Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue. J. Vis. Exp. (97), e52550, doi:10.3791/52550 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

De hippocampus speelt een belangrijke rol in het geheugen en het leren evenals emotioneel gedrag. Een hoofdfunctie bestaat uit de consolidatie van kortetermijngeheugen in lange termijn geheugen, die een hoge plasticiteit van het zenuwstelsel vereist. De dentate gyrus van de hippocampus treedt op als eerste gateway voor ingangsinformatie en is één van twee hersengebieden met voortdurende neurogenese volwassen leeftijd 1,2. De ontwikkeling van de hippocampus constructie optreedt tijdens de late embryogenese en vooral tijdens de eerste 3-4 weken postnatale 3. Tijdens de vroege ontwikkeling van de gyrus dentatus een stamcel zwembad gevestigd is, is vereist voor postnatale evenals volwassen neurogenese 4. Het ontwikkelen van neuronen passeren verschillende stadia, van de stamcel door verschillende stadia van voorlopercellen naar het onvolwassen en tenslotte de volwassen neuron tijdens postnatale evenals volwassen neurogenese. In verschillende stadia van de expressie van neurogenesespecifieke genen is vereist om de rijping en integratie van nieuwe neuronen in de hippocampus circuits 5,6 toe.

Met muisgenetica en fenotype analyse met immunohistochemie en moleculaire methoden toegestaan ​​definieert het expressiepatroon en functie van vele van deze genen. Daarnaast microarray analyse als chromatine immunoprecipitatie (chip) verstrekt informatie over mogelijke directe en indirecte targetgenen 7,8. Echter, er zijn nog veel open vragen met betrekking tot de regulerende mechanismen van de hippocampus ontwikkeling, met name de ontwikkeling van de dentate gyrus. Om verder inzicht hoe specifieke genen worden gereguleerd een systeem nodig waarmee de manipulatie van een klein aantal cellen krijgen door neerwaartse of opwaartse regulatie van het gen van interesse en / of de doelwitgenen en volgen hun lot tijdens de ontwikkeling. In utero elektroporatie van shRNAs, cDNA van genen van belang of Cre recombinase biedt een dergelijk instrument. Om de aanwezigheid van het gewenste DNA of kleine RNA expressie plasmiden worden gebruikt voor elektroporatie waarborgen. Deze benadering is zeer succesvol geïmplementeerd bestuderen Corticale 9,10, maar is moeilijker benadering waarin de ontwikkeling van de dentate gyrus door de positie van de hippocampale structuren in diepere lagen hersenen.

Ex utero elektroporatie gevolgd door organotypische slice cultuur is een aanpak van dit probleem 11,12 omzeilen. In tegenstelling tot in de baarmoeder elektroporatie niet het hele embryo, maar alleen het hoofd wordt gebruikt waardoor dus de elektroden te plaatsen in een gunstiger manier om direct de shRNA / DNA in de richting van de hippocampus en dentate gyrus. Onze groep succes toegepast ex utero elektroporatie om de rol van de transcriptiefactor Bcl11b bestuderen tijdens dentate gyrus ontwikkeling 8. Bcl11b heeft een dubbele rol in de gyrus dentatus ontwikkeling door regulating voorlopercellen celproliferatie evenals differentiatie zoals werd aangetoond door immunohistochemie. Een mechanisme voor Bcl11b betrokkenheid bij deze processen verder te definiëren, werden protocollen van de Polleux groep 11,12 aangepast aan de dentate gyrus zoals hieronder beschreven in de paragraaf protocol bestuderen. In een eerste benadering werd de vraag aan bod of Bcl11b is het reguleren van neuronale celdifferentiatie cel autonoom. Een tweede benadering onderzocht of Desmoplakine een direct doelwit gen Bcl11b, is voldoende om de Bcl11b fenotype te redden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Duitse wet worden uitgevoerd en werden goedgekeurd door de regering kantoren in Tübingen.

1. Bereiding van Micropipetten, oplossingen en Membranen

  1. Bereiding van Micropipetten
    1. Trek glas micropipetten met behulp van een micropipet trekker met het volgende programma: Hitte: 540, Pull: 125, Snelheid: 20 en Vertraging: 140. De naald lengte bedraagt ​​5,5 cm.
    2. Bevel naalden met behulp van een microgrinder om een ​​geschikte tip grootte van 4 mm te verkrijgen. Bewaar de naalden in een doos of 15 cm petrischaal beschadiging van de uiteinden te voorkomen.
  2. Voorbereiding van Solutions
    1. Plasmide DNA Solution
      1. Bereid plasmide DNA dat het gewenste cDNA construct middels endotoxine vrij Maxi-prep kit volgens protocol van de fabrikant.
      2. Pas plasmide-DNA-oplossing tot een eindconcentratie van 3 ug / ul (zonder GFP spike vector) of 4 ug /pl (bij 1 ug GFP aar vector) in endotoxine vrij Tris-EDTA-buffer die snel groen (eindconcentratie 0,05%).
    2. Laminin Stock oplossing
      1. Los 1 mg laminine in steriel water tot een eindvolume van 1 ml. Bereid 100 ul aliquots en bewaar bij -80 ° C.
    3. Poly-L-Lysine voorraadoplossing
      1. Los 50 mg van poly-L-lysine in 50 ml steriel water tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg / ml. Bereiden 1 ml porties en bewaar in -20 ° C.
    4. Voltooien Hank's Balanced Salt Solution (Complete HBSS)
      1. Bereid Compleet HBSS door het combineren van 100 ml 10x HBSS, 2,5 ml 1 M HEPES buffer (pH 7.4), 30 ml 1 M D-glucose, 10 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100 mM MgSO4 en 4 ml 1 M NaHCO3. Voeg steriel water tot 1 l en bewaar bij 4 ° C.
        OPMERKING: Autoclaaf alle oplossingen verwachten 1 M HEPES buffer en 1 M D-glucose, die fil zijnter gesteriliseerd.
    5. Slice Cultuur Medium
      1. Bereid slice kweekmedium door toevoeging van 35 ml basismedium Eagle 12,9 ml compleet HBSS (1.2.4), 1,35 ml 1 M D-glucose, 250 ul 200 mM L-glutamine, en 500 pl van penicilline-streptomycine op verkrijgen van een eindvolume van 50 ml. Voeg paardenserum tot een eindconcentratie van 5% en bewaar bij 4 ° C.
    6. Lage smeltpunt (LMP) Agarose
      1. Bereid een 4% LMP agarose door toevoeging van 2 g LMP agarose 50 ml compleet HBSS (1.2.4), gevolgd door verwarmen in een magnetron gedurende 1-2 minuten bij een hoog vermogen. Bewaar deze oplossing in een waterbad bij 37-39 ° C. Bewaar de oplossing bij 4 ° C en hergebruik.
    7. Paraformaldehyde Solution
      1. In een zuurkast stelt een 4% paraformaldehyde (PFA) door toevoeging van 4 g paraformaldehyde 100 ml 1x PBS. Verwarm de oplossing tot 60 ° C en enkele druppels van 1 N NaOH totdat de oplossing clear.
    8. Permeabilisatie Solution
      1. Oplossen in 300 ml 1X PBS dat 0,3% Triton X-100 en bewaar bij 4 ° C 9 g BSA. Voeg 10% natriumazide voor lange termijn opslag.
  3. Coating van Membraan Inserts
    1. Verdun een aliquot van laminine stamoplossing (1.2.2) en een aliquot van poly-L-lysine voorraadoplossing (1.2.3) in steriel water tot een eindvolume van 12 ml.
    2. Plaats membraan inserts in 6 well platen met elk putje dat 2 ml steriel water. Voeg 1 ml bekledingsoplossing bovenop het membraan en geïncubeerd O / N bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
    3. Na incubatie was de membraan inserts driemaal met 1 ml steriel water en droog. Gebruik gecoat membraan inserts op dezelfde dag of bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal vier weken in een droge plaat met 6 putjes.

2. DNA-injectie en elektroporatie van E15.5 en E18.5 embryo

  1. Euthanaseren het onbewuste muis door cervicale dislocatie op embryonale dag (E) 15.5 of 18.5. Prepareer de baarmoeder met de embryo's 13 en plaats deze in een petrischaal met 15-20 ml koud volledig HBSS.
    LET OP: Vanaf dit punt, houdt de embryo's en weefsels op ijs.
  2. Gebruik een schaar om elk embryo uit de baarmoeder hoorn en plaats te scheiden in een tweede petrischaal met koud compleet HBSS.
  3. Onder een stereomicroscoop, scheiden de baarmoeder spierwand en de placenta met een paar fijne pincet (# 55) en schaar. Zorgvuldig het embryo uit de dooierzak los.
  4. Gebruik een paar van Bonn schaar om decapitate het embryo boven de voorpoten bij een hoek van 60 °. Als het experiment vereist genotypering van de embryo's, het verzamelen van een weefselmonster voor genomische DNA-isolatie (een klein stukje van de staart).
  5. Breng het hoofd naar een schone en droge petrischaal. Omdat de kop werd onthoofd in een hoek van 60 °, moet het hoofd opzij kantelen wanneer geplaatst dorsale zijde naar boven.
  6. Plaats een naald voorzichtig in het midden van de halve bol nabij de bregma (Figuur 1A, B). Injecteer ongeveer 2-3 ul (3 of 4 ug / ul) van DNA oplossing voet op het pedaal van de picospritzer III toepassing van 30 kilo druk gedurende de duur van 10-15 msec per puls aanbrengen 5-8 pulsen. De duur en het aantal pulsen afhankelijk van de diameter van de naald opening met kleinere openingen meer tijd nodig. Het interval tussen elke puls bedraagt ​​1 sec.
  7. Voor het plaatsen van de elektroden, enkele druppels volledig HBSS op het hoofd van de embryo. Plaats de elektroden zodanig dat de "negatieve" terminal aan dezelfde kant als het geïnjecteerde ventrikel en de "positieve" elektrode aan de tegenoverliggende zijde van de geïnjecteerde ventrikel onder het oor van het hoofd van de embryo's (Figuur 1C, D). Solliciteer 5 pulsen van 50 V.
    1. Gebruik 3 mm elektroden voor E 15,5 en 5 mm elektroden voor E 18,5.

3. Dissectie van de hersenen

  1. Na de elektroporatie, loslaten van de huid van het hoofd met behulp van een paar fijne pincet. Met een paar veer schaar een kleine incisie in het midden van het cerebellum op de middenlijn van de schedel.
  2. Plaats de veer schaar in de incisie en snijd in de lengte langs de pijlnaad. Schil van de schedel en verwijder de hersenen uit de schedel door het gebruik van fijne pincet. Breng de hele brein in 15-20 ml koud volledige HBSS oplossing.
  3. Ondertussen giet 4% LMP agarose,bij 37-39 ° C bewaard in een waterbad, in een peel-away schimmel.
  4. Neem de hersenen uit de volledige HBSS door een klein bolletje spatel en afvoer van overtollig HBSS met behulp van fijne papieren zakdoekje of Kimwipes.
  5. Plaats het hele brein voorzichtig in de agarose en zijn positie met een fijne naald aan te passen. Houd de mal op ijs tot de agarose is gestold en het blok is verdeeld (voor coronale secties de olfactorische bollen omhoog wijzen).

4. Vibratome Sectioning en Slice Cultuur

  1. Trim de LMP agarose blokken en lijm ze met het model podium met behulp van 'super lijm'. Nadat de lijm is droog overdracht het monster etappe naar de buffer lade van de vibratome en vul met ijskoud voltooien HBSS totdat het blok wordt ondergedompeld in de oplossing.
    OPMERKING: Steriliseer alle instrumenten en apparatuur oppervlakken met 70% ethanol voor het snijden.
  2. Bereid 250 micrometer dik vibratoomcoupes behulp van een nieuw blad zoals gevolgd.
    1. Trim het blok wiste de volgende instellingen; frequentie - 60 Hz, amplitude - 0,7 micrometer, snelheid 16-18 mm / sec. Snijd de gedeelten met het gewenste weefsel met bovenstaande hier op lage snelheid (9 mm / sec). Vanaf het snijden van de achterhersenen, het verzamelen van 5-7 secties van de grote hersenen.
    2. Breng de sectie om een schone 6 putjes schotel met 5 ml ijskoud compleet HBSS met behulp van een gebogen spatel en op ijs bewaren totdat alle secties verzameld (figuur 1E).
  3. Bevochtig de membraan in een kruis wijze met 100 pl volledig HBSS alvorens de onderdelen over de membraan, de oriëntatie van de delen te vergemakkelijken.
  4. Breng de secties met behulp van een gebogen spatel op het membraan (pick-up een hoek van de sectie met een pincet en trek op de spatel en vervolgens met de tang om de sectie te duwen op het membraan). Plaats maximaal vijf secties op een membraan en regelen met behulp van een pincet (Figuur 1F). Niet overlappen de secties met elkaar.
    1. Neem het overtollige van HBSS uit het membraan met behulp van een pipet. De specifieke membranen hier gebruikt zijn bevestigd aan een frame en ingebracht in het weefsel kweekplaat, waardoor het weefsel in contact, maar niet in het medium.
  5. Plaats het membraan inserts in een 6-wells plaat met 1,8 ml slice kweekmedium (1.2.5) (figuur 1 G, H). Incubeer de kweekschaal bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende 11 DIV of 14 DIV. Wijzig de helft van het medium (0,9 ml) om de dag.
    Opmerking: In dit stadium reagentia wil toevoegen Bromodeoxyuridine (BrdU; 10 uM eindconcentratie) etikettering prolifererende cellen aan de media voor de eerste 20 uur van de kweekperiode.

5. Bevestiging van de secties Gevolgd door immunofluorescentiekleuring

  1. Gebruik een schone en scherpe scalpel te snijden en trimmen van de membranen, afhankelijk van de oriëntatie vande secties.
  2. Breng de delen samen met het membraan van een 24 wells plaat met 1 ml 4% PFA (1.2.7). Incubeer de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur gevolgd door 3 wasbeurten met 1x PBS gedurende 15 minuten elk. Incubeer de secties O / N met permeabilisatie oplossing bij 4 ° C onder zacht schudden.
  3. De volgende dag, incubeer de gedeelten met geschikte primaire antilichamen verdund in permeabilisatie oplossing, O / N of gedurende 48 uur bij 4 ° C onder zacht schudden.
  4. Was de secties 3 keer voor 15 minuten met 1x PBS en incubeer O / N bij 4 ° C met de juiste secundaire antilichamen verdund in permeabilisatie oplossing.
  5. Na de incubatie met secundaire antilichamen, was de secties eenmaal met 1x PBS gedurende 15 minuten gevolgd door DAPI kleuring gedurende 10 min.
  6. Was de secties 3 keer met 1x PBS gedurende 15 minuten elk en over te dragen aan dia microscoop. Voeg ImmunoMount en voorzichtig plaats een dekglaasje op de top van de secties. Droog de glaasjes aan O / N bij 4 ° C en seal met nagellak.
    OPMERKING: Houd de dia's altijd bij 4 ° C.
    1. Analyseer de slice culturen door confocale microscopie (Figuur 1I).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ablatie van de transcriptiefactor Bcl11b veroorzaakt aantasting van voorlopercellen celproliferatie en neuronale differentiatie hetgeen afbreuk dentate gyrus grootte en aantal cellen. Verder mutant neuronen niet te integreren in de hippocampus circuits waardoor leren en geheugen impairment 8. Om vragen over de regulerende mechanisme (s) van Bcl11b in deze processen ex utero elektroporatie werd tewerkgesteld beantwoorden.

Het aanpakken van de vraag of Bcl11b cel-autonoom regelt neuronale celdifferentiatie, mozaïek verwijderingen van Bcl11b werden gegenereerd door ex utero elektroporatie van een GFP-Cre recombinase construct of GFP alleen 11 in Bcl11b flox / flox hippocampus bij E15.5 gevolgd door organotypische slice cultuur up tot 18 dagen na elektroporatie (Figuur 2A, B; deze figuur is gewijzigd van 8). Om te bepalen of Bcl11b regelt differentiatie van granule cellen cel-autonoom immunofluorescentie kleuring werd uitgevoerd met specifieke antilichamen die NeuroD en GFP. NeuroD wordt uitgedrukt in mitotische fase 2b / 3 en vroege postmitotische cellen 14. We hebben eerder aangetoond dat het aantal NeuroD positieve cellen aanzienlijk verhoogd in Bcl11b voorwaardelijke mutanten aangeeft aanhouding van neuronale differentiatie 8. Hoewel het aantal GFP positieve cellen alleen en GFP / NeuroD positieve cellen verschilden niet in controle en mutantcellen een aanzienlijke toename NeuroD positieve cellen werd waargenomen in de dentate gyrus waar de cellen Cre recombinase hadden ontvangen (Figuur 2C; deze figuur is gemodificeerd 8). Het vinden van NeuroD positieve cellen niet alleen in cellen die Cre recombinase had ontvangen, maar ook in het wild-type cellen gesuggereerd dat indirecte mechanismen betrokken zijn bij Bcl11b regulering van de neuronale celdifferentiatie. Uit deze gegevens echter additional cel-autonome functies van Bcl11b kan niet worden uitgesloten.

Voorheen Desmoplakine werd bepaald als een direct doelwit gen Bcl11b 8. Ook werd aangetoond dat Desmoplakine is betrokken bij de regulatie van voorlopercellen celproliferatie en differentiatie van keratinocyten 15. Aantonen of Desmoplakine betrokken is bij de regulatie van voorlopercellen celproliferatie en / of neuronale differentiatie van de dentate gyrus plasmide-DNA GFP expressie alleen of GFP en Desmoplakine onder de controle van de CMV promoter werd geëlektroporeerd in controle en Bcl11b mutant hersenen (Figuur 3A - C; dit cijfer is aangepast van 8). De hersenplakjes werden gedurende de eerste 20 uur in aanwezigheid van BrdU (10 uM eindconcentratie). Op dag 11 na de elektroporatie slice cultures werden vastgesteld gevolgd door BrdU immunokleuring en het aantal BrdU-positieve cellen werd bepaald. Bcl11b mutant tissue geëlektroporeerd met GFP alleen bevatten beduidend minder BrdU-positieve cellen in vergelijking met de controle weefsel. Echter, co-elektroporatie van GFP en Desmoplakine redde het aantal BrdU-positieve cellen aan te beheersen (Figuur 3D; dit cijfer is aangepast van 8). Samen vormen deze gegevens verder te bevestigen Desmoplakine als een direct doelwit-gen van Bcl11b en zijn rol in de regulatie van voorlopercellen celproliferatie.

Figuur 1
Figuur 1. Set-up van ex utero elektroporatie en organotypische slice cultuur op E15.5. (A) Injectie van DNA in één hersenhelft. (B) Schematische tekening van DNA-injectie. (C) Plaatsing van de elektroden. (D) Schematische tekening van de plaatsing van de elektroden. (E) Vibratome snijden en handling van hersensecties. (F) plaatsen hersencoupes specifieke membranen. (GI) Helder-veld (G) en fluorescentie (H, GFP) analyse van slice culturen op dag 1 na elektroporatie. (I) confocale beeld van de dentate gyrus op dag 11 na elektroporatie met DAPI en GFP kleuring. Gestippelde lijn geeft de dentate gyrus. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Mozaïek verwijdering van Bcl11b door ex utero elektroporatie en organotypische slice cultuur (gewijzigd van 8). Elektroporatie van controle vector pCIG2 alleen (A) en pCIG2- Cre construct (B) in de dentate gyrus in E15.5 gevolgd door organotypische slice cultuur gedurende 18 dagen. Secties werden immunologisch gekleurd met antilichamen die GFP (groen) en NeuroD (rood). Bijvoegsels tonen GFP (groen) en Bcl11b (rood) kleuring bij een grotere vergroting verlies van Bcl11b expressie in cellen die Cre -recombinase tonen. (C) Statistische analyse van GFP, NeuroD en GFP / NeuroD positieve cellen. Onderbroken lijnen geven de dentate gyrus. t-test, * p <0,005; error bars, sd; n = 5. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Bcl11b fenotype gered door herintroductie van Desmoplakine (gemodificeerd 8). Alleen GFP (A, B) en GFP en Desmoplakine (C) werden geëlektroporeerd in de dentate gyrus van de controle (A) en mutant (B, C) ​​hersens E15.5 gevolgd door organotypische slice cultuur gedurende 11 dagen. Secties werden immunologisch gekleurd met antilichamen die GFP (groen) en BrdU (rood). (D) Statistische analyse van BrdU-positieve cellen. Onderbroken lijnen geven de dentate gyrus. Inzetstukken geven Desmoplakine kleuring (groen) bij hogere vergroting. t-test, * p <0,01; error bar, sem; n = 4. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Ex utero elektroporatie op E 18,5, gevolgd door organotypische slice cultuur.Injectie van DNA dat GFP tot één hemisfeer gevolgd door immunokleuring op dag 16 na elektroporatie (A) DAPI kleuring,. (B) GFP kleuring, (C) samengevoegd beeld. Binnen de lijn geeft dentate gyrus. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hippocampus is een belangrijke functie bij het leren en het geheugen. De dentate gyrus is één van twee hersengebieden waar neurogenese treedt niet alleen tijdens de ontwikkeling, maar ook op volwassen leeftijd. Postnatale en volwassen hippocampale neurogenese verloopt op soortgelijke wijze waarbij veel gemeenschappelijke kenmerken. Het definiëren van de regulerende mechanismen van deze factoren zal zeer nuttig zijn bij het begrijpen van neurodegeneratieve ziekten, die op zijn beurt zal leiden tot nieuwe therapieën en preventieve maatregelen. Om deze informatie te verkrijgen van één vereist een systeem om enkele cellen te manipuleren en te observeren hen in hun eigen omgeving, zoals aangetoond door ex utero elektroporatie gevolgd door organotypische slice cultuur.

Ex utero elektroporatie werd eerst met succes toegepast bij het ​​bestuderen cortex ontwikkeling 11,16. Voor zover wij weten het onderzoeken van de rol van Bcl11b in de hippocampus ontwikkeling is de eerste beschrijving van ex utero elektroporatie van DNA in gyrus dentatus weefsel 8. We baseerden ons protocol op de gepubliceerd door de Polleux groep bestuderen cortex ontwikkeling 11,12 methoden. Om deze methode om de dentate gyrus van de grootte en positie van de elektroden moest worden aangepast studeren succes toegepast. Het plaatsen van de negatieve elektrode op het cortex nabij de injectieplaats en de positieve elektrode aan de andere zijde onder het oor verandert de polariteit van de elektroporatie en wist introduceren van DNA in cellen van de dentate gyrus. Het plaatsen van de elektroden goed en toepassen van een stroom van 0,06-0,08 mA bleek zeer cruciale stappen om bevredigende resultaten elektroporatie. Voor het verkrijgen van de meest geschikte stroom hangt vooral af van de juiste plaatsing van de elektroden zoals boven beschreven. Extra kritische stappen van het protocol zijn het injecteren van het materiaal in het ventrikel, alsook de behandeling van de schijfjes na vibratome snijden. Het hersenweefsel is niet gedurende de gehele procedure vastgesteld endus het weefsel is zeer zacht en gemakkelijk te vernielen wanneer het van de vibratome op het membraan voor de teelt. Secties hebben ook met grote zorg worden behandeld bij het starten van de immunokleuring. Met deze aanpassingen en overwegingen manipulaties van afzonderlijke cellen van de dentate gyrus succesvol uitgevoerd beantwoorden van vragen over Bcl11b regulering van de vroege ontwikkeling hippocampus (figuur 2 en 3, deze cijfers zijn gewijzigd 8).

Zoals hierboven manipuleren van enkele cellen genoemd en observeren hun lot is het grote voordeel van ex utero elektroporatie. Een belangrijk nadeel van de ex utero aanpak in vergelijking met de in de baarmoeder elektroporatie is de beperkte tijd om te plakken in cultuur te houden. Het is ook mogelijk dat ex utero kweekomstandigheden een vertraging in ontwikkeling kan leiden. In onze experimenten tot nu toe waren we in staat om de plakjes in de cultuur houden up tot 18 dagen, die overeenkomt met de leeftijd van P14. Teelt van organotypische plakjes buiten deze tijd leiden tot desintegratie van het weefsel. Een bijkomend nadeel van de ex utero aanpak is de beperkte aantal embryo's dat kan worden geëlektroporeerd per moeder. In tegenstelling tot in utero elektroporatie waar tot 8 embryo dit aantal kan worden behandeld is beperkt tot 4 embryo's in de ex utero benadering. Dissectie van de embryo, elektroporatie, vibratoom snijden en overdracht van de plakken in kweekomstandigheden hebben in korte tijd worden uitgevoerd om succesvolle slice cultures waarborgen.

Vanwege de grote gebeurtenissen van de gyrus dentatus ontwikkeling optreden tussen P14 en P30 het nodig zou zijn om organotypische plakjes in cultuur te houden gedurende langere perioden. In een eerste poging om de kweek te breiden werden moment electroporations uitgevoerd bij E 18.5 dienovereenkomstig aanpassend omstandigheden (figuur 4; zie protocol). Electroporating bij Thwordt tijd punt maakt het bijhouden van de hersenen secties in de cultuur tot P17 of 18. Naast de hippocampus formatie wordt verder ontwikkeld op E 18,5 in vergelijking met E 15,5, bijvoorbeeld, zijn de hippocampus structuren reeds gevormde en meer herkenbaar. In de toekomst zouden we graag ex utero elektroporatie presteren op nog latere tijdstippen, bijvoorbeeld, P0 tot P4 tot veranderingen tijdens gyrus dentatus ontwikkeling tot P30 te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Flaming/ Brown Micropipette Puller Sutter Instruments Company (USA) P-97
Fine Glass Pipettes Warner Instruments G100F-4
Microgrinder Narishige, Japan EG-44
Anesthetic Bracket unit Harvard Apparatus PY2 34-0412
Halovet Vaporizer Harvard Apparatus PY2 34-0398
Fluovac System Harvard Apparatus PY2 34-0387
IMS Fluosorber Harvard Apparatus PY2 34-0415
Anesthetizing Chamber Harvard Apparatus PY2 34-0460
Electroporator BEX Company CUY21 EDIT
Tweezers with disk electrodes BEX Company LF650P3 3 mm electrodes for E15.5
Tweezers with disk electrodes BEX Company LF650P5 5 mm electrodes for E18.5
Picospritzer III Parker Hannifin Corporation P/N 052-0500-900
HM 650 V Vibrating Blade Microtome, 230 V Thermo Scientific 920120
Dissection Microscope Carl Zeiss Microscopy Gmbh Stemi SV8
Inverted Microscope Leica Leica DM IL LED
Confocal Microscope Leica Sp5II
6 well dish BD Falcon #353502
6 well dish CELLSTAR #657160
Tissue culture inserts BD Falcon #353090
Fast Green Sigma F7252
Laminin Sigma #L2020
Poly-L-lysine Sigma #P5899
Spring scissors Fine Science Tools 15003-08
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Forceps Dumont #55 11255-20 Inox
HBSS 10x Life Technology 14180-046
BME Life Technology 41010-26

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).
  2. Frotscher, M., Zhao, S., Forster, E. Development of cell and fiber layers in the dentate gyrus. Prog Brain Res. 163, 133-142 (2007).
  3. Muramatsu, R., Ikegaya, Y., Matsuki, N., Koyama, R. Neonatally born granule cells numerically dominate adult mice dentate gyrus. Neuroscience. 148, 593-598 (2007).
  4. Li, G., Pleasure, S. J. Morphogenesis of the dentate gyrus: what we are learning from mouse mutants. Dev Neurosci. 27, 93-99 (2005).
  5. Hsieh, J. Orchestrating transcriptional control of adult neurogenesis. Genes Dev. 26, 1010-1021 (2012).
  6. Li, G., Pleasure, S. J. Genetic regulation of dentate gyrus morphogenesis. Prog Brain Res. 163, 143-152 (2007).
  7. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
  8. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. Embo J. 31, 2922-2936 (2012).
  9. Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
  10. Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. (65), (2012).
  11. Hand, R., et al. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-62 (2005).
  12. Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), 19 (2002).
  13. Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J Vis Exp. (2), (2007).
  14. Sugiyama, T., Osumi, N., Katsuyama, Y. The germinal matrices in the developing dentate gyrus are composed of neuronal progenitors at distinct differentiation stages. Dev Dyn. 242, 1442-1453 (2013).
  15. Lechler, T., Fuchs, E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organization in the epidermis. J Cell Biol. 176, 147-154 (2007).
  16. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics