Tensión y calcio Dual Channel Mapping óptico de Cultivadas HL-1 auricular miocitos monocapa

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Biology

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Yan, J., Thomson, J. K., Zhao, W., Fast, V. G., Ye, T., Ai, X. Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer. J. Vis. Exp. (97), e52542, doi:10.3791/52542 (2015).

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Abstract

Mapeo óptico ha demostrado ser una técnica valiosa para detectar la actividad eléctrica cardiaca tanto intacto ex vivo corazones y en monocapas de miocitos en cultivo. Células HL-1 han sido ampliamente utilizado como un modelo celular 2-Dimensional para el estudio de diversos aspectos de la fisiología cardiaca. Sin embargo, ha sido un gran reto al mapa ópticamente calcio (Ca) los transitorios y los potenciales de acción simultáneamente desde el mismo campo de visión en una culta HL-1 monocapa celular auricular. Esto se debe a que se requiere un manejo y cuidado especial para preparar las células sanas que se pueden capturar eléctricamente y mapeados ópticamente. Por lo tanto, hemos desarrollado un protocolo de trabajo óptimo para el mapeo óptico de doble canal. En este manuscrito, que hemos descrito en detalle cómo realizar el experimento de doble canal mapeo óptico. Este protocolo es una herramienta útil para mejorar la comprensión de la acción potencial de propagación y la cinética de Ca en el desarrollo de arritmias.

Introduction

Una calcio único (Ca) y la tensión (V m) técnica de mapeo óptico de doble canal 5.1 se está convirtiendo en una herramienta eficaz para registrar simultáneamente señales V m y Ca en ambos corazones intactos y monocapas de células cultivadas. Esta técnica hace posible la obtención de información de gran alcance respecto a la relación entre los transitorios de calcio y los potenciales de acción de entender mejor los mecanismos subyacentes electrofisiológicas de las arritmias cardiacas.

Monocapas de células cultivadas han demostrado ser un modelo celular útil para estudiar la electrofisiología cardiaca y el mecanismo subyacente de las arritmias. 4,6-8 HL-1 células son una línea de cultivo de miocitos fibrilación bien caracterizado. Células HL-1 también mantienen un genotipo y el fenotipo diferenciado de forma única que incluye morfológica, electrofisiológico, y las características farmacológicas de los miocitos auriculares adultos. Estas células expresan genes y proteínas cardíacas, incluyendo important canales iónicos cardíacos (es decir, L y los canales de calcio tipo T) 9 y isoformas maduras de las proteínas contráctiles del sarcómero se encuentran normalmente en miocitos auriculares adultos como los demás y nos han informado anteriormente. 10-13 Además, las células HL-1 pueden ser cultivan para formar un 2-dimensional (2-D) monocapa de miocitos. Por lo tanto, las ventajas de utilizar cultivadas monocapas HL-1 incluyen: 1) el costo relativamente más bajo y más fácil de mantener una línea de cultivo de los miocitos de aislamiento y cultivo de miocitos neonatales primarios; 2) una monocapa confluente de células reduce las complejidades estructurales que resultan de la estructura 3-D del corazón; 3) una monocapa celular se puede eliminar la interferencia de la fibrosis intersticial que se produce en el corazón intacto. Esto se puede utilizar para diseccionar funciones electrofisiológicas específicas de un grupo de miocitos sin interferencia de los fibroblastos y la matriz intersticial; 4) evaluación de las consecuencias funcionales de la manipulación farmacológica o genética en culmonocapas de células radas se pueden lograr con eficacia. Por lo tanto, las células HL-1 se han convertido en un modelo celular ampliamente utilizado para el estudio de diversos aspectos de la fisiología de los miocitos, así como actividades eléctricas anormales inducidos por estimulación. 13-16 Sin embargo, se requiere un manejo y cuidado especial a la cultura monocapas de células sanas que responden al exterior estimulación eléctrica para los estudios de mapeo óptico. Además, la doble procedimiento de tinción de colorante fluorescente puede dañar fácilmente la integridad de las monocapas de células confluentes cultivadas. Por lo tanto, la realización de V m / CA mapeo óptico de doble canal en cultivos de HL-1 monocapas ha sido un gran reto.

El objetivo de este método es proporcionar los pasos clave para llevar a cabo con éxito mapeo óptico de doble canal en cultivos de HL-1 monocapas. Aquí hemos proporcionado amplios detalles sobre un protocolo optimizado para la preparación monocapa-1 HL celular, mapeo óptico de doble canal de una monocapa de células cultivadas, y procesamiento de datos de mapas.

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Protocol

1. Preparación de la solución

  1. La norepinefrina solución (NP)
    1. Disolver 40 mg de NP en 25 ml de 30 mM de ácido ascórbico (0,1475 g de ácido ascórbico en 25 ml de Milli-Q (MQ) agua purificada. Evitar exposición a la luz directa durante esta preparación de la solución debido a la norepinefrina (NP) es sensible a la luz.
    2. Filtrar la solución NP con un filtro de jeringa de 0,22 micras. Alícuota de la solución en 1 ml microtubos estériles y se almacena a -20 ° C. Una vez congelado, NP es estable durante un mes.
  2. Suplementado Lave y Final Claycomb
    1. Iniciar con 43,5 ml de medio de Claycomb y complementar con 5 ml de suero bovino fetal (FBS), 0,5 ml de penicilina / estreptomicina, 0,5 ml de NP y 1: 100 diluido L-Glutamina para hacer 50 ml de medio complementado Claycomb final. Evitar exposición a la luz directa durante esta preparación solución porque medio Claycomb es sensible a la luz.
    2. Preparar el medio de lavado Claycomb usando la misma receta que el supmedio complementado Claycomb excepto agregar 5% de SFB y omitir el NP y los componentes de L-glutamina.
      NOTA: Los medios de comunicación Final y Wash Claycomb complementado son buenos para dos semanas cuando se almacena a 4 ° C, sin exposición a la luz directa.
  3. Soja solución inhibidora de tripsina
    1. Disolver 25 mg de inhibidor de tripsina de soja en 100 ml de Ca-Mg-libre y libre de salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS).
    2. Filtrar la solución usando un filtro de jeringa de 0,22 micras.
      NOTA: La solución esterilizada es estable durante un mes si se almacena a 4 ° C.
  4. Solución de revestimiento plato de gelatina / fibronectina
    1. Disolver 0,1 g de gelatina en 500 ml de agua MQ para hacer 0,02% de gelatina.
    2. Autoclave, luego diluir 1 ml de fibronectina en 199 ml de 0,02% de gelatina y mezclar suavemente.
    3. Alícuota 6 ml de solución de gelatina en tubos separados y almacenar a -20 ° C.
  5. La solución salina de Hanks
    1. Usando un gran revueloplaca, disolver las siguientes sales en agua MQ (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5.366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0,4000), MgSO4 (0,8142), D-Glc (5.051), NaHCO3 (4.162), HEPES (5.042), CaCl 2 (1.261).
  6. Tinte sensible al calcio solución (Rhod2)
    1. Diluir 1 mg de polvo seco Rhod2 en 400 l de 20% de Pluronic F-127 en DMSO para hacer una Rhod2 tinte solución madre y se almacena a -20 ° C.
    2. Diluir esta solución madre 1: 1000 con una solución salina de Hanks para hacer una solución de trabajo final antes de iniciar el experimento.
  7. Voltaje colorante sensible solución (Rh237)
    1. Diluir 5 mg de Rh237 con 2 ml de DMSO para hacer la solución madre y se almacena a -20 ° C. Diluir la solución madre de 1: 1000 con una solución salina de Hanks para hacer una solución de trabajo final antes de iniciar el experimento.

& #160; NOTA: 1-4 soluciones se basan en el HL-1 protocolo de cultivo celular Claycomb con modificación menor.

2. pases y cultivo HL-1 auricular miocitos en cubreobjetos

NOTA: Las células HL-1 se pueden obtener del Dr. Claycomb (Louisiana State University).

  1. Se cultivan las células HL-1 en frascos T25 y alimentar con 5 ml de complementado Claycomb Medio diarias. Passage las células en matraces T25 cada cinco días de acuerdo con la HL-1 protocolo de cultivo celular Claycomb (descrito a continuación) 10.
  2. Cubreobjetos redondos de lugares (20 mm de diámetro) en placas de cultivo de 12 pocillos 24 h antes de las células en el matraz T25 son completamente confluente y listo para ser passaged, y luego cubrir los cubreobjetos con gelatina / fibronectina durante la noche a 37 ° C.
  3. Al día siguiente, aspirado y desechar la gelatina / fibronectina de las placas de cultivo y reemplazar con 1,5 ml de medio final Claycomb complementado en cada pocillo.
  4. Dividir celdas de una cultur T25e frasco después de alcanzar plena confluencia en el día 5. Aspirar el medio del matraz T25 que contiene el cultivo confluente y enjuague la cultura brevemente con PBS a 37 ° C.
  5. Aspirar PBS y añadir 3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA a 37 ° C pipeteando la tripsina / EDTA en el fondo del matraz T25 para evitar el contacto directo con las células. Incubar a 37 ° C durante 1 min.
  6. Eliminar tripsina / EDTA por aspiración y añadir otro 1,3 ml de tripsina / EDTA por matraz T25. Incubar a temperatura ambiente durante 1 min. Examinar al microscopio y si las células todavía se atan al matraz, toque para desalojar completamente las células restantes.
  7. Añadir 1,3 ml de inhibidor de tripsina de soja a las células y las células de transferencia desde el matraz a un tubo de centrífuga de 15 ml. Lavar el recipiente vacío con 5 ml de medio de lavado Claycomb. Añadir el enjuague a las células en el tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar a 500 xg durante 5 min.
  8. Después de centrifugar, aspirar el sobrenadante y suavemente volver a suspender el sedimento celularen 6 ml de medio final Claycomb suplementado.
  9. Semillas cada pocillo de una placa de 12 pocillos con 0,5 ml de suspensión de células de los pases de células. Alimentar a las células con medio suplementado fresco final Claycomb diaria.
    NOTA: Vigilar de cerca el crecimiento de las células, por lo general las monocapas de células alcanzan el estado de confluencia en el día 4 y las actividades espontáneas siguen siendo visibles. Entonces, la monocapa se cultivan estará listo para el mapeo óptico en días 4-5.

3. Carga de calcio y de tensión tintes sensibles a las células

  1. Para los estudios de mapeo óptico, retire suavemente el cubreobjetos de la placa de cultivo celular de 12 pocillos y enjuague con una solución de sal de Hanks.
  2. Para teñir las células con colorante sensible al Ca Rhod2, incubar la monocapa celular en el cubreobjetos con 3 ml de la oxigenada (burbujeo con 5% de CO 2/95% O 2 gas) solución de trabajo Rhod2 a 37 ° C en un baño de agua durante 30 min .
  3. Para la tinción de las células con V m colorante sensibleRh237, sumerja la monocapa celular cargado Rhod2 en 3 ml de solución de trabajo Rh237 oxigenada a 37 ° C en un baño de agua durante otros 15 minutos.

Mapeo 4. Canal de Óptica Doble

  1. Coloque la monocapa celular, que es de doble teñido con colorantes V m y Ca, en una cámara de circulación en un microscopio de fluorescencia invertida. Utilice un sistema de circulación se calienta para mantener la temperatura de la cámara de la celda a 35 ± 1 ° C. Controlar cuidadosamente la temperatura del líquido de perfusión mediante el ajuste de la velocidad del flujo que circula a través de la cámara para evitar un gradiente de más de 0,3 ° C a través de la cámara.
    1. Antes de grabar V m / señales de Ca, lavar la monocapa de células con solución de Hanks fresco durante aproximadamente 5 minutos para eliminar el colorante restante de los pasos de tinción anteriores.
  2. Pace monocapas de células saludables utilizando un electrodo bipolar integrado por una pipeta de vidrio lleno de solución de sal de Hanks y silver alambre enrollado alrededor de la punta de la pipeta a lo descrito previamente 12,17.
  3. Pace monocapas de células sanas en una longitud de ciclo de 200 a 500 ms y ancho de pulso de 2 ms, contar con un umbral de estimulación en aproximadamente 1 mV.
    NOTA: Para cada lote de monocapas cultivadas, al menos dos monocapas no tratadas deben ser utilizados para probar la condición del lote celular. Monocapas de control sanos deben ser capaces de ser capturado por la estimulación eléctrica en la duración de los ciclos de 200 a 500 ms. Si las monocapas control fallan a ritmo eléctricamente, esto sugiere que todo el lote de células puede no ser adecuado para los experimentos de mapeo óptico.
  4. Para excitar tanto V m y Ca colorantes sensibles, utilizar una fuente de luz LED (520 nm longitud de onda) junto con un filtro de excitación (510 nm / 40) y un espejo dicroico (561 nm).
    1. Recoger las señales fluorescentes emitidas por las células a través de un objetivo de 40X y se dividió con un espejo dicroico (594 nm) en un componente V m y un componente de Ca.Se filtra la luz emitida en el canal V m con un filtro de pase largo (700 nm) y la luz emitida en el canal de Ca con un filtro de paso de banda (585/40 nm).
    2. Recoge la luz fluorescente filtrada utilizando dos cámaras CCD (80 x 80 píxeles, 1.000 fps; redshirt Imaging).
    3. Para evitar colorante photobleaching, hacer grabaciones durante menos de 2 segundos en cada campo de visión para limitar el tiempo de exposición a la luz. Aquí, típicamente imagen cuatro áreas diferentes para cada monocapa.

5. Proceso de Datos de V mo Ca Grabaciones

  1. Por tanto V señales de Ca (80 x 80 píxeles) m, y el promedio de los valores de intensidad de veinticinco (5 x 5) píxeles vecinos en un valor de intensidad en diferentes puntos de tiempo de grabación para reducir el ruido de fondo.
    NOTA: Después de que el promedio de datos, cada punto de tiempo de grabación de un potencial de acción individual o Ca transitoria produce una matriz de datos que contiene 16 x 16 promediaron los valores de intensidad (promediadocanales de datos) con una resolución espacial de 50 m.
  2. Definir el tiempo de activación (AT) de las señales de Ca registrado V mo.
    1. Para definir un tiempo de activación (AT) de un potencial de acción individual o Ca transitoria, determinar el tiempo de 50% de amplitud de pico de las señales de CA mediante un algoritmo basado en MATLAB a medida V m o como se describe anteriormente. 12
    2. Corregir manualmente el AT analizados para eliminar cualquier error que pueda ocurrir durante el análisis del programa.
    3. La Web de los definidos en la MATRIZ (16 x 16 promediaron canales de datos) del potencial de acción grabado y transitorios de calcio, respectivamente, en el software utilizado.
  3. Calcule el potencial de acción o transitorios de velocidad de conducción (CV) vectores de calcio en la matriz AT utilizando el método de análisis de campo de vectores como se ha descrito anteriormente, con modificaciones menores 12,18.
    1. Calcular el vector de CV de un canal de datos en relación con su entorno en los puntos de datos (5 ×; 5 vecina promedió canales de datos) para simular una superficie lisa polinomio de tiempos de activación (en la superficie) utilizando un algoritmo de mínimos cuadrados dentro del programa MATLAB 12,18.
    2. Calcular la conducción vector usando las siguientes fórmulas
      Fórmula 1:
      Ecuación 1
      Fórmula 2:
      θ = arctan [(dy / dt) / (dx / dt)]
      NOTA: Ve es un vector CV proyectado en xey ejes; dx / dt es la proyección del vector CV en el eje x; dy / dt es la proyección del vector CV en el eje y. T es la superficie AT; x, y se refieren a la 2-D coordenadas; T x = ∂T / ∂x es la derivada parcial de T con respecto a x; T y = ∂T / ∂y es la derivada parcial de T con respecto a Y; θ es la dirección final de un vector de CV.
    3. Grupo todos los vectores de la matriz AT en 36 vías, cada una de las cuales cubre un sector de diez grados en la brújula. </ Li>
    4. Seleccione la ruta que contiene la mayor población de los vectores de CV entre las 36 vías de conducción. Calcular el promedio de CV de esta vía para representar el CV de la monocapa.

6. Visualización de la Propagación de la onda frontal

  1. Normalizar la intensidad de señal de un potencial de acción individual o Ca transitoria en diferentes puntos de tiempo de grabación con respecto a su valor de pico utilizando el software MATLAB.
  2. Almacenar temporalmente los datos de intensidad normalizados de cada punto de tiempo grabado en una matriz de intensidad de 16 x 16 en el software MATLAB utilizado.
  3. Construir un mapa de intensidad con código de color de la matriz de intensidad almacenada de cada punto de tiempo de grabación utilizando la función surf.m.
    NOTA: En el mapa de intensidad, el rojo representa alta intensidad de las señales de Ca V mo, y azul refleja baja intensidad de las señales de fluorescencia.
  4. Crear un archivo .avi mediante la función avifile.m.
  5. Guarde toda la imapas ntensity en diferentes puntos de tiempo de grabación del potencial de acción o Ca transitoria mediante la función addframe.m.
    NOTA: En este punto, se generarán dos archivos avi separadas de V m y propagación Ca.

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Representative Results

Una monocapa confluente culta presenta un ritmo intrínseco regular como se demuestra en la película 1. A continuación realizó V m dual mapeo óptico canal / Ca en una totalmente confluente HL-1 monocapa. Figura 1A muestra un ejemplo de los rastros de las señales V Ca my de un grabado único superar. Mapas isócronos representativos de las señales de Ca utilizando el sistema de mapeo óptico de doble canal propagado uniformemente V m y se muestran en las figuras 1B y 1C. Cronológicos imágenes representativas de los potenciales de acción se propagan uniformemente y transitorios de Ca se obtuvieron de la misma HL-1 cultivo en monocapa. Por último, Películas 2 y 3 son ejemplos de animación de un potencial de acción se propaga de manera uniforme (Película 2) y transitorios de calcio (Movie 3) en la HL-1 monocapa confluente.

-página = "always"> Figura 1
Figura 1: (A) Ejemplos de restos de V m (azul) y Ca (rojo) de un latido eléctricamente estimulado en una longitud de ciclo (CL) de 500 mseg. (B) Una imagen de nuestro sistema de mapeo óptico para HL-1 monocapas. (C) Un Mapa isócrono de potencial de acción de propagación desde el mismo ritmo de ritmo a lo largo de todo el campo de visión. (D) Un Mapa isócrono de Ca propagación transitoria de la misma latido de marcapasos en todo el campo de visión. En ambos mapas isócronos, lapso de tiempo se representa con los colores, comenzando con el azul oscuro como la iniciación y de color rojo oscuro en 50 ms. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: (A) Una serie de mapas de distribución m V a 60, 80, 140 y 200 ms después del inicio de la grabación. (B) los mapas de distribución de CA en 60, 80, 140 y 200 ms después del inicio de la grabación.

Película 1: Una película representante grabado desde un confluente HL-1 monocapa a día de cultivo cinco, bajo un microscopio óptico con un objetivo de 40X.

Película 2 : Una película representante de un potencial de acción propagado de un latido del ritmo en un CL de 500 ms.

Movie 3 : Una película representativa de un transitorio Ca propagado de un paced venció a una CL de 500 ms.

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Discussion

Este artículo describe los aspectos clave de mapeo óptico en una culta HL-1 miocitos auricular monocapa teñido con calcio y tensión tintes fluorescentes sensibles. Incluye el cultivo de una óptima HL-1 monocapa celular, la configuración de los equipos de la cartografía, la cartografía de una monocapa cultivadas, y el análisis de datos.

Para asignar con éxito células cultivadas, la clave es preparar una monocapa de células uniformemente distribuida. Cuando la siembra de las células en los cubreobjetos, asegúrese de dispersar uniformemente las células. Siempre mapa monocapas celulares totalmente crecido y completamente confluentes, ya que estos serán mejor responder a la estimulación eléctrica. También es importante para mantener las células oxigenados durante la carga de los tintes, pero las burbujas de oxígeno no debe entrar en contacto directo con las células ya que esto puede causar la muerte o desalojarlos del cubreobjetos. La reducción de la concentración de colorante y la reducción de intensidad de la luz disminuirá magnitud de la señal y reducir la relación señal a ruido, mientras que el aumento de tinte concentratiy la mejora en la intensidad de la luz aumentará magnitud de la señal, sino también aumentar el ruido. Por lo tanto, un equilibrio óptimo de concentración de colorante fluorescente y la fuerza de luz de excitación debe ser determinada para mejorar la relación señal-ruido de las señales de grabación. Por otra parte, durante la grabación de mapeo óptico, asegúrese de evitar la exposición de la monocapa celular a largas exposiciones de luz concentrada, ya que puede causar daño celular fotodinámica en el área de la luz expuesta. Finalmente, se requiere un sistema de cartografía óptica que proporciona una alta resolución temporal y espacial de señales de grabación para la obtención de datos de alta calidad.

Mientras mapeo óptico de doble canal en los corazones intactos tiene un gran potencial para el estudio de electrofisiología cardiaca debido a su capacidad para señales de tensión y de calcio cobro revertido simultáneas, una limitación es que esta técnica recoge la información de una superficie 3-D como un mapa de proyección 2-D. Obtenidos 2-D datos de corazones intactos con información ignorado de curvat 3-Dure del corazón podría dar lugar a errores en los análisis de los datos, sobre todo en el análisis de la velocidad de conducción. Con las ventajas de utilizar un HL-1 modelo celular cultivada en 2-D, que son capaces de visualizar los ritmos regulares e irregulares, evaluar Ca transitoria y potencial de acción cinética, determinar la velocidad de conducción y caracterizar Ca y acción potencial patrones de propagación (uniforme o no propagación uniforme) sin interferir de la estructura 3-D de un corazón intacto. Por lo tanto, la cartografía exitosamente ambas transitorios de calcio y los potenciales de acción en un cultivaron HL-1 miocitos auricular monocapa como un enfoque complementario puede mejorar en gran medida la comprensión de las propiedades electrofisiológicas de los miocitos auriculares y los mecanismos subyacentes de la arritmogénesis auricular.

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Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias al doctor Claycomb para proporcionar células HL-1 y el protocolo detallado de mantenimiento. También nos gustaría dar las gracias a la señora Elena Carrillo y el Dr. Seth Robia por su ayuda en la generación de la película de células y el Sr. Pete Caron por su ayuda con la fabricación de algunos accesorios para nuestro sistema de mapeo óptico de doble canal.

Este trabajo fue apoyado por la American Heart Association (10GRNT3770030 y 12GRNT12050478 a XA), los Institutos Nacionales de Salud (HL113640 a XA), y el Fondo de la Universidad Loyola de Investigaciones para el Desarrollo (a XA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhod2 dry powder AAT Bioquest 21062
pluronic AAT Bioquest 20050
DMSO Sigma 276855
Rh237 Invitrogen S-1109
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P3911
KH2PO4 Sigma P0662
NaH2PO4 Sigma S9638
MgSO4 Sigma M7506
D-Glucose Sigma G8270
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
HEPEs Sigma H3375

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References

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