Het beoordelen van overdraagbare spongiforme encefalopathie Soort Barrières met een

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Johnson, C. J., Carlson, C. M., Morawski, A. R., Manthei, A., Cashman, N. R. Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay. J. Vis. Exp. (97), e52522, doi:10.3791/52522 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's, prionziekten) zijn een groep van fatale neurodegeneratieve ziekten met uitgebreide incubatie periodes die een verscheidenheid aan dieren en mensen beïnvloeden. De vermeende etiologische agens van TSE bestaat uit een verkeerd gevouwen isomeer van de gastheer prioneiwit (PrP), dat in staat is zichzelf voortplant sjabloongerichte omzetting van de normale cellulaire vorm van PrP (PrP C) in een besmettelijke, ziekte-geassocieerde vorm (PrP TSE) dat zich ophoopt in het centrale zenuwstelsel weefsels van de geïnfecteerde gastheer 1. Besmettelijke zoogdieren prionen algemeen uitzenden van host-to-host in een soort-specifieke manier, die aanleiding heeft gegeven tot het concept van de "TSE soort barrière" het beperken van interspecies transmissie gebeurtenissen 2. De biologische determinanten van het prion soort barrière zijn niet goed begrepen. Aminozuurvolgorde gelijkenis tussen de besmettelijke PrP TSE en de gastheer PrP C ceen sterke invloed op de vraag of conversie plaatsvindt 3-5, maar blijft onvoldoende om alle prion transmissie gebeurtenissen waargenomen in vivo 6,7 verklaren.

Zo heeft de karakterisering van TSE soorten barrières grotendeels ingeroepen dier challenge studies: blootstellen naïeve dieren van een bepaalde soort te prionen van een ander en het meten van de resulterende incubatietijd van de ziekte ontstaan ​​en de attack rate als indicatoren van de transmissie-efficiëntie. Muizen die PrP C van heterologe species worden ook gebruikt voor dit type onderzoek 8. De kosten in verband met transgene muis productie en langdurige prion bioassays, evenals ethische overwegingen van het gebruik van dieren, zijn belemmeringen voor experimenteel onderzoek van TSE soorten barrières. Beoordeling van de menselijke soort barrière voor TSE's is gebaseerd op gemanipuleerde muizen met menselijke PrP C te drukken. Deze muizen vereisen lange incubatieperiode te bezwijken voor de menselijke TSE of aanpassingen aan tHet menselijke PrP C molecule voor snelle ziektebegin 9. Incubatieperiode van de niet-menselijke TSE's bij deze muizen kunnen buiten de normale muis levensduur waardoor interpretatie van negatieve resultaten uitdagend. Niet-menselijke primaten zijn ook gebruikt als proxies voor het bestuderen soortbarrières mens, maar deze studies zijn beladen met dezelfde problemen als andere soorten dierproeven en niet-menselijke primaten niet precies ziekte herhalen terwijl het zich in de menselijke gastheer.

Animal bioassays blijven de "gouden standaard" methode voor het meten van de gevoeligheid van een soort van een TSE, maar de obstakels, kosten en ethische deze levende dierstudies onderzoek naar alternatieven gedwongen. Een aantal in vitro assays, gebaseerd op de beoordeling van de omzetting van PrP c gastheer een proteïnase K (PK) resistente toestand (PrP res) na enting van PrP TSE, ontwikkeld en gebruikt om TSE species barrières 10-12. Voorbeelden van in vitro assays omvatten celvrije conversie testen eiwit misfolding cyclische amplificatie (PMCA) en de conversie efficiency ratio (CER) test 10-14. Hoewel geen van deze tests rekening worden gehouden met betrokken bij soorten barrières na natuurlijke infectie perifere factoren, kan alle nuttige om potentieel gevoelig hosts identificeren voor TSE's zijn.

Hier presenteren we het protocol voor de CER assay, waarbij twee gedenatureerd PrP C substraten afgeleid van normaal hersenweefsel homogenaten worden in tafelmodel prion omzettingsreacties (figuur 1) 13. PrP c in het substraat gedenatureerd bij pH 7,4 kan alleen PrP res worden omgezet PrP TSE gezaaid in de reactie in de afwezigheid van een soort barrière 14. Daarentegen denaturatie van PrP c in het andere substraat bij pH 3,5 het geschikt maakt omgezet PrP res na incubatiemet PrP TSE van elke soort en dient als controle voor conversie. De verhouding van de omzetting van PrP c naar PrP res in pH 7.4 substraat ten opzichte van die van de pH 3,5 substraat een maat van de soort barrière. Wij hebben gevonden dat de CER test voorspelt bekende species barrières van laboratoriummuizen verschillende TSE en de assay gebruikt in pogingen om de soort dam van vele zoogdiersoorten, waaronder bighornschapen, chronische wasting disease (CWD) en andere TSE 14 voorspellen, 15. Onderzoekers geïnteresseerd in een tool waardoor een snelle screening van TSE soorten barrières of beoordeling van PrP C to-PrP-res conversie zal deze methodiek nuttig vindt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dierlijke werk uitgevoerd aan de USGS National Wildlife Health Center werd uitgevoerd in overeenstemming met de NIH Bureau van Laboratory Animal Welfare richtlijnen en onder institutionele verzorging van dieren en het gebruik commissie protocol # EP080716. Weefsels uit-jager geoogst dieren waren geschenken van de Wisconsin of Michigan Afdelingen van Natuurlijke Hulpbronnen.

1. Oplossing Voorbereiding

OPMERKING: De onderstaande oplossingen zijn nodig voor de voorbereiding van de CER assay substraat in Deel 2 hieronder. Bereid elk van deze oplossingen van hogere concentratie voorraad oplossingen; aanbevolen concentraties voorraadoplossingen worden haakjes na elke respectieve chemische naam vermeld. Bereid alle oplossingen vers na voorbereiding van de ondergrond en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.

  1. Voor lysis buffer, een oplossing van de volgende in 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5 voorraadoplossing aanbevolen): 100 mM sodium chloride (NaCl, 1 M stockoplossing), 10 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 stockoplossing), 0,5% NP-40 (10% voorraad-oplossing), 0,5% deoxycholaat (DOC, 10% stockoplossing ).
  2. Voor conversie buffer, een oplossing van 0,05% natriumdodecylsulfaat (SDS, 10% voorraadoplossing) en 0,5% Triton X-100 (10% voorraadoplossing) in 1 fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, 10, pH 7,4 stamoplossing).
  3. Voor chaotropische oplossingen, voor te bereiden twee 3 M oplossingen van guanidinehydrochloride (GdnHCl, 8 M voorraad) in 1x PBS (10x voorraad-oplossing). Stel de pH van een van de oplossingen tot 3,5 ± 0,05 met geconcentreerd zoutzuur (HCl). De pH van de tweede oplossing is bij pH 7,4 ± 0,05 en aanpassen met geconcentreerd zoutzuur of natriumhydroxide (NaOH) indien nodig.

2. Bereid CER Assay Ondergrond Pairs

  1. Verkrijgen van gezonde, niet-TSE-geïnfecteerde hersenweefsel van soorten van rente en een 10% gewicht per-volume te bereiden(W / v) homogenaat in lysisbuffer met een van de volgende methoden: dounce, parel molen of vijzel homogeniseren. Verder verfijnen resulterende homogenaten door hen te onderwerpen aan de spuit-en-naald homogenisering, met behulp van naalden van toenemende gauge tot substraat kan worden opgezogen en uitgestoten met gemak door middel van een 27 G naald van de spuit.
    1. Voor substraten bereid uit knaagdieren en andere kleine zoogdieren, homogeniseren hele brein (s); voor substraten bereid van grotere zoogdieren, gebruiken OBEX (hersenstam) weefsel homogenaten bereiden. Bij het selecteren van de hoeveelheid hersenhomogenaat, bereid maximaal 50% van de capaciteit van de centrifuge voor proteïneprecipitatie in stap 2.6.
    2. Als de kwaliteit van de verkregen hersenweefsel twijfelachtig beoordelen PrP C niveaus door SDS-PAGE en immunoblot 16 17 voorafgaand aan substraat preparaat.
  2. Verdeel hersenhomogenaat in twee gelijke volumes in aparte gelabelde plastic conische buizen. Voeg GdnHCl (3 M oplossingen in PBS 1) aan beide pH 3,5 of 7,4 aan elke buis in een 1: 1 volumeverhouding met hersenhomogenaat.
  3. Controleer de pH-waarden van de twee oplossingen. Stel de pH van de pH 3,5 tot pH substraat ± 0,05 met geconcentreerd HCl. Controleer de pH van het andere substraat blijft bij pH 7,4 ± 0,05 en pH zo nodig met HCl of NaOH indien nodig. Vermijd overschrijding pH door oordeelkundige toevoeging van zuur of base.
  4. Draai oplossingen op end-over-end mixer bij kamertemperatuur (RT) gedurende 5 uur.
  5. Neerslag eiwit door het toevoegen van vier volumes methanol aan het substraat oplossingen telkens conische buis, vortex goed te mengen en incuberen bij -20 ° C gedurende 16-18 uur.
  6. Sediment monsters door centrifugatie bij 13.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C. Voorzichtig decanteren en gooi de bovenstaande vloeistoffen en laat methanol verdampen van de pellets. Gebruik wattenstaafje applicators helpt bij het absorberen methanol vast aan de binnenzijde van de buis. Sta niet toe dat pellets te over-dry en eenmaal methanol niet meer zichtbaar, verder met de volgende stap.
  7. Hersuspendeer eiwit pellets in conversie buffer. Gebruik een hoeveelheid omzetting buffer gelijk is aan de hoeveelheid hersenhomogenaat uitgangsmateriaal verdeeld in elke buis in stap 2.2.
    LET OP: Het is cruciaal dat de conversie buffer gebruikt om eiwit pellets opnieuw in suspensie van zowel pH 3,5 en 7,4-behandelde substraat voorbereidingen wordt de in stap 1.2 hierboven (die lage niveaus van detergenten en een fysiologische pH bevat) oplossing.
  8. Kort sonicaat substraat oplossingen in een cuphorn sonicator (10 sec bij ~ 30% maximale vermogen), hoeveelheid in 0,5-1,0 ml volumes in geëtiketteerde 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Voer een kwaliteitscontrole immunoblot (stap 2.9) met een deel van elk substraat. Bewaar andere fracties bij -80 ° C tot klaar om CER test (deel 4) uit te voeren.
  9. Voer kwaliteitscontrole op CER substraat paren voor gebruik (figuur 2). Deze stappen zorgen ervoor dat CER substraten zal provide een optimaal resultaat van de conversie studies.
    1. Zorgen voor vergelijkbare hoeveelheden van PrP C in de twee substraten. Vergelijk PrP ​​niveaus in 10-25 pl van elk substraat door SDS-PAGE en immunoblotting 16 17. Als eiwitniveaus in de pH 7,4 en 3,5 substraten in ~ 10% van elkaar, het substraat paren geschikt zijn voor gebruik in CER studies.
      OPMERKING: De PrP immunoblots mag geen bewijs uitgebreide PrP C afbraak vertonen. Het PrP immunoreactiviteit dient voornamelijk> 20 kDa. Bands minder dan dit molecuulgewicht kan afbraakproducten. Strepen patronen moet ongeveer gelijk tussen substraat paren zijn.
    2. Aangezien de PrP C beide substraten PK gevoelig moet zijn, behandelen 10-25 ui van elk substraat met PK bij een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml en verteren monsters bij 1000 rpm bij 37 ° C gedurende 1 uur in de thermo-shaker. Beoordeelt alle resterende PrP signaal door SDS-PAGE 16 en immunoblotten 17.Ondergronden met PrP res zijn niet geschikt voor gebruik in CER studies.

3. Bereid TSE Agent Zaden

  1. Verkrijgen TSE geïnfecteerd hersenweefsel van van belang zijnde species en bereiden een 10% (w / v) homogenaat in 1x PBS pH 7,4 met behulp van de in stap 2.1 hierboven genoemde methoden.
    OPMERKING: zaden kunnen ook worden verkregen uit andere TSE geïnfecteerde weefsels buiten het centrale zenuwstelsel echter omzettingsrendement van hersenen afgeleide substraten door zaden afgeleid van TSE geïnfecteerde perifere weefsels nog niet experimenteel vastgesteld in de gepubliceerde literatuur.
  2. Aliquot resulterende homogenaat (s) in 100-300 ul volumes in 0,5 ml microcentrifuge buizen en bewaar bij -80 ° C tot gebruik CER analyse uit te voeren.

4. CER Assay

OPMERKING: De CER bepaling omvat toevoeging van een relatief kleine hoeveelheid PrP TSE (verschaft in de "seed") van de ene specieseen relatieve overmaat PrP C (verschaft in de geïnfecteerde hersenen "substraat") van andere species die gedeeltelijk gedenatureerd bij zowel pH 3,5 en 7,4. Na een uitgebreide schudden incubatieperiode wordt sjabloongerichte omzetting van PrP c van PrP TSE in elke reactie vastgesteld door de densitometrische signaal PrP res overblijft na PK digestie en immunoblot detectie. Vergelijking PrP res niveaus in de substraten eerder gedenatureerd bij pH 3,5 vs. 7,4 geeft een maat van de soort barrière. Een experimentele overzicht van deze assay procedure wordt in figuur 1.

  1. Langzaam ontdooien geïnfecteerde CER substraat paren (test vereist gelijke volumina substraten eerder gedenatureerd bij zowel pH 3,5 en 7,4) en TSE geïnfecteerde zaad oplossingen door ze op een bed van ijs (ongeveer 1 uur ontdooien tijd).
  2. Eenmaal volledig ontdooid, aspireren en vervolgens verdrijven elk substraat oplossing door een27 G naald meerdere malen opnieuw te homogeniseren het. Kort ultrasone trillingen elke TSE besmette zaad oplossing voor 10 sec bij ~ 30% maximale kracht. Houd alle oplossingen op het ijs, terwijl de voorbereiding conversie reacties.
  3. Label 5 individuele lage binding, dunwandige PCR-buisjes per TSE-agens wordt getest.
  4. Bereid omzettingsreacties in deze buizen door toevoeging van 5 ui 10% TSE-geïnfecteerde zaadoplossing 95 gl (a) CER substraat bereid bij pH 7,4 en (b) CER substraat bereid bij pH 3,5.
    1. Voor elke experimentele monster, bereiden parallelle reacties in CER substraat paren eerder gedenatureerd bij zowel pH 3,5 en 7,4.
    2. Optimaliseer verhoudingen van TSE-agens zaad tot niet-geïnfecteerde hersenen substraat door middel van empirische bepaling. Vaak zaad: substraat verhoudingen in dienst te houden in totaal reactie volume van 100 ul en omvatten 1:99 ui, 2:98 ui en 5:95 pi. Voor de meeste toepassingen is de 5:95 ul zaad: substraat volume verhouding passend is en wordt wat wordt gepresenteerd in this protocol.
  5. Bereid drie controlemonsters per TSE agens wordt als volgt getest: (a) voeg 5 ui 10% TSE-geïnfecteerde zaadoplossing 95 gl conversie buffer als controle voor invoer PrP res; voeg 5 ul omzetting buffer 95 gl substraat bereid in (b) pH 3,5 en (c) pH 7,4 als controles voor niet-specifieke niet-matrijs conversie.
  6. Elk monster kort vortex in de gesloten PCR-buis om zaad en de ondergrond goed mengen. Volg met een kortstondige puls in een langzame bench top mini-centrifuge één volume van het reactiemengsel gevangen in de PCR-buis deksel te verwijderen.
  7. Monsters lading in individueel-gelabelde PCR-buizen in een bench top thermo-shaker uitgerust om PCR-buisjes te accepteren. Schud de monsters bij 1000 rpm bij 37 ° C gedurende 24 uur.
  8. Na schudden toevoegen sarkosyl tot een eindconcentratie van 2% (w / v) en PK tot een uiteindelijke concentratie van 100 ug / ml. Digest monsters bij 1000 rpm bij 37 ° C gedurende 1 uur in de thermo-shaker.
    NOTE: Toevoeging van sarkosyl om monsters na de conversie helpt bij PK vertering van PrP C. Vals positieve signalen in ongeplaatste monsters (Stap 4.5) zijn vrijwel geëlimineerd door toevoeging van sarkosyl.
  9. Voeg SDS-PAGE monsterbuffer, warmte monsters tot 95 ° C gedurende 5 minuten en lossen resterende PrP res in elk monster door SDS-PAGE 16 gevolgd door immunoblotting 17.
    Opmerking: na toevoeging van monsterbuffer en verwarming monsters worden onmiddellijk verwerkt of monsters bij -20 ° C worden opgeslagen of -80 ° C voorafgaand aan immunoblotting. Alle hier gepresenteerde gegevens werden gegenereerd met behulp van de Novex NuPAGE gel en overdracht systemen. Afzonderlijke monsters van de CER assay werden behandeld met monsterbuffer en reductiemiddel volgens de instructies van de fabrikant. Monsters werden vervolgens bij 95 ° C gedurende 5 minuten verwarmd en 30 pl van elk monster werd in een 12% bis-tris voorgegoten gels geladen.
  10. Bereken de conversie efficiency ratio (CER) als een maatregelvan soorten barrière. Meet niveaus van PrP res met densitometrie 17 en verdeel de totale dichtheid van het pH 7,4 monster dat van het pH 3,5 monster. Vermenigvuldigen met 100 om een ​​percentage te produceren.
  11. Gegevens te verzamelen van onafhankelijke experimentele herhalingen tot een gemiddelde CER ± standaarddeviatie voor een soort met een bepaalde TSE-agens te genereren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Succesvol gebruik van de CER test is grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van het substraat paren in omzettingsreacties. Daarom volgende procedures CER substraat paren bereiden, kwaliteitscontrole immunoblot worden uitgevoerd (figuur 2). Voor beide substraten assay 10-25 pl door immunoblotting. PrP C moet gemakkelijk detecteerbaar in elk substraat en PrP C niveaus moet ongeveer gelijk tussen de twee. Immunoreactiviteit zal voornamelijk zichtbaar boven 20 kDa, maar kleinere bands mag ook duidelijk zijn. In onze ervaring, de aanwezigheid van kleinere bands is soortafhankelijke. Als lagermoleculaire produkten worden waargenomen, moet hun aanwezigheid bevestigd worden in zowel substraat paren.

Het is belangrijk dat CER substraten vrij van endogene PrP res door behandeling van substraten met PK (figuur 2). Als PrP res aanwezig is, het dier gebruikt voor substrate preparaat kan zijn met TSE besmette of subklinisch geïnfecteerd. Alternatief kan de PrP C in het substraat om een PK-bestendige toestand heeft verkeerd gevouwen tijdens denaturatie en precipitatie procedures. Onafhankelijk van de oorzaak, CER substraat dat PrP res is niet aanvaardbaar voor de ombouw assay.

Laboratorium muizen zijn een van de meest gebruikte proefdieren in TSE-onderzoek; als zodanig, hun gevoeligheid voor de meeste TSE's is goed gekarakteriseerd 8, het verstrekken van een in vivo benchmark waartegen de trouw van de CER-test te testen. Figuur 3A presenteert resultaten van CER test omzetting van PrP C uit muis (CD1 stam) substraat te PrP res door 1) het RML stam van muis passage scrapie, een middel aangepast aan de muizengastheer 18 2) binnenlandse schapen klassieke scrapie, een middel dat kan doorgeven aan muizen na een lange incubatietijd 18, en 3) white-staart hert (Odocoileus virginianus) CVO en 263K stam van-hamster gepasseerd scrapie, agentia waarop muizen minimaal of niet gevoelig 19,20 zijn. Resulterend PrP res niveaus waren sterk van de muis substraten gedenatureerd bij een pH van 7,4 en ingezaaid met de verschillende TSE-agentia terwijl PrP res werd gevonden in alle substraten gedenatureerd bij een pH van 3,5 en ingezaaid met een TSE-agens. Omzetting verhoudingen vergelijken van de PrP res niveaus in de pH 7,4 en 3,5 substraten werden afzonderlijk berekend ten minste drie keer en gemiddelden ± SD zijn getoond in figuur 3B. Voor reacties gezaaid door RML, conversie ratio's tussen pH 7,4 en 3,5 substraten waren ongeveer 100%. Voor gezaaid scrapie, omzetting in het pH 7.4 substraat was ongeveer 75% van die in de pH 3,5 substraat. CWD of 263K geïnduceerde omzetting van de pH 7.4 substraat minimaal was. Een one-way analyse van variantie kan een verschil in de conversie ratio van RML en is niet te onderscheidenCrapie of CWD en 263K echter conversie ratio van RML en scrapie waren significant verschillend van die van CVO en 263K.

De CER test kan worden aangepast voor gebruik met menselijke weefsels of diersoorten waarbij bioassays te moeilijk of niet ethisch en transgene muizen productie niet gewenst. We zijn met behulp van deze test om de gevoeligheid van verschillende soorten dieren in het wild te CWD karakteriseren. Als voorbeeld van het gebruik van deze test presenteren we enkele voorlopige resultaten in Figuur 4. Hersenen van jager gevangen bobcats (Lynx rufus) bleken nog detecteerbare niveaus van PrP c en PrP afbraakproducten bevatten werden niet uitgebreid, wat suggereert dat deze weefsel kan een aanvaardbare bron voor CER substraat (figuur 4A) zijn. Substraat paren gegenereerd uit bobcat hersenen toonde PrP immunoreactiviteit van een passend molecuulgewicht en geen endogene PrP-res bevatten (figuur 4B). Wanneer bobcat CER substraat paren gegenereerd uit twee afzonderlijke dieren werden met dezelfde witstaartherten CVO middel gebruikt in de muis CER test beschreven in figuur 3, vonden we substraten bereid bij pH 7,4 had niveaus van PrP res vergeleken met substraten voorbereid bij pH 3,5 (Figuur 4C), indicatief voor een minimale soort barrière van bobcat PrP C tot conversie door CVO. De CER voor de omzetting van witstaartherten PrP C door dezelfde CVO isolaat gebruikt om bobcat PrP C zetten hier, als een positieve controle, werd eerder gemeld als 95,2 ± 18,4% in Morawski et al. (2013) 15.

Figuur 1
Figuur 1:. Experimentele overzicht van de CER assay twee test substraten worden bereid door gedeeltelijke denaturatie PrP C in niet-prion geïnfecteerd hersenweefsel wi chaotrope oplossingen op ofwel pH 3,5 of pH 7,4. Substraten worden geënt met PrP TSE van prion agens plaats en experimentele monsters worden onderworpen aan 24 uur incubatie onder schudden tot PrP C laten PrP TSE omzetting in zowel pH 3,5 en 7,4 substraten. Na incubatie wordt de omzetting bepaald door SDS-PAGE en immunoblotting. Signal dichtheden worden gelezen door densitometrie en CER wordt berekend door de verhouding van pH 7,4 tot pH 3,5 signaal dichtheden voor elke experimentele monster.

Figuur 2
Figuur 2: Kwaliteitscontrole op CER substraten. (A) Voor hun gebruik in de CER test muis substraten bereid bij zowel pH 7,4 en 3,5 worden getest door immunoblot in 1) geen PK behandeling PrP C gehalte van elk substraat paren beoordelen (PrP C niveaus moet gelijk zijn tussen pH 7,4 en 3,5 Substra tes voor gebruik in CER test) en 2) de aanwezigheid van PK (100 ug / ml) behandeling testen bestaande PrP res in weefsels gebruikt om substraten (alle substraten die weergegeven bestaand PrP res zijn niet geschikt voor gebruik in voorbereiding CER assay). (B) te testen voor niet-specifieke PrP res formatie tijdens de omzetting assay muizen PrP C substraten bereid bij zowel pH 7,4 en 3,5 zijn geënt met conversie buffer, geschud gedurende 24 uur bij 1000 rpm, 37 ° C en vervolgens PK-behandelde (100 ug / ml) en getest op PrP res door immunoblotting (rechts twee rijstroken). Niet-geschud, niet-PK behandelde muis substraten overeen met de totale PrP C-gehalte in assay reacties (links twee rijstroken). Voor (B), irrelevant rijstroken bebouwd duidelijkheid, maar elke immunoblot paneel afgeleid van dezelfde gel, membraan en belichting. Immunoblots in alle panelen gebruikt monoklonaal antilichaam SAF 83.

"> Figuur 3
Figuur 3:. CER test met behulp van laboratorium muis substraat (A) Muis CER assay substraat voorbereid op een van beide pH 7,4 of 3,5 werd geïncubeerd met RML-muis aangepaste scrapie, binnenlandse schapen klassieke scrapie, witstaartherten Chronic Wasting Disease (CWD) of 263K stam van-hamster aangepaste scrapie in de CER test. Controlemonsters (het label "geen") bevatte slechts een gelijke hoeveelheid infectieuze agens en geen muis substraat. Monsters werden geanalyseerd op de aanwezigheid van PK-resistente prioneiwit (PrP res) van immunoblot met monoklonaal antilichaam SAF 83. Ruwe densitometrische waarden voor elk monster worden onder elke laan weergegeven. (B) Bar grafiek die de gemiddelde ratio (± standaarddeviatie) tussen pH 7,4 en 3,5 muis substraten voor elke ziekteverwekker basis van ten minste 3 onafhankelijke test runs. Kleine letters verwijzen naar statistischhomogene deelverzamelingen (variantieanalyse met Tukey-Kramer minimum significantie verschillen werkwijze; p <0,05). Dit cijfer is gewijzigd van Morawski et al. 2013 15.

Figuur 4
Figuur 4: Voorbeeld gebruik van CER assay bobcat gevoeligheid Bobcat hersenhomogenaat (A) en CER assay substraat (B) werd getest door immunoblotting in de afwezigheid en aanwezigheid van PK (100 ug / ml) bestaande PrP C beoordelen onderzoeken in CWD. niveau en de aanwezigheid van reeds bestaande PrP res respectievelijk. (C) Bobcat substraten werden geënt met conversie buffer en getest in de CER assay aspecifieke PrP res vorming beoordelen (links twee rijstroken). Niet-geschud, niet-PK behandeld bobcat substraten overeen met de totale PrP C-gehalte in assay reacties (rechts twee rijstroken).(D) Bobcat substraat voorbereid op een van beide pH 7,4 of 3,5 werd geïncubeerd met witstaartherten CVO gebruik van de CER-test. De controle monster (het label "geen") bevatte een gelijke hoeveelheid CVO middel maar geen bobcat substraat. Ruwe densitometrische waarden voor elk monster worden onder elke laan weergegeven. Immunoblots in alle panelen monoklonaal antilichaam 3F4, dat reageert met het feline prioneiwit 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Voor een succesvolle afronding van dit protocol, moet aandacht worden besteed aan PrP C niveaus in niet-geïnfecteerde hersenweefsel gebruikt voor voorbereiding van de ondergrond (stap 2.1.2) en het zaad tot ratio voor conversie reacties (stap 4.4.2) substraat. In onze ervaring, kunnen de hersenen worden gewonnen voor gebruik als CER substraat na een aanzienlijke periode post-mortem, zolang PrP C aanwezig door immunoblotting (figuur 4) is. In feite werd enige autolyse waargenomen in de hersenen van de bobcats voor CER studies. Niettemin incubatie van substraten die uit deze hersenen nog resulteerde in de vorming van PrP res. We speculeren dat gedeeltelijk de robuustheid van de CER test wordt afgeleid uit de denaturatie van CER substraten in 1,5 M GdnHCl, die vele proteasen inactiveren.

Zaad tot verhoudingen substraat dient empirisch vastbesloten om aanvaardbare PrP res signaal te verkrijgen door immunoblotting te zijn. Te veel of te little PrP res te densitometry, hoge achtergrond PrP res niveau presteren in controlemonsters ontbreekt substraat en inconsistent conversie ratio's zijn allemaal redenen om zaad te optimaliseren: substraat verhoudingen. Variaties onderhouden van een totaal reactie volume van 100 ul en omvatten 1:99 ui, 2:98 ui en 5:95 pi. Bij bijna alle gelegenheden hebben wij gevonden dat 5:95 ui zaad substraat volumeverhouding optimaal. Wat verhouding wordt toegepast, gelijke hoeveelheden TSE agens worden gebruikt en de assay is intern consistent. Echter, zaad concentratie van het prion geïnfecteerd hersenhomogenaat gebruikt template reacties waarschijnlijk invloed op de uitkomst van de CER assay die variërende zaad titers of verdunningen kan resulteren in verschillende niveaus van PrP C tot-PrP res conversie. Dit effect is aangetoond in andere in vitro prion omzetting assays 22 en zijn de vergelijking van verschillende prion isolaten bemoeilijken. Om dit in de CER-test aan te pakken, zaden could getitreerd in elk PrP ​​C-substraat bereid bij pH 3,5 en 7,4 om een reeks verdunningen die PrP C conversie template identificeren. Ideaal zaad verdunningen voorkomen verzadigen van de oplossing met overmaat zaad prionen en toch geven inzicht in de gevoeligheid van de omzettingsreactie. Alternatief zou PrP C tot-PrP res conversie CER Testreacties gemeten op meerdere regelmatige tijdstippen gedurende de duur van de test en uitgezet als rate of conversie curves, verwant aan de uitlezingen van real-time polymerase-kettingreactie ( qPCR) 23 en real-time trillen veroorzaakte conversie (RT-QUIC) 24 assays. Dergelijke uitlezingen kon uitgebreider interpretaties van soorten barrières toelaten en zijn een interessante focus van de toekomstige ontwikkeling van deze methodiek.

In het protocol hier gepresenteerde gebruiken we lage bindingsaffiniteit, dunwandige PCR buizen, maar we hebben ook standaard 1,5 ml buizen in een thermo-shaker ingericht voordit type buis. Geen andere variaties van het protocol nodig zijn grotere afmetingen buizen gebruiken. In onze ervaring, maar we hebben meer PrP res productie en meer reproduceerbare resultaten bij weinig binding PCR-buisjes vergeleken met 1,5 ml buisjes gehad. Terwijl verklaringen voor de verbeterde prestatie van de test in PCR buizen slechts speculatief op dit moment gebaseerd op resultaten wijzen dat de lucht-water grensvlak is cruciaal voor PrP fibrillization 25, veronderstellen we dat de kleinere buizen garanderen een optimale oppervlaktespanning van PrP conversie.

Misschien is de belangrijkste beperking voor gebruik van de CER test is te begrijpen wat conversie ratio vertegenwoordigen in termen van in vivo soortbarrières determinanten zoals ziekte penetrantie of lengte van de incubatietijd. Hoewel momenteel niet bekend, translatie tussen in vitro en in vivo soortbarrière factoren duidelijker moet worden voortgezet gebruik van de CER assay testen additional TSE soorten barrières die al in vivo hebben vastgesteld en zal helpen om resultaten te kwalificeren in soorten waar bioassay gegevens niet beschikbaar zijn. Een voordeel van de CER assay opzichte PMCA is de aanwezigheid van een interne controle voor PrP omzetting, namelijk pH 3,5 substraat, die kan worden omgezet door een TSE agens. Deze controle is van waarde wanneer het onduidelijk is welke, indien aanwezig, moet TSE-agentia misfolding van een exotische gastheer PrP C veroorzaken. Het onvermogen van een bepaalde gastheer substraat aan een specifieke TSE-agens in PMCA versterkt zou kunnen worden geïnterpreteerd als een bewijs van een soort barrière of kan te wijten zijn aan technische tekortkomingen. Nadelen van de CER-test vergeleken met PMCA bevatten beperkte versterking van PrP res, extra stappen in CER voorbereiding van de ondergrond en geen bekende besmettelijkheid in het PrP res geproduceerd door CER reacties. Het zij opgemerkt dat in een eerdere studie, maar wij vonden de CER assay resulteerde in een vergelijkbaar patroon van PrP res formatie die van PMCA 15. De hier gepresenteerde resultaten geven ook aan dat de CER test voorspelt correct de soorten barrières voor de transmissie van verschillende TSE's aan het laboratorium muizen (figuur 3) en suggereren dat bobcats gevoeligheid kan hebben om CVO (figuur 4), in overeenstemming met rapporten dat de binnenlandse katten (Felis catus) kan prion ziekte na experimentele CVO uitdaging 26,27 verwerven. Studies die gebruik maken van de CER-test kon PrP sequencing inspanningen om dieren in het wild gevoeligheid begrijpen om CWD 28 complimenteren.

De CER-test maakt een snelle, goedkope, betrouwbare beoordeling van TSE soorten barrières in vitro. Hoewel niet een volledige vervanging voor de "gouden standaard" van dierlijke bioassay, kan de CER-test worden gebruikt als een eerste beoordeling van het bestaan ​​van een TSE soort barrière die kan rechtvaardigen of te ondervangen verdere studies in levende dieren. Daarom, en omdat de assay berust alleenop hersenweefsel die kan worden verkregen uit niet-proefdieren, de CER is in overeenstemming met de inspanningen om te vervangen, verminderen en verfijnen dier experimentele procedures 29. Behalve de beoordeling soortbarrières kan de CER test ook een vereenvoudigde platform waarmee de mechanismen van de fundamentele gebeurtenis definieert prionziekte biologie onderzoeken: de conversie van normale, functionele PrP C om een verkeerd gevouwen vorm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Bis-Tris SDS-PAGE gels Life Technologies NP0342
0.5 mm Zirconium oxide beads Next Advance ZROB05 Other varieties of beads are also effective
Antibodies various suppliers Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest
Bead homogenizer Next Advance BBY24M
Centrifuge Beckman Coulter 369434 High speed with temperature control
Conical tubes any brand
Cotton-tipped applicator Uline S-18991
Cuphorn sonicator Heat Systems-Ultrasonics W-380 Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC
Densitometry software program UVP Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software Other programs, such as NIH ImageJ, will also work
Dounce homogenizer Kimble Chase 885300
End-over-end mixer Labnet International H5600
Ethylenediaminetetra acetic acid Boston Bioproducts P-770 Hazardous chemical: eye irritation
Guanidine hydrochloride, 8 M Thermo Fisher Scientific 24115 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation
Heating block Fisher Scientific 11-718
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 435570 Hazardous chemical: strong acid
Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x Life Technologies NP0008 Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid
Microcentrifuge tubes any brand
Mini-centrifuge Labnet International C1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) Sigma-Aldrich  L-5125 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage
Nonidet P-40 Amresco M158 Hazardous chemical: skin irritation, eye damage
SDS-PAGE gel system Life Technologies NuPAGE electrophoresis system Other SDS-PAGE systems will also work
PCR tubes (low-binding) Axygen PCR-02-L-C
Pestle homogenizer Fisher Scientific 03-392-106
pH meter Sentron SI600
Polyvinyldifluoride membrane Millipore IPVH00010
Proteinase K Promega V3021 Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity
Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x Life Technologies NP0009
Sodium chloride Fisher Scientific 7647-14-5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich  D6750 Hazardous chemical: acute toxicity
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 28364 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Hazardous chemical; strong base
Syringe BD Biosciences various Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized
Syringe needles BD Biosciences various
Thermoshaker (PCR tube shaker) Hangzhou All Sheng Instruments MS-100
Tris base Bio Basic 77-86-1 Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation
Triton X-100 Integra Chemical Company T756.30.30 Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation
Vortexer Fisher Scientific 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (1), a006833 (2011).
  2. Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
  3. Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59, (5), 847-857 (1989).
  4. Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
  5. Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
  6. Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389, (6650), 448-450 (1997).
  7. Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9, (3), e89722 (2014).
  8. Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39, (4), 32 (2008).
  9. Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (8), 4784-4789 (2003).
  10. Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (9), 3923-3927 (1995).
  11. Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19, (7), 4425-4430 (2000).
  12. Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3, (4), 220-223 (2009).
  13. Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277, (46), 43942-43947 (2002).
  14. Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364, (4), 796-800 (2007).
  15. Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157 (2013).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  17. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
  18. Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1, (7191), 1378-1379 (1961).
  19. Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78, (23), 13345-13350 (2004).
  20. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51, (1), 135-144 (1987).
  21. Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5, (4), 401-413 (1999).
  22. Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, (5), 757-768 (2008).
  23. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5, (3), 150-153 (2011).
  25. Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9, (6), e98753 (2014).
  26. Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87, (4), 1947-1956 (2013).
  27. Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. (2014).
  28. Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7, (12), e50623 (2012).
  29. Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. Methuen. (1959).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics