Tensão e cálcio Dual Channel Mapping Optical do Cultivadas HL-1 Atrial miócitos Monolayer

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Biology

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Yan, J., Thomson, J. K., Zhao, W., Fast, V. G., Ye, T., Ai, X. Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer. J. Vis. Exp. (97), e52542, doi:10.3791/52542 (2015).

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Abstract

Mapeamento Optical tem provado ser uma técnica valiosa para detectar a atividade elétrica cardíaca em ambos intacta ex vivo corações e em monocamadas miócitos em cultura. Células HL-1 têm sido amplamente utilizados como um modelo celular de 2-dimensional para o estudo de diversos aspectos da fisiologia cardíaca. No entanto, tem sido um grande desafio para o mapa opticamente cálcio (Ca) transientes e potenciais de ação simultaneamente a partir do mesmo campo de visão em um HL-1 monocamada de células cultivadas atrial. Isto porque manuseio e cuidado especial é necessário para preparar as células saudáveis ​​que podem ser eletricamente capturados e opticamente mapeadas. Por conseguinte, foi desenvolvido um protocolo de trabalho óptima para o mapeamento óptico de canal duplo. Neste manuscrito, temos descrito em detalhes como realizar o experimento mapeamento óptico de canal duplo. Este protocolo é uma ferramenta útil para melhorar a compreensão da propagação do potencial de ação e cinética de Ca no desenvolvimento de arritmia.

Introduction

A única cálcio (Ca) e tensão (V m) técnica de mapeamento óptico de canal duplo 1-5 está a emergir como uma ferramenta eficiente para gravar simultaneamente sinais V m e Ca em ambos os corações intactos e monocamadas de células em cultura. Esta técnica torna possível obter informações poderoso sobre a relação entre transientes de cálcio e os potenciais de acção para compreender melhor os mecanismos subjacentes electrofisiológicas de arritmias cardíacas.

As monocamadas de células cultivadas têm provado ser um modelo útil para estudar celular electrofisiologia cardíaca e o mecanismo subjacente de arritmias. 4,6-8 células HL-1 são uma linha de cultura dos miócitos atriais bem caracterizado. Células HL-1 também manter um genótipo e fenótipo diferenciado com exclusividade, que inclui morfológica, eletrofisiológico, e as características farmacológicas dos miócitos atriais adultos. Estas células expressam genes e proteínas cardíacas, incluindo important canais iónicos cardíacos (ou seja, L e canais de cálcio do tipo T) 9 e isoformas de proteínas maduras contrácteis sarcoméricas normalmente encontrado nos miócitos atriais adultos como os outros e que têm relatado anteriormente. 10-13 Além disso, as células HL-1 pode ser cultivadas para formar uma 2-dimensional (2-D) monocamada de miócitos. Assim, as vantagens de usar cultivadas monocamadas de HL-1 incluem: 1) custo relativamente mais baixo e mais fácil de manter uma linha de cultura de miócitos de isolar e cultivar os miócitos neonatais primários; 2) uma monocamada confluente de células reduz as complexidades estruturais que resultam da estrutura 3-D do coração; 3) uma monocamada de células pode eliminar a interferência de fibrose intersticial que ocorre no coração intacto. Isto pode ser utilizado para dissecar funções específicas electrofisiológicas de um grupo de miócitos, sem interferência de fibroblastos e da matriz intersticial; 4) avaliação das consequências funcionais a partir de manipulação farmacológica ou genética na culmonocamadas de células Tured pode ser efetivamente alcançado. Portanto, HL-1 células tornaram-se um modelo celular amplamente utilizado para estudar diversos aspectos da fisiologia dos miócitos, bem como atividades elétricas anormais induzida por estimulação. 13-16 No entanto, manuseio e cuidados especiais são necessários para a cultura monocamadas de células saudáveis ​​que respondem a externo A estimulação eléctrica para estudos de mapeamento óptico. Além disso, o processo de coloração do corante fluorescente dupla pode facilmente danificar a integridade de monocamadas confluentes de células cultivadas. Assim, a realização V m / CA dual channel mapeamento óptico no cultivadas HL-1 monocamadas tem sido um grande desafio.

O objetivo deste método é fornecer os principais passos para a realização com êxito mapeamento óptico de canal duplo em cultivadas HL-1 monocamadas. Aqui nós fornecemos detalhes abrangentes sobre um protocolo otimizado para preparação monocamada HL-1 celular, mapeamento óptico de canal duplo de uma monocamada de células cultivadas, e processamento de dados de mapeamento.

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Protocol

1. Preparação de Solução

  1. Solução Norepinefrina (NP)
    1. Dissolver 40 mg de NP em 25 ml de ácido ascórbico 30 mM (0,1475 g de ácido ascórbico em 25 ml de água purificada Milli-Q (MQ). Evite a exposição à luz directa durante esta preparação solução porque norepinefrina (NP) é sensível à luz.
    2. Filtra-se a solução de NP com um filtro de seringa de 0,22? M. Alíquota da solução em 1 ml microtubos estéreis e armazenar a -20 ° C. Uma vez congelado, NP é estável durante um mês.
  2. Meios suplementados Lave e Final Claycomb
    1. Comece com 43,5 ml de meio Claycomb e suplementar com 5 ml de soro fetal bovino (FBS), 0,5 ml de penicilina / estreptomicina, 0,5 ml de NP e de 1: 100 diluído L-glutamina para fazer 50 ml de meio suplementado Claycomb final. Evite a exposição à luz directa durante esta preparação solução porque médio Claycomb é sensível à luz.
    2. Preparar o meio de lavagem Claycomb usando a mesma receita que a supmédio mentado Claycomb exceto adicionar 5% FBS e omitir o NP e componentes L-glutamina.
      NOTA: A mídia Final e Wash Claycomb complementado são boas por duas semanas, quando armazenado a 4 ° C, sem exposição à luz direta.
  3. Soja solução inibidora de tripsina
    1. Dissolve-se 25 mg de inibidor de tripsina de soja em 100 ml de Ca e Mg livre-livre de soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (PBS).
    2. Filtrar a solução através de um filtro de seringa de 0,22? M.
      NOTA: A solução esterilizada é estável durante vários meses, quando armazenada a 4 ° C.
  4. Solução de gelatina / Fibronectina revestimento prato
    1. Dissolve-se 0,1 g de gelatina em 500 ml de água para fazer MQ 0,02% de gelatina.
    2. Autoclave, então diluir 1 ml de fibronectina em 199 ml de 0,02% de gelatina e misture delicadamente.
    3. Aliquota 6 ml de solução de gelatina em tubos separados e armazenar a -20 ° C.
  5. Solução de sal de Hanks
    1. Usando um rebuliçoplaca, dissolver os seguintes sais em água MQ (mmol / L), NaCl (136,9), KCl (5.366), KH 2 PO 4 (0,4409), NaH 2 PO 4 (0,4 mil), MgSO 4 (0,8142), D-Glc (5.051), NaHCO 3 (4.162), HEPES (5.042), CaCl 2 (1,261).
  6. Solução corante sensível ao cálcio (Rhod2)
    1. Dilui-se 1 mg de pó seco Rhod2 em 400 ul de 20% de Pluronic F-127 em DMSO para fazer uma solução estoque Rhod2 tingir e armazenar a -20 ° C.
    2. Dilui-se esta solução de reserva de 1: 1000 com uma solução de sal de Hanks para fazer uma solução de trabalho final antes do início da experiência.
  7. Solução de corante sensível Tensão (Rh237)
    1. Dilui-se 5 mg de Rh237 com 2 ml de DMSO para fazer uma solução estoque e armazenar a -20 ° C. Dilui-se a solução stock de 1: 1000 com uma solução de sal de Hanks para fazer uma solução de trabalho final antes do início da experiência.

& #160; NOTA: 1-4 soluções baseiam-se no protocolo de HL-1 de cultura de células Claycomb com pequenas modificações.

2. Passaging e Cultivo HL-1 atriais miócitos em lamelas

NOTA: As células HL-1 pode ser obtido a partir de Dr. Claycomb (Louisiana State University).

  1. Crescer HL-1 células em frascos T25 e alimentar com 5 ml de suplementado Claycomb Medium diárias. Passagem as células em frascos T25 de cinco em cinco dias de acordo com o protocolo de HL-1 de cultura de células Claycomb (descrito abaixo) 10.
  2. Coloque as lamelas circulares (20 mm de diâmetro) em 12 placas de cultura de 24 horas antes das células no frasco T25 confluente são totalmente e pronto para ser passado, e então cobrir as lamelas com gelatina / fibronectina durante a noite a 37 ° C.
  3. No dia seguinte, aspirado e descartar a gelatina / fibronectina a partir das placas de cultura e substitua com 1,5 ml de meio suplementado Claycomb final em cada poço.
  4. Dividir células de uma cultur T25e após atingir confluência balão cheio no dia 5. Aspirar o meio do frasco T25 contendo a cultura confluente e enxaguar a cultura brevemente com PBS a 37 ° C.
  5. Aspirar PBS e adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina / EDTA a 37 ° C por pipetagem a tripsina / EDTA para o fundo do frasco T25 para evitar o contacto directo com as células. Incubar a 37 ° C durante 1 min.
  6. Remover tripsina / EDTA por aspiração e adicionar outros 1,3 ml de tripsina / EDTA por frasco T25. Incubar à temperatura ambiente durante 1 min. Examinar ao microscópio e se as células que ainda estão presos ao balão, toque para desalojar completamente as células restantes.
  7. Adicionar 1,3 ml de inibidor de tripsina de soja para as células e as células de transferência de balão para um tubo de centrífuga de 15 ml. Lavar o balão vazio com 5 ml de meio de lavagem Claycomb. Adicionar a água para as células no tubo de centrifugação de 15 ml. Centrifugar a 500 xg durante 5 min.
  8. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento celularem 6 ml de meio suplementado Claycomb final.
  9. Semente cada poço de uma placa de 12 poços com 0,5 ml de suspensão de células a partir de passagens em células. Alimente as células com meio suplementado final Claycomb fresca diariamente.
    NOTA: Estreitamente monitorar o crescimento das células, tipicamente as monocamadas de células confluentes atingir o estatuto no dia 4 e as actividades espontâneas permanecem visíveis. Em seguida, a monocamada cultivadas estará pronto para mapeamento óptico no dia 4-5.

3. Carregamento de cálcio e de tensão Corantes sensíveis às células

  1. Para os estudos de mapeamento de óptica, remova cuidadosamente a lamela do 12-placa de cultura de células e enxaguar com solução salina de Hanks.
  2. Para corar as células com o corante sensível ao Ca Rhod2, incubar a monocamada de células na lamela com 3 ml da oxigenado (borbulhar com 5% de CO 2/95% O 2 gás) a solução de trabalho Rhod2 a 37 ° C em banho-maria durante 30 min .
  3. Para manchar as células com corante sensível V mRh237, imergir o Rhod2 monocamada celular carregado em 3 ml de solução de trabalho de Rh237 oxigenada a 37 ° C num banho de água durante mais 15 min.

Mapeamento 4. Dual Channel Optical

  1. Coloque a monocamada de células, que é o dobro-coradas com corantes V m e Ca, em uma câmara de circulação de um microscópio de fluorescência invertido. Usar um sistema de circulação aquecido para manter a temperatura da câmara da célula, a 35 ± 1 ° C. Controlar cuidadosamente a temperatura do perfusado, ajustando a velocidade do fluxo que circula através da câmara, para evitar um gradiente de mais do que 0,3 ° C ao longo da câmara.
    1. Antes de gravar V m / sinais de Ca, lava-se a monocamada de células com solução de Hanks fresco durante aproximadamente 5 minutos para remover o corante que permanece nos passos anteriores de coloração.
  2. Pace monocamadas de células saudáveis, usando um eletrodo bipolar composta de uma pipeta de vidro preenchido com solução salina de Hanks e um silver fio espiral ao redor da ponta da pipeta, como descrito anteriormente 12,17.
  3. Pace monocamadas de células saudáveis ​​em um comprimento de ciclo de 200-500 ms e pulso largura de 2 ms, à espera de um limiar de estimulação em aproximadamente 1 mV.
    NOTA: Para cada lote de monocamadas de cultura, pelo menos, duas monocamadas não tratadas devem ser utilizados para testar o estado do lote de células. As monocamadas de controlo saudáveis ​​deve ser capaz de ser capturada por estimulação eléctrica em comprimentos de ciclo de 200-500 ms. Se as monocamadas de controlo falhar para ser electricamente estimulado, isto sugere que o lote de célula inteira pode não ser adequado para as experiências de mapeamento óptico.
  4. Para excitar tanto V m e corantes sensíveis Ca, use uma fonte de luz LED (520 nm de comprimento de onda), acoplado com um filtro de excitação (510 nm / 40) e um espelho dicróico (561 nm).
    1. Recolha os sinais fluorescentes emitidos pelas células através de uma objetiva de 40X e dividir com um espelho dicróico (594 nm) em um componente V m e um componente Ca.Filtra-se a luz emitida no canal de m V com um filtro de passagem longa (700 nm) e a luz emitida no canal de cálcio, com um filtro de passagem de banda (585/40 nm).
    2. Coletar a luz fluorescente filtrada usando duas câmeras CCD (80 x 80 pixels, 1.000 fps; RedShirt imagem).
    3. Para evitar a fotodegradação de corante, para fazer gravações de menos de 2 segundos em cada campo de vista a limitar o tempo de exposição à luz. Aqui, normalmente imagem quatro áreas diferentes para cada monocamada.

5. Processamento de Dados do V m ou Ca Recordings

  1. Para ambos os sinais Ca V (80 x 80 pixels) e m, calcular a média dos valores de intensidade de vinte e cinco (5 x 5) pixels vizinhos para um valor de intensidade, em diferentes pontos no tempo de gravação para reduzir o ruído de fundo.
    NOTA: Após a média de dados, cada ponto de um potencial de ação individual ou Ca transitória tempo de gravação gera uma matriz de dados que contém 16 x 16 em média valores de intensidade (médiacanais de dados) com uma resolução espacial de 50 um.
  2. Definir o tempo de ativação (AT) de sinais de Ca gravado V m or.
    1. Para definir um tempo de activação (AT) de um potencial de acção individual ou Ca transiente, determinar o tempo de 50% da amplitude de pico do V, sinais de Ca utilizando um algoritmo baseado no MATLAB feito por encomenda ou m, tal como descrito anteriormente. 12
    2. Corrigir manualmente o ATs analisados ​​para eliminar quaisquer erros que possam ocorrer durante a análise do programa.
    3. Armazenar o definido AT matriz (16 x 16 canais de dados média) de potencial de acção gravado e transiente de cálcio, respectivamente, no software usado.
  3. Calcular potencial de acção ou transientes de cálcio a velocidade de condução (CV) na matriz de vectores AT usando o método de análise do campo de vectores como descrito anteriormente com modificações menores 12,18.
    1. Calcula-se o vector de CV de um canal de dados em relação ao seu redor AT pontos de dados (5 ×; 5 vizinha média de canais de dados) para simular uma superfície lisa polinomial dos tempos de ativação (na superfície) usando um algoritmo de mínimos quadrados dentro do programa MATLAB 12,18.
    2. Calcular condução vector utilizando as fórmulas abaixo
      Fórmula 1:
      Equação 1
      Fórmula 2:
      θ = arctan [(dy / dT) / (dx / dT)]
      NOTA: Ve é um vetor CV projetada em xey eixos; dx / dT é a projeção do vetor CV no eixo-x; dy / dT é a projeção do vetor CV no eixo-y. T é a superfície da AT; x, y referem-se a 2-D coordenadas; T x = ∂t / ∂x é a derivada parcial de T em relação a x; T y = ∂t / ∂y é a derivada parcial de T em relação à y; θ é a direcção final, de um vector de CV.
    3. Grupo de todos os vetores da matriz AT em 36 vias, cada um dos quais abrange um sector de dez graus na bússola. </ Li>
    4. Seleccione o percurso que contém a maior população de vectores CV entre as 36 vias de condução. Calcule o CV média desta via para representar o CV da monocamada.

6. A visualização da propagação da onda frontal

  1. Normalizar a intensidade do sinal de um potencial de acção individual ou Ca transiente em diferentes pontos de tempo de gravação em relação ao seu valor de pico utilizando o software MATLAB.
  2. Armazenar temporariamente os dados de intensidade normalizadas de cada ponto de tempo gravado numa matriz 16 x 16 de intensidade no software Matlab utilizado.
  3. Construa uma intensidade mapa colorido a partir da matriz de intensidade armazenado de cada ponto de tempo de gravação utilizando a função surf.m.
    NOTA: No mapa de intensidade, o vermelho representa alta intensidade do V sinais Ca m ou e azul reflete baixa intensidade dos sinais de fluorescência.
  4. Criar um arquivo .avi usando a função avifile.m.
  5. Guarde todo o imapas ntensity em momentos diferentes de gravação do potencial de ação ou Ca transiente usando a função addframe.m.
    NOTA: Neste ponto, dois arquivos AVI separadas de V m e propagação Ca será gerada.

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Representative Results

A monocamada confluente cultura apresenta um ritmo intrínseco regular como demonstrado no filme 1. Nós, então, realizada V m / Ca mapeamento óptico de dois canais em um totalmente confluente HL-1 monocamada. A Figura 1A mostra exemplo vestígios de V sinais Ca m e a partir de um único gravado bater. Mapas isócronos representativos de sinais de Ca utilizando o sistema de mapeamento óptico de duplo canal uniformemente propagadas V m e estão apresentados nas Figuras 1B e 1C. Imagens cronológicas representativos de potenciais de ação uniforme propagadas e transientes de Ca foram obtidos a partir do mesmo HL-1 cultura em monocamada. Finalmente, Cinema 2 e 3 fornecem exemplos de animação de um potencial uniforme propagada ação (Filme 2) e transiente de cálcio (Filme 3) na HL-1 monocamada confluente.

-páginas = "always"> Figura 1
Figura 1: (A) os traços Exemplo de V m (azul) e Ca (vermelho) de uma batida eletricamente passeado em um comprimento de ciclo (CL) de 500 ms. (B) Uma imagem de nosso sistema de mapeamento óptico para HL-1 monocamadas. (C) Um Mapa isócrono de ação potencial de propagação da mesma batida compassada em todo o campo de visão inteiro. (D) Um Mapa isócrono de Ca propagação transitória da mesma batida compassada em todo o campo de visão. Em ambos os mapas isócronos, lapso de tempo é representada com cores, começando com azul escuro como iniciação e vermelho escuro, a 50 ms. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: (A) Uma série de mapas de distribuição V m a 60, 80, 140 e 200 ms após o início da gravação. (B) Os mapas de distribuição Ca em 60, 80, 140 e 200 ms após o início da gravação.

Filme 1: Um filme representante inscrito a partir de um confluente HL-1 monocamada na cultura dia cinco, sob um microscópio de luz com uma objetiva de 40X.

Filme 2 : Um filme representante de um potencial de ação propagado de uma batida compassada em um CL de 500 ms.

Filme 3 : Um filme representante de um transiente Ca propagada a partir de um paced bater em um CL de 500 ms.

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Discussion

Este artigo descreve os principais aspectos do mapeamento óptico em um culto HL-1 miócitos atrial monocamada coradas com cálcio e tensão corantes fluorescentes sensíveis. Ele inclui a cultura de um HL-1 monocamada de células ideal, configuração dos equipamentos de mapeamento, o mapeamento de uma monocamada de culto, e análise de dados.

Para mapear com sucesso células em cultura, é a chave para preparar uma monocamada de células distribuídas uniformemente. Quando semear as células sobre a as lamelas, certifique-se para dispersar uniformemente as células. Sempre mapear monocamadas de células totalmente crescidos e completamente confluentes, como estes irão responder melhor à estimulação elétrica. É também importante para manter as células oxigenadas durante o carregamento dos corantes, mas as bolhas de oxigénio não deve entrar em contacto directo com as células como este pode matar ou desalojar-los a partir da lamela. Diminuir a concentração de corante e a redução da intensidade da luz diminui grandeza de sinal e reduzir a relação sinal-ruído, enquanto aumenta concentrati corantese melhorando a intensidade da luz vai aumentar magnitude do sinal, mas também aumentar o ruído. Portanto, um equilíbrio óptimo de concentração de corante fluorescente e luz de excitação força deve ser determinado para melhorar a relação sinal-ruído dos sinais de gravação. Além disso, durante a gravação de mapeamento óptico, certifique-se para evitar a exposição a monocamada de células para longas exposições de luz concentrada, pois isso pode causar danos às células fotodinâmica dentro luz exposta a área de. Finalmente, um sistema de mapeamento óptico que fornece alta resolução temporal e espacial de sinais de gravação é necessária para a obtenção de dados de elevada qualidade.

Enquanto mapeamento óptico de canal duplo em corações intactos tem um grande potencial para o estudo de eletrofisiologia cardíaca, devido à sua capacidade de sinais de tensão e de cálcio cobrar simultâneas, uma limitação é que esta técnica coleta informações a partir de uma superfície 3-D como uma projeção de mapa 2-D. Obtidos 2-D dados de corações intactos com informações ignoradas, de 3-D curvature do coração pode resultar em erros na análise de dados, em especial na análise da velocidade de condução. Com as vantagens de usar um HL-1 modelo celular cultivadas 2-D, que são capazes de visualizar ritmos regulares e irregulares, avaliar Ca transitória e potencial de ação cinética, determinar a velocidade de condução e caracterizar Ca e ação potencial padrões de propagação (uniforme ou não- propagação uniforme) sem interferência a partir da estrutura 3-D de um coração intacto. Portanto, o mapeamento com sucesso ambos os transientes de cálcio e potenciais de ação em um culto HL-1 miócitos atrial monocamada como uma abordagem de cortesia pode aumentar consideravelmente a compreensão das propriedades eletrofisiológicas de miócitos atriais e os mecanismos subjacentes da arritmogênese atrial.

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Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Claycomb para fornecer células HL-1 e protocolo de manutenção detalhado. Gostaríamos também de agradecer Ms. Elena Carrillo e Dr. Seth Robia por sua assistência com a geração de o filme celular e Mr. Pete Caron por sua ajuda com fazer alguns acessórios para o nosso sistema de mapeamento óptico de canal duplo.

Este trabalho foi financiado pela American Heart Association (10GRNT3770030 & 12GRNT12050478 para XA), os Institutos Nacionais de Saúde (HL113640 para XA) e Loyola Fundo de Desenvolvimento Research University (a XA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhod2 dry powder AAT Bioquest 21062
pluronic AAT Bioquest 20050
DMSO Sigma 276855
Rh237 Invitrogen S-1109
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P3911
KH2PO4 Sigma P0662
NaH2PO4 Sigma S9638
MgSO4 Sigma M7506
D-Glucose Sigma G8270
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
HEPEs Sigma H3375

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References

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