배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yan, J., Thomson, J. K., Zhao, W., Fast, V. G., Ye, T., Ai, X. Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer. J. Vis. Exp. (97), e52542, doi:10.3791/52542 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

광학 매핑은 하트 생체 EX 모두 그대로에 배양 심근 세포 단층에서 심장의 전기 활동을 검출하는 유용한 기술로 입증되었다. HL-1 세포는 심장 생리학 널리 다양한 양상을 연구하기위한 2 차원 모델 세포로서 사용되어왔다. 그러나, 배양 HL-1 심방 세포 단층의 한 시야에서 동시에 광학적지도 칼슘 (Ca) 과도 및 활동 전위에 큰 도전이었다. 특별한 처리 및 관리에 전기적 및 광학적 캡처 매핑 될 수 건강한 세포를 준비 할 필요가 있기 때문이다. 따라서, 우리는 듀얼 채널 광학 매핑을위한 최적의 작업 프로토콜을 개발했습니다. 이 논문에서는 듀얼 채널 광 매핑 실험을 수행하는 방법을 상세히 설명 하였다. 이 프로토콜은 부정맥 개발 활동 전위의 전파 및 CA 역학의 이해를 향상시키는 유용한 도구이다.

Introduction

고유 칼슘 (Ca) 및 전압 (V의 m) 듀얼 채널 광학 매핑 기술 1-5 동시에 그대로 마음과 배양 세포 단일 층에 모두 V의 m과 칼슘 신호를 기록 할 수있는 효율적인 도구로 부상하고있다. 이 기술은 가능한 더 부정맥의 전기 생리 기본 메커니즘을 이해하기 위해 칼슘 과도 활동 전위와의 관계에 관한 강력한 정보를 얻을 수있다.

배양 세포 단일 층은 심장 전기 생리학 및 부정맥의 기본 메커니즘을 연구하는 유용한 셀룰러 모델로 입증했다. 4,6-8 HL-1 세포가 잘 특성화 심방 근육 세포 배양 라인입니다. HL-1 세포는 형태 학적, 전기 생리 및 성인 심방 근육 세포의 약리학 적 특성을 포함하는 차별화 된 유전자형과 표현형을 유지한다. 이 세포들은 importa을 포함한 심장 유전자와 단백질을 표현NT 심장 이온 채널 (즉, L- 및 T 형 칼슘 채널) 9 sarcomeric 수축성 단백질의 성숙 이성체가 정상적으로 등의 성인 심방 근육 세포에서 발견 우리는 이전에보고했다. (10-13) 또한, HL-1 세포가 될 수 2 차원 (2-D) 심근 세포의 단층을 형성하기 위해 배양 하였다. 따라서, 배양 된 HL-1 단층을 사용할 때의 장점은 1) 상대적으로 낮은 비용과 더 쉽게 분리 및 일차 배양 신생아 심근 세포보다 심근 세포 배양 라인을 유지하기; 2) 세포가 단층은 심장의 3-D 구조로 인한 구조의 복잡성을 감소시킨다; 3) 세포 단층은 그대로 심장에서 발생하는 간질 섬유화의 간섭을 제거 할 수 있습니다. 이것은 간질 섬유 아세포 행렬의 간섭없이 근세포의 특정 그룹의 전기 생리 학적 기능을 절개하는데 사용될 수있다; 막 다른 골목에서 약리학 또는 유전자 조작에서 기능적 결과 4) 평가여 체계적인 세포 단층을 효과적으로 달성 할 수있다. 따라서, HL-1 세포는 심근 세포 생리학의 다양한 측면뿐만 아니라 페이싱에 의한 비정상적인 전기적 활동을 연구하는데 널리 사용되는 셀룰러 모델이되고있다. 외부에 응답 13-16 그러나, 특별한 취급 및 관리 문화에 필요한 건강한 세포 단일 층 광학 매핑 연구를위한 전기 서성 거려. 또한, 이중 형광 염료 염색 과정은 쉽게 세포 배양 합류 단층의 무결성을 손상시킬 수있다. 따라서, 배양 HL-1 단일 층에서 수행 V의 m / CA 듀얼 채널 광학 매핑은 큰 도전이었다.

이 방법의 목적은 성공적으로 배양 HL-1 단층 듀얼 채널 광 맵핑을 수행하기위한 주요 단계를 제공하는 것이다. 여기에서 우리는 HL-1 세포 단층 준비, 배양 세포 단층의 듀얼 채널 광학 매핑 및 매핑 데이터 처리에 최적화 된 프로토콜에 대한 광범위한 정보를 제공하고 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 솔루션 준비

  1. 노르 에피네프린 (NP) 솔루션
    1. . 정제 밀리-Q (MQ) 물 25 ㎖에 30 mM의 아스코르브 산 (0.1475 g의 아스코르브 산 25 ml의에 순이익 40 mg을 녹이고 노르 에피네프린 (NP)은 민감한 빛 때문에이 솔루션을 준비하는 동안 직사광선에 노출을 피하십시오.
    2. 0.22 μm의 주사기 필터 NP 용액 필터. -20 ° C에서 1 ml의 멸균 마이크로 튜브에 솔루션 및 저장 나누어지는. 냉동 후에, NP는 한 달 동안 안정하다.
  2. 보충 세척 및 최종 Claycomb 미디어
    1. Claycomb 매체 43.5 ㎖로 시작하여 소 태아 혈청 (FBS) 5 ㎖, 페니실린 / 스트렙토 마이신을 0.5 ㎖, NP 0.5 ㎖의 1로 보충 : 최종 보충 Claycomb 배지 50 mL로 L 글루타민 희석 100. Claycomb 매체가 빛에 민감하기 때문에이 솔루션을 준비하는 동안 직사광선에 노출을 피하십시오.
    2. 한모금과 동일한 조리법을 사용하여 세척 Claycomb 매체를 준비제외 대상으로 실시 Claycomb 매체는 5 % FBS를 추가하고 NP 및 L 글루타민 요소를 생략.
      참고 : 직사광선에 노출하지 않고 4 ℃에서 저장 될 때 보충 최종 워시 Claycomb 미디어는 2 주 동안 좋다.
  3. 콩 트립신 억제 솔루션
    1. 칼슘 - 무료 및 마그네슘이없는 둘 베코의 인산염 완충 생리 식염수 100 ㎖ (PBS)로 대두 트립신 억제제의 25 mg을 녹인다.
    2. 0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터.
      참고 : 4 ° C에서 저장 될 때 멸균 솔루션은 1 개월 안정적이다.
  4. 젤라틴 / 피브로넥틴 요리 코팅 용액
    1. 0.02 % 젤라틴 있도록 MQ 물 500 ㎖ 중에 젤라틴 0.1 g을 녹이고.
    2. 오토 클레이브 후, 0.02 % 젤라틴 199 ㎖ 중에 1 ml의 피브로넥틴을 희석하고 부드럽게 혼합한다.
    3. 나누어지는 -20 ° C에서 젤라틴 별도의 튜브에 솔루션 및 저장의 6 ml의.
  5. 행크스 '소금 솔루션
    1. 파문을 사용하여판은, 염화나트륨 (136.9)의 KCl (5.366), KH 2 PO 4 (0.4409)의 NaH 2 PO 4 (0.4000), 황산 (0.8142), D-Glc를을 MQ 물 (밀리몰 / L)에 다음과 같은 염을 용해 (5.051)의 NaHCO3 (4.162), HEPES (5.042), 염화칼슘 2 (1.261).
  6. 칼슘에 민감한 염료 (Rhod2) 솔루션
    1. Rhod2는 -20 ° C에서 원액 저장을 염색 할 DMSO 20 % 플루로 닉 F-127의 400 μL에 Rhod2 건조 분말 1 mg을 희석.
    2. 실험을 시작하기 전에 최종 작업 솔루션을 만들기 위해 1000 행크스 '소금 용액이 원액 1을 희석.
  7. 전압에 민감한 염료 (Rh237) 솔루션
    1. -20 ° C에서 원액 및 저장을 할 DMSO 2 ㎖로 Rh237 5 ㎎을 희석. 실험을 시작하기 전에 최종 작업 용액을 만들기 위해 1000 행크스 식염수 : 원액 1 희석.

& #(160); 참고 : 1-4 솔루션은 약간의 수정과 Claycomb HL-1 세포 배양 프로토콜을 기반으로합니다.

2.과 Passaging 및 배양 HL-1 심방 근육 세포 Coverslips는 상

참고 : HL-1 세포 박사 Claycomb (루이지애나 주립 대학)에서 얻을 수 있습니다.

  1. T25 플라스크에 HL-1 세포 성장과 매일 보충 Claycomb 중간의 5 ml로 공급. 통로는 T25에서 세포 Claycomb HL-1 세포 배양 프로토콜 (후술) (10)에있어서 5 일마다 형틀.
  2. 24 시간 T25 플라스크에서 세포 전에 12-well 배양 판에 장소 라운드 된 커버 (20mm 직경) 계대 배양 한 다음 37 ℃에서 하룻밤 젤라틴 / 피브로넥틴로 된 커버를 커버 할 완전히 합류와 준비가되어 있습니다.
  3. 다음 날, 기음과 문화 판에서 젤라틴 / 피브로넥틴을 취소하고 잘 각각 보충 최종 Claycomb 매체의 1.5 ml로 교체합니다.
  4. T25의이 배양에서 분할 세포대기음이 합류 문화를 포함하는 T25 플라스크 매체는 37 ° C에서 PBS 짧게 문화를 씻어 하루 5에서 전체 합류에 도달 한 후 전자 플라스크.
  5. PBS 및 기음 셀과 직접 접촉을 피하기 위해 T25 플라스크의 바닥에 트립신 / EDTA를 피펫 팅하여 37 ° C에서 3 ml의 0.05 % 트립신 / EDTA를 추가한다. 1 분 동안 37 ° C에서 품어.
  6. 흡인에 의해 트립신 / EDTA를 제거하고 T25 플라스크 당 다른 트립신의 1.3 ㎖ / EDTA를 추가합니다. 1 분 동안 실온에서 배양한다. 현미경으로 검사하고 세포가 여전히 플라스크에 부착하는 경우, 완전히 남아있는 세포를 이동시키다 누릅니다.
  7. 15 ㎖의 원심 분리 관으로 플라스크에서 세포와 세포를 전송에 대두 트립신 억제제의 1.3 ML을 추가합니다. 워시 Claycomb 매체의 5 mL를 빈 플라스크를 씻어. 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 세포에 린스를 추가합니다. 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기.
  8. 조심스럽게 뜨는을 기음과 원심 분리 한 후 세포 펠렛을 다시 중단보충 최종 Claycomb 배지 6 ㎖ 중의.
  9. 세포 계대의 세포 현탁액 0.5 ml로 12- 웰 플레이트의 각 웰을 시드. 매일 신선한 보충 최종 Claycomb 매체와 세포를 공급.
    주 : 밀접 세포의 성장을 모니터링 전형적 세포 단층을 4 일째에 합류 상태에 도달하고 자발적인 활동이 계속 표시. 이후, 배양 된 단층은 하루 4-5 광학 매핑을위한 준비가 될 것입니다.

셀 3.로드 칼슘 및 전압에 민감한 염료

  1. 광학적 맵핑 연구 부드럽게 12 웰 세포 배양 플레이트로부터 커버 슬립을 제거하고 행크스 식염수로 세정.
  2. 칼슘 민감성 염료 Rhod2으로 세포를 염색하기 위해, 3 ㎖와 커버 슬립에서 세포 단층을 부화 산소를 30 분 동안 수욕에서 37 ° C에서 Rhod2 작업 용액 (5 % CO 2 / 95 % O 2 가스로 버블 링) .
  3. V m에 민감한 염료와 세포를 얼룩Rh237는 또 다른 15 분 동안 수조에서 37 ° C에서 산소화 Rh237 작업 용액 3 ㎖에 Rhod2로드 셀 단층 몰입.

4. 듀얼 채널 광학 매핑

  1. 거꾸로 형광 현미경에 순환 챔버로, V의 m과 칼슘 염료로 두 번 스테인드 세포 단층을 놓습니다. 35 ± 1 ℃에서 셀 챔버의 온도를 유지하기 위해 가열 된 순환 시스템을 사용한다. 챔버에 걸쳐 조심스럽게 0.3 ° C의 구배를 방지하기 위해 상기 챔버를 통해 순환하는 흐름의 속도를 조절하여 관류 액의 온도를 제어한다.
    1. V의 m / CA 신호를 기록하기 전에, 이전의 염색 공정에서 잔존 염료를 제거하기 위해 약 5 분 동안 신선한 행크스 용액으로 세포 단층을 세척한다.
  2. 행크스 염 용액과 SILV 가득 유리 피펫으로 이루어지는 쌍극 전극을 이용하여 페이스 건강한 세포 단층어 이전으로 피펫 팁 주위 코일 와이어 12,17 설명했다.
  3. 약 1 MV를 서성 거려 임계 값을 기대 2 밀리의 200 ~ 500 밀리 초 펄스 폭의 사이클 길이의 페이스 건강한 세포 단일 층.
    주 : 단층 배양의 각 배치에 대해 적어도 2 개의 비 처리 된 단층은 셀 배치의 조건을 검사하는 데 사용되어야한다. 건강한 제어 단일 층은 200 ~ 500 밀리의주기 길이에 전기 페이싱에 의해 포착 할 수 있어야합니다. 제어 단층 전기적으로 진행되어야하지 않으면,이 셀 전체 일괄 광학적 맵핑 실험에 적합하지 않을 수 있다는 것을 시사한다.
  4. V의 m 및 CA 민감한 염료 모두를 여기 시키는데, 여기 필터 (파장 510 ㎚ / 40) 및 다이크로 익 미러 (561 ㎚)과 결합 된 LED 광원 (520 nm 파장)를 사용한다.
    1. V m을 구성 요소로 다이크로 익 미러 (594 ㎚)과 칼슘 성분과 40X 목표 및 분할을 통해 세포에 의해 방출되는 형광 신호를 수집합니다.대역 통과 필터와 칼슘 채널에서 긴 통과 필터 (700 ㎚) 및 출사 광 V의 m 채널에서 방출 된 광을 필터 (40분의 585 ㎚).
    2. 두 개의 CCD 카메라 (; RedShirt 이미지 80 X 80 픽셀, 1000 FPS)를 사용하여 필터링 된 형광 빛을 수집합니다.
    3. 염료 광표백을 방지하기 위해, 노광 시간을 제한하기 위해 각 시야마다에 2 초 미만에 대한 기록을 만든다. 여기에, 일반적으로 이미지를 각각의 단층에 대 한 4 개의 서로 다른 영역.

V m 또는 칼슘 녹음 5. 데이터 처리

  1. 모두 V의 m 및 CA 신호 (80 X 80 픽셀)의 경우, 배경 잡음을 줄이기 위해 다른 기록 시점에서 1 휘도 값으로 강도 스물 다섯 (5 × 5)의 값이 인접한 화소의 평균.
    주 : 데이터를 평균화 한 후, 개별 활동 전위 또는 CA 과도의 각 기록 시점 평균화 × 16 16 강도 값들을 평균화 포함하는 데이터 매트릭스 (수득50 ㎛의 공간 해상도와 데이터 채널).
  2. V m의 기록 또는 CA 신호의 활성화 시간 (AT)를 정의.
    1. 전술 한 바와 같이 개별 활동 전위 또는 CA 과도의 활성화 시간 (AT)를 정의하기 위해, V의 m 또는 주문품 MATLAB 기반 알고리즘을 사용하여 칼슘 신호의 피크 진폭의 50 %의 시간을 결정한다. (12)
    2. 수동으로 프로그램 분석 중 발생할 수있는 오류를 제거하기 위해 분석의 AT를 교정.
    3. 행렬에서 정의 저장소 사용되는 소프트웨어에 각각 기록 된 활동 전위 칼슘 과도의 (16 × 16 데이터 채널 평균).
  3. 이전에 약간의 수정과 함께 설명 된 바와 같이 12, 18, ​​20, 22 필드 벡터 분석 방법을 사용하여 AT 행렬에 활동 전위 또는 칼슘 과도 전도 속도 (CV) 벡터를 계산한다.
    1. (5 × 데이터를 그 지점에서 주변에 데이터 채널의 상대적인 CV 벡터를 계산; 도 5는 이웃 MATLAB 프로그램 (12, 18) 내에서 최소 제곱 알고리즘을 이용하여) 표면 AT 활성화 시간 (다항식의 매끄러운 표면을 시뮬레이션하기 위해) 데이터 채널을 평균화.
    2. 아래의 수식을 사용하여 전도 벡터를 계산
      포뮬러 1 :
      식 (1)
      화학식 2 :
      θ θ를 (DY / dT를) / (DX / dT를)]
      주 : Ve로는 X 축 및 Y 축에 투영 CV 벡터이고; DX / dT를는 X 축에 CV 벡터의 투영이고; DY / dT를는 Y 축에 CV 벡터의 투영이다. T는 AT면이고; X, Y 좌표의 2-D 참조; X = T ∂T / ∂x는 X에 대해 T의 편미분이고; T의 Y = ∂T / ∂y는 Y에 대하여 T의 편미분이고; CV θ는 벡터의 최종 방향이다.
    3. 나침반에 10도 섹터를 커버 각각 36 경로,에 AT 행렬의 그룹 모든 벡터. </ 리>
    4. (36) 전도 경로 중 CV 벡터의 최대의 인구를 포함하는 경로를 선택합니다. 단일 층의 CV를 나타 내기 위해이 경로의 평균 CV를 계산합니다.

웨이브 프론트 전파 6. 시각화

  1. MATLAB 소프트웨어를 사용하여 피크 값에 대해 상이한 기록 된 시점에서 각각의 활동 전위 또는 CA 과도의 신호 강도를 정규화한다.
  2. 일시적 사용 MATLAB 소프트웨어의 16 × 16 매트릭스의 강도에 기록 된 모든 시점의 정규화 된 강도 데이터를 저장한다.
  3. surf.m 기능을 사용하여 각 기록 시점의 저장 강도 매트릭스에서 색상 코딩 된 강도 맵을 구축합니다.
    참고 : 강도지도에서 빨간색 V m 또는 칼슘 신호의 높은 강도를 나타내며, 파란색 형광 신호의 낮은 강도를 반영한다.
  4. avifile.m 기능을 사용하여 .avi 파일을 만듭니다.
  5. 모든 I 절감addframe.m 함수를 사용하여 활동 전위 또는 CA 과도 상이한 기록 시점에서지도 ntensity.
    주 :이 시점에서, V의 m 및 CA 전파 개의 분리 AVI 파일이 생성 될 것이다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

영화 1에서 입증 된 바와 같이 배양 합류 단층는 일반 고유 리듬을 나타낸다. 우리는 다음 완전히 합류 HL-1 단층에서 V의 m / CA 듀얼 채널 광학 매핑을 수행 하였다. 그림 1a는 기록 하나에서 V의 m과 칼슘 신호의 예 흔적을 보여줍니다 이길. 균일하게 전파 V의 m 및 듀얼 채널 광 매핑 시스템을 이용하여 칼슘 신호의 대표적인 등시성지도는도 1b 및도 1c에 도시되어있다. 균일 활동 전위 전파 및 CA 과도의 대표적인 이미지는 연대순 동일한 HL-1 단층 배양에서 얻었다. 마지막으로, 영화 2와 3은 HL-1 융합 단층에 균일하게 전파 활동 전위 (영화 2) 칼슘 과도 (동영상 3)의 애니메이션 예를 제공합니다.

-page = "항상"> 그림 1
그림 1 : (A) 500 밀리의 사이클 길이 (CL)에 전기적 속도로 비트에서 V의 m (파란색)과 칼슘 (빨간색)의 예 추적. (B) HL-1 단일 층에 대한 우리의 광학 매핑 시스템의 이미지입니다. (C) 전체 비전 분야에 걸쳐 같은 속도로 비트에서 활동 전위의 전파 등시의지도. (D) 비전 분야에 걸쳐 같은 속도로 비트에서 칼슘 과도 전파 등시의지도. 모두 등시의지도에서, 시간 경과 50 밀리 초에서 시작과 어두운 붉은 어두운 파란색으로 시작, 색상으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

/52542/52542fig2highres.jpg "/>
그림 2 : (A)의 60 V의 m 분포지도 시리즈, 80, 140, 및 기록의 시작 후 200 밀리. (B)는 60 ℃에서의 칼슘 분포지도, 80, 140, 및 기록의 시작 후 200 밀리.

영화 1 : 40X의 목적으로 광학 현미경, 문화의 날 5시에 합류 HL-1 단일 층에서 기록 된 대표적인 영화.

영화 2 : 500 밀리의 CL의 속도로 비트에서 전파 활동 전위의 대표 영화.

영화 3 : PAC에서 전파 된 칼슘 과도의 대표적인 영화ED는 500 밀리의 CL에서 이겼다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 문서에서는 칼슘 및 전압에 민감한 형광 염료로 염색 배양 HL-1 심방의 심근 세포 단일 층에 광학 매핑의 주요 측면에 대해 설명합니다. 또한, 최적의 HL-1 세포 단층, 매핑 장치의 설정을 배양하는 배양 된 단층을 매핑 및 데이터 분석을 포함한다.

성공적으로 배양 된 세포를 매핑, 키는 균일하게 분포 된 세포 단층을 제조하는 공정이다. 커버 슬립에의 세포를 파종 할 때, 균일하게 세포를 분산해야합니다. 이 가장 전기 페이싱에 응답으로 항상 완벽하게 성장하고 완전하게 융합 세포 단일 층을 매핑합니다. 이는 염료를로드하는 동안 산소 세포를 유지하는 것도 중요하지만, 산소 버블이 죽이거나 커버 슬립에서 그들을시키다 수 있으므로 셀과 직접 접촉해서는 안된다. 염료 concentrati을 증가시키면서, 염료 농도를 낮추고 신호 크기를 감소시키고 신호 대 잡음 비율을 감소시킬 것이다 광 강도를 감소온 신호 크기를 증가시킬뿐만 아니라, 소음을 증가 광 강도를 강화. 이 때문에, 형광 염료의 농도 및 여기 광 강도의 균형이 최적의 기록 신호의 신호 대 잡음 비를 향상시키기 위해 결정되어야한다. 이 빛에 노출 지역에서 광역 세포 손상의 원인이 될 수 또한, 광학 매핑을 촬영하는 동안 진한 빛의 장시간 노출로 세포 단층에 노출되지 않도록해야합니다. 마지막으로 기록 된 신호의 높은 공간적 해상도를 제공 광학 매핑 시스템은 고품질의 데이터를 얻기 위해 필요하다.

그대로 하트 듀얼 채널 광 매핑 인해 동시 콜렉트 전압 및 칼슘 신호하는 능력에 심장 전기 생리학 연구를위한 큰 잠재력을 가지고 있지만, 하나의 제한은이 기술은 2-D 투사 맵으로 3-D 표면으로부터 정보를 수집하는 것이다. 3-D의 curvat의 정보를 그대로 무시 마음에서 얻어진 2-D 데이터데이터가 특히 전도 속도의 분석, 분석에 마음의 올바 오류가 발생할 수 있습니다. 배양 2-D의 HL-1 세포 모델을 사용의 이점과 함께, 우리는 (균일하거나 비를, 정규 및 비정규 리듬을 시각화 칼슘 과도 활동 전위 동력학을 평가 전도 속도를 결정하고, 캘리포니아 및 활동 전위 전파 패턴을 특성화 할 수있다 그대로 심장의 3-D 구조로부터 간섭없이 균일 전파). 따라서 성공적으로 무료 방법으로 배양 된 HL-1 심방의 심근 세포 단일 층에 칼슘 과도 및 활동 전위를 모두 매핑 크게 심방 근육 세포의 전기 생리 특성 및 심방 arrhythmogenesis의 기본 메커니즘의 이해를 향상시킬 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

우리는 HL-1 세포 및 세부 유지 보수 프로토콜을 제공하기 위해 박사 Claycomb에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 우리의 듀얼 채널 광학 매핑 시스템에 대한 몇 가지 액세서리를 만드는 그의 도움을 셀 영화 씨와 피트 카론를 생성하는 그들의 도움 씨 엘레나 카리 박사 세스 Robia에게 감사의 말씀을 전합니다.

이 작품은 (XA에 10GRNT3770030 & 12GRNT12050478) 미국 심장 협회 (American Heart Association), 국립 보건원 (XA에 HL113640) 및 (XA에) 로욜라 대학 연​​구 개발 기금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhod2 dry powder AAT Bioquest 21062
pluronic AAT Bioquest 20050
DMSO Sigma 276855
Rh237 Invitrogen S-1109
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P3911
KH2PO4 Sigma P0662
NaH2PO4 Sigma S9638
MgSO4 Sigma M7506
D-Glucose Sigma G8270
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
HEPEs Sigma H3375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, (1), 21-33 (2004).
  2. Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor ... [et al.]. 12, (Unit 12 17), (2009).
  3. Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, (5), H2053-H2060 (2001).
  4. Fast, V. G. Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium. J Electrocardiol. 38, (4 Suppl), 107-112 (2005).
  5. Sowell, B., Fast, V. G. Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium. Heart Rhythm. 9, (1), 96-104 (2012).
  6. Fast, V. G., Kleber, A. G. Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes. Circ Res. 73, (5), 914-925 (1993).
  7. Hou, L., et al. A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer. Circ Res. 107, (12), 1503-1511 (2010).
  8. Beauchamp, P., et al. Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes. Circ Res. 99, (11), 1216-1224 (2006).
  9. Xia, M., et al. Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells. J Mol Cell Cardiol. 36, (1), 111-119 (2004).
  10. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (6), 2979-2984 (1998).
  11. Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells. J Mol Cell Cardiol. 45, (5), 642-649 (2008).
  12. Yan, J., et al. c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias. Cardiovasc Res. 97, (3), 589-597 (2013).
  13. White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286, (3), H823-H829 (2004).
  14. Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes. J Mol Cell Cardiol. 38, (2), 299-308 (2005).
  15. Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 62, (3), 521-528 (2004).
  16. Umapathy, K., et al. Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model. Heart Rhythm. 5, (7), 1029-1035 (2008).
  17. Fast, V. G., Cheek, E. R. Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures. Circ Res. 90, (6), 664-670 (2002).
  18. Bayly, P. V., et al. Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data. IEEE Trans Biomed Eng. 45, (5), 563-571 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics