
  2. Zur Umwandlung Puffer wird eine Lösung aus 0,05% Natriumdodecylsulfat (SDS, 10% ige Stammlösung) und 0,5% Triton X-100 (10% -ige Stammlösung) in 1 phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 10, pH 7,4 Stammlösung).
  3. Für chaotropen Lösungen, bereiten zwei 3 M Lösungen von Guanidinhydrochlorid (GdnHCl, 8 M Lager) in 1x PBS (10x Stammlösung). Der pH-Wert einer der Lösungen auf 3,5 ± 0,05 unter Verwendung von konzentrierter Salzsäure (HCl). Prüfen, ob der pH-Wert der zweiten Lösung bei pH 7,4 ± 0,05 bleibt und stellen mit konzentrierter HCl oder Natriumhydroxid (NaOH), falls erforderlich.

2. Bereiten Sie CER Assay Substrat-Paare

  1. Erhalten gesunde, nicht-TSE-infizierten Hirngewebe von Spezies von Interesse und bereiten eine 10% Gewicht pro Volumen(W / v) Homogenat in Lysepuffer mit einer der folgenden Methoden: Dounce, Kugelmühle oder Mörser und Stößel Homogenisierung. Weiter verfeinern resultierenden Homogenate indem sie einer Spritze und Nadel-Homogenisierung mit Nadeln zunehmender Spur bis Substrat abgesaugt und mit Leichtigkeit durch eine 27G-Spritzennadel ausgestoßen werden.
    1. Für Substrate aus Nagetiere und andere kleine Säugetiere hergestellt homogenisieren gesamte Gehirn (s); für Substrate von größeren Säugetieren bereit, verwenden Obex (Hirnstamm) Gewebe-Homogenate vorzubereiten. Bei der Wahl der Menge von Hirnhomogenat vorzubereiten nicht mehr als 50% der Kapazität der Zentrifuge zur Eiweißfällung in Schritt 2.6 verwendet.
    2. Wenn die Qualität der erworbenen Hirngewebe ist fraglich, bewerten PrP-C-Spiegel durch SDS-PAGE und Immunoblot 16 17 vor der Untergrundvorbereitung.
  2. Teilen Sie Hirnhomogenat in zwei gleiche Volumina in separaten gekennzeichnete Kunststoff konische Röhrchen. Fügen GdnHCl (3 M Lösung in 1 PBS) bei entweder pH 3,5 oder 7,4 zu jedem Röhrchen in einem 1: 1 Volumenverhältnis zu Hirnhomogenisat.
  3. Überprüfen Sie die pH-Werte der beiden Lösungen. Den pH-Wert der pH 3,5 Substrat auf pH ± 0,05 unter Verwendung von konzentrierter HCl. Sicherstellen, dass der pH-Wert des anderen Substrats bei pH 7,4 ± 0,05 bleibt und der pH wird, falls notwendig, mit HCl oder NaOH nach Bedarf. Vermeiden Schwingen pH-Werte durch sorgfältige Zugabe von Säure oder Base.
  4. Drehen Lösungen auf einem End-Over-End-Mixer bei Raumtemperatur (RT) für 5 Stunden.
  5. Auszufällen Protein durch Zugabe vier Volumina Methanol zu den Substratlösungen in jeden konischen Rohr, Wirbel um gut zu mischen, und Inkubation bei -20 ° C für 16-18 Std.
  6. Sedimentproben durch Zentrifugation bei 13.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Dekantieren Sie vorsichtig und entsorgen Sie die Überstände und lassen Methanol aus den Pellets verdampfen. Verwenden Sie Wattestäbchen, um bei der Aufnahme von Methanol zu der Innenseite des Rohres klammerte unterstützen. Lassen Sie keine Pellets zu über-dry und einmal Methanol nicht mehr sichtbar ist, mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
  7. Resuspendieren Proteinpellets in Konvertierungspuffer. Verwenden einer Menge des Umwandlungspuffers gleich der Menge Hirnhomogenat Ausgangsmaterial in Schritt 2.2 in jedem Röhrchen verteilt.
    HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Umwandlung Puffer verwendet werden, um Protein-Pellets von beiden pH 3,5 und 7,4 behandelte Substrat Vorbereitungen resuspendieren wird die in Schritt 1.2 (die geringe Reinigungsmittel und einen physiologischen pH-Wert enthält) definiert Lösung.
  8. Kurz beschallen Substratlösungen in einem cuphorn Ultraschallgerät (10 sec bei ~ 30% der maximalen Leistung), Aliquots in 0,5 bis 1,0 ml-Volumina in der Bezeichnung 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie eine Qualitätskontrolle Immunoblot (Schritt 2.9) aus einem aliquoten Teil von jedem Substrat. Bewahren anderen Aliquots bei -80 ° C bis zum Gebrauch CER-Test (Abschnitt 4) durchzuführen.
  9. Führen Sie die Qualitätskontrolle auf CER Substrat-Paare vor der Anwendung (Abbildung 2). Diese Schritte sicherzustellen, dass CER Substrate wird provide optimale Ergebnisse bei der Umwandlung Studien.
    1. Stellen Sie sicher, vergleichbare Mengen an PrP C in den beiden Substraten. Vergleichen PrP Ebenen in 10-25 ul jedes Substrat durch SDS-PAGE und Immunoblotting 16 17. Wenn Protein-Spiegel in der pH 7,4 und 3,5 Substrate innerhalb von ~ 10% voneinander unterscheiden, sind die Substrat-Paare für die Verwendung in CER Studien geeignet.
      HINWEIS: Die PrP Immunoblots nicht Beweise für umfangreiche PrP C Abbau zeigen. Das PrP Immunreaktivität sollte vor allem> 20 kDa ist. Bands geringer als dieser Molekülmasse können Abbauprodukte sein. Bandenmuster sollte etwa gleich zwischen Substrat-Paare sein.
    2. Da die PrP C in beiden Substraten sollte PK empfindlich sein, behandeln 10-25 ul jedes Substrats mit PK in einer Endkonzentration von 100 ug / ml und verdauen Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 1 Stunde in der Thermoschüttler. Beurteilen verbleibende PrP Signals durch SDS-PAGE und Immunoblotting 16 17.Substrate mit PrP res sind nicht für den Einsatz in CER Studien geeignet.

