Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Developmental Biology

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Zehentmeier, S., Cseresnyes, Z., Escribano Navarro, J., Niesner, R. A., Hauser, A. E. Automated Quantification of Hematopoietic Cell – Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone. J. Vis. Exp. (98), e52544, doi:10.3791/52544 (2015).

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Abstract

Microscopia confocale è il metodo di scelta per l'analisi della localizzazione di molteplici tipi di cellule all'interno dei tessuti complessi come il midollo osseo. Tuttavia, l'analisi e la quantificazione di localizzazione cellulare è difficile, come in molti casi si basa sul conteggio manuale, portando così il rischio di introdurre una polarizzazione rater-dipendente e riducendo l'affidabilità interrater. Inoltre, è spesso difficile giudicare se la co-localizzazione tra due celle risultati di posizionamento casuale, soprattutto quando tipi cellulari differiscono fortemente la frequenza del loro verificarsi. Qui, viene introdotto un metodo per la quantificazione obiettiva cellulari co-localizzazione nel midollo osseo. Il protocollo descrive la preparazione del campione utilizzato per ottenere sezioni istologiche di intere murini ossa lunghe, compreso il midollo osseo, così come il protocollo di colorazione e l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione. Un flusso di lavoro di analisi che va dal riconoscimento di ematopoietiche e non-hemattipi di cellule opoietic in 2 dimensioni immagini midollo (2D) ossa alla quantificazione dei contatti diretti tra queste cellule è presentato. Questo include anche un'analisi quartiere, per ottenere informazioni sul microambiente cellulare che circonda un certo tipo di cellula. Per valutare se la co-localizzazione di due tipi di cellule è il semplice risultato del posizionamento cella casuale o riflette associazioni preferenziali tra le cellule, uno strumento di simulazione che è adatto per testare questa ipotesi nel caso di ematopoietiche e cellule stromali, è utilizzato. Questo approccio non è limitato al midollo osseo, e può essere estesa ad altri tessuti per consentire riproducibili, analisi quantitativa dei dati istologici.

Introduction

A causa di recenti sviluppi tecnologici rapidi microscopio, tra cui imaging ottico, l'analisi di cellule nel contesto di tutto il tessuto è diventato sempre più accessibile per immunologi. La caratterizzazione di singole cellule in sospensione rappresenta un metodo prezioso e indispensabile per comprendere la funzione cellulare e molecolare. Tuttavia, l'analisi delle cellule all'interno del loro (micro) ambiente -anatomical è essenziale per la comprensione delle interazioni tra i vari tipi di cellule che collaborano in processi complessi come lo sviluppo delle risposte immunitarie.

Mentre è relativamente facile per microscopisti di ottenere informazioni qualitative da immagini, rimane una sfida per quantificare questi dati, in parte a causa del fatto che i metodi di analisi in questo campo sono in ritardo rispetto a quanto è possibile in acquisizione dell'immagine. Molti ricercatori si affidano ancora a conteggio manuale delle cellule nelle loro immagini istologici che richiede tempo,introducendo così una polarizzazione tra i diversi valutatori e ostacolare la replica da parte di altri gruppi. Spesso, una immagine rappresentativa viene scelto per sottolineare una dichiarazione sulla posizione di cellulare o di co-localizzazione in una pubblicazione, il che rende difficile per il lettore a giudicare la rilevanza statistica di un tale evento.

Insieme con il fatto che l'intero contenuto informazioni di dati dell'immagine è raramente sfruttata, questo sottolinea la necessità di un approccio più imparziale, veloce e completo per analizzare immagini istologiche.

Il midollo osseo è un tessuto complesso, che assume importanti funzioni vitali come organo di ematopoiesi in vertebrati adulti. Oltre ad essere il luogo di nascita di cellule ematopoietiche 1,2 e giocando un ruolo importante nello sviluppo dei linfociti B 3, agisce anche come un luogo in cui vengono avviate le reazioni immunitarie 4 e supporta, le cellule B mature ricircolo 5. Inoltre, il suo ruolo nel mantenere imemoria mmunological è diventato sempre più apprezzato negli ultimi dieci anni, come sono stati trovati per soggiornarvi 6-9 diversi tipi di cellule che costituiscono la memoria immunitaria.

Il rapporto tra l'architettura tissutale complesso del midollo osseo e delle sue funzioni rimangono ancora sfuggente. A differenza di organi linfoidi secondari, che sono organizzati in macro-comparti, come le zone delle cellule T e B, il midollo osseo non ha un chiaro macro-compartimentazione. Finora compartimenti distinti nel midollo osseo sono definite dalla loro vicinanza al corticale ossea o vascolare. L'importanza delle varie popolazioni cellulari stromali residenti nel midollo osseo per un certo numero di processi come le cellule staminali di supporto, sviluppo di cellule B o manutenzione di popolazioni di cellule immunitarie memoria (quali cellule plasmatiche lunga durata (PC), CD4 + e CD8 + cellule T di memoria) indica chiaramente che vi sia un certo grado di micro-compartimentalizzazione nel midollo osseo.

10. La visualizzazione e la caratterizzazione delle cellule stromali del midollo osseo è difficile a causa delle loro caratteristiche morfologiche con lunghi, sottili estensioni dendritiche formando una rete attraverso il midollo osseo, e la mancanza di marcatori appropriati per discriminare sottopopolazioni stromali.

Non è ancora chiaro in quale misura queste nicchie condividono caratteristiche comuni rispetto alla loro compositio cellulare e molecolaren, e quali elementi rendono una certa nicchia unico. Oltre alle cellule stromali, tipi di cellule ematopoietiche hanno dimostrato di giocare un ruolo cruciale fornendo alcuni segnali almeno per alcune delle nicchie. Chiaramente, la complessità della composizione nicchia richiede loro analisi in situ, ed è diventato sempre più importante per immunologi e hematologists per ingrandire osseo microarchitettura ossea, ad esempio, analizzando le relazioni spaziali tra i suoi componenti cellulari.

Qui, una strategia per quantificare cellulari co-localizzazione e di vicinato relazioni nel midollo osseo in modo automatizzato e imparziale è presentato. Un flusso di lavoro dettagliate inclusa la generazione di topi chimerici, l'ospitare cellule fluorescenti stromali e cellule ematopoietiche non fluorescenti, preparazione di sezioni istologiche di ossa undecalcified, acquisizione di immagini confocali coprono l'intero osso, così come l'analisi delle immagini automatizzata di c cellulareo-localizzazione e la convalida / discriminazione dal posizionamento casuale per uno strumento di simulazione è fornito (Figura 8).

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Protocol

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dai comitati statali appropriate per il benessere degli animali (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlino) e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e le disposizioni vigenti (licenza esperimento animale G0194 / 11).

1. Generazione di topi fluorescente Midollo Osseo chimerici

NOTA: La generazione di midollo osseo fluorescente topi chimerici per visualizzare le cellule stromali del midollo osseo viene eseguita come descritto prima delle 9.

  1. Inizia il trattamento di Del-Cre x topi ROSA-tdRFP (topi che esprimono la proteina tandem rosso fluorescente (tdRFP) ubiquitariamente 11-13) per prepararli per irraggiamento. In alternativa, utilizzare qualsiasi altro ceppo con l'espressione ubiquitaria di proteina fluorescente. Somministrare 1 mg / ml di neomicina e 1 mg / ml di vitamine (A, D3, E, C) attraverso l'acqua potabile due giorni prima irradiazione.
  2. Irradiare topi due volte con 3,8 grigio con un Cesio-137 gamma-irradiatore wisottile un intervallo di 3 ore. Per questo, posizionare topi in una gabbia torta irraggiamento adatto per il rispettivo irradiatore.
    NOTA: Per l'irradiazione dei topi, il nostro Istituto non richiede anestesia. Seguire le politiche istituzionali locali riguardanti l'anestesia per l'irradiazione. Trattare gli animali con 5 mg / kg per via sottocutanea di carprofen (sc) al giorno dopo l'irradiazione, se ci sono segni di dolore.
  3. Il giorno successivo, ricostituire topi da una iniezione endovenosa di 3 x 10 6 cellule di midollo osseo ottenuti da ossa lunghe di C57BL / 6 topi donatori nel buffer di trasferimento 9. Mantenere i topi su neomicina e vitamine per un massimo di 2 settimane e monitorare il loro benessere e il peso durante questo periodo. Attendere almeno 4 settimane per consentire la ricostituzione del sistema immunitario prima di iniziare i trattamenti sperimentali specifici (ad esempio, l'immunizzazione) 9.
  4. Sacrificio topi e metterli su una tavola di dissezione, sterilizzare le gambe con il 70% di etanolo. Euthanize topi in conformità con le politiche istituzionali locali. Il nostro Istituto svolge dislocazione cervicale.
  5. Utilizzare pinze e forbici per rimuovere la pelle dalle cosce. Rimuovere il tessuto muscolare per esporre l'osso femorale. Luxate l'osso femorale dal dell'anca e del ginocchio con pinze e forbici. Fare attenzione a non rompere o tagliare l'osso.
  6. Rimuovere accuratamente restanti grandi pezzi di tessuto muscolare e la cartilagine dall'osso con le forbici. Rimuovere restante tessuto muscolare strofinando l'osso con la carta velina di laboratorio. Raccogliere le ossa pulite in una capsula di Petri con tampone fosfato (PBS).
  7. Fissare intere ossa femorali in 4% paraformaldeide (PFA, microscopia elettronica-grade) per 4 - 6 ore.
  8. Eliminare PFA e incubare le ossa nel 10% di saccarosio in PBS O / N. Il giorno successivo, incubare le ossa nel 20% di saccarosio O / N. Il giorno dopo, incubare le ossa di 30% di saccarosio O / N.

2. criosezionamento of Bones

NOTA: Dopo 16-24 ore nel 30% di saccarosio, congelare le ossa e cryosection loro secondo il metodo del nastro di Kawamoto 14,15.

  1. Preparare un grande bicchiere (2,000 ml volume) con ghiaccio secco e acetone (circa 2: 1 rapporto in volume, ad esempio, 400 ml di ghiaccio secco e 200 ml di acetone) sotto una cappa aspirante. Mettere un piccolo bicchiere (150-250 ml di volume) con esano interna (30 - 50 ml circa). Attendere la miscela si raffreddi (circa 10 min, fino a visualizzare gelo all'esterno della grande becher).
  2. Riempire ¾ della cryomold marcato con Super Cryoembedding Medium (SCEM); posizionare con cura le ossa dentro fino a quando non sono completamente immersi, facendo attenzione che non si tocchino i bordi dello stampo. Con grandi pinze tenere la cryomold nel becher con il fondo dello stampo sfiora la superficie del esano.
    1. Sia i bordi esterni del congelamento SCEM (indicato da opacità, questo richiede circa 15 sec). Poi rilasciare completamente lo stampo in esano e lasciarlo freEze 1 - 2 min. Estrarre il campione congelato e avvolgere nel cellophane e poi un foglio di alluminio (per proteggere il campione dalla disidratazione e per evitare l'esposizione alla luce). Conservare a -80 ° C fino criosezionamento.
  3. Per criosezionamento delle ossa femorali utilizzare uno standard di lame microtomo e microtomo per tessuti duri.
  4. Impostare la temperatura del campione e la lama del microtomo a -24 ° C. Lasciate riposare il campione all'interno del microtomo per circa 15 minuti prima del taglio.
    1. Fissare il blocco campione al porta-campioni di metallo con SCEM o la temperatura ottimale di taglio (OCT) medio. Regolare l'orientamento del blocco se necessario. Tagliare il campione fino all'osso è completamente aperta e il midollo è visibile. Regolare lo spessore della sezione di 7 micron (scartare la prima sezione).
    2. Fissare un pezzo di nastro Kawamoto con la parte adesiva sulla parte superiore del blocco campione utilizzando una spatola di legno cervi rivestita in cuoio. Successivamente, tagliare il campione e ruotare il nastro in modo che la sezioneposizionato sul lato superiore. Trasferire il nastro di un vetrino con pinze. Fissare il nastro al vetro scorrevole con scotch.
  5. Lasciate sezioni asciutti per almeno 30 minuti e conservare a -80 ° C fino al loro utilizzo. Conservare vetrini non colorati e montati in scatole di diapositive di plastica con distanziali tra singole diapositive in modo da evitare che si attaccano insieme. Macchiato e montati diapositive possono essere conservati fino a una settimana in cartone cartelle di diapositive a 4 ° C.

3. Immagine Collection

  1. Scongelare e criosezioni macchia secondo protocolli di immunofluorescenza comuni 9. Includere una macchia nucleare, ad esempio, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo dicloridrato (DAPI) per visualizzare l'integrità dei tessuti.
    NOTA: Mordente, per esempio, per RFP di visualizzare le cellule stromali (anti-RFP-biotina anticorpi e streptavidina Alexa Fluor 555), eosinofili macchia con topo anti-principale proteina di base (MBP) e anticorpi anti-rat-Alexa Fluor 647 anticorpi cellule B,con il ratto anti-B220-Alexa Fluor 594 anticorpi e PC con la luce anti-κ catena fluoresceina-iso-tiocianato (FITC) e anticorpi catena-FITC luce anti-λ1 (dettagli della procedura di colorazione sono descritti in 9).
  2. Montare sezioni colorate: mettere una goccia di Fluoromount sulla sezione e poi coprire con un # 1 copertura in vetro antiscivolo, evitando accuratamente la formazione di bolle d'aria. Successivamente, effettuare microscopio confocale a scansione laser con uno strumento equipaggiato con linee laser adatti per la colorazione.
  3. Al fine di registrare le immagini per l'analisi automatizzata di co-localizzazione di cellule ematopoietiche del midollo osseo con cellule stromali utilizzando lo strumento Wimasis, applicare le seguenti impostazioni:
    1. Utilizzare una lente obiettivo 20X e un campo visivo di 708,15 x 708,15 micron. Per l'analisi automatizzata, mantenere le dimensioni di tutte le immagini coerenti a 2.048 x 2.048 pixel (px) per mantenere i risultati comparabili.
    2. Registra un canale per strutture stromali (es, (ad esempio, DAPI, 405 nm) e canali aggiuntivi per le cellule ematopoietiche di interesse (ad esempio, 3 canali, 488/594/633 nm per eosinofili, cellule B e PC).
    3. Registrare le immagini utilizzando la linea media di 4 16. Idealmente, coprono l'intera sezione femorale prendendo immagini adiacenti singoli. In alternativa, scattare foto non adiacenti provenienti da varie regioni del midollo osseo (diafisario e epifisi).
      NOTA: Fare attenzione a non produrre sovrapposizioni tra immagini adiacenti (per evitare analisi ripetute delle cellule nelle zone di sovrapposizione).
  4. Salvare le immagini in un formato di file immagine al microscopio. Controllare e, se necessario, regolare il contrasto per tutti i canali del software immagine viewer / analisi.
  5. Export 3 file .jpg per file immagine: un file .jpg per il canale DAPI (formato rosso / verde / blu (RGB), falso codice colore in giallo), un file .jpg per il canale stroma (scala di grigi) e uno .jpg file contenentei canali di cellule ematopoietiche (3 canali al massimo, formato RGB, ad esempio, FITC (PC, falsi colori: verde) / Alexa Fluor 594 (cellule B, falsi colori: blu) / Alexa Fluor 647 (eosinofili, falsi colori: rosso)) .

4. Automated Image Analysis

  1. Utilizzare uno strumento di analisi di immagine per eseguire la segmentazione di immagini, la quantificazione di co-localizzazione e dintorni analisi (vedi Discussione).
  2. Se si utilizzano gli strumenti Wimasis, procedere come segue:
    1. Caricare i set di 3 file .jpg per immagine con lo stesso nome del file seguito da una sottolineatura e da un numero che indica il tipo di immagine.
    2. Utilizzare _1 per il file jpg con le cellule ematopoietiche, _2 per il file .jpg per il canale DAPI, _3 per il file .jpg per il canale stroma. Per esempio: Image1_1.jpg (cellule ematopoietiche), Image1_2.jpg (canale DAPI), e Image1_3.jpg (canale stroma). Carica le immagini attraverso il conto cliente.
    3. Per contatti cell quantificazionescegliere lo strumento di contatto delle cellule cliccando sul rispettivo campo. Per vicinanze cellule quantificazione, scegliere lo strumento vicinanze cellulare e inserire il raggio vicinanze preferito in micron (che si misura dai bordi delle celle).
    4. Scarica i risultati.
      NOTA: I risultati sono forniti come file jpg mostrano le cellule ematopoietiche e il canale stroma i confini degli oggetti rilevati evidenziati, così come file .csv singoli contenenti le misurazioni per ogni immagine, in aggiunta a una sintesi .csv che contiene i dati relativi a tutte le immagini caricate.
  3. Dal contatto misurazioni determinano la frequenza di cellule ematopoietiche (rosso, verde, blu) o cellule a contatto con le cellule stromali, o le frequenze di globuli rossi, verdi, blu o contattando gli altri tipi di cellule ematopoietiche (un esempio è mostrato nella Rappresentante dei risultati , Figura 4). Per determinare le frequenze, dividere i dati di contatto conteggi per immagine dala cella totale conta per immagine.
    1. Per gli esperimenti con singoli topi, riassumere i conteggi totali contatto di tutte le immagini da singoli topi e dividere la somma della conta delle cellule totali di tutte le immagini.
  4. Dalle misurazioni vicinanze, determinare la frequenza di cellule rosse, verde o blu all'interno della distanza selezionata da cellule stromali e / o le frequenze di globuli rossi, verdi o blu in prossimità preferito agli altri tipi di cellule ematopoietiche come descritto al punto 4.3 ( vedi anche Rappresentante dei risultati, Figura 4).

5. Simulazione di Random Midollo Osseo Posizionamento

  1. Prima di eseguire le simulazioni di posizionamento cellulare casuale sul midollo osseo immagini istologiche analizzate, preparare i seguenti file in anticipo: i file .csv singoli forniti dallo strumento di contatto delle cellule, i file .jpg originali per il canale DAPI ei file .jpg originali per il canale stromale.
  2. Per effettuaresimulazioni lotti su una serie di immagini (ad esempio, tutte le immagini di una sezione femorale), raccolgono tutti i file originali .jpg (_1, _2 e _3) ei relativi file .csv singoli in una cartella.
    NOTA: Lo strumento di simulazione per il posizionamento di cellule di midollo osseo casuale è disponibile su richiesta.
  3. Avviare lo strumento di simulazione, selezionare la casella "Auto-load dati di immagine".
    NOTA: Il programma leggerà i conteggi cellulari e dimensione media delle cellule dal file .csv automaticamente. Questi valori vengono visualizzati nelle caselle per "numero Cell" e "size cellulare AVG" (Figura 5A).
  4. Inserisci il tag comune per i file .csv, cioè, il fattore comune nei loro nomi. Inserire il numero di set di immagini che dovrebbero essere utilizzati per la simulazione in modalità batch.
  5. Caricare il file .jpg generato dal canale stroma (con il nome del file che termina _3).
  6. Immettere le impostazioni per la generazione la maschera dal canale DAPI:
    1. Seleziona la casella "? Applicare maschera "Impostare la soglia per convertire l'immagine DAPI in una maschera binaria a 10 (gamma 0 - 255).
    2. Seleziona la casella "8-bit?" Seleziona la casella "Dilatare?" E impostare il grado di dilatazione di 5 px. Seleziona la casella "w / erosione?".
    3. Inserire il valore desiderato per il raggio vicinanze (raggio quartiere) utilizzati per l'analisi delle immagini simulate. Per un'immagine di 708,15 x 708,15 micron con una dimensione di 2.048 x 2.048 px (pixel scala xy: 0,346 micron), 29 px corrisponde a 10 micron.
  7. Casella "Usa Otsu?", Per usare l'algoritmo di Otsu 17 per il rilevamento automatico delle strutture stromali.
    NOTA: Questo è lo stesso algoritmo utilizzato dallo strumento di contatto e dintorni. Utilizzando lo stesso algoritmo di segmentazione di immagini in analisi automatizzata dell'immagine registrata e l'immagine simulata è cruciale per mantenere i dati comparabili.
  8. Immettere le impostazioni per le cellule ematopoietiche, che are simulato come forme circolari.
    NOTA: I numeri di cellulari per i globuli rossi, verdi e blu sono direttamente caricate dal file .csv (vedi anche punto 5.6).
    1. Utilizzare lo strumento di simulazione per calcolare il diametro medio in px dei globuli rossi, verdi e blu. Determinare la superficie media di una singola cella, la superficie complessiva di ogni tipo di cellula nell'immagine px diviso per il numero totale di cellule per immagine. Utilizzare l'area media per calcolare il raggio del disco usando la formula. Raddoppiare la distanza per determinare il diametro medio.
  9. Misurare la distribuzione delle dimensioni delle cellule dei tipi di cellule analizzate con qualsiasi software di analisi delle immagini che include funzioni di segmentazione degli oggetti. Determinare σ per tutti i tipi di cellule ematopoietiche (18 e Figura 5B).
    NOTA: Poiché le distribuzioni dimensionali cella delle celle registrati non sono determinati dalla analisi di immagine automatica, utilizzare una distribuzione gaussiana come approssimazione delle distribuzioni reali. La larghezza di tegli curva di distribuzione è descritto da σ e può essere molto diverso per i vari tipi di cellule. (Per i dettagli, vedere la Figura 5B).
    1. Da queste misurazioni, determinare il "dimensioni della cella cutoff": il diametro in px che descrive l'oggetto più piccolo ancora riconosciuta come cella completo con lo strumento di analisi dell'immagine.
  10. Immettere i parametri nelle rispettive caselle sull'interfaccia utente grafica (Figura 5A).
    1. Inserire la dimensione della cella tagliato, cioè, la dimensione minima consentita celle nella simulazione, come diametro px.
    2. Inserire σ in px per la simulazione della distribuzione delle dimensioni delle cellule per cellule rosse, verde e blu (dal punto 5.9).
    3. Seleziona la casella "Elimina" nella sottosezione "Celle in Maschera". Con questa impostazione, il programma sceglierà una nuova posizione per una cella se si sovrappone con almeno un pixel con una zona no-go della maschera. Seleziona la casella "evitare sovrapposizioni cellulare? ̶1; nella sottosezione "esclusione Cell".
    4. Inserire la distanza minima consentita tra i centri di due cellule in px.
      NOTA: La distanza minima deve essere determinato dalle immagini registrate. Erroneamente distanze minime misurate porteranno a / risultati artificiali parziali per il confronto delle immagini registrate e simulati.
    5. Impostare la massima area di sovrapposizione al 100% se la sovrapposizione è definita dalla distanza minima da centro a centro.
    6. Impostare lo strumento di simulazione a 1.000 ripetizioni.
    7. Selezionare la casella "cellule di salvataggio automatico?" Per salvare le coordinate degli oggetti simulati per tutte le ripetizioni di ogni immagine del lotto come file .rect (in formato testo). Selezionare la casella "immagini di salvataggio automatico?" Per salvare un file TIFF per ciascuna immagine simulata. Immettere un tag comune per i file salvati.
      NOTA: Il "? Cellule di salvataggio automatico" opzione riduce la simulazione in esecuzione il tempo e la dimensione complessiva dei dati, rispetto a quando si salva l'attuale simulato imaGES. I file .rect memorizzare le coordinate delle celle simulati come rettangoli e possono quindi essere convertiti in immagini simulate se necessario.
  11. Avviare la simulazione facendo clic su "Esegui simulazione".
    NOTA: Lo strumento di simulazione genera automaticamente un file .csv per 1.000 simulazioni di ogni immagine, compresi i conti di contatto medi e conta vicinanze di globuli rossi, verdi e blu con globuli rossi, verdi, blu, e stromali per ogni serie di simulazioni ripetute . Inoltre, per tutti questi valori, vengono forniti medie dei 1.000 simulazioni con deviazione standard (STD) e l'errore standard della media (SEM).
  12. Determinare la media frequenza di contatto e le frequenze vicinanze di un gruppo di 1.000 immagini simulate. Per questo, dividere il contatto media e conta vicinanze del conteggio delle cellule registrate per immagine. Confrontare le frequenze ai risultati dell'analisi co-localizzazione automatizzata dell'immagine registrata.
  13. Applicare STATI appropriateMetodi stical funzione dell'analisi del 19 (per la figura 7, abbiamo usato un Wilcoxon a due code firmato rank test).

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Representative Results

Taglio criosezioni di osso undecalcified con il metodo del nastro Kawamoto permette l'osso intero da tagliare come sezione intatta, con midollo osseo della regione endosseo ancora attaccato all'osso mineralizzato, sia nella diafisi nonché nelle zone epifisarie con la loro alta densità trabecolare ossea (Figura 1). Colorazione nucleare delle sezioni rivela che anche se piccole crepe nel preparato non possono essere completamente evitati, la struttura delle sinusoidi e arterie e la rete reticolare del parenchima rimane intatta.

Come esempio di una colorazione immunofluorescenza di rosso fluorescente midollo osseo chimerico e la sua successiva analisi, è mostrata una colorazione per eosinofili (maggiore proteina basica, MBP), PC (κ e λ luce catena) e cellule B (B220). I topi sono stati immunizzati con 100 mg di 4-idrossi-3-nitrophenylacetyl aptene accoppiato γ pollo globulin (NP-CGG) in allume ip, 4 settimane doporicostituzione, potenziato con 50 mg di NP-CGG in PBS iv 21 giorni dopo e analizzato il giorno 30 dopo la spinta. L'analisi delle immagini automatizzata comportato una rilevazione molto precisa delle strutture stromali, compresi anche molto piccoli frammenti di processi reticolari. Poiché il numero di cellule di cellule stromali non può essere determinata con il sistema qui presentato (vedi anche Discussione), senza soglia dimensionale è stato introdotto per il canale stromale, al fine di rilevare tutti i frammenti di immagini (Figura 2). PC e eosinofili sono più grandi di cellule B e mostrano anche una forma più eterogeneo. Tutti e tre i tipi di cellule sono stati ben riconosciuto a prima vista. Cluster cellulari, in particolare delle cellule B, erano ben separati. Lo strumento di analisi è ottimizzato per i tipi di cellule di cui sopra (eosinofili, PC, B cellule). Per altri tipi di cellule, le regolazioni possono essere necessarie. I file .csv generati dallo strumento di contatto delle cellule contengono le seguenti misure rilevanti per cellule ematopoietiche:conta delle cellule per ogni popolazione di cellule; superficie totale per ogni popolazione di cellule in px; conteggio contatto dei globuli rossi (in questo caso eosinofili), le cellule verdi (qui PC) o cellule blu (qui cellule B) con globuli rossi, verdi, blu o grigio (cellule stromali). I file .csv generati dallo strumento vicinanze cellule contengono le seguenti misure per le cellule ematopoietiche: numero di celle per ogni popolazione di cellule; superficie totale per ogni popolazione di cellule in px; conteggio vicinanze dei globuli rossi, verdi e blu con globuli rossi, verdi, blu e grigio (cellule stromali).

Per convalidare la qualità degli strumenti di analisi dell'immagine, i risultati delle analisi automatizzata stati confrontati a quello di un conteggio manuale 6 valutatori addestrati (Figura 3). Tutti i valutatori hanno ricevuto immagini identiche per l'analisi. Strutture stromali e cellule ematopoietiche sono state accuratamente delineati con uno strumento di analisi di immagine e di queste regioni di interesse sono stati salvati e analizzati. Per le strutture stromali, la superficie totale per immagineè stata confrontata tra analisi automatizzata e manuale. Strutture stromali sembravano essere difficile per i valutatori addestrati a riconoscere esattamente, come risulta dalla grande varianza osservata per la dimensione della superficie totale della stroma contati manualmente (Figura 3A). Qui, l'analisi automatizzata determinato un valore vicino alla superficie media rilevata da valutatori addestrati. Per tutte le cellule, lo strumento di analisi automatizzata determinata una quantità leggermente inferiore di cellule di contato manualmente. Tuttavia, per PC e eosinofili, il numero era ancora nel range della varianza interrater osservato per i conteggi manuali. Il numero di cellule B identificati mediante analisi automatizzata, tuttavia, era leggermente al di sotto di questo intervallo (Figura 3A). La dimensione della cella media (area in px), come determinato dalla analisi automatizzata era 512 px per PC, 436 px per eosinofili, e 317 px per le cellule B, mentre valutatori addestrati determinato una dimensione di 515 px per PC, 464 px per eosinofili, e 291 px per le cellule B. Pertanto, la media cdimensione ell per le cellule B, PC e eosinofili determinati dalla analisi automatizzata era paragonabile alle dimensioni delle celle medi rilevati da valutatori manuali (Figura 3B). Questo strumento di analisi automatica delle immagini può ora essere utilizzato per quantificare i contatti diretti di candidato midollo osseo tipi di cellule di nicchia. Inoltre, la frequenza delle cellule di un certo tipo di cellule stromali vicine o altri tipi di cellule ematopoietiche può essere determinato. Un'analisi di PC del midollo osseo e alla loro contatti stromali cellule, eosinofili, cellule B, e altri PC è mostrato, così come la frequenza di PC confinanti questi tipi di cellule all'interno di 10 e 20 micron (Figura 4A). Inoltre, le frequenze di contatto di vari tipi di cellule ematopoietiche con stroma possono essere quantificati (Figura 4B).

Prima di eseguire una simulazione di posizionamento casuale midollo osseo di queste cellule con lo strumento di simulazione, i parametri che descrivono la distribuzione delle dimensioni delle cellule come GausDistribuzione sian devono essere determinate. Per una distribuzione gaussiana, che può essere visualizzato come una curva "a campana" simmetrica e, necessitano solo due parametri da determinare: la posizione del centro della curva (modalità, cioè, dove si trova il picco della curva ) e la larghezza della curva simmetrica (questo è descritto dal parametro σ citata). Questa procedura è mostrato per PC, eosinofili e cellule B (Figura 5B). Distribuzioni dimensionali cellule misurati dimostrano che, per le cellule B, la larghezza della curva di distribuzione descritto da σ è inferiore per PC e eosinofili. Per la simulazione, i valori relativi di σ misurato per i tre popolazioni di cellule sono state mantenute (cioè, le cellule B sono stati sempre simulati da una distribuzione stretta due volte più grande di quella dei PC 'ed eosinofili'), mentre i valori σ definiti in px erano set per abbinare l'aspetto visivo delle cellule registrate (Figura6B). Questo ci ha portato ad applicare un σ di 2 px per le cellule B e σ di 4 px sia per PC e eosinofili. Il cutoff dimensioni delle cellule è stato determinato dalle distribuzioni di dimensione delle cellule misurata. Per PC e eosinofili, un taglio a 300 px dimensioni dell'oggetto, con conseguente 20 px di diametro per un oggetto circolare (circa 7 micron) e per le cellule B un taglio a 220 px, portando ad un diametro 17 px (circa 6 micron) è stato utilizzato per la simulazione.

Per definire aree dell'immagine simulata casuale che accettano le cellule ad essere immessi dallo strumento di simulazione, una maschera è stata generata dai segnali nucleari nel canale DAPI di midollo osseo immagine istologica (figura 6A). Un valore di 10 è stato determinato per essere la soglia ottimale di intensità per la generazione le immagini binarie (pannello superiore, immagine a destra). La soglia determinata dall'algoritmo di Otsu non comporti pieno riconoscimento di tutti i nuclei nell'immagine (pannello superiore, dell'immagine centrale), analogamente a intensità fissasoglie di 50 o 150 (pannello inferiore, sinistra e immagine al centro) .La rilevanza di contatti di PC, eosinofili o cellule B con cellule stromali (Figura 4B) è stata testata utilizzando lo strumento di simulazione (Figura 7). Questa analisi ha rivelato tassi di contatto significativamente più alti nelle immagini registrate rispetto alla simulazione per PC e le cellule B (Figura 7A), in linea con il concetto di nicchie stromali supportano queste popolazioni. Ciò è stato confermato in 5 singoli topi chimerici fluorescenti (Figura 7B, D). Al contrario, nessuna differenza evidente è stato determinato nel caso di eosinofili (Figura 7A, C).

Figura 1
Figura 1. Descrizione immagine di fluorescenza di una sezione longitudinale di un femore murino cryosectioned con il metodo del nastro Kawamoto. Il metodo permette nastro cutting sezioni con una regione endosseo intatta, sia nella diafisario nonché nelle zone epifisarie, dall'osso undecalcified. Una sezione 7 micron di spessore osseo di un ingenuo C57BL / 6 del mouse era macchiato per la proteina della matrice extracellulare laminina (rosso), per Sca-1 per visualizzare arteriole (verde) e per nuclei (blu, DAPI). 47 piastrelle di 1.446 x 1.088 micron, risoluzione 1.360 x 1.024 px sono stati registrati e cucita per creare l'immagine panoramica. Questa immagine è stata acquisita su un microscopio a fluorescenza a grande campo, con una lente obiettivo 10X (0,45 NA). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. automatico di rilevamento delle cellule stromali e ematopoietiche del midollo osseo. Una sezione osso femorale di una chi fluorescente rossaMouse Meric il giorno 30 dopo spinta era macchiato di RFP (grigio) per visualizzare stroma, MBP (rosso, eosinofili), κ e λ catena leggera (verde, PC) e B220 (blu, cellule B). Sinistra: immagine originale acquisita su un microscopio confocale, utilizzando una lente obiettivo 20X (0,8 NA) e un campo di vista di 708,15 x 708,15 micron. Destra: immagine segmentata. I contorni degli oggetti riconosciuti vengono evidenziati. I rettangoli bianchi segnano l'area mostrata nelle immagini in basso. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Validazione di analisi delle immagini automatizzata da valutatori qualificati. (A) Superficie totale di strutture stromali e numeri cellulari totali di cellule ematopoietiche contate da valutatori formati in uno (strutture stromali), 10 (PC), due (eosinofili) e un'immagine (cellule B) rispetto al numero di cellule ottenute mediante analisi automatizzata dell'immagine. Dots rappresentano singoli valutatori (n = 5-6). Bar indicano valori medi o valori determinati automaticamente. (B) Oggetto distribuzione delle dimensioni degli oggetti contati manualmente rispetto alla dimensione media oggetto determinato mediante analisi automatizzata. Al fine di tener conto delle diverse frequenze dei vari tipi cellulari, i PC sono stati contati in 10, eosinofili in due e B cellule in una sola immagine. Dots rappresentano singoli oggetti. Le linee indicano media. (C) delineare Manuale di strutture stromali da valutatori qualificati. A sinistra: immagine originale. Middle: esempi di immagini analizzate manualmente. A destra:. Strutture stromali rilevati da analisi automatizzata Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. automatizzata analisi co-localizzazione di PC, eosinofili, cellule B e le cellule stromali del midollo osseo del femore. (A) A sinistra: Frequenza di PC a diretto contatto con le strutture stromali, eosinofili, cellule B o altri PC fluorescente topi chimerici il giorno 30 dopo la spinta. Middle e destra: Frequenza di PC in 10 micron vicinanze o 20 micron prossimità di strutture stromali, eosinofili, cellule B o altri PC. Parti di questa figura (contatto diretto, 10 micron dintorni) vengono modificate da Zehentmeier et al. 9 (B) Frequenza di PC, eosinofili e cellule B in diretto contatto con le strutture stromali. 52-515 PC, 918-3179 eosinofili, 4.146-13.063 B cellule in 10-21 immagini sono stati contati da 5 topi chimerici fluorescenti giorno 30 dopo la spinta, pool da due esperimenti indipendenti. Dots rappresentano singoli topi. Le linee indicano mediana.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Determinazione della distribuzione delle dimensioni delle cellule di midollo osseo PC, eosinofili e cellule B. (A) Schermata dell'interfaccia utente grafica (GUI) dello strumento di simulazione. (B) La distribuzione dimensione della cella (area in px) dei PC (κ e luce λ catena, verde), eosinofili (MBP, rosso) e le cellule B (B220, blu) è mostrato in istogrammi misurata dopo il riconoscimento di oggetti da software Volocity (pannello superiore). Nelle immagini del midollo osseo del femore (pannello inferiore), rilevati i PC sono contrassegnati in rosso (sovrapposizione giallo), eosinofili in blu (sovrapposizione viola) e le cellule B in giallo (si sovrappongono grigio). Segmentazione immagine è stata eseguita fissando una soglia minima dimensione di 180 px per PC,300 px per eosinofili e 220 px per le cellule B. 250 oggetti sono stati misurati per PC, 650 oggetti per eosinofili e 3.000 oggetti per le cellule B. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Generazione della maschera per il posizionamento delle cellule casuale simulata. (A) Il canale originale DAPI (giallo) e sovrapposizioni di DAPI con immagini binarie generate applicando diverse soglie sono mostrati. La maschera generata dalla immagine binaria (soglia impostata su 10) seguito (pannello in basso, immagine a destra) viene visualizzato. Le aree nere rappresentano no-go zone, aree bianche rappresentano le aree in cui sono consentite le cellule ad essere immessi. (B) L'immagine registrata (a sinistra) e la corrispondente immagine simulata (a destra) mostrano alta visivosomiglianza. Gli eosinofili (MBP), PC (κ e catena λlight), cellule B (B220) e le cellule stromali (RFP) vengono visualizzati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. Il contatto diretto di tipi di cellule ematopoietiche con strutture stromali in immagini simulate registrate contro. (A) Frequenza di PC, eosinofili e cellule B a diretto contatto con stroma in simulato rispetto alle immagini registrate di fluorescenza topi chimerici il giorno 30 dopo la spinta. Linee collegano corrispondente simulati e le immagini registrate (punti). Immagini di un mouse rappresentante sono indicati in ogni trama. (B) le frequenze di PC, eosinofili e cellule B a diretto contatto con stroma in simulato rispetto alle immagini registrate su 5 singoli topi da due esperimenti indipendenti. Wilcoxon rank test, due code (PC: *** p = 0,0001; p = 0,0371 *; * p = 0,0161; ** p = 0,0012; **** p <0,0001; eosinofili: *** p = 0,0007 ; p = 0,1055; p = 0,0161 *; p = 0,4143; p = 0,0007 ***; B cellule: **** p <0,0001; ** p = 0,0020; *** p = 0,0005; ** p = 0,0012 ; **** p <0,0001). Dots rappresentano le singole immagini. Barre indicano media. Valori di P 0,05 sono considerati differenze significative. Gli asterischi in cifre indicano i seguenti valori di P: ns: p> 0.05; *: P 0,05; **: P 0.01; ***: P 0,001; ****: P 0.0001. Parti di questa figura (contatto diretto del PC con strutture stromali) vengono modificate da Zehentmeier et al. 9 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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. Figura 8. workflow completo dell'approccio quantificazione delle cellule ematopoietiche - interazioni cellulari stromali in murino midollo osseo L'approccio si divide in tre parti principali: 1. sezioni del midollo osseo di topo sono preparati e dati grezzi sono raccolti da scansione laser microscopia confocale, 2 . viene eseguita l'analisi automatica delle immagini registrate e la simulazione di posizionamento casuale di cellule del midollo osseo, 3. i contatti e di vicinato conteggi ottenuti da immagini registrate e simulate vengono confrontati. L'ingresso (file immagine) e di uscita (file di testo) delle analisi automatizzata è indicato in blu, l'ingresso (file immagine) e di uscita (file di testo e, facoltativamente, i file di immagine) del strumento di simulazione è indicato in verde. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Nonostante i progressi in moderni metodi di imaging ottico, l'analisi dei dati istologica è ancora spesso ostacolato dalla mancanza di strumenti di quantificazione ei modi, o da analisi parziali che si concentrano su una piccola area di interesse. L'approccio sinergico qui presentato combina analisi dell'immagine che copre l'intera regione di midollo osseo, la segmentazione automatica e rilevamento di oggetti di diversi tipi di cellule ematopoietiche e stromali, analisi co-localizzazione, ed infine uno strumento di convalida di contatti non si verificano casualmente fornite da un nuovo CUSTOM- software di simulazione progettato.

Istologia di ossa interi compresi midollo osseo è stata difficile da ottenere per le varie densità tessuti presenti in una sezione - una parte molto duro, osso mineralizzato, invece midollo estremamente fragile, che viene facilmente interrotto quando cut insieme con l'osso. In alternativa, il metodo a nastro per il taglio di sezioni ossee presENTED qui 14,15 ha il vantaggio che stabilizza il tessuto, lasciando così le aree endostali intatta (Figura 1). Oltre ad essere ricco di osteoblasti, queste zone sono state proposte a svolgere un ruolo in cellule staminali di manutenzione 20.

Il ruolo cruciale delle cellule stromali nei processi di sviluppo e manutenzione cellulari nel midollo osseo sta diventando sempre più evidente. Tuttavia, l'analisi di questi rari, fragili cellule si è dimostrato difficile per due ragioni: primo, sono difficili da isolare dal midollo osseo; secondo, il grado di eterogeneità della popolazione stromale non è nota, e quindi si può perdere una popolazione importante utilizzando alcuni marcatori che sono state descritte per le cellule stromali. Il metodo per generare chimere fluorescenti midollo osseo è utile mark fluorescente e successivamente analizzare la popolazione di cellule stromali del midollo osseo nel suo complesso. Tuttavia, va notato che in questi mice tutte le cellule mesenchimali del midollo osseo sono visualizzati, comprese le cellule endoteliali e osteoblasti. Questo deve essere preso in considerazione se i dati provenienti da tali topi chimerici viene analizzato. Anche se vi è anche il rischio di cellule ematopoietiche di origine destinatario sopravvissuti l'irradiazione, queste cellule tipicamente coprono solo una piccola area per campo visivo rispetto al CD45 + cellule del donatore, pertanto non modificano l'analisi istologica 9. Chiaramente, questo metodo dovrebbe essere combinata in una fase successiva con una rilevazione più specifica stromali (sotto) popolazioni. Attualmente, l'analisi di queste cellule è effettuata principalmente tramite istologico per i motivi di cui sopra, che impone un limite al numero di parametri che possono essere analizzati allo stesso tempo. Lo sviluppo di multi-parametro di analisi in microscopia aiuterà a superare questi limiti.

Durante l'analisi dell'immagine, la segmentazione è stata effettuata utilizzando l'algoritmo originale Otsu. Essenzialmente, Questo metodo thresholding basata clustering determina automaticamente la soglia di intensità per la separazione ottimale del piano (segnale) e di fondo (rumore) pixel in due gruppi con la divergenza statistica più basso in un dato canale, determinando un'immagine binaria 17. Qui, Metodo Otsu stato applicato alla versione logaritmo naturale dell'immagine originale, cioè:

Immagine Ingresso per Otsu = ln (Immagine in entrata)

Questo funziona meglio per le immagini di fluorescenza dal metodo di Otsu può identificare cellule dim come sfondo. Aggiungendo la funzione logaritmica permette una migliore separazione delle cellule e lo sfondo in due classi differenti dall'algoritmo di Otsu. Tuttavia, thresholding intensità da sola non è sufficiente per rilevare con precisione oggetti singoli. Funziona efficiente quando rilevare oggetti ben separati nelle immagini, ma non è sufficiente a cellule singoli separati situati nei poli. Come alcuni dei tipi di cellule cheerano di interesse per noi, come ad esempio gli eosinofili o cellule B, sono spesso raggruppati insieme nel tessuto, i loro nuclei nel canale DAPI sono stati segmentati utilizzando un algoritmo basato sulla significa k-raggruppamento dell'istogramma intensità con k = 10 21. La algoritmo di segmentazione cella tracciare la più brillante ai pixel più debole (raggruppati in 10 scomparti) e cercare costantemente per la formazione di oggetti cellule Simile. Questi oggetti verranno definite come cellule. Quando sono stati utilizzati tutti i pixel, i nuclei risultanti sono dilatati per generare una maschera che viene poi applicata ad altri canali di separazione cluster.

Va notato che questa analisi funziona bene per le cellule ematopoietiche che sono compatti, ma che è limitato rispetto alle cellule stromali, in quanto non è possibile determinare i confini di questi grandi cellule distribuite a causa di interconnessione della loro estensioni dendritiche che formano una rete reticolare. Così, cellulare conta cellule stromalinon può essere fornita. Etichettatura singole cellule tramite giornalisti destino-mapping sotto il controllo di promotori specifici stroma risolverà questo problema, secondo quanto è stato pubblicato per i neuroni (utilizzando il "Brainbow" system 22) e per l'etichettatura di cellule follicolari dendritiche nei linfonodi 23.

Oltre ad applicare una fase di riduzione del rumore per tutti i canali escludendo oggetti sotto 30 px, esclusione dimensionale stato applicato nel processo di riconoscimento di oggetti per ematopoietica ma non stromale cellule. Piccoli frammenti di cellule che sono state tagliate dalla sezionatura possono essere esclusi; Tuttavia, la perdita può essere trascurata in questo caso a favore di un riconoscimento univoca delle cellule. Estendendo l'analisi e la simulazione da due a tre dimensioni sarà superare questa limitazione. Lo sviluppo di metodi per studiare la distribuzione cellulare in supporti interi, ad esempio, mediante microscopia fotoni più o luce foglio microscopio / SPIM, sarà certamente di aiuto in thè il rispetto. Per studiare la composizione cellulare complesso di nicchie multicomponente, sarà anche necessario estendere il numero di parametri che vengono analizzati in situ. Approcci promettenti per l'analisi multiparametrica di informazioni istologico in combinazione con citometria quantificazione sono stati pubblicati di recente 24, 25.

L'analisi è stata eseguita contatto quantificando la sovrapposizione di due oggetti. Il contatto diretto è stata definita come una sovrapposizione di almeno un pixel. È importante sottolineare che, questa analisi è limitata dalla risoluzione delle immagini microscopia e dipende quindi dalla lunghezza d'onda e la modalità di eccitazione, nonché l'apertura numerica della lente obiettivo utilizzato nel microscopio, e la dimensione pinhole. Nell'analisi qui illustrato, un obiettivo 0.8 NA, 20X con combinazioni fluorocromi eccitato con 488, 561, 594, e 633 nm è stato applicato utilizzando uno di eccitazione fotone. Quindi, risoluzione laterale valori tra0,372 e 0,483 micron sono stati raggiunti. Questo permette asserzioni da effettuare sulla giustapposizione di diversi sottoinsiemi di cellule; tuttavia, non fornisce alcuna informazione circa meccanismi molecolari putativi coinvolti in interazioni cellulari. Inoltre, sono necessari altri metodi come 2-photon microscopia intravitale per migliorare la caratterizzazione di questi contatti intercellulari 9. Förster-risonanti trasferimento di energia (FRET) sistemi basati può aiutare per confermare se queste interazioni sono in realtà funzionali 26.

Per valutare il microambiente cellulare di nicchie tissutali, non solo è fondamentale per analizzare i contatti diretti cella, ma anche per quantificare i tipi cellulari in prossimità di un certo tipo cella di interesse ("analisi vicinanze"). Precedentemente pubblicato studi distanze tra cellule e strutture tissutali misurati come navi in base alla posizione del nucleo 27. Dato che eravamo interessati a determinzione la distanza di vari tipi cellulari, in parte con diversi rapporti di nucleare volume del citoplasma, abbiamo preferito per misurare la distanza tra le superfici. A questo scopo, abbiamo calcolato il raggio vicinanze determinando la distanza euclidea da un confine elettriche della cellula dopo la conversione dei valori da micron a px. La distanza euclidea è la distanza in linea retta tra due pixel e può essere descritto dalla formula 28:
Equazione 1

Cellule con i pixel dei loro confini entro una distanza euclidea di esempio, 10 micron dai pixel di confini di una cella di destinazione sono stati contati come vicina questa cella.

Nella sua forma attuale, l'analisi determina solo se una cella è contattato o avvicinato da un'altra cella dello stesso o di tipo diverso, offrendo solo un binario SI / NO caratterizzazione. Il numero effettivo di cellules che contattare la cellula di interesse o sono una determinata distanza da esso non viene calcolato. Il passo successivo sarà estendere l'analisi di corrente in modo che la dimensione del gruppo di contatto o di cellule vicine può essere rilevata e confrontata tra differenti cellule bersaglio dello stesso tipo. Questo porterà ad ulteriori importanti informazioni sulla composizione di nicchie midollo osseo, come la nicchia di sopravvivenza per le cellule plasmatiche midollo osseo, per cui un contributo variabile di cellule accessorie ematopoietiche è stato discusso 29-33.

Gli algoritmi di riconoscimento degli oggetti sono stati ottimizzati insieme con gli specialisti di Wimasis usando il loro servizio soluzione personalizzata disponibile in commercio e sono disponibili su richiesta. Un'altra opzione è quella di utilizzare software disponibile in commercio per l'analisi delle immagini, come ad esempio Definiens, Volocity, o Imaris, o freeware come il CellProfiler.

La segmentazione delle cellule e di analisi delle immagini strumenti automatizzati noire convalidato confrontando i risultati con dati analizzati manualmente forniti da 6 valutatori immagine addestrati rispetto ai due parametri, vale a dire la dimensione dell'oggetto e il numero di cellule in varie popolazioni cellulari. Come mostrato nella Figura 3B, la dimensione media oggetto per cellule ematopoietiche (PC, eosinofili e cellule B) era simile tra i due metodi, con una varianza superiore per la determinazione formato manuale plasmacellule ed eosinofili, probabilmente a causa della loro forma più irregolare rispetto a B cellule. Il rilevamento automatico del numero di cellule prodotto valori leggermente inferiori a quelli rilevati manualmente. In particolare, erano ancora all'interno della gamma dei valori manuali nel caso di eosinofili e PC, mentre erano sotto di questi valori nel caso di cellule B, probabilmente a causa di una maggiore eterogeneità di espressione di B220, che è stato utilizzato come marcatore per le cellule B. B220 è conosciuto per essere up-regolata durante B differenziazione cellulare nel midollo osseo e le cellule B a basso e ad alto intensity colorazione per B220 può essere osservato. Cellule B con segnali a bassa B220 è sceso sotto la soglia applicata, che può aver portato all'esclusione delle cellule primi stadi B. Una soglia inferiore per la rilevazione automatica potrebbe risolvere questo problema. Per le cellule stromali, che sono più difficili da individuare a causa della loro meno compatto, più dendritiche, e la morfologia disteso, il rilevamento manuale comportato alte variazioni tra i singoli valutatori. È interessante notare che l'area totale medio di stroma è uguale all'area totale determinata automaticamente, indicando che l'analisi è adatto a compensare polarizzazione individuale dai valutatori. Presi insieme, questi dati dimostrano che i risultati automatici rappresentano generalmente i valori medi di analisi manuale e sono particolarmente indicati per ridurre la variabilità interrater nell'analisi.

Per discriminare posizionamento casuale e non casuale di cellule entro i limiti strutturali del tessuto, è stato sviluppato uno strumento di simulazione. Durzione la simulazione, un'immagine artificiale con cellule ematopoietiche posizionati casualmente viene creato per ogni immagine registrata istologico del midollo osseo. Innanzitutto, l'immagine del canale stroma è utilizzato nel suo formato originale. Una maschera viene generato dall'immagine DAPI applicando una soglia basato intensità fissa, convertendo così l'immagine in formato binario; la maschera binaria poi subisce più passaggi di dilatazione e di erosione pixel-based. La maschera definisce le aree nel campo dell'immagine in cui sono consentite le cellule simulate da posizionare. Le coordinate dei centri delle cellule simulati sono forniti da un generatore di numero casuale uniforme, i cui confini dove determinate dalla dimensione dell'immagine. Le informazioni sul numero di cellule e la dimensione media delle celle per ogni popolazione determinata dalla analisi delle immagini automatizzata delle immagini registrate vengono utilizzati per definire le popolazioni simulate di cellule ematopoietiche. Il diametro delle cellule simulato si presume seguire una distribuzione gaussiana unidimensionale da cui l'attualediametro cella è scelto a caso: il diametro viene quindi modificato in modo che siano introdotti formato cella cut-off per la dimensione minima ammissibile oggetto. Nel caso in cui la cella simulato sarebbe posizionato in modo tale che uno o più pixel sovrappongono con zona no-go o sarebbe all'interno di una distanza predefinita da un'altra cella già collocato (4 micron da centro a centro come determinato nelle immagini registrate), nuove coordinate casuali sarà scelto mentre il diametro rimane inalterato. Questo viene ripetuto finché il numero di cellule simulati uguale al numero di celle della immagine registrata.

Lo strumento è stato basato sul presupposto che le cellule ematopoietiche possono essere posizionati liberamente nel midollo osseo, mentre le strutture stromali agiscono come una matrice fissa all'interno del tessuto. Lo strumento è stato ottimizzato per la situazione nel midollo osseo dove aree parenchimali sono attraversate da un complesso sistema di sinusoidi. Un approccio di modellazione simile è stato recentemente pubblicato da Frenette e collaboratori al fine dianalizzare il posizionamento di cellule staminali ematopoietiche in relazione alle cellule stromali e strutture vascolari, che costituiscono circa il 30% del midollo osseo femorale volume totale 25. Per correggere questo effetto, lo strumento di simulazione qui presentata si basa su una maschera di aree erano cellule permessi da posizionare. Ciò è stato ottenuto utilizzando un'immagine colorazione nucleare, in cui gli oggetti che rappresentano i nuclei sono stati espansi da una dilatazione 5-passo (vedi Figura 6) dopo binarizzazione. Le aree con una bassa densità cellulare, vale a dire, a bassa densità di nuclei, come ossa e sinusoidi, non contribuiranno alla maschera e quindi diventare zone no-go. Per evitare una riduzione artificiale di questi no-go zone nel procedimento dilatazione, erosione 5-passo è stato applicato successivamente, riaprendo così grandi aree di esclusione, lasciando l'alta densità nucleare (quindi "accettati") aree inalterato. Questo metodo può essere facilmente adattato per altri organi linfoidi. In quelle tproblemi erano questo metodo potrebbe non funzionare (ad esempio, in zone dove sono presenti cellule con un alto rapporto citoplasma / nucleo), altri metodi come etichettatura citoplasmatica possono essere usati per creare la maschera.

Cellule ematopoietiche sono stati simulati come oggetti circolari cui dimensione è stato determinato utilizzando un generatore di numero casuale gaussiana, la media dei quali accordo con il diametro medio calcolato di ciascun tipo di cellula. La larghezza della distribuzione è basata sulla distribuzione delle dimensioni delle cellule misurata nelle immagini registrate come determinato da un software di analisi di immagine. Per tener conto del fatto che piccoli frammenti cellulari sono stati esclusi nella analisi di immagini automatizzata, sono stati introdotti formato cella cut-off come determinato dalle distribuzioni misurate dimensioni della cella per ciascun tipo cellulare (vedi Figura 5).

Naturalmente, questo funziona bene per i tipi di cellule che sono relativamente uniformi nella loro dimensione e forma, ma possono causare problemi nel caso di cellule che unri estremamente eterogenea rispetto a questi parametri. Va notato che questa analisi è ottimizzata per i principali tipi di cellule ematopoietiche del midollo osseo (granulociti, progenitori ematopoietici e linfociti), che hanno in comune il fatto di possedere una forma regolare, quasi arrotondata. Tuttavia, questo metodo non è stato testato per le cellule dendritiche, macrofagi o tipi di cellule con corpi cellulari fortemente irregolari. Analizzando tali cellule presenteranno nuove sfide alla nostra analisi automatizzata immagine nonché l'approccio della simulazione, compresa la necessità di migliorare grappolo cella algoritmi di separazione 24, nonché la forma dettagliata analisi e simulazione di non solo le cellule di dimensioni diverse, ma anche di forma diversa. Un'alternativa sarebbe un approccio di simulazione che funziona con le forme esatte come registrato. Tuttavia, si deve notare che questo metodo aumenterebbe significativamente il comportamento deterministico del sistema modello.

Per la expe simulatoriments, sono stati generati 1.000 ripetizioni della simulazione per ogni immagine registrata. Utilizzando questo molte ripetizioni ridurrà l'errore relativo contributo di processo simulazione stessa a circa il 3%. Vale a dire, se i valori cellula-cellula co-localizzazione sono calcolati da simulazioni che sono casuali, allora il processo di simulazione stessa sarà caratterizzato da una funzione di errore -1/2 N, dove N è il numero di simulazioni per immagine misurata. Questo è il contributo del processo di simulazione stessa all'errore accumulata dei valori co-localizzazione misurati. Così, per N = 1000 l'errore contribuito è 3.16%. Le simulazioni riportate qui ha funzionato per 20 a 60 minuti per immagine per 1.000 ripetizioni quando solo il salvataggio delle immagini simulate come file .rect (un semplice formato testo), piuttosto che come immagini reali in formato .jpeg o .tiff (anche un'opzione nel software ).

Nel loro insieme, questo approccio permette un imparziale, analisi high-throughput immagine istologica dis e consente la generazione di dati statisticamente rilevanti. Questo può essere utile nel confrontare localizzazione cellulare in condizioni diverse. Inoltre, la componente temporale può in futuro essere integrate in un approccio di modellazione di movimenti delle cellule del midollo osseo, come più dati sulla motilità di vari tipi di cellule nel midollo osseo diventa disponibile. Questo metodo può quindi essere utilizzato per simulare perturbazioni del sistema, come la mobilizzazione delle cellule dal midollo osseo nella circolazione, ad esempio, neutrofili nel caso di un'infiammazione acuta 34. Per chiarire ulteriormente la funzione del midollo osseo come deposito per celle di memoria immunitarie, si può anche immaginare estendendola per modellare il concorso per fattori di sopravvivenza. Inoltre, l'eventuale diafonia tra nicchie distinte potrebbe essere affrontata, così come l'induzione di nicchie. Insieme, questo aiuterà a capire i cambiamenti fisiologici (ad esempio, trigger per il comportamento rigenerativa delle cellule staminali) come well come le perturbazioni patologiche del sistema nel suo complesso, per esempio nel caso di disturbi autoimmuni, neoplasia, o infiammazione acuta. Come parte di un concetto iterativo dell'esperimento e modellazione, nuove ipotesi possono essere generate in base simulazioni, che a sua volta può essere nuovamente testati sperimentalmente, contribuendo così a comprendere ulteriormente la funzione e l'interazione di vari tipi cellulari all'interno della complessità dei tessuti.

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Acknowledgments

Ringraziamo Andreas Radbruch per le discussioni di valore. Siamo grati a Sabine Gruczek, Patrick Thiemann e Manuela Ohde per l'assistenza con la cura degli animali e Robert Günther per un'eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo i nostri valutatori qualificati Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Firenze Pache e Katharina Horn per la valutazione dei campioni istologici e Randy Lindquist per revisione del manoscritto. Ringraziamo J. e N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, Stati Uniti d'America per gli anticorpi MBP-specifici.

Questo lavoro è stato sostenuto dalla DFG HA5354 / 4-1, da Jimi-una sovvenzione nucleo DFG rete impianto per la microscopia intravitale e TRR130 / TP17 e DFG PER 2165 (HA5354 / 6-1) per AEHSZ è stata sostenuta dalla Max Planck Internazionale Scuola per le Malattie Infettive e Immunologia (IMPRS-IDI), Berlino.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neomycin Sigma N6386 SIGMA Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC Serumwerke Bernburg 1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin) Sigma P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg Rockland D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade) Science Services 15713 EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose Carl Roth 4621.1
Dry ice
Acetone Sigma-Aldrich 179124 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane Sigma-Aldrich 208752 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard) Sakura 4557 25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583
Kawamoto's SCEM embedding medium Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit  Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9) Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile Thermo Scientific 3052835 L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated Rockland 600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin Life Technologies S-32355
Rat anti-MBP J. and N. Lee available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647 Life Technologies A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594 produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium DAKO S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) Carl Roth H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm) VWR 48311-703
Laser scanning confocal microscope equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow Wimasis, Munich The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime Microsoft free download
Simulation tool for random cell positioning available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software  free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).

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