조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

Developmental Biology

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Zehentmeier, S., Cseresnyes, Z., Escribano Navarro, J., Niesner, R. A., Hauser, A. E. Automated Quantification of Hematopoietic Cell – Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone. J. Vis. Exp. (98), e52544, doi:10.3791/52544 (2015).

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Abstract

초점 현미경은 골수 같은 복잡한 조직 내에서 여러 종류의 세포 편재 분석위한 선택 방법이다. 많은 경우에 따라서 레이터 의존적 바이어스를 도입하고 자간 신뢰성을 감소의 위험을 담지 수동 계산에 의존하지만, 셀룰러 편재 및 정량 분석​​이 어렵다. 세포 유형은 그 발생 빈도의 차이가 특히 강하게 또한, 임의 위치로부터의 결과 두 셀 간의 공동 지역화 여부를 판단하는 것이 곤란하다. 여기서, 골수 세포 공동 편재 편견 정량 방법이 도입된다. 프로토콜은 골수를 포함한 전체 뮤린 긴 뼈의 조직 학적 섹션을 획득하기 위해 사용되는 샘플 제조뿐만 아니라, 염색 프로토콜과 고해상도 화상의 취득을 설명한다. 조혈 및 비 hemat의 인식에서 스패닝 분석 워크 플로우이들 셀 사이의 직접적인 접촉의 정량화 2 차원 (2D) 골수에서 이미지 opoietic 세포 유형이 제공된다. 이것은 또한 특정 세포 유형을 둘러싸 세포 미세 환경에 대한 정보를 얻기 위해, 이웃 분석을 포함한다. 두 종류의 세포 공동 지역화 랜덤 셀 위치의 단순한 결과 또는 셀 간의 우선 연결을 적용할지 여부를 평가하기 위해, 조혈뿐만 아니라 간질 세포의 경우,이 가설을 시험하기에 적합하다 시뮬레이션 도구이며, 사용. 이 방법은 골수에 한정되지 않으며, 조직 학적 데이터의 재현성, 정량 분석​​을 허용하기 위해 다른 조직으로 확장 될 수있다.

Introduction

인해 광학 현미경 이미지 등을 포함한 최근의 급속한 기술 발전에, 조직 전체의 문맥 내에서 세포의 분석은 면역학 점점 접근되고있다. 서스펜션에서 단일 세포의 특성은 세포 및 분자 기능을 이해하는 귀중한 불가결 방법을 나타냅니다. 그러나, 그들의 (마이크로) -anatomical 환경 내 세포의 분석은 면역 반응의 개발과 같은 복잡한 공정에서 공동 다양한 세포 유형 간의 상호 작용을 이해하는 데 필수적이다.

현미경 학자, 이미지의 정 성적 정보를 획득하는 것이 상대적으로 용이하지만, 그것은 부분적으로는이 분야의 분석 방법은 화상 획득 가능한 것과 비교 뒤쳐져 있다는 사실, 이들 데이터를 정량화 할 과제로 남아. 많은 연구자들은 여전히​​ 시간 소모적 그들의 조직학 이미지에서 수동 세포 카운팅에 의존따라서 다른 평가자 사이에 바이어스를 도입하고 다른 그룹에 의해 복제를 방해. 때때로, 하나의 대표 이미지는 하드 독자가 이러한 경우의 통계적 관련성을 판단 할 만들기, 책에서 휴대 전화 위치 또는 공동 현지화에 문을 강조하기 위해 선택된다.

함께 화상 데이터의 전체 정보 콘텐츠가 거의 이용되지 않는다는 사실과, 이는 더 빠르고 편견 광범위한 조직 학적 방법이 이미지를 분석 할 필요성을 강조한다.

골수는 성인 척추 동물의 조혈 기관으로 중요한 기능 회복에 걸리는 복잡한 조직이다. 조혈 세포 1,2 출생지와 B 림프구의 발달 3 중요한 역할 외에, 또한 면역 반응 개시 4 성숙한 재순환 B 세포 5 지원되는 사이트로서 작용한다. 난을 유지하는 외에, 그 역할면역 메모리를 구성하는 세포의 여러 종류가 6-9이 존재하는 것으로 밝혀졌다으로 mmunological 메모리는 점점, 지난 10 년간 평가되고있다.

복잡한 조직 골수의 구조와 기능 사이의 관계는 여전히 애매 남아있다. 이러한 T 및 B 세포 영역으로 매크로 구획으로 구성되어 차 림프 기관과는 달리, 골수 맑은 매크로 구획화 없다. 지금까지 골수에서 별개의 구획 골 피질 또는 혈관의 근접에 의해 정의된다. 이러한지지 줄기 세포, B 세포 또는 장수 형질 세포 (PC와 같은 면역 기억 세포 집단 (유지), CD4 + 및 개발 등의 처리의 수에 대한 골수의 다양한 상주 간질 세포 집단의 중요성 CD8 + 메모리 T 세포)는 명확 골수 미세 구획화 어느 정도가 있음을 나타낸다.

(10)의 여러. 골수에서 시각화 및 간질 세포의 특성 때문에 가늘고 긴 돌기 확장 골수에 걸쳐 네트워크를 형성하는 자신의 형태 적 특징에 곤란하며, 해당 마커의 부족 기질 아 집단을 구별하기.

이러한 틈새가 자신의 세포 및 분자 compositio에 대한 공통적 인 특징을 공유 어느 정도는 아직까지 명확하지 않다n 및 요소는 특정 틈새 시장 고유의 렌더링합니다. 간질 세포 이외에, 조혈 세포 유형은 틈새의 적어도 일부 특정 신호들을 제공함으로써 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 분명히, 틈새 조성물의 복잡성은 동일계에서의 분석이 필요하고, 면역학 및 혈액학는 세포 성분 사이의 공간적 관계를 분석하여, 예를 들어 골수 마이크로 아키텍처를 확대하는 것이 점점 더 중요 해지고있다.

여기에, 전략은 제시 자동화 및 편견 방법으로 골수 세포 공동 현지화 및 이웃 관계를 정량화한다. 형광 기질 세포 및 비 형광 조혈 세포, undecalcified 뼈, 전체 뼈를 덮는 공 초점 화상의 취득으로부터 조직 학적 단면의 제조뿐만 아니라, 셀룰러 (C)의 자동화 된 이미지 분석, 키메라 마우스의 생성을 포함하는 형질 상세한 플로오 - 현지화 및 시뮬레이션 툴에 의해 임의의 위치에서의 검증 / 차별 (그림 8)을 제공한다.

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Protocol

동물 실험은 동물 복지 (Landesamt에 대 한 아퍼 싶게 Soziales, 베를린)에 해당하는 국가위원회에 의해 승인되었고, 현재의 지침과 규정 (동물 실험 라이센스 G0194 / 11)에 따라 수행되었다.

형광 골수 키메라 마우스의 1 세대

주 : 9 전에 설명한 바와 같이 골수 간질 세포를 시각화하기 위해 형광 골수 키메라 마우스의 생성이 행해진 다.

  1. 델-Cre 호텔이 조사를 위해 준비하기 (탠덤 적색 형광 단백질 (tdRFP) 도처 11-13을 표현 마우스) ROSA-tdRFP 마우스를 X 치료를 시작합니다. 또한, 형광 단백질의 유비쿼터스 식으로 다른 변형을 사용합니다. 이일 조사 전에 마시는 물을 통해 네오 마이신의 1 ㎎ / ㎖, 1 ㎎ / 비타민 ml의를 (A, D3, E, C) 관리합니다.
  2. 세슘 137 감마선 조사 장치 위스콘신 3.8 회색으로 두 번 쥐를 조사3 시간의 간격 얇은. 이를 위해, 각각의 조사 장치에 적합한 조사 파이 케이지에 마우스를 놓습니다.
    참고 : 마우스의 조사의 경우, 우리 연구소는 마취가 필요하지 않습니다. 조사를위한 마취에 대한 지역 기관 정책을 따릅니다. 고통의 흔적이있는 경우 조사 후 하루 카프로 펜 피하 (SC)의 5 ㎎ / ㎏과 동물을 취급합니다.
  3. 다음날, 전송 버퍼 9 C57BL / 6 마우스의 공여체 긴 뼈로부터 제조 3 × 106의 골수 세포의 정맥 내 주사에 의해 생쥐 재구성. 최대 2 주 동안 네오 마이신에 마우스 및 비타민을 유지하고이 시간 동안 자신의 건강과 체중을 모니터링 할 수 있습니다. 특정 실험 치료를 시작하기 전에 면역계의 재구성이 가능하도록 적어도 사주 잠깐 (예를 들어, 면역화) 9.
  4. 쥐를 희생하고 해부 보드에 배치, 70 % 에탄올로 다리를 소독. Euthaniz지역 기관 정책에 따라 전자 마우스. 우리 연구소는 자궁 경부 전위를 수행합니다.
  5. 허벅지에서 피부를 제거하기 위해 집게와 가위를 사용합니다. 대퇴 뼈를 노출 근육 조직을 제거합니다. 집게와 가위를 사용하여 고관절과 무릎 관절에서 대퇴골을 삐다. 깨지거나 뼈를 절단하지 않도록주의하십시오.
  6. 조심스럽게 가위를 사용하여 뼈에서 근육 조직과 연골의 큰 조각을 나머지 제거합니다. 실험실 휴지와 뼈를 문질러 남아있는 근육 조직을 제거합니다. 인산염 완충 식염수 (PBS)와 페트리 접시에서 청소 뼈를 수집합니다.
  7. 6 시간 - 4 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA, 전자 현미경 등급)에 전체 대퇴 뼈를 고정합니다.
  8. PFA를 버리고 PBS O / N 10 % 자당의 뼈를 품어. 다음 날, 20 % 자당 O의 / n에서 뼈를 품어. 날이 후, 30 % 자당 O의 / n에서 뼈를 품어.

뼈 2. 냉동 절편

참고 : 한 후6 - 30 % 자당에 24 시간, 뼈를 동결 카와 모토의 테이프 방법 (14, 15)에 따라 그들을 동결 절단 (Cryosections).

  1. 드라이 아이스, 아세톤으로 큰 비이커 (2000 ml의 부피)를 준비 (약 2 : 1 부피비를, 예를 들면, 드라이 아이스 및 아세톤 400 ㎖를 200 ㎖) 흄 후드. (- 50 ml의 약 30) 내부 헥산 - (250 ml의 볼륨 150) 작은 비커를 놓습니다. (서리가 큰 비커의 외부에 표시 될 때까지, 약 10 분) 냉각 믹스 기다립니다.
  2. 슈퍼 Cryoembedding 중간 (SCEM)로 표시 cryomold의 ¾을 채우 그들은 완전히 그들이 금형의 가장자리를 만지지 않도록주의하면서 몰입 될 때까지 조심스럽게 내부의 뼈를 배치합니다. 큰 집게로 바로 헥산의 표면을 만져 금형의 바닥 비커에 cryomold를 개최합니다.
    1. SCEM 동결의 바깥 쪽 가장자리하자 (불투명도로 표시를,이 약 15 초 소요). 그런 다음 완전히 헥산으로 금형을 삭제하고 FRE을하자2 분 - 1 EZE. 냉동 샘플을 꺼내 셀로판 포장 한 후 알루미늄 호일 (건조되는 샘플을 보호하고 빛에 대한 노출을 피해야). 냉동 절편 때까지 -80 ° C에서 보관.
  3. 대퇴 뼈의 냉동 절편을 위해 열심히 조직에 대한 표준 마이크로톰 및 마이크로톰 블레이드를 사용합니다.
  4. -24 ° C에서 마이크로톰의 샘플 및 블레이드 온도를 설정합니다. 샘플을 절단하기 전에 약 15 분 동안 마이크로톰 안에 앉아 보자.
    1. SCEM 또는 최적의 절단 온도 OCT () 매체와 금속 시료 홀더에 샘플 블록을 수정합니다. 블록 필요한 경우의 방향을 조정합니다. 뼈가 완전히 열릴 때까지 샘플을 잘라 내고 골수 볼 수 있습니다. 7 μm의 단면 두께 (첫 번째 섹션 폐기) 조정합니다.
    2. 사슴 가죽 커버 나무 주걱을 사용하여 샘​​플 블록의 상단에있는 끈적 끈적한면 카와 모토 테이프의 조각을 수정. 이어서, 시료를 절단하고 단면이되도록 테이프를 켜상부 측에 위치. 집게를 사용하여 슬라이드 글래스에 테이프를 전송합니다. 스카치 테이프로 슬라이드 글라스에 테이프를 고정합니다.
  5. 섹션 적어도 30 분 동안 건조 시키 및 사용 때까지 -80 ° C에 저장합니다. 그들이 함께 스틱 것을 피하기 위해 하나의 슬라이드 사이에 스페이서 플라스틱 슬라이드 상자에 흠 및 마운트 해제 슬라이드를 저장합니다. 스테인드 및 장착 된 슬라이드는 4 ° C에서 최대 일주일 판지에 슬라이드 폴더에 저장할 수 있습니다.

3. 이미지 모음

  1. 일반적인 면역 프로토콜 9 항에 해동 얼룩 저온부. 예 :염색, 조직 무결성을 나타낼 4 ', 6-diamidino-2 염산염 페닐 인돌 (DAPI)을 포함한다.
    참고 : 얼룩, 예를 들어, RFP에 대한 기질 세포 (안티 - RFP - 비오틴 항체 및 스트렙 타비 딘 - 알렉사 형석 555), 쥐 안티 주요 기본 단백질 (MBP) 항체 및 안티 쥐 알렉사 형석 647 항체와 얼룩 호산구를 시각화 , B 세포안티 κ 경쇄 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 및 항 λ1 경쇄-FITC 항체 랫트 항 - B220 - 알렉사 형석 594 항체 및 PC를 (염색 과정의 세부 사항은도 9에 기재되어있다).
  2. 스테인드 섹션을 탑재합니다 섹션에 fluoromount 한 방울을 넣고 조심스럽게 기포의 형성을 방지하는 동안, # 1 유리 커버 슬립 커버. 그 후, 염색에 적합한 레이저 라인을 갖추고 악기 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 수행합니다.
  3. 간질 세포는 다음과 같은 설정을 적용 Wimasis 도구를 사용하여 골수 조혈 세포의 자동화 공동 지역화 분석 이미지를 기록하기 위해 :
    1. 20 배 대물 렌즈와 708.15 X 708.15 ㎛,보기의 필드를 사용합니다. 자동화 된 분석을 위해, 비교 결과를 유지하기 위해 2048 X 2048 픽셀 (PX)에서 일관된 모든 이미지의 크기를 유지한다.
    2. 예를 들어, (간질 구조에 대한 하나의 채널을 기록, (예를 들어, DAPI, 405 ㎚)과이자의 조혈 세포 (추가 채널 예를 들어, 3 채널, 호산구, B 세포와 PC 용 488/594/633 ㎚).
    3. 4 16 평균 회선을 사용하여 이미지를 기록. 이상적으로, 하나의 인접한 이미지를 취함으로써 전체 대퇴골 부분을 커버한다. 대안 적으로, 골수 (골간뿐만 아니라 성장판)의 다양한 영역들에서 인접하지 않은 사진을 촬영.
      참고 : 인접 이미지 (중복 영역에서 세포의 반복 분석을 피하기 위해) 사이의 중복을 생성하지 않도록주의하십시오.
  4. 현미경 이미지 파일 포맷으로 이미지를 저장. 확인하고, 필요한 경우, 이미지 뷰어 / 분석 소프트웨어의 모든 채널에 대한 대비를 조정합니다.
  5. 이미지 파일 당 수출 3 .JPG 파일 : DAPI 채널 (빨강 / 녹색 / 청색 (RGB) 형식으로, 노란색으로 구분 거짓 색상), 기질 채널에 대한 하나 .jpg 파일 (그레이 스케일)과 하나 .JPG 하나 .jpg 파일 파일 포함조혈 세포에 대한 채널 (3 채널 최대, RGB 형식, 예를 들어, FITC (PCS, 거짓 색상 : 녹색) / 알렉사 형석 594 (B 세포, 거짓 색상 : 블루) / 알렉사 형석 647 (호산구, 거짓 색상 : 적색)) .

4. 자동 이미지 분석

  1. 영상 분할, 공동 현지화 및 지역 분석 (토론 참조)의 정량을 수행하기 위해 이미지 분석 도구를 사용합니다.
  2. Wimasis 도구를 사용하는 경우 다음과 같이 진행합니다 :
    1. 밑줄과 화상의 종류를 나타내는 숫자가 뒤에 동일한 파일 이름으로 이미지 당 3 .JPG 파일 세트 업로드.
    2. 조혈 세포와 .jpg 파일에 대한 _1를 사용하여, 기질 채널에 대한 .jpg 파일에 대한 DAPI 채널 _3을위한 .jpg 파일에 대한 _2. Image1_1.jpg (조혈 세포), Image1_2.jpg (DAPI 채널) 및 Image1_3.jpg (기질 채널) 예를 들면 다음과 같습니다. 고객 계정을 통해 이미지를 업로드합니다.
    3. 세포 연락처 정량각각의 필드를 클릭하여 셀 접촉 도구를 선택합니다. 세포 주변 정량, 셀 주변 도구를 선택하고 (세포 '가장자리에서 측정) μm의에서 선호 주변 반경을 입력합니다.
    4. 결과를 다운로드합니다.
      주 : 결과 요약에 더하여, .JPG의 조혈 세포 및 검출 된 객체의 경계를 가진 기질 채널을 나타내는 파일 강조뿐만 아니라 모든 이미지에 대한 측정을 포함하는 단일 .CSV 파일로 제공되어 .CSV 파일 그 업로드 된 모든 이미지에 대한 데이터가 포함되어 있습니다.
  3. 접촉으로부터 측정 예 대표 결과에 나타낸다 기질 세포 또는 다른 조혈 세포 유형을 접촉시키는 적색, 녹색 또는 청색 셀의 주파수와 접촉 (조혈 세포 (적색, 녹색 또는 청색의 셀)의 주파수를 결정 그림 4). 주파수를 결정하기 위해, 화상에 의해 주어진 접촉 당 카운트 분할총 셀은 이미지 당 계산합니다.
    1. 개별 쥐 실험을 위해, 하나의 마우스에 대한 사진의 총 접촉 카운트를 합산하고 사진의 총 세포 수의 합으로 나누어 이들을.
  4. 단계 4.3 (에 기재된 근방 측정으로부터, 간질 세포 및 / 또는 다른 조혈 세포 유형에 바람직 근방 적색, 녹색 또는 청색 셀의 주파수로부터 선택된 거리에 적색, 녹색 또는 청색 셀의 주파수를 결정 또한 참조 대표 결과, 그림 4).

임의의 골수 위치 5. 시뮬레이션

  1. 분석 골수 조직 학적 영상에 임의의 셀 위치 결정의 시뮬레이션을 실행하기 전에, 미리 다음 파일을 준비 : 세포 접촉 도구 DAPI 채널에 대한 원래 .JPG 파일과 원래 .JPG 파일에 의해 제공되는 단일 .CSV 파일 간질 채널.
  2. 수행하기 위해서일련의 이미지에 배치 시뮬레이션 (예를 들어, 하나의 대퇴 섹션의 모든 이미지), 하나의 폴더에 모든 원본 .JPG 파일 (_1, _2와 _3)와 대응하는 하나의 .CSV 파일을 수집합니다.
    참고 : 임의의 골수 세포의 위치 결정을위한 시뮬레이션 도구의 요청에 따라 사용할 수 있습니다.
  3. 박스 "자동로드 이미지 데이터를"확인, 시뮬레이션 도구를 시작합니다.
    주 : 프로그램 .csv 파일에서 세포 수 및 평균 기포 크기를 자동으로 판독 할 것이다. 이 값은 "셀 번호"와 "셀 크기 AVG"(그림 5A)에 대한 상자에 표시됩니다.
  4. .CSV 파일, 즉, 이름에 공통 요인에 대한 공통 태그를 입력합니다. 회분식 시뮬레이션 표기 화상 세트의 수를 입력한다.
  5. (파일 이름 끝 _3과) 기질 채널에서 발생하는 .jpg 파일을로드합니다.
  6. DAPI 채널로부터 마스크를 생성하기위한 설정 입력 :
    1. 상자를 "확인? 마스크를 적용 "(10) (- 255 범위 0)에 바이너리 마스크로 DAPI 이미지를 변환하는 임계 값을 설정합니다.
    2. 확인란을 선택합니다 "팽창?" "? 8 비트"상자를 선택하고 5 픽셀로 팽창의 등급을 설정합니다. "/ 침식? w"확인란을 선택합니다.
    3. 시뮬레이션 이미지의 분석에 사용 근방 반경 (이웃 반경)에 대한 원하는 값을 입력한다. (픽셀 스케일링 XY : 0.346 μm의) 2,048 X 2,048 픽셀의 크기 708.15 X 708.15 μm 인 이미지의 경우, 29 PX 10 μm의에 해당합니다.
  7. 확인란을 선택합니다 "오오 츠를 사용?"간질 구조를 자동으로 감지 오츠의 알고리즘 (17)를 사용합니다.
    주 :이 접촉 부근 툴에 의해 사용되는 동일한 알고리즘이다. 기록 된 화상과 시뮬레이션 화상의 자동 분석에 동일한 이미지 분할 알고리즘을 이용하여 유사한 데이터를 유지하기 위해 중요하다.
  8. 아칸소 조혈 세포에 대한 설정을 입력전자는 원형 모양으로 시뮬레이션.
    참고 : 적색, 녹색, 청색 세포의 세포 수를 직접합니다 (5.6 단계) .csv 파일에서로드됩니다.
    1. 적색, 녹색, 청색의 픽셀 셀의 평균 직경을 계산하는 시뮬레이션 툴을 사용한다. 이미지 당 총 세포 수로 나눈 PX의 이미지의 각 세포 유형의 총면적 단일 셀의 평균 면적을 결정한다. 수식을 이용하여 디스크의 반경을 계산하는 평균 면적을 사용한다. 평균 직경을 결정하기 위해 반경 두배.
  9. 오브젝트 세그멘테이션 기능을 포함하는 이미지 분석 소프트웨어로 분석 세포 유형의 세포 크기 분포를 측정한다. 모든 조혈 세포 유형 (18 및도 5b)에 대한 σ를 결정합니다.
    주 : 기록 셀의 셀 크기 분포는 자동화 된 이미지 분석에 의해 측정되지 않기 때문에, 실제의 분포로 근사 가우스 분포를 사용한다. t의 폭그 분포 곡선은 σ에 의해 설명되고, 다양한 세포 유형에 대해 상당히 상이 할 수있다. (자세한 내용은 그림 5B 참조).
    1. 정지 화상 분석 툴에 의해 전체 셀로서 인식 작은 개체를 설명 PX의 직경이 측정에서, "셀 크기 컷"을 결정한다.
  10. 그래픽 사용자 인터페이스 (그림 5A)에 각각의 상자에 매개 변수를 입력합니다.
    1. PX에 직경으로, 차단 셀 크기, 즉, 시뮬레이션에서 허용 최저 셀 크기를 입력한다.
    2. (단계 5.9)에서, 적색, 녹색 및 청색 셀 대 셀 크기 분포의 시뮬레이션 (PX)에서 σ를 입력한다.
    3. 하위 섹션 "마스크 세포"의 "삭제"확인란을 선택합니다. 이 마스크의 출입 금지 영역이 적어도 하나의 픽셀 겹치면이 설정 프로그램이 새로운 셀에 대한 위치를 선택한다. 세포의 중복을 피 "확인란을 선택? ̶1; 하위 섹션 "셀 배제"에.
    4. PX 두 세포의 중심 간의 최소 허용 거리를 입력한다.
      참고 : 최소 거리는 녹화 된 영상에서 결정해야합니다. 잘못 측정 된 최소 거리를 기록하고 시뮬레이션 이미지의 비교에 대한 편견 / 인공 결과로 이어질 것입니다.
    5. 오버랩 중심 중심으로부터 최단 거리에 의해 정의되는 경우 100 %의 최대 오버랩 영역을 설정.
    6. 1000 반복에 대한 시뮬레이션 도구를 설정합니다.
    7. 확인란을 선택합니다 "자동 저장 세포를?".rect 파일 (텍스트 형식)으로 배치의 각 이미지의 모든 반복에 대한 모의 객체의 좌표를 저장합니다. 확인란을 선택합니다 "자동 저장 이미지를?"시뮬레이트 된 각 이미지의 .TIFF 파일을 저장합니다. 저장된 파일에 대한 공통 태그를 입력합니다.
      주 : "? 자동 저장 셀"옵션을 실제 시뮬레이션 IMA를 저장할 때와 비교하여, 시뮬레이션 실행 시간 및 전체 데이터 크기를 줄일GES. .rect 파일은 직사각형으로 모의 셀의 좌표를 저장하고 필요에 따라서 시뮬레이션 이미지로 변환 할 수있다.
  11. "실행 시뮬레이션"을 클릭하여 시뮬레이션을 시작합니다.
    주 : 시뮬레이션 도구가 자동 반복 시뮬레이션의 각 세트에 대해 적색, 녹색, 청색 및 간질 세포와, 적색, 녹색 및 청색 셀의 평균 접촉 횟수와 근방 카운트 포함한 모든 이미지의 1000 시뮬레이션을위한 .csv 파일을 생성 . 또한, 모든 값, 표준 편차 (STD)과 평균의 표준 오차 (SEM)과 1,000 시뮬레이션의 평균이 제공됩니다.
  12. 연락처 주파수와 1,000 시뮬레이션 이미지 중 하나 세트의 주변 주파수 평균을 결정합니다. 이를 위해, 이미지 당 기록 된 세포 수에 의한 평균 연락처 및 주변 수를 나눕니다. 촬영 된 이미지의 자동화 된 공동 현지화 분석 결과에 주파수를 비교한다.
  13. 적절한 쓰레딩 적용분석 (19)에 따라 stical 방법은 (그림 7, 우리는 양측 Wilcoxon signed rank test를 사용).

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Representative Results

카와 모토 테이프 방법 undecalcified 뼈의 저온부를 절단 골간뿐만 아니라 함께 골단 영역 모두에서 전체 뼈 여전히 광물 뼈에 부착 내막 영역의 골수, 손상 부분으로 절단되도록 그들의 소주 골의 고밀도 (도 1). 섹션들의 핵 염색 제조에 작은 균열이 완전히 회피 될 수 없지만, 동맥 정현파의 구조뿐만 아니라, 실질의 망상 네트워크를 그대로 유지하는 것이 알 수있다.

적색 형광 키메라 골수의 면역 형광 염색의 예와 그 이후의 분석으로, 호산구에 대한 염색 (주요 기본 단백질, MBP)와 PC (κ와 λ 경쇄)와 B 세포 (B220)가 표시됩니다. 마우스는 명반 IP 닭 γ 글로불린 (NP-CGG)에 결합 된 100 μg의 4- 히드 록시 -3- 니트로 페닐 합텐 4 주 후에 면역화 된재구성 21 일 후 PBS 정맥에서 NP-CGG의 50 μg의 접종 및 부스트 후 30 일째에 분석했다. 자동화 된 이미지 분석은 또한 망상 프로세스 매우 작은 단편을 포함하여, 간질 구조 매우 정확한 인식 결과. 간질 세포의 세포 수는 여기에 제시된 시스템에 결정되지 않을 수 있기 때문에 이미지의 모든 단편을 검출하기 위해, (도 2)에 대한 크기 임계 값, 간질 채널에 도입되지 않았다 (또한 설명을 참조). PC와 호산구는 B 세포보다 더 큰 있고 더 이질적인 형태를 보여줍니다. 세 가지 종류의 세포가 잘 첫눈에 인정을 받고있다. 셀룰러 클러스터는, 특히 B 세포, 잘 분리 하였다. 분석 툴은 상기 세포 유형 (호산구와 PC, B 세포)에 최적화되어있다. 다른 세포 유형의 경우, 조정해야 할 수도 있습니다. 셀 접촉 툴에 의해 생성 된 파일은 .CSV 조혈 세포에 대한 다음의 관련 측정을 포함 :각각의 세포 집단에 대한 세포 수; PX의 각 세포 집단에 대한 전체 면적; 연락처 (이 경우 호산구) 적혈구의 수, 녹색 세포 (여기의 PC) 또는 적색, 녹색, 청색 또는 회색 기질 세포와 파란색 셀 (여기에 B 세포). 셀 근방 툴에 의해 생성 된 파일은 .CSV 조혈 세포에 대한 다음 측정을 포함 각 세포 집단에 대한 세포 수를; PX의 각 세포 집단에 대한 전체 면적; 적색, 녹색, 청색 및 회색 기질 세포와, 적색, 녹색, 청색 셀의 근방 카운트.

이미지 분석 도구의 품질을 확인하기 위해, 자동 분석의 결과는 6 채점자 훈련 (도 3)에 의하여 서, 카운팅의 것과 비교 하였다. 모든 평가자는 분석을 위해 동일한 이미지를 받았습니다. 기질의 구조 및 조혈 세포 신중 화상 해석 도구로 약술하고, 관심 영역이 저장하고 분석 하였다. 간질 구조를 들어, 이미지 당 전체 면적자동 및 수동 분석을 비교했다. 훈련 된 평가자가 정확하게 인식하기 위해 수동으로 계산 (그림 3A) 기질의 총 면적의 크기를 관찰 큰 차이가 반영 기질 구조는 어려울 것 같았다. 여기서, 자동 분석 훈련 평가자에 의해 검출 평균 면적에 가까운 값을 결정 하였다. 수동 계산보다는 모든 셀들에 대해, 자동 분석 도구는 셀 약간 낮은 양을 결정 하였다. 그러나, PC 및 호산구를 들어, 숫자는 수동 카운트 관찰 자간 분산의 범위 내에 여전히 있었다. 자동 분석에 의해 검출 된 B 세포의 수는 있지만,이 범위를 다소 (도 3A) 미만이었다. 자동 분석에 의해 결정된 평균 기포 크기 (PX 인 영역)의 PC 용 512 PX, 호산구 대 436 픽셀이고, B 세포 317 PX 훈련 평가자가 호산구에 대한 PC의 515 PX, 464 픽셀의 크기를 결정하는 동안, 및 B 세포에 대한 291 픽셀. 따라서, 평균 CB 세포, PC 및 자동화 된 분석에 의해 측정 용 엘 호산구 크기 채점자 설명서 (도 3B)에 의해 결정된 평균 셀 크기에 필적 하였다. 이 자동화 된 이미지 분석 공구는 현재 후보 골수 틈새 세포 유형의 직접 접촉을 정량화하는데 사용될 수있다. 더욱이, 특정 세포 유형 인접 간질 세포 또는 다른 조혈 세포 유형의 세포의 주파수를 결정할 수있다. 골수 PC 및 그들의 접촉부 분석은 세포, 호산구, B 세포를 간질하고, 다른 PC (10) 및 20 ㎛의 (도 4a) 내에서 이들 세포 유형 이웃의 PC뿐만 아니라 주파수 도시된다. 또한, 기질 다양한 조혈 세포 유형의 접촉 빈도가 (도 4B)을 정량 할 수있다.

시뮬레이션 도구로 이들 세포의 골수 임의 위치의 시뮬레이션을 수행하기 전에 GAUS 같이 셀 크기 분포를 설명하는 파라미터시안 분포가 결정되어야한다. 대칭 "종형"곡선으로 시각화 될 수 가우시안 분포의 경우, 두 개의 매개 변수를 결정해야 곡선의 피크가있는 곡선 (모드, 즉, 영역의 중심 위치를 )과 대칭 인 곡선의 폭 (이 상술 σ 파라미터에 의해 설명된다). 이 절차는 PC를, 호산구 및 B 세포 (그림 5B)에 대해 여기에 표시됩니다. 측정 셀 크기 분포는 B 세포, σ 설명 분포 곡선의 폭이 PC 및 호산구에 대한보다 작은 것을 나타낸다. PX에 정의 σ 값 동안 시뮬레이션, 세 세포 집단을 측정 σ의 상대 값 (즉, B 세포는 항상 배 좁은 크기의 PC보다도 분포 '및 호산구'에 의해 모의 된) 유지시켰다 기록 된 세포의 시각적 모양에 맞게 설정 (그림6B). 이 B 세포 2 픽셀의 σ 및 PC와 호산구 모두 4 픽셀의 σ를 적용 할 우리를 이끌었다. 셀 크기 컷오프은 측정 셀 크기 분포로부터 결정 하였다. 17 PX 직경 선도 220 PX에서 컷오프 원형 오브젝트 (약 7 μm의) 및 B 세포를 20 PX 직경 생성 PC와 호산구 300 PX 객체 크기로 절단, 내 (약 6㎛의)를 사용했다 시뮬레이션.

세포 시뮬레이션 툴에 의해 배치 될 수 있도록 허용 된 임의의 시뮬레이션 된 이미지의 영역을 정의하기 위해, 마스크는 골수 조직 학적 화상 (도 6A)의 DAPI 채널 내의 신호로부터 핵 생성 하였다. (10)의 값은 이진 이미지 (상판, 오른쪽 이미지)를 생성하기위한 최적 임계치의 강도로 측정되었다. 오츠의 알고리즘에 의해 결정되는 임계 값은 고정 강도와 유사하게, 이미지의 모든 핵의 완전한 인식 (상단 패널, 센터 이미지)로 연결되지 않습니다(50) 또는 (150)의 임계 값 (하판, 좌측 및 중앙 이미지) 기질 세포 (도 4b)가있는 PC, 호산구, 또는 B 세포의 콘택트의 국지적 인 관련성 시뮬레이션 툴 (도 7)을 사용하여 시험 하였다. 이 분석은 이러한 집단을 지원하는 간질 틈새 시장의 개념에 맞춰 PC와 B 세포 (그림 7A)에 대한 시뮬레이션에 비해 녹화 된 영상에서 유의하게 더 높은 접촉 율을 밝혔다. 이는 5 개인 형광 키메라 마우스 (도 7b, D)에서 확인되었다. 대조적으로, 명확한 차이가 호산구 (도 7a, C)의 경우에 결정되지 않았다.

그림 1
카와 모토의 테이프 방법으로 저온 절단 된 쥐의 대퇴골의 종단면의 그림 1. 개요 형광 이미지. 테이프 방법은 cuttin 수 있습니다그대로 내막 영역과 g 섹션, 골간뿐만 아니라 성장판 분야에서, undecalcified 뼈에서 모두. 순진한 C57BL / 6 마​​우스의 7 μm의 두께 뼈 부분은 소동맥 (녹색)과 핵에 대해 (파란색, DAPI)를 시각화하는 무서-1, 세포 외 기질 단백질 인 라미닌 (빨간색)에 대한 염색. 1446 X 1088 μm의 47 타일, 해상도 1360 X 1024 픽셀 기록 개요, 이미지를 만들 스티치했다. 이 이미지는 10 배 대물 렌즈 (0.45 NA)로, 넓은 필드 형광 현미경에 인수되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
간질 및 조혈 골수 세포의 그림 2. 자동 감지. 적색 형광 카이의 대퇴골 절부스트 후 30 일째에 병용 방식 마우스 기질, MBP (빨강, 호산구), κ와 λ 경쇄 (녹색, PCS)과 B220 (파란색, B 세포)를 시각화하기 위해 RFP (회색)에 대한 염색. 왼쪽 : 원본 이미지는 20 배 대물 렌즈 (0.8 NA)와 708.15 X 708.15 ㎛,보기의 필드를 사용하여, 공 초점 현미경에 인수했다. 오른쪽 : 분할 된 이미지입니다. 인식 된 객체의 윤곽선 강조 표시됩니다. 흰색 사각형 아래 이미지에 표시된 영역을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 훈련 된 평가자에 의한 자동화 된 이미지 분석 3. 검증. (A) 하나 (간질 구조)의 기질 구조 훈련 평가자에 의해 계산 조혈 세포의 총 세포 수의 총 면적 10 자동화 된 이미지 분석에 의해 얻어지는 세포 수를 비교하여 (PCS), 두 (호산구) 및 하나의 화상 (B 세포). 점은 개별 평가자를 나타냅니다 (N = 5-6). 막대는 평균값 또는 자동으로 결정된 값을 나타낸다. 자동 분석에 의해 결정된 평균 객체 크기에 비해 수동 카운트 오브젝트 (B) 객체 크기 분포. 다양한 세포 유형의 상이한 주파수를 설명하기 위해, 하나의 PC는 두 개의 이미지 및 B 세포, 호산구 (10)을 계수 하였다. 점은 개별 개체를 나타냅니다. 선은 평균을 나타냅니다. (C) 훈련 된 평가자에 의한 간질 수동 구조물 개요. 왼쪽 : 원본 이미지. 중동 : 수동으로 분석 이미지의 예. 오른쪽 :. 자동화 된 분석에 의해 감지 된 간질 구조물 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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대퇴 골수에서 PC를, 호산구, B 세포와 기질 세포의 그림 4. 자동화 된 공동 현지화 분석. (A) 왼쪽 : 간질 구조, 호산구, B 세포 또는 부스트 후 30 일째에 형광 키메라 마우스에서 다른 PC와 직접 접촉의 PC의 주파수. 중앙과 오른쪽 : 10 μm의 주변 또는 간질 구조, 호산구, B 세포 또는 다른 PC의 20 μm의 주변에 PC를 주파수. 이 도면 (직접 접촉 10㎛, 부근)의 부품. Zehentmeier 외에서 개질 간질 구조와 직접 접촉의 PC, 호산구 및 B 세포의 9 (B) 주파수된다. 52-515의 PC, 918-3179 호산구, 10-21 이미지에 4146-13063 B 세포는 두 개의 독립적 인 실험에서 풀링, 부스트 후 하루 (30)에 5 형광 키메라 마우스에서 계수 하였다. 점은 각각의 마우스를 나타냅니다. 선은 평균을 나타냅니다.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
골수의 PC, 호산구 및 B 세포의 세포 크기 분포의 측정 5. 도표. 시뮬레이션 툴의 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI)의 (A) 스크린 샷. (녹색 κ 및 λ 경쇄)의 PC (B) 셀 크기 분포 (PX 인 영역), 호산구 (MBP, 빨강)과 B 세포 Volocity 소프트웨어 (상단 패널)에 의한 물체 인식 후 측정 (B220, 파란색)을 막대 그래프에 표시됩니다. 대퇴 골수 이미지 (아래 패널)에서, PC는 (노란색 오버레이), 노란색 파란색 (오버레이 보라색)에서 호산구와 B 세포 (회색 오버레이) 빨간색으로 표시됩니다 감지했습니다. 영상 분할은, PC를위한 180 PX의 최소 크기 임계 값을 설정하여 실시 하였다호산구 300 픽셀 및 B 세포 220 픽셀. 250 개체가, PC 용 호산구 650 개체와 B 세포 3,000 개체를 측정 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
모의 임의의 셀 위치에 대한 마스크의 6 세대 그림. (A) 다양한 임계 값을 적용하여 생성 된 바이너리 이미지의 원래 DAPI DAPI 채널 (황색)뿐만 아니라 오버레이가 도시된다. 바이너리 이미지 (임계 값을 10으로 설정)에서 생성 된 마스크 (하단 패널, 사진 오른쪽) 아래에 표시됩니다. 검은 영역이 출입 금지 영역을 명시하지 화이트 영역 (B). 기록되는 이미지 셀이 배치되는 것이 허용되는 영역을 나타낸다 (왼쪽)와 대응하는 시뮬레이션 이미지 (오른쪽) 높은 시각적 표시유사성. 호산구 (MBP)와 PC (κ 및 λlight 체인), B 세포 (B220)와 (RFP) 표시됩니다 기질 세포. 이 ​​그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
대 기록 시뮬레이션 이미지에서 간질 구조와 조혈 세포 유형의 그림 7. 직접 접촉. 의 기질과 직접 접촉의 PC, 호산구 및 B 세포의 (A) 주파수 부스트 후 30 일째에 형광 키메라 마우스의 녹화 된 영상에 비해 시뮬레이션. 라인 이미지 (점) 시뮬레이션 및 기록 대응 연결합니다. 한 대표 마우스의 이미지는 각각의 플롯에 표시됩니다. 기질과 직접 접촉의 PC, 호산구 및 B 세포 (B) 주파수를 5의 녹화 된 영상에 비해 시뮬레이션 두 개의 독립적 인 실험에서 개별 마우스. 윌 콕슨 순위 검정, 두 개의 꼬리 (PC를 로그인 : *** P = 0.0001 * P = 0.0371 * P = 0.0161 ** P = 0.0012; **** P <0.0001; 호산구 : *** P = 0.0007 ; P = 0.1055 * P = 0.0161, P = 0.4143; *** p = 0.0007; B 세포 **** P <0.0001 ** P = 0.0020; *** p = 0.0005 ** P = 0.0012 **** P <0.0001). 점은 개별 이미지를 나타냅니다. 바 평균을 나타냅니다. P 값이 0.05으로 유의 한 차이로 간주됩니다. NS : 그림에서 별표는 다음의 P 값을 표시 p> 0.05; * : P 0.05; ** : P 0.01; *** : P 0.001; **** : P 0.0001. 이 그림 (간질 구조와 PC를 직접 접촉)의 일부는 Zehentmeier 등에서 수정됩니다. (9) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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. - 조혈 세포의 정량 방법의 그림 8. 전체 워크 플로우 쥐의 골수 기질 세포 상호 작용이 접근 방식은 세 가지 주요 부분으로 나누어 져 있습니다 : 1. 쥐의 골수 섹션을 준비하고 원시 데이터는 레이저 스캐닝 공 초점 현미경, (2)에 의해 수집 . 기록 된 이미지의 자동 분석 및 골수 세포의 임의의 위치의 시뮬레이션은 시뮬레이션 이미지 기록으로부터 얻어지는 접촉 3. 이웃과 비교하는 카운트 행한다. 입력 (화상 파일) 및 자동 분석의 출력 (텍스트 파일)가 청색으로 표시되고, 입력 (화상 파일)과 출력 (텍스트 파일 및 임의로, 이미지 파일) 시뮬레이션 툴의 녹색으로 표시된다. 링크를 클릭 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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Discussion

현대 광학 묘화 법의 진보에도 불구하고, 데이터의 조직 학적 분석은 여전히​​ 종종 적절한 정량 도구와 방법의 부족 또는 관심사 작은 영역에 집중 편향된 분석에 의해 방해된다. 여기에 제시된 시너지 효과는 이미지 전체 골수 영역을 커버 분석, 자동 분할 및 다양한 조혈 및 간질 세포 유형, 공동 현지화 분석의 물체 인식, 새로운 관례가 제공하는 비 무작위로 발생하는 접점의 마지막 유효성 검사 도구를 결합 설계 시뮬레이션 소프트웨어.

골수를 포함하는 전체 뼈의 조직 학적으로 인해 하나의 섹션에 존재하는 다양한 조직 밀도에 수행 할 어려웠다 - 한 손으로 열심히, 광물 뼈에 쉽게 절단 중단되는 반면 충격에 골수에 함께 뼈. 대안, 뼈 부분 대가 절단 테이프 방법으로서ented 여기 14,15는 그대로하여 (도 1) 엔도 영역을 떠나, 조직 안정화 이점을 갖는다. 조골 세포에서 풍부한되고 게다가, 이러한 분야는 줄기 세포의 유지 (20) 역할을하는 것으로 제안되어왔다.

발달 과정 및 골수 간질 세포의 유지에 중요한 세포의 역할은 점점 분명 해지고있다. 그러나, 이러한 희귀 깨지기 세포 분석은 두 가지 이유에서 어려운 것으로 입증되었다 : 첫째, 그들은 골수로부터 분리하기 어렵다; 둘째로, 기질 인구 중 이질성의 정도가 알려져 있지 않고, 따라서 하나의 간질 세포에 기술 된 소정의 마커를 이용하여 중요한 인구를 놓칠 수도있다. 형광 골수 키메라를 생성하는 방법은 형광 표지에 유용하고이어서 전체 골수 간질 세포 집단을 분석. 그러나, 주목해야 이들 미시간골수의 전체 CE 간충직 세포 및 내피 세포를 포함하여 골아 세포, 시각화 하였다. 이는 키메라 마우스로부터의 데이터를 분석하는 경우 고려 될 필요가있다. 또한 조사 살아남은받는 기원의 조혈 세포의 우려가 있음에도 불구하고, 이러한 세포는 전형적 따라서 조직 학적 분석 (9)에 영향을주지 않는, 도너 CD45 + 세포에 비해 시야 당 매우 작은 영역을 커버한다. 명확하게, 이러한 방법은 기질 (부) 개체군 더 특정 검출와 후속 단계에서 결합되어야한다. 현재, 이러한 세포의 분석은 거의 동시에 분석 될 수있는 매개 변수의 수에 제한을 부과하고, 상기 언급 인해 이유로 조직학에 의해 수행된다. 다중 매개 변수의 개발은 이러한 한계를 극복하는 데 도움이 될 것입니다 현미경 분석한다.

이미지 분석 중에 분할 원래 오츠의 알고리즘을 사용하여 수행 하였다. 본질적으로이 클러스터링 기반 임계 화 방식은 자동 치 화상 (17)의 결과로, 주어진 채널에서 가장 낮은 통계적 차이로 두 그룹으로 전경 (신호)과 배경 (노이즈) 화소의 최적 분리 강도 임계치를 결정한다. 여기에서, 오츠의 방법은 원 화상의 자연 로그 버전에 적용되었다, 즉 :

오츠의 입력 이미지 = LN (입력 이미지)

오츠의 방법을 배경으로 희미 세포를 식별 할 수 있기 때문에이 형광 이미지를 더 잘 작동합니다. 로그 함수를 추가하면 오츠의 알고리즘에 의해 두 개의 서로 다른 클래스로 더 나은 세포의 분리 및 배경 수 있습니다. 그러나, 단독으로는 임계 강도 정확하게 단일 물체를 감지하기에 충분하지 않다. 이미지가 잘 분리 물체를 검출 할 때 효율적으로 작동하지만, 클러스터 내에 위치한 별개의 단일 세포에 충분하지 않다. 세포 유형의 일부로서 그이러한 호산구 또는 B 세포로, 빈번하게 조직에 모여, 우리가 관심시키고, DAPI 채널에서의 핵은 K = 1021.와 크기 히스토그램의 k는-수단 클러스터링에 기초한 알고리즘을 사용하여 분할 하였다 셀 분할 알고리즘 (10 쓰레기통에 클러스터) 가장 어두운 픽셀로 밝은 플롯과 끊임없이 세포를 닮은 개체의 형성을 찾을 것입니다. 이러한 개체는 다음 세포로 정의됩니다. 모든 화소가 사용 된 경우, 생성 핵은 클러스터 분리를위한 다른 채널에 적용되는 마스크를 생성하도록 팽창된다.

인한의 배선이 분석은 소형 조혈 세포에서 잘 작동하지만, 이러한 큰 확산 아웃 셀들의 경계를 결정하는 것은 불가능하다대로, 간질 세포에 대하여 한정되는 것은 아니다 그들의 망상 네트워크를 형성 수지상 확장. 따라서, 세포 간질 세포에 대한 카운트제공 할 수 없다. 간질 - 특이 적 프로모터의 통제하에 운명 매핑 기자를 통해 단일 세포를 레이블링 림프절과 여포 수지상 세포의 라벨에 대한 ( "Brainbow"시스템 (22)을 사용하여) 뉴런 게시 된 내용에 따라이 문제를 해결할 수 (23).

30 이하 PX 오브젝트를 제외한 모든 채널에 의한 노이즈 저감 공정을 적용 할 수있을뿐만 아니라, 크기 배제 조혈에 대한 객체 인식 방법에서 적용되지만 세포 기질 않았다. 제외 될 수 있습니다 단면으로 절단 세포의 작은 조각; 그러나, 손실은 세포의 명확한 인식의 찬성이 경우 무시 될 수있다. 두 차원에서 3 차원 분석 및 시뮬레이션을 확장하는 것은 이러한 한계를 극복한다. 방법의 개발은 확실히 일에 도움이 될 것입니다, 다 광자 현미경이나 빛 시트 현미경 / SPIM으로 예를 들어 전체 마운트에 세포 분포를 공부하기존경합니다. 다 성분 복합체의 틈새 세포 조성물을 연구하기 위해, 또한 현장에서 분석되고있는 파라미터의 수를 확장하는 것이 필요해질 것이다. 세포 측정 정량화와 함께 조직 학적 정보의 다중 매개 분석을위한 유망 접근 방법은, (25)는 최근 24 발표되었다.

접촉 분석은 두 물체의 중첩을 정량함으로써 행 하였다. 직접적인 접촉은 적어도 하나의 픽셀의 중첩으로 정의 하였다. 중요하게는, 이러한 분석은 현미경 이미지의 해상도에 의해 제한되고, 따라서, 현미경에 사용되는 대물 렌즈의 개구 수, 및 핀홀 크기뿐만 아니라, 파장 및 여기의 모드에 의존한다. 여기에 표시된 분석에서 형광 색소 조합 0.8 NA, 20 배의 목표는 488, 561, 594과 흥분, 하나의 광자 여기를 사용하여 633 nm의 적용되었다. 따라서, 수평 해상도 사이의 값0.372과 0.483 μm의 달성 하였다. 이 주장은 다양한 세포의 서브 세트에 대해 병치 될 수 있도록; 그러나, 세포의 상호 작용에 관여 추정되는 분자 메커니즘에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 또한, 이러한 생체 내에 2- 광자 현미경과 같은 다른 방법이 간 콘택트 (9)의 특성을 향상시키기 위해 필요하다. 이러한 상호 작용 26 실제로 기능하는 경우 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 기반 시스템을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

티슈 틈새 세포 미세 환경을 평가하기 위해, 직접적인 세포 접촉을 분석 할뿐만 아니라, 소정의 관심의 세포 유형 ( "근방 분석")의 주변의 세포 유형을 정량화 할뿐만 아니라 중요하다. 종전에는 핵 (27)의 위치를 기초로 혈관 세포 및 조직 구조 사이의 거리를 측정 연구를 발표했다. 우리는 determin에 관심이 있기 때문에핵 세포질 부피의 비율이 변하는 부분에서 다양한 세포 유형의 거리를 보내고, 우리는 표면들 사이의 거리를 측정하는 것이 바람직. 이를 위해, 우리는 PX로부터 μm의 값을 변환 한 후 cell's 경계로부터 유클리드 거리를 결정함으로써 근방 반경을 계산 하였다. 유클리드 거리는 두 개의 픽셀과 화학식 (28)에 의해 설명 될 수 간의 직선 거리이다 :
식 (1)

등의 유클리드 거리, 타겟 셀의 경계의 화소에서 10 μm의 경계 내에서의 픽셀 셀이 이웃 셀로서 계수 하였다.

현재의 형태에서, 분석은 세포가 접촉하거나 이에 만 바이너리 YES / NO 특성을 제공하지 동일 또는 상이한 유형의 다른 셀에 의해 접근되어 있는지 여부를 판정한다. 셀의 실제 개수그것으로부터 일정 반경 내에서 관심의 세포에 문의하거나 아르의 계산되지 않습니다. 다음 단계는 접촉 또는 인접 셀의 그룹 크기가 검출과 같은 다른 유형의 표적 세포 사이에 비교 될 수있는 방식으로 현재의 분석을 확장하는 것이다. 이는 조혈 세포의 액세서리 변화 기여 29-33 논의 된 골수 플라즈마 세포 생존 틈새 같은 골수 틈새의 조성물에 대한 중요한 부가 정보로 이어질 것이다.

물체 인식 알고리즘은 Wimasis에서 전문가들이 상업적으로 이용 가능한 사용자 지정 솔루션 서비스를 사용하여 요청에 따라 사용할 수 있습니다와 함께 최적화되었다. 또 다른 옵션은 Definiens, Volocity 또는 Imaris 또는 CellProfiler 같은 프리웨어로 이미지 분석을 위해 상용 소프트웨어를 사용하는 것이다.

자동화 된 셀 분할 및 이미지 분석 도구 우리두 개의 매개 변수, 즉, 물체의 크기 및 다양한 세포 집단에서 세포의 수에 대하여 6 훈련 화상 평가자에 의해 제공된 수동 해석 데이터와 결과를 비교하여 재 검증. 도 3b, 조혈 세포 (PCS, 호산구, 및 B 세포)에 대한 평균 개체 크기에 도시 된 바와 같이 그들의 불규칙 형상 비해 아마도 인해, 형질 세포 및 호산구 수동 크기 결정에 대한 높은 분산이, 두 방법 사이에 유사했다 B 세포합니다. 세포 수의 자동 검출 수동 검출 것보다 약간 낮은 값을 얻었다. 이들이 B 세포의 경우에 이러한 값 아래에있는 동안 특히, 이들은 아마도 마커로서 사용 하였다 B220의 발현 높은 이질성에, 호산구와 PC의 경우에는 수동의 값의 범위 내에 여전히 있었다 B 세포에 대한. B220은 상향 조절 골수 B 세포 분화 중에 것으로 공지되고, B 세포와 로우뿐만 아니라 높은 IB220에 대한 ntensity 염색 관찰 할 수있다. 낮은 B220 신호와 B 세포는 초기 단계 B 세포의 배제에지도 모른다 적용된 임계치를 하회. 자동 감지를위한 낮은 임계 값은이 문제를 해결할 수 있습니다. 그들의 적은 소형, 더 수상에 감지 할 어렵 간질 세포, 연신 아웃 형태의 경우, 수동 탐지 개별 평가자 사이의 높은 차이의 결과. 흥미롭게도, 기질의 평균 면적은 분석이 잘 평가자에 의한 개별 바이어스를 보상하도록 적합되는 것을 나타내는 자동으로 결정 총면적 동등했다. 함께 찍은, 이러한 데이터는 자동화 된 결과는 일반적으로 수동 분석의 평균 값을 나타냅니다 잘 분석 자간 변동성을 줄이기에 적합한 것으로 나타났다.

조직의 구조적인 한계 내에서 세포의 임의의 비 - 랜덤 위치를 구별하기 위해서, 시뮬레이션 툴이 개발되었다. 지속시뮬레이션을 보내고, 무작위로 위치 조혈 세포와 인공 이미지는 모든 기록 골수 조직 학적 이미지 생성됩니다. 첫째로, 기질 채널 영상이 원래 형식으로 사용된다. 마스크 따라서 바이너리 형식으로 이미지를 변환 할 때 고정 된 임계 강도 계를인가함으로써 DAPI 화상으로부터 생성되고; 바이너리 마스크는 픽셀 기반의 팽창과 침식의 여러 단계를 거친다. 마스크는 모의 셀을 배치 할 수 있도록 허용 된 필드 화상 영역을 정의한다. 모의 셀의 중심의 좌표가 균일 한 난수 생성기에 의해 제공되는, 경계는 어느 화상 사이즈에 따라 결정한다. 기록 된 이미지의 자동화 된 이미지 분석에 의해 결정된 각각의 모집단 세포 수 및 평균 기포 크기에 대한 정보가 시뮬레이션 된 조혈 세포 집단을 정의하는 데 사용된다. 모의 셀 직경은 일차원 가우스 분포를 따르는 것으로 가정되는 실제로부터기포 직경은 무작위로 선택된다 : 최소 허용 객체 크기 셀 크기 컷 - 오프가 도입되도록 직경 후 수정된다. 경우에 모의 셀은 한 개 이상의 픽셀이없는 이동 지역과 겹치거나 다른 이미 배치 셀 (기록 된 이미지에서의 결정에 따라 중앙에 센터에서 4 μm의), 새로운 임의의 좌표에서 미리 정의 된 거리에있을 것 같은 것을 배치 할 것 직경이 변경되지 않은 채 남아있는 동안 선택됩니다. 시뮬레이션 된 셀의 개수가 기록 된 화상의 셀 개수와 동일 할 때까지 반복 될 것이다.

도구는 간질 조직 구조 내의 고정 된 매트릭스로서 작용하면서 조혈 세포가 골수 내에 자유롭게 위치 될 수 있다는 가정에 근거했다. 공구는 실질 영역이 정현파 복잡한 시스템에 의해 교차되는 골수 상황에 최적화 하였다. 비슷한 모델링 접근 방식은 최근에 순서의 Frenette 및 동료에 의해 출판되었다전체 대퇴골 골 체적 (25)의 약 30 %를 구성하는 기질 세포 및 혈관의 구조와 관련하여 조혈 줄기 세포의 위치를 분석한다. 이 효과를 보정하기 위해, 여기에 제시된 시뮬레이션 툴의 지역 기반으로 마스크는 균체 배치하도록 허용 하였다. 이것은 핵을 나타내는 개체가 5 단계에 의해 팽창되는 팽창 된 핵 염색 이미지를 사용하여 달성 하였다 이진화 후 (도 6 참조). 낮은 세포 밀도, 즉, 뼈와 사인 곡선으로 핵의 저밀도 지역은 마스크에 기여하기 때문에 영역을 더 - 이동 될하지 않습니다. 팽창 과정에 의해이 출입 금지 구역의 인공 감소를 회피하기 위해서는, 5 단계의 침식 따라서 영역 불변 (따라서 "허용") 높은 핵 밀도를 떠나는 동안, 큰 배제 영역을 재개, 후속 적으로 도포 하였다. 이 방법은 용이하게 다른 림프 기관에 대해 적응 될 수있다. t 그에서문제는 세포질 라벨링과 같은 다른 방법들이 마스크를 생성하는데 사용될 수있다 (높은 세포질 / 핵 비율 세포가 존재하는 장소에서, 예)이 방법은 작동하지 않을 수도 있었다.

조혈 세포는 크기가 각 세포 유형의 계산 된 평균 직경 합의 평균 어느 가우시안 난수 생성기를 사용하여 측정 하였다 원형 개체로 시뮬레이션 하였다. 분포의 폭은 화상 해석 소프트웨어에 의해 결정되는 바와 같이 기록 된 이미지에서 측정 된 셀 크기 분포에 기초 하였다. 각 세포 유형에 대해 측정 된 셀 크기 분포로부터 결정된 바와 같이 작은 세포 조각이 자동화 된 이미지 분석에서 제외 하였다 것을 고려하기 위해서는 셀 크기 컷 - 오프를 도입 하였다 (도 5 참조).

당연히, 이것은 그들의 크기와 모양에 비교적 균일하지만 세포의 경우에 문제가 발생할 수 종류의 세포에서 잘 작동이러한 매개 변수에 대한 매우 이질적인 다시. 이것은이 분석들이 정규 거의 둥근 형상을 가지고 있다는 공통점 골수 (과립구, 림프구 및 조혈 전구 세포)에서 주요 조혈 세포 유형에 최적화되는 것은 아니다. 그러나이 방법은 수지상 세포 나 대 식세포, 강하게 불규칙한 세포 기관과 세포 유형 테스트를 거치지 않았습니다. 분석 이러한 세포는 개선 된 세포 클러스터 분리 알고리즘 (24)뿐만 아니라 상세한 형상 분석뿐만 아니라 상이한 크기뿐만 아니라, 다른 형태의 세포의 시뮬레이션에 대한 필요성을 포함하여, 우리의 자동화 된 이미지 분석뿐만 아니라 시뮬레이션 접근법에 새로운 도전을 제시한다. 대안은 기록 된 정확한 형태와 함께 작동하는 시뮬레이션 방법이 될 것입니다. 그러나,이 방법은 크게 모델 시스템의 동작이 증가한다고 지적되어야한다.

시뮬레이션을 expe 들어riments, 모든 촬영 된 이미지에 대한 시뮬레이션의 1000 반복이 발생했다. 이러한 많은 반복을 사용하면 약 3 %로 시뮬레이션 프로세스 자체로 기부 상대 오차를 감소시킬 것이다. 세포 - 세포 공동 지역화 값이 랜덤 시뮬레이션 계산하는 경우 즉, 만약 시뮬레이션 프로세스 자체는 N 측정 이미지 당 시뮬레이션의 개수 N -1/2 에러 함수에 의해 특징 화 될 것이다. 이 측정 공동 지역화 값의 누적 오차 시뮬레이션 프로세스 자체로 기여한다. 따라서, N = 1000에 대한 기여 오차 3.16 %이다. 만을 .jpeg .TIFF 형식으로 .rect 파일로 시뮬레이션 이미지 (간단한 텍스트 형식)보다는 같은 실제 이미지 (소프트웨어도 옵션을 저장할 때 여기에 표시된 시뮬레이션은 1000 반복 당 이미지 당 60 분 20 달렸다 ).

종합적으로, 이러한 접근법은 화상의 조직 학적 공평, 높은 처리량 분석을 허용S와 통계 관련 데이터의 생성을 가능하게한다. 이것은 서로 다른 조건에서 세포의 현지화를 비교 유용 할 수있다. 또한, 미래의 시간적 구성 요소 수는 골수에서 다양한 종류의 세포 운동성에 대한 데이터로서, 골수 세포의 움직임을 모델링 접근법에 통합이 가능하게된다. 이 방법은 다음과 같은 순환으로 골수 세포의 동원, 예를 들면, 급성 염증 (34)의 경우에서와 같이 호중구 시스템의 교란을 시뮬레이션하는데 사용될 수있다. 상기 면역 메모리 셀의 저장 장소로서 골수의 기능을 규명하기 위해, 하나는 생존 인자에 대한 경쟁을 모델링을 연장 상상할 수있다. 또한, 별개의 틈새 사이의 가능한 크로스 토크 어드레스뿐만 아니라, 틈새 유도 될 수있다. 함께, 이러한 생리적 변화를 이해하는 데 도움이 될 것입니다 w로 (예를 들면, 줄기 세포의 재생 동작을 트리거)엘자가 면역 질환, 종양, 급성 염증의 경우, 예를 들면 시스템 전체의 병리 섭동 등. 실험 및 모델링의 반복적 인 개념의 일부로서, 새로운 가설 차례로 다시 실험적으로 시험 할 수 시뮬레이션에 기초하여 생성 될 수시켜 상기 조직의 복잡성 내에서 다양한 세포 유형의 기능 및 상호 작용을 이해하는 데 도움.

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Acknowledgments

우리는 가치있는 토론 안드레아스 Radbruch 감사합니다. 우리는 우수한 기술 지원을 동물 관리 및 로버트 귄터에 대한 지원은 Gruczek, 패트릭 Thiemann와 마뉴 엘라 Ohde을 사빈에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 원고의 교정에 대한 조직 학적 샘플의 평가와 랜디 린드 퀴 스트에 대한 우리의 훈련 된 평가자 로라 Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, 카트린 로스, 피렌체 Pache와 카타리나 혼 감사합니다. 우리는 MBP-특이 항체에 대한 J. 및 N. 리, 메이요 클리닉, 스코 츠 데일, 애리조나, 미국 감사합니다.

이 작품은 생체 내에 현미경 지미-DFG의 핵심 시설 네트워크 연구비에 의해 DFG HA5354 / 4-1에 의해 지원되었다 TRR130 / TP17 및 DFG는 AEHSZ에 2165 (HA5354 / 6-1) 국제 막스 플랑크에 의해 지원되었다 감염증 및 면역학 (IMPRS-IDI), 베를린 (Berlin) 학교.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neomycin Sigma N6386 SIGMA Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC Serumwerke Bernburg 1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin) Sigma P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg Rockland D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade) Science Services 15713 EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose Carl Roth 4621.1
Dry ice
Acetone Sigma-Aldrich 179124 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane Sigma-Aldrich 208752 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard) Sakura 4557 25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583
Kawamoto's SCEM embedding medium Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit  Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9) Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile Thermo Scientific 3052835 L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated Rockland 600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin Life Technologies S-32355
Rat anti-MBP J. and N. Lee available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647 Life Technologies A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594 produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium DAKO S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) Carl Roth H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm) VWR 48311-703
Laser scanning confocal microscope equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow Wimasis, Munich The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime Microsoft free download
Simulation tool for random cell positioning available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software  free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).

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