3. Bereiten Sie TSE-Agent Seeds

  1. Erhalten TSE-infizierten Hirngewebe von Spezies von Interesse und bereiten eine 10% (w / v) Homogenat in 1x PBS, pH 7,4, unter Verwendung der in Schritt 2.1 oben genannten Methoden.
    HINWEIS: Saatgut kann auch aus anderen TSE-infizierten Geweben außerhalb des zentralen Nervensystems hergestellt werden, aber die Effizienz der Umwandlung der aus dem Gehirn stamm Substraten durch Samen von TSE-infizierten peripheren Geweben abgeleitet wurde noch nicht experimentell in der Literatur untersucht.
  2. Aliquoten resultierende Homogenat (n) in 100-300 ul-Volumina in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C, bis bereit, die CER-Test durchzuführen.

4. CER Assay

HINWEIS: Die CER Test umfasst Zugabe einer relativ kleinen Menge von PrP TSE (in der "Samen" zur Verfügung gestellt) von einer Speziesin einen relativen Überschuss von PrP C von einer anderen Spezies, das teilweise an entweder pH 3,5 oder 7,4 denaturiert (in der nicht-infizierten Hirn "Substrat", zur Verfügung gestellt). Nach einer längeren Schütteln Inkubationszeit wird vorlagengesteuerten Umwandlung von PrP C von PrP TSE in jeder Reaktion durch densitometrische Signal des PrP res übrigen nach PK-Verdau und Immunoblot-Nachweis untersucht. Vergleichen PrP res Ebenen der Substrate zuvor bei pH 3,5 vs. 7,4 denaturiert liefert ein Maß für die Artenbarriere. Eine experimentelle Übersicht dieses Testverfahrens ist in 1 bereitgestellt.

  1. Langsam tauen nicht infizierte CER Substrat-Paare (Assay erfordert gleiche Volumina Substrate zuvor sowohl auf pH 3,5 und 7,4 denaturiert) und TSE-infizierte Saatgut-Lösungen, indem sie auf einem Bett aus Eis (ca. 1 Stunde auftauen Zeit).
  2. Sobald sie vollständig aufgetaut, absaugen und dann vertreiben jedes Substratlösung durch eine27 G Injektionsnadel mehrmals neu zu homogenisieren. Kurz beschallen jeden TSE-infizierten Samen Lösung für 10 s bei ca. 30% der maximalen Leistung. Bewahren Sie alle Lösungen auf Eis während der Vorbereitung Umwandlungsreaktionen.
  3. Label 5 Einzel geringe Bindungs, dünnwandigen PCR-Röhrchen pro TSE-Erreger getestet.
  4. Bereiten Umwandlungsreaktionen in diesen Rohren durch Zugabe von 5 ul 10% TSE-infizierten Samen Lösung in 95 & mgr; l von (a) CER Substrat bei pH 7,4 und (b) CER Substrat bei pH 3,5 hergestellt.
    1. Für jede Versuchsprobe, bereiten Parallelreaktionen in CER Substrat-Paare zuvor sowohl auf pH 3,5 und 7,4 denaturiert.
    2. Optimieren Verhältnisse von TSE-Erregern Samen nicht infizierten Gehirnsubstrat durch empirische Bestimmung. Gemeinsame Samen: Substrat Verhältnissen eingesetzt pflegen eine Gesamtreaktionsvolumen von 100 ul und beinhalten 1:99 ul, 2:98 und 5:95 ul ul. Für die meisten Anwendungen, die 5:95 ul Samen: angemessen ist Substrat-Volumen-Verhältnis und ist das, was in th vorgestelltist Protokoll.
  5. Bereiten Sie drei Kontrollproben pro TSE-Erreger wird wie folgt geprüft: (a) mit 5 ul 10% TSE-infizierte Saatgut Lösung auf 95 & mgr; Konvertierungspuffer als Kontrolle für Eingabe PrP res; mit 5 ul Konvertierungspuffer 95 & mgr; l Substrat in (b) pH 3,5 und (c) pH 7,4 als Kontrollen für nicht-spezifische, nicht-gestützten Umwandlung vorbereitet.
  6. Vortexen Sie jede Probe in seiner geschlossenen PCR-Röhrchen, um Saatgut und Substrat gut mischen. Folgen Sie mit einem momentanen Impuls in einem Low-Speed-Tisch Mini-Zentrifuge, jede Volumen des Reaktionsgemisches in der PCR-Röhrchen Deckel gefangen zu entfernen.
  7. Tragen Sie die Proben in individuell-markierten PCR-Röhrchen in einer Tischthermoschüttler ausgestattet, um PCR-Röhrchen zu akzeptieren. Schütteln Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 24 Stunden.
  8. Nach Umschütteln Sarcosyl in einer Endkonzentration von 2% (w / v) und PK auf eine Endkonzentration von 100 ug / ml. Digest Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 1 Stunde in der Thermoschüttler.
    NHINWEIS: Die Zugabe von Sarkosyl Proben nach der Konvertierung hilft bei der PK Verdauung von PrP C. Falsch positive Signale in ungeimpften Proben (Schritt 4.5) praktisch durch Zugabe von Sarkosyl eliminiert.
  9. Hinzufügen SDS-PAGE-Probenpuffer, Wärme Proben auf 95 ° C für 5 Minuten und Lösung verbleibenden PrP res in jeder Probe durch SDS-PAGE 16 gefolgt von Immunoblotting 17.
    HINWEIS: Nach Zugabe von Probenpuffer und Heizung, Proben können sofort verarbeitet werden oder Proben können bei -20 ° C oder vor dem Immunoblotting gespeichert -80ºC. Alle hier vorgestellten Daten wurden unter Verwendung der Novex NuPAGE Gel und Transfersysteme erzeugt. Einzelne Proben aus dem CER-Test wurden mit Probenpuffer und Reduktionsmittel nach Herstellerangaben behandelt. Die Proben wurden anschließend bei 95 ° C für 5 min erhitzt und 30 ul jeder Probe wurde in eine 12% Bis-Tris Fertiggelen geladen.
  10. Berechnen des Umwandlungswirkungsgrad (CER) als MaßArtenschranke. Maßnahme Ebenen PrP res densitometrisch 17 und unterteilen die Gesamtdichte des pH 7,4 Probe durch diejenige des pH 3,5 Probe. Mit 100 multipliziert, um einen Prozentsatz zu produzieren.
  11. Kompilieren von Daten aus unabhängigen experimentellen Wiederholungen, um eine mittlere CER ± Standardabweichung für eine Spezies mit einer bestimmten TSE-Erreger zu generieren.

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Representative Results

Der erfolgreiche Einsatz des CER Assay hängt weitgehend von der Qualität der in Umwandlungsreaktionen verwendeten Substrat-Paaren. Aus diesem Grund folgt vor, um CER Substratpaare vorbereiten, eine Qualitätskontrolle Immunoblot sollte (Abbildung 2) durchgeführt werden. Für beide Substrate Assay 10-25 ul durch Immunoblotting. PrP C sollte in jedem Substrat leicht nachweisbar sein und PrP C Ebenen müssen etwa gleich zwischen den beiden. Immunreaktivität wird vor allem sichtbar oberhalb von 20 kDa, aber kleinere Bänder können auch offensichtlich. Nach unserer Erfahrung ist die Anwesenheit von kleineren Bands ist speziesabhängig. Bei Produkten mit niedrigerem Molekulargewicht beobachtet werden, sollte ihre Präsenz in beiden Substratpaaren bestätigt werden.

Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die CER Substrate frei von endogenen PrP-res durch Behandeln von Substraten mit PK (Abbildung 2). Wenn PrP res vorhanden ist, das Tier für subst verwendetKursvorbereitung wurde möglicherweise TSE-infiziert haben oder subklinisch infiziert. Alternativ kann die PrP C in das Substrat, um eine PK festen Zustand während der Denaturierung oder Ausfällungsverfahren fehlgefaltetem haben. Unabhängig von dem Grund ist KEA enthaltenden Substrat PrP res nicht für die Verwendung bei der Umwandlung Assay akzeptabel.

Labormäuse sind eine der am häufigsten verwendeten Versuchstiere in der TSE-Forschung; als solche, die Anfälligkeit gegenüber den meisten TSE ist gut charakterisierten 8 und bietet eine in vivo Maßstab, an dem die Wiedergabetreue des CER-Test zu testen. 3A stellt Ergebnisse CER Test Umwandlung von PrP C aus Maus (CD1 Stamm) Substrat an PrP Auflösung von 1) der RML Mäusestamm-agiert Traberkrankheit, zur Maus Wirt 18, 2) Hausschafen der klassischen Traberkrankheit, ein Mittel, das auf Mäuse übertragen kann nach einer langen Inkubationszeit 18 und 3) whi angepasst ein Agentte Wedelhirsch (Odocoileus virginianus) CWD und 263K Stamm von Hamster-Scrapie agiert, Mittel gegen die Mäuse minimal oder nicht anfällig 19,20 sind. Resultierende PrP res Niveau waren variabel über Maus Substrate denaturiert bei pH 7,4 und mit den verschiedenen TSE-Erreger geimpft, während PrP res wurde bei allen Substraten gefunden denaturiert bei pH 3,5 und mit einem TSE-Erreger geimpft. Umwandlungsverhältnisse Vergleichen des PrP res Ebenen der pH 7,4 und 3,5 Substrate wurden unabhängig mindestens dreimal berechnet und Mittel ± SD sind in 3B gezeigt. Bei Reaktionen von RML ausgesät waren Umtauschverhältnisse zwischen pH 7,4 und 3,5 Substrate ca. 100%. Für diejenigen, die mit Scrapie beimpft war Umwandlung in der pH 7,4-Substrat etwa 75% der in der pH 3,5-Substrat. CWD oder 263K induzierte Umwandlung der pH 7,4 Substrat war minimal. Eine Einwegvarianzanalyse konnte kein Unterschied in der Umwandlungsverhältnisse von RML und s unterscheidencrapie oder CWD und 263K jedoch Umtauschverhältnisse von RML und Scrapie unterschieden sich signifikant von denen des CWD und 263K.

Die CER-Test kann für die Verwendung mit menschlichem Gewebe oder mit Tierarten, wo Tierversuche sind zu anspruchsvoll oder nicht ethisch und transgenen Maus Produktion nicht erwünscht ist angepasst werden. Wir benutzen diesen Test, um die Anfälligkeit der verschiedenen Tierarten auf CWD charakterisieren. Als ein Beispiel für die Verwendung dieses Assays, stellen wir einige vorläufige Ergebnisse in Abbildung 4. Gehirne von Jäger und gefangen Luchse (Lynx Rufus) erwiesen sich noch nachweisbare Mengen an PrP C und PrP Abbauprodukte enthalten waren nicht umfangreich, was darauf hindeutet, dass diese Geweben konnte eine akzeptable Quelle für CER Substrat (4A) sein. Aus bobcatSchürzen Gehirn erzeugten Substrat-Paare zeigten PrP Immunreaktivität eines geeigneten Molekulargewichts und der nicht endogenen PrP res enthalten (4B). Wenn bobcat CER aus zwei separaten Tieren erzeugten Substrat-Paare wurden mit der gleichen Weißwedelhirsche CWD Mittel in der in Abbildung 3 beschriebenen Maus CER-Test verwendet inkubiert, fanden wir Substrate bei pH 7,4 zubereitet hatte Ebenen der PrP res im Vergleich zu Substraten bei pH-Wert hergestellt 3,5 (4C), was auf eine minimale Artengrenze von bobcat PrP C, um die Umwandlung von CWD. Die CER für die Umwandlung von Weißwedelhirsche PrP C durch den gleichen CWD-Isolat verwendet werden, um hier zu konvertieren Bobcat PrP C, als eine positive Kontrolle, war zuvor als 95,2 ± 18,4% in Morawski et al (2013) 15..

Figur 1
Abb. 1: Experimentelle Überblick über die CER-Test Zwei Testsubstrate werden durch teilweises Denaturieren PrP C in nicht-Prionen infizierte Hirngewebe w vorbereitetith chaotropen Lösungen entweder pH 3,5 und pH 7,4. Substrate mit PrP TSE von Prionmittel von Interesse ausgesät und experimentellen Proben werden 24 h Inkubation unter Schütteln, um PrP C an PrP TSE Umwandlung sowohl pH 3,5 und 7,4 Substrate ermöglichen unterzogen. Nach der Inkubation wird die Umwandlung durch eine SDS-PAGE und Immunoblotting untersucht. Signaldichten durch Densitometrie gelesen und die CER wird durch das Verhältnis von pH 7,4 bis pH 3,5 Signaldichten für jede experimentelle Probe berechnet.

Abbildung 2
Abbildung 2: Qualitätskontrolle an CER Substraten. (A) Vor ihrer Verwendung in der CER-Test, Maus Substrate entweder pH 7,4 oder 3,5 zubereitet werden durch Immunoblot im 1) Abwesenheit von PK-Behandlung zu PrP-C-Gehalt von jedem Substrat Paar beurteilen getestet (PrP C-Spiegel sollten gleichwertig zwischen sein pH 7,4 und 3,5 Substra tes für den Einsatz in CER-Test) und 2) Vorhandensein von PK (100 ug / ml) Behandlung, auf die getestet vorbestehenden PrP res im Gewebe verwendet werden, um Substrate (alle Substrate, die angezeigt werden bereits bestehende PrP res für den Einsatz in nicht vorbereiten die CER-Test). (B) Um nicht-spezifische PrP res Bildung bei der Umsetzung Assay zu testen, werden Maus-PrP C Substrate entweder pH 7,4 oder 3,5 zubereitet mit Wandlungs Puffer bei 1000 Upm ausgesät, für 24 Stunden geschüttelt, 37 ° C und anschließend PK behandelten (100 & mgr; g / ml) und für PrP res analysiert durch Immunoblotting (rechte zwei Spuren). Nicht geschüttelt, nicht-PK behandelten Maus Substrate, die den Gesamt PrP-C-Gehalt in Testreaktionen (links zwei Spuren). Für (B) sind irrelevant Fahrspuren für Klarheit beschnitten worden, aber jede Immunoblot Tafel ergibt sich aus demselben Gel, Membran und Belichtung. Immunoblots in allen Panels verwendet monoklonale Antikörper SAF 83.

"> Figur 3
Abb. 3: CER Test unter Verwendung von Labormaus Substrat (A) Maus CER-Assay-Substrat entweder bei pH 7,4 bzw. 3,5 wurde mit RML Maus-adaptierten Scrapie, Hausschafen der klassischen Traberkrankheit, Weißwedelhirsche Chronic Wasting Disease inkubiert (CWD) oder 263K vorbereitet Stamm von Hamster-adaptierten Scrapie in der CER-Test. Kontrollproben (mit "none") enthielt nur eine gleiche Menge an infektiösen Agens und keine Maus Substrat. Die Proben wurden auf das Vorhandensein von PK-Prionprotein (PrP res) durch Immunblot mit monoklonalem Antikörper SAF 83. Raw densitometrischen Werte für jede Probe sind unter jeder Spur durchsucht. (B) eine Balkenanzeige mit der durchschnittlichen Verhältnisse (± Standardabweichung) zwischen pH 7,4 und 3,5 Maus Substrate für jede Infektionserreger auf mindestens 3 unabhängigen Testläufen basieren. Kleinbuchstaben beziehen sich auf statistischhomogene Untergruppen (Varianzanalyse mit Tukey-Kramer Mindest Bedeutung Unterschiede Verfahren; p <0,05). Diese Zahl hat sich von Morawski et al. 2013 15 geändert wurde.

4
Abbildung 4: Beispiel-Verwendung von CER-Test zu bobcat Anfälligkeit CWD untersuchen Bobcat Hirnhomogenat (A) und CER-Assay-Substrat (B) wurde durch Immunoblotting in der Abwesenheit und Anwesenheit von PK (100 ug / ml) zu beurteilen vorhandenen PrP C getestet. Pegel und die Anwesenheit von vorbestehenden PrP res sind. (C) Bobcat Substrate wurden mit Konvertierungspuffer ausgesät und im CER Assay unspezifischer PrP res Bildung beurteilen getestet (zwei linken Bahnen). Nicht geschüttelt, nicht-PK behandelt bobcat Substrate, die den Gesamt PrP-C-Gehalt in Testreaktionen (rechts zwei Spuren).(D) Bobcat Substrat bei beiden pH-Wert 7,4 oder 3,5, wurde mit Weißwedelhirsche CWD mit dem CER-Assay inkubiert. Die Kontrollprobe (mit "none") enthalten die gleiche Menge an CWD Mittel, aber keine bobcat Substrat. Raw densitometrischen Werte für jede Probe sind nachfolgend jeder Spur angezeigt. Immunoblots in allen Platten verwendet monoklonale Antikörper 3F4, der mit dem felinen Prionprotein 21 reagiert.

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Discussion

Bei erfolgreichem Abschluss des Protokolls sollte die Aufmerksamkeit auf PrP-C-Spiegel bei nichtinfizierten zur Untergrundvorbereitung (Schritt 2.1.2) und der Samen-Verhältnis für Umwandlungsreaktionen (Schritt 4.4.2) Substrat verwendet Hirngewebe zu zahlen. Nach unserer Erfahrung können Gehirne für die Verwendung als CER-Substrat nach einem beträchtlichen Zeitraum post mortem entnommen werden, solange PrP C durch Immunoblotting (Abbildung 4) vorhanden ist. In der Tat wurden einige Autolyse in den Gehirnen der für CER Studien verwendet bobcats beobachtet. Dennoch Inkubation von Substraten aus diesen Gehirnen abgeleitet noch in der Bildung von PrP res geführt. Wir vermuten, dass teilweise die Robustheit des CER Assay aus der Denaturierung von CER Substrate in 1,5 M GdnHCl, die viele Proteasen zu inaktivieren, wird abgeleitet.

Seed-Verhältnisse Substrat kann sein müssen empirisch bestimmt, um akzeptable PrP res Signal durch Immunoblotting erhalten. Zu viel oder zu lSubstrat-Verhältnisse: ittle PrP res zu Messung, hohe Hintergrund PrP res Niveau in den Kontrollproben ohne Substrat und inkonsistente Umtauschverhältnisse sind alles Gründe, um Samen zu optimieren zuführen. Variationen pflegen eine Gesamtreaktionsvolumen von 100 ul und beinhalten 1:99 ul, 2:98 und 5:95 ul ul. Auf fast allen Fällen haben wir festgestellt, dass 5:95 ul Samen: Substrat-Volumen-Verhältnis ist optimal. Egal, welche Verhältnis verwendet wird, gleiche Mengen von TSE-Erregern verwendet werden und der Test ist in sich konsistent. Allerdings Samenkonzentration des Prion-infizierten Hirnhomogenat auf Vorlage Reaktionen wahrscheinlich wirkt sich das Ergebnis der CER-Test, dass unterschiedliche Samen Titer oder Verdünnungen können in unterschiedlichem PrP C to-PrP res Konvertierung führen. Dieser Effekt wurde auch in anderen in vitro Prionumwandlungs Assays 22 gezeigt und kann den Vergleich der verschiedenen Isolate Prion erschweren. Um dies in der CER-Test anzusprechen, Samen could jeweils PrPC Substrat bei pH 3,5 und 7,4, hergestellt, um eine Reihe von Verdünnungen, die PrP C Konvertierungsvorlage identifizieren titriert werden. Ideal seed Verdünnungen verhindern Sättigen der Lösung mit überschüssigem Saatgut Prionen und dennoch einen Einblick in die Empfindlichkeit der Umwandlungsreaktion. Alternativ könnte PrP C to-PrP res Umwandlung in CER-Test Reaktionen an mehrere, regelmäßige Zeitpunkten während der gesamten Dauer des Tests gemessen und als Rate-of-Umsatzkurven, ähnlich wie die Anzeigen für Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (werden qPCR) 23 und Echtzeitzitterinduzierte Umwandlung (RT-QuIC) 24 Tests. Solche Anzeigen könnten umfassen Interpretationen der Artgrenzen zu ermöglichen und sind eine interessante Schwerpunkte der künftigen Entwicklung dieser Methodik.

In der hier vorgestellten Protokoll verwenden wir geringe Bindungs, dünnwandigen PCR-Gefäße, aber wir haben auch Standard-1,5-ml-Röhrchen in einem Thermoschüttler ausgestattet verwendetDiese Art von Rohr. Keine andere Änderung des Protokolls nötig sind, um die grßeren Röhren verwendet. Nach unserer Erfahrung haben wir jedoch mehr PrP res Produktion und reproduzierbare Ergebnisse in Nieder verbindlich PCR-Gefäße im Vergleich zu 1,5-ml-Röhrchen hatte. Während Erklärungen für die verbesserte Leistung des Assays in PCR-Röhrchen sind zu diesem Zeitpunkt nur spekulativ, basierend auf den Ergebnissen anzeigt, dass das Luft-Wasser-Grenzfläche ist für PrP Fibrillenbildung 25 wir die Hypothese auf, dass die kleineren Rohre liefern eine optimale Oberflächenspannung für PrP Konvertierung.

Vielleicht ist die Hauptbegrenzung auf Nutzung der CER-Test ist zu verstehen, was Umtauschverhältnisse stellen in Bezug auf die in vivo Artgrenzen Faktoren wie Krankheit Penetranz oder Länge der Inkubationszeit. Während derzeit nicht bekannt, Übersetzung zwischen in vitro und in vivo Artengrenze Faktoren sollten klarer werden mit fortgesetzte Nutzung der CER-Test in Test additional TSE Artgrenzen, die bereits in vivo etabliert haben und wird dazu beitragen, Ergebnisse an, in denen Arten Bioassay Daten liegen keine vor. Ein Vorteil der CER Assay, verglichen mit PMCA- ist die Anwesenheit einer internen Kontrolle von PrP Umwandlung, nämlich die pH 3,5-Substrat, das durch eine TSE Mittel umgewandelt werden kann. Diese Steuerung ist der Wert, wenn es unklar ist, ob und welche sollten TSE-Erreger Fehlfaltung eines exotischen Host PrPC verursachen. Die Unfähigkeit von einem bestimmten Host-Substrat, um eine bestimmte TSE-Erreger in PMCA verstärken könnte als Beweis für eine Speziesbarriere oder interpretiert werden könnte wegen technischer Mängel ist. Nachteile des CER-Test im Vergleich zu PMCA umfassen begrenzte Verstärkung von PrP res, weitere Schritte in CER Grundvorbereitung und ohne bekannte Infektiosität in den PrP res durch CER Reaktionen erzeugt. Es ist anzumerken, daß in einer früheren Studie fanden wir jedoch die CER Assay resultierte in einem ähnlichen Muster von PrP res formationen wie der PMCA 15. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen auch, dass die CER-Test richtig sagt die Artgrenzen für die Übertragung von verschiedenen TSE auf Labormäusen (Abbildung 3) und legen nahe, dass Luchse können die Anfälligkeit für CWD (Abbildung 4) haben, in Übereinstimmung mit Berichten, dass Hauskatzen (Felis catus) können Prionenerkrankung nach experimenteller CWD Herausforderung 26,27 zu erwerben. Studien mit dem CER-Test könnte PrP Sequenzierung Bemühungen, Tieranfälligkeit CWD 28 verstehen zu ergänzen.

Die CER-Test ermöglicht eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Beurteilung der TSE Artgrenzen in vitro. Während nicht ein vollständiger Ersatz für die "Goldstandard" der Tier Bioassay kann die CER-Test als eine erste Beurteilung des Vorliegens einer TSE, die Artengrenze zu rechtfertigen oder zu vermeiden weitere Studien in lebenden Tieren verwendet werden. Aus diesem Grund und weil der Assay beruht nurauf Hirngewebe, die aus Nicht-Versuchstieren erworben werden können, ist der CER im Einklang mit den Bemühungen zur Vermeidung, Verringerung und Verbesserung von Tierversuchsverfahren 29. Neben der Beurteilung Artgrenzen kann die CER-Test auch eine vereinfachte Plattform, mit der die Mechanismen der Grund Ereignis definieren Prionenkrankheit Biologie zu befassen: die Umwandlung von normalen, funktions PrP C zu einer falsch gefalteten Form.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Bis-Tris SDS-PAGE gels Life Technologies NP0342
0.5 mm Zirconium oxide beads Next Advance ZROB05 Other varieties of beads are also effective
Antibodies various suppliers Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest
Bead homogenizer Next Advance BBY24M
Centrifuge Beckman Coulter 369434 High speed with temperature control
Conical tubes any brand
Cotton-tipped applicator Uline S-18991
Cuphorn sonicator Heat Systems-Ultrasonics W-380 Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC
Densitometry software program UVP Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software Other programs, such as NIH ImageJ, will also work
Dounce homogenizer Kimble Chase 885300
End-over-end mixer Labnet International H5600
Ethylenediaminetetra acetic acid Boston Bioproducts P-770 Hazardous chemical: eye irritation
Guanidine hydrochloride, 8 M Thermo Fisher Scientific 24115 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation
Heating block Fisher Scientific 11-718
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 435570 Hazardous chemical: strong acid
Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x Life Technologies NP0008 Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid
Microcentrifuge tubes any brand
Mini-centrifuge Labnet International C1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) Sigma-Aldrich  L-5125 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage
Nonidet P-40 Amresco M158 Hazardous chemical: skin irritation, eye damage
SDS-PAGE gel system Life Technologies NuPAGE electrophoresis system Other SDS-PAGE systems will also work
PCR tubes (low-binding) Axygen PCR-02-L-C
Pestle homogenizer Fisher Scientific 03-392-106
pH meter Sentron SI600
Polyvinyldifluoride membrane Millipore IPVH00010
Proteinase K Promega V3021 Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity
Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x Life Technologies NP0009
Sodium chloride Fisher Scientific 7647-14-5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich  D6750 Hazardous chemical: acute toxicity
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 28364 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Hazardous chemical; strong base
Syringe BD Biosciences various Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized
Syringe needles BD Biosciences various
Thermoshaker (PCR tube shaker) Hangzhou All Sheng Instruments MS-100
Tris base Bio Basic 77-86-1 Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation
Triton X-100 Integra Chemical Company T756.30.30 Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation
Vortexer Fisher Scientific 12-812

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