Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. J. Vis. Exp. (98), e52551, doi:10.3791/52551 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Yetişkin nöron yeni nöronlar giderek kararlı ara progenitör alt tipleri ile aktive edilmiş bir nöral kök hücre elde edildiği yüksek ölçüde düzenlenmiş bir çok-aşamalı süreçtir. Bu alt-tiplerin her biri, birlikte, özel morfolojik kriterlere göre tespit edilmek için kullanılabilen spesifik moleküler markörlerin bir dizi ifade eder. Tipik haliyle, immünofloresan teknikler ekso- ya da endojen çoğalma işaretleri ile kombinasyon halinde alt tip-spesifik antikorlar içeren uygulanır. Biz burada yetişkin hipokampal nöron tüm aşamalarında saptanması ve ölçülmesi için yöntemler immün tarif. Bu timidin analogları, transcardial perfüzyon, doku işleme, ısı kaynaklı epitop alma, ABC immünohistokimya, çoklu dolaylı immunofloresan, konfokal mikroskopi ve hücre ölçümü uygulaması içermektedir. Ayrıca biz sorunları u circumvents sıralı birden immunofloresans protokolü sunuyoruzsually aynı konak türlerinde kaldırdı birincil antikorlar kullanılarak ihtiyacı doğan. Tek bir bölüm içinde bir çoğalma işareti ile birlikte tüm hipokampal progenitör alt tiplerinin doğru belirlenmesini sağlar. Bu teknikler paralel farklı progenitör alt tiplerinin düzenleme, beyin patolojileri katılımlarını ve spesifik beyin fonksiyonları rollerini incelemek için güçlü bir araçtır.

Introduction

İki beyin bölgeleri kurucu yaşam boyunca yeni nöronlar oluşturmak, lateral ventriküllerin subventriküler bölge ve hipokampusün (DG) subgranular bölge (SGZ). Yeni doğan nöronlar nöral progenitör hücrelerden elde ve olgunluğa 1,2 ulaşmadan önce morfolojik ve fizyolojik gelişimin farklı aşamalarında gitmek. Yavaş bölünmesi radyal glia-benzeri kök hücre (tip 1) transit ardışık aşamaları ara progenitör hücrelerin ortaya yükselterek. daha farklılaşmamış alt tipi (Tip 2a ve tip 2b) kısa teğet süreçleri ile düzensiz bir şekle sahiptir. Onlar (dendritler moleküler tabakası doğru genişletilmiş) ile giderek olgunlaşmamış nöronların olmak için hücre döngüsünü çıkmak ve nihayet hipokampal ağ gibi olgun granül hücreleri içine entegre Nöroblastlar (tip 3) oluşturur. Dolayı özellikle fizyolojik özellikleri bu hücreler gelişmiş plastisite 3 sugges ile devreyi sağlamakting hipokampustaki benzersiz bir rolü. Aslında, son on çalışmaları yetişkin nöron mekansal bellek, desen ayırma ve duygusal davranış 4,5 katkıda önemli kanıtlar oluşturdu.

Yetişkin nöron farklı yaklaşımlar kullanılarak incelenebilir. Timidin analogları hücre döngüsünün S-fazında DNA içine dahil ve yeni doğan hücrelerin 6-8 doğum partner, miktar ve kader analizi sağlar. Farklı timidin analogları (örneğin, CldU, edu veya DUK) sıralı uygulama hücre yenileme ya da bir deney 9 sırasında farklı zaman noktalarında doğan hücre popülasyonlarının incelemek için kullanılabilir. Bir alternatif olarak, hücre proliferasyonu için endojen işaretleyici Ki67 olup. Hücre döngüsü (G1, S, G2, E) dinlenme aşamasında dışında (G0) ve G1 10,11 başında her safhasında hücrelerin bölünmesi ile ifade edilir. Yetişkin dentat yenidoğan hücre popülasyonlarının fenotipi analiz etmekE girus çeşitli safha spesifik moleküler markörler GFAP, Nestin, DCX ve neuN 1,6 olarak kullanılabilir. GFAP erişkin astrositlerin bir göstergesi, aynı zamanda, yetişkin önbeyin radyal glial benzeri hücrelerde ifade edilir. Nestin radyal glia-benzeri hücreler ve erken orta projenitör hücrelere özgü bir ara filamenttir. DCX ara progenitörlerle nöroblast- ve olgun nöronlarda ifade edilen bir mikrotübüle bağlı bir proteindir. + Nestin - türü 2a (GFAP - tip 1 (GFAP + Nestin +, DCX): Bu üç işaretleri ve dört ayrı progenitör hücre alt tipleri tespit edilebilir etiketli hücrelerin morfolojik özellikleri (eş) ifadesi dayanarak , DCX -), tip 2b (GFAP -, Nestin +, DCX +) ve tip 3 (GFAP -, Nestin - DCX +) 1. Birlikte postmitotik nöronların ifade neun, ile DCX Eş-etiketleme immatür farklılaşmasını izin verire (DCX + neun +) ve olgun (DCX - neun +) granül nöronlar.

Yukarıda belirtilen belirteçler sıklıkla yeni doğmuş hücrelerin sayısını ve kimliğini analiz etmek üzere immünoflüoresan ko-etiketleme ve daha sonra konfokal mikroskopi için kullanılır. Bu, tipik olarak, istenmeyen antikor çapraz reaktivite önlemek için farklı bir ev sahibi türünden antikorların gerektirir. Ancak nöron araştırma için uygun bir temel antikorların büyük bir kısmı ya da tavşanlar ya da fareler (örneğin, fare α-BrdU, fare α-neun, tavşan α Ki67, tavşan α-GFAP) yetiştirilir. Bu, tek bir dilim değerlendirilebilir antijenlerin sayısı ve kombinasyon halinde ciddi kısıtlamalara yol açar. Bu da birden fazla boyamaları girmelidirler gibi yalnızca boyama sarfedilen güç artar, ama aynı zamanda sonuçların güvenilirliğini tehlikeye atabilir. Bununla birlikte, bazı antijenler, formalin tespit kaynaklı epitop maskeleme (ör Ki67 duyarlıdırlar, Nestin). Biz burada klasik tek ve çoklu immün protokolleri değişiklikleri tanımlamak (örneğin, epitop alma, birden fazla sıralı immun, Nestin-GFP transgenik farelerin 12 kullanımı) bu sorunların çoğunun üstesinden. Özel olarak, sıralı çok sayıda imüno protokol antikorların bir kısmı da, ev sahibinden türemiş bile, dört farklı antijenlere karşı boyama sağlar. Bu aynı anda Tip 1, Tip 2a, tip 2b ve tip 3 projenitör hücrelerin saptanmasını, hem de tek bir bölüm içinde çoğalma aktivitesi sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: yaşayan hayvanları kapsayan tüm işlemler EC direktifi 86/609 / EEC sayılı laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı ile ilgili kurallar ve yerel etik kurul (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz) tarafından onaylanan uygun olarak yapılmıştır.

Timidin Analoglarının 1. periton içine enjeksiyon

  1. Enjeksiyondan önce hayvanlar gün tartılır. Bir sonraki gün aynı zamanda, bir 10 mg / ml stok çözeltisi, bireysel ağırlığa göre ayarlanmış enjeksiyon hacimleri planlanan tüm enjeksiyonlar için gereken timidin analoğu miktarını hesaplayın.
  2. 10 mg / ml timidin stok çözelti hazırlayın. (DİKKAT! Thymidine benzerleri zehirlidir. Bir kimyasal davlumbaz kullanmak, yani, tedarikçiler tarafından sağlanan özel Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) izleyin laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek).
    1. Dondurucudan timidin analog alın ve yaklaşık RT getirmek. 21 ° C. 10 mg tartılır ve ekleyinveya 0.04 N NaOH (BrdU ve CldU için) steril tuzlu su (steril tuzlu su içinde, IDU için), vorteks. Bir 50 ° C su banyosu ve girdap içinde, 15 dakika, her - 2 - tozu çözmek üzere 3 dk için en az 10 yerleştirin.
      Not: en fazla 24 saat için kullanımlar çözeltileri, oda sıcaklığında ve -20 ° C de bir kaç hafta içinde saklanabilir. Işık (alüminyum folyo ile kapak) çözümler koruyun. Her zaman çökeltilerin kontrol ve gerekirse-çözülür yeniden.
  3. Ense fare kısıtlamaktadır ve periton içine, 30 G iğne ile ince bir dozaj şırıngası kullanılarak (oda sıcaklığında) stok çözeltisi, uygun bir, ağırlığa göre ayarlanmış hacim enjekte edilir.
    Not: durumda CldU ve Idu, aynı hayvanda sıralı olarak uygulanabilir gerekir eşit mol konsantrasyonları enjekte düşünün (örn, 50 mg / kg BrdU uygun 42.5 mg / kg CldU ve 57.5 mg / kg Idu). Bu nedenle, buna uygun olarak, 10 mg / ml'lik stok çözeltiler enjeksiyon hacimlerini ayarlamak.

2. Doku Hazırlanması

  1. Prepaperfüzyon bir gün önce 0.1 M fosfat tamponu pH 7.4 içinde% 4 formaldehit yeniden. 4 ° C'de saklayın.
  2. Transkardiyal 40 ml buz gibi soğuk formaldehid (akış oranı 5 mL / dakika) ile daha sonra 10 ml buz gibi soğuk PBS ile sol ventrikil yoluyla derin anestezi altındaki farelerin (% 3.5 izofluran) serpmek. 4 ° C'de 24 saat boyunca aynı sabitleyici beyin ve sonrası düzeltme ayır.
  3. Arka arkaya, 10% (4 ° C'de 24 saat) ve% 30 sakaroz (beyin lavabolar kadar, yakl. 48 saat) içine beyin aktarın. Kabarcıklar doku ortaya kadar donma için, yavaş yavaş -25 ° C izopentan içine Kriyo-korumalı beyinleri daldırın. -80 ° C'de saklayın.
  4. Bir dondurma mikrotomda 40 mikron kalınlığında koronal bölümleri kesin (-25 blok sıcaklığı -16 ° C). Bir 24-yuvalı hücre kültürü plakasının oyuklarına içeren antifriz solüsyonu içine Sıralı aktarım bölümleri (Şekil 1 e bakınız). -20 ° C'de saklayın.

"Şekil 24-plaka içine microtome dilim aktarılması Şekil 1. şematik gösterimi. A1 başlayın ve A6 vb sonraki satır B gidin ve sonra, satır A içine sonraki dilimlerini yerleştirin. D6 ulaşan yaparken, A1 geri dönmek ve devam edin. Dilimlerin Bu düzenleme tüm beyin bölümlerinde inci her n ölçülmesini sağlar. Yenidoğan hücrelerin ölçümü için immünoflüoresans feno (tek sütun 2 alternatif satır içeriği eşdeğer) her 12 inci bölüm alır, (tek sütun içeriğine eşdeğeri) beyin bölümünde inci her 6 alır.

3. immün

Not: Bölüm 6 oyuklu plakalar bir taşıyıcı plaka ile donatılmış uçları örgü genellikle, serbest yüzer işlenir. Bir istisna olarak, antikor inkubasyon ABC Reaksiyon örgü uçlar (a başına 0,5-1 mi olmadan 12 veya 24 oyuklu plakalar içinde yapılır engellemeell) lekeli gereken dilim sayısına bağlı olarak yeterlidir. Bu adımlar sırasında, ince bir fırça yardımıyla (her yeni çözümü ile durulayın) ile bölümleri aktarmak. Bütün inkübasyonlar, sürekli çalkalama (en fazla 150 rpm) ile yapılır.

  1. İmmünohistokimya (ABC yöntemi)
    1. Tamamen antifriz çıkarmak için (10 dakika her biri için oda sıcaklığında, 5 kez, 4 ° C'de bir kez O / N), TBS içinde antifriz kesitler aktarın ve iyice yıkayın.
    2. Endojen peroksidaz aktivitesi söndürmek için TBS-T içinde% 1.5 H2O 2 30 dakika boyunca inkübe edin. Köpüren dikkat ve gerekirse bölümleri-daldırın yeniden. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın.
    3. İsteğe bağlı: Bu arada, bir ısıtma kabini ve 37 ° C'de 2 N HCI ısıtın. DNA'yı denatüre etmek için 2 N HCI içinde 37 ° C'de 30 dakika boyunca bölümler inkübe edin. Bir fırça yardımıyla hafifçe ayrı bölümler.
    4. İsteğe bağlı: 0.1 M borat tamponu pH 10 dakika boyunca bölümler nötralize8.5, RT. Transfer ederken, kısaca HCI artıkları çıkarmak için kağıt havlu üzerine bölümleri içeren örgü ekler çubukla. 15 dakika her biri için TBS 2 kez durulayın.
    5. Doku geçirgenliği ve spesifik bir antikor bağlayıcı siteler, oda sıcaklığında 1 saat bloke TBSplus inkübe edin.
    6. 4 ° C'de TBSplus O / N seyreltilmiş primer antikor içinde inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın.
    7. TBSplus, oda sıcaklığında 3 saat içinde seyreltilmiş biyotinlenmiş sekonder antikor olarak inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın. Bu arada ...
    8. Üreticinin protokolü (TBS-T içinde% 1 a + 1,% B) işlemine göre, ABC kompleksi hazırlanır. Kullanmadan önce, oda sıcaklığında 30 dakika için beklemeye bırakın. Oda sıcaklığında 1 saat için AB reaktif bölümleri inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın.
    9. Sırasıyla iki yarım ve pipet 4 ml ya da 2 ml oyuk başına bölünmüş, 6 ya da 12 oyuklu plaka başına, TBS-T içinde 50 mi, 0.5 mg / ml DAB hazırlayın. DAB çözeltisi (DİKKAT içine Transferi bölümler! DAB toksiktir. Specifi izleyinc yani, laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek, tedarikçi tarafından sağlanan MSDS) kimyasal davlumbaz kullanın.
    10. Iyi peroksidaz reaksiyonu başlatmak için her yukarıdaki gibi, geriye kalan 25 ml DAB çözeltisine 0.5 ml% 1 H 2 O 2 ekleyin karıştırın ve pipet eşdeğer birimler. 12 dakika boyunca inkübe edin. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın.
    11. Jelatin slaytlar Mount bölümleri, hava kuru O / N. Kalıcı montaj orta ile lamel.
    12. İsteğe bağlı: lamel yerleştirmeden önce Counterstain (bakınız bölüm 3.5).
      Not: bir sinyal-gürültü oranı olduğundan, yüksek bir arka plan ve düşük ise, AB reaktifi (aşama 3.1.8) ile inkübasyondan sonra H2O 2 tedavi tekrarlayın.
  2. Çoklu-immunofloresans
    1. Tek veya aynı anda çoklu immunofloresans
      1. TBS içinde antifriz kesitler aktarın ve iyice yıkayın (4 ° C'de bir kez O / N, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 5 kez her biri) tamamen bir kaldırmatifreeze.
      2. İsteğe bağlı: 3.1.3 adımları olarak - 3.1.4.
      3. Spesifik olmayan antikor bağlayıcı siteler, oda sıcaklığında 1 saat doku geçirgenliği ve engellemek için TBSplus inkübe edin.
      4. Birincil antikor kokteyli inkübe (örneğin, sıçan α-BrdU, kobay-DCX α, keçi α-GFP), 4 ° C'de TBSplus O / N seyreltilmiştir. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın.
      5. Florokrom-konjuge sekonder antikor kokteyli inkübe (örneğin, Rodamin Kırmızı α-sıçan, Alexa-647 α-kobay, Alexa-488 α-keçi, tüm eşek türetilmiş), TBSplus içinde seyreltilmiş 3 saat RT veya O / N at 4 ° C'de ilave edildi. Şu andan itibaren ışıktan korumak bölümleri. 15 dakika her TBS 3 kez durulayın.
      6. Jelatin slaytlar Mount bölümleri, hava kuru O / N. Sulu yapıştırma vasatı ile lamel.
    2. Aynı konak türünden primer antikorlar ile sıralı çoklu immunofloresans
      1. 3.2.1.3 - 3.2.1.1 adımları gibi.
      2. Fi inkübeilk birincil antikor (ör tavşan α-antijen A), O / N 4 ° C'de ilave edildi. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      3. İlk florokrom-konjuge sekonder antikor (örneğin, Rodamin kırmızı geçidi. Eşek α-tavşan), 3 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Şu andan itibaren ışıktan korumak bölümleri. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      4. İlk ikincil antikor açık paratoplar doyurmak için 3 saat oda sıcaklığında birincil antikorlar aynı ana (örneğin, tavşan serumu) den% 10 normal serum içinde inkübe. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      5. 50 ug (örn α-tavşan IgG (H + L)), ikinci ikincil antikor, O / N oranında tarafından kabul edilebilir epitoplarını kapsayan birincil antikor konak karşı / ml birleşmemiş tek değerli Fab fragmanları ile TBSplus inkübe 4 ° C.
      6. 10 dakika her biri için TBS-T içinde en az 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın. Transfer ederken, kısaca swab kağıt havlu üzerine bölümleri içeren örgü ekler herhangi Fab artıkları çıkarmak için.
      7. 4 ° C 'de, ikinci birincil antikor (ör tavşan α-antijen B) O / N inkübe edin. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      8. İkinci florokrom-konjuge sekonder antikor (örneğin, Alexa 488-geçidi. Eşek α-tavşan), 3 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 15 dakika her biri için TBS 3 kez durulayın monte ve yukarıdaki gibi lamel.
        NOT: Farklı konak türler ekleyebilirsiniz gelen antikorlar ile antijenleri etiketlemek için 3.2.2.2 adıma ve ilgili ikincil antikorlar 3.2.2.3 adıma.
    3. Primer antikor olarak aynı türden ikincil antikor bir
      NOT: Bu protokol, GFAP, Nestin-GFP ve DCX birlikte BrdU veya Ki67 karşı dörtlü-boyama için uygundur.
      1. 3.2.1.5 - 3.2.1.1 izleyin kesinlikle protokol adımları. Bu noktaya kadar TBSplus tek eşek serumu kullanın.
      2. T inkübeOda sıcaklığında 1 saat süre ile% 3 keçi serumu ihtiva eden BSplus. Bu α-keçi sekonder antikor açık paratoplar kapsar. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      3. AMCA-conj inkübe edin. TBSplus, 3 saat oda sıcaklığında veya O / N 4 ° C'de seyreltilmiş keçi α-tavşan. 15 dakika her biri için TBS içinde üç kez yıkayın monte ve yukarıdaki gibi lamel.
    4. CldU, DUK ortak boyama
      1. , Durulayın denatüre ve bölüm 3.2.1 de açıklandığı gibi bölümleri nötralize (- 3.2.1.2 3.2.1.1 adımları).
      2. Α-fare TBSplus IgG (H + L), oda sıcaklığında 1 saat 20 ug / ml birleşmemiş Fab fragmanları kuluçkalayın. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 4 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      3. 4 ° C'de TBSplus O / N sulandırılmış ve fare α-BrdU (350 1); (IgG2 arıtıldı 400 1), sıçan α-BrdU içeren birincil antikor kokteyli içinde inkübe edin. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      4. Biyotinlenmiş eşek içeren ikincil antikor kokteyli inkübe α-sıçan (1: 500) ve FITC-geçidi. eşek α-fare Fab fragmanları (1: 100). 10 dakika her biri için TBS-T içinde 3 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın.
      5. Rodamin Kırmızı conj inkübe edin. Streptavidin, oda sıcaklığında 2 saat. 15 dakika her biri için TBS 3 kez durulayın monte ve yukarıdaki gibi lamel.
    5. Nestin-GFP farelerde, floresan sinyalinin amplifıkasyonu
      1. Primer antikor kokteyli keçi α-GFP ekleyin.
      2. (. Bu tür Alexa 488 conj olarak α-keçi eşek) GFP benzer spektral özelliklere sahip bir florokrom konjuge sekonder antikor ekle ikincil antikor kokteyl.
  3. Epitop alma
    1. Antifriz dışarı durulama sonra epitop alma yürütmek. 99 ° C (yaklaşık 25 dakika) - 0.1 M sitrat tamponu pH 6,0-95 içeren 6- veya 12-yuvalı plakalar ile ön ısıtma gemi.
    2. (30 dakika boyunca sıcak sitrat tamponu ve buhar haline bölümleri transfer plastik l alüminyum folyo ile plakaları kaplamakkimlikleri ısıya dayanıklı değildir).
    3. Hemen soğumaya bir buz banyosu içinde plaka yerleştirin. Bu doğum sonrası hayvanların beyin kesitleri ile çalışırken özellikle önemli olan doku morfolojisi, korumaya yardımcı olur.
    4. Yıkayın ve sitrat nötralize ve boyama devam etmek 10 dakika her TBS 3 kez durulayın.
  4. Fare fare doku üzerinde antikorların
    1. -Α fare IgG 20 ug / ml tek değerli Fab fragmanları ekleyin (H + L ikincil antikor ile aynı ana-türleri), ilk blokaj aşama (örneğin, aşama 3.1.5 ya da 3.2.1.3).
    2. 10 dakika her biri için TBS-T içinde 4 kez TBS içinde ve bir kere yıkayın ve ilgili protokol ile devam edin.
  5. Cresyl menekşe counterstaining
    1. (Cam kavanoz içinde) 60 ° C'ye kadar ön ısıtma kresil menekşe rengi solüsyon. 3 dakika boyunca sıcak çözeltiye slaytlar inkübe edin.
    2. Sulu içinde durulayın. dest. ve% 70 oranında 1 dakika her biri,% 96 ve% 100 izopropanol 2 kez kurutmak. 6 ksilen dakika veya uyumlu kalıcı montaj ortamı ile bir ksilen yerine ve lamel - 5 için Clear.

4. Veri Analizi

  1. Kıvrımlarının tüm rostro ölçüde boyunca her 6 th bölümünde peroksidaz lekeli yenidoğan hücreleri saymak. 400X büyütmede ışık mikroskobu kullanın.
  2. Yenidoğan hücrelerin toplam sayısının bir tahmin elde etmek kavşak aralığı ile sonuçlanan hücre sayıları çarpın.
  3. Görüntü floresan uygun lazerler ve filtre sistemleri ile donatılmış bir konfokal lazer mikroskobu ile bölümleri etiketli. 400X büyütmede kıvrımlarının tüm genişliği boyunca herhangi bir konumda görüntü yığınlarını alın ve diğer belirteçler ile birlikte etiketleme için, hemisfer başına ilgi dahilindeki en az 50 rastgele seçilmiş hücrelerin analiz eder.
  4. Mutlak hesaplamak için yeni doğan hücrelerin toplam sayısı ile birlikte etiketlenmiş hücreler (/% 100) elde edilen yüzdeler çarpınBelirli yenidoğan hücre popülasyonlarının sayıları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz ölçmek ve doğum sonrası ve yetişkin hipokampus yenidoğan hücreleri karakterize etmek yukarıda açıklanan yöntemleri uygulamalı. Bu nedenle, vahşi tip ve nöron-eksikli siklin D2 nöron oranı (yani, zenginleştirilmiş bir ortam, EE) 13,14 etkilediği bilinen koşullar altında muhafaza (Ccnd2 KO) fareler nakavt kullanılır. Ki67, BrdU, CldU veya DUK ya karşı immünohistokimyasal DAB boyama sürekli yabanitipte ve Ccnd2 KO farelerde (Şekil 3) 15 arasında yenidoğan hücre sayılarında farklılıklar saptandı. Ayrıca, CldU ve DUK art arda eşit molar enjeksiyonları ile biz EE (Şekil 3C, D) belirli dönemlerde doğan hücre popülasyonlarının ayırt başardık. Bölüm 3.2.4 benimseyen başarıyla eşit sinyal yoğunlukları ve onların eşzamanlı teslim (Şekil 4) sonra CldU ve EUK mükemmel örtüşme tespit olabilir. BrdU etiketli yeni doğmuş hücrelerin stan fenotiplenebilmektedir olabilirya da aynı anda tatbik BrdU ve neuN (Şekil 5) ya da BrdU, GFAP, Nestin-GFP ve DCX antikorları (Şekil 6B) ile dart immünofloresan yöntemi. Bu teknik, başarılı kimlik tip 1, 2a, 2b ve bir numune (Şekil 6B, D) içerisinde 3 progenitör hücreler izin verdi. Ki67 ve GFAP'ye karşı birincil antikorlar tavşan büyüdü gibi progenitör belirteçleri ile Ki67 Eş-etiketleme üretilmiştir dahası, primer antikorlar biri (keçi α-GFP) (bölüm 3.2.2 için geçerlidir) antikorların sıralı uygulamasını gerekli sekonder antikor biri (AMCA conj. keçi α-tavşan) aynı konak. Bölümler Nestin-GFP antikor ile birlikte Ki67 ilk inkübe, ikincisi GFAP antikor ama tersi (Şekil 6C). Şekil 2B onaylı uygulama planları özetler olsaydı bölümlerde 3.2.2 ve 3.2.3 bir kombinasyonu mükemmel çalıştı.


Aynı konak türlerinden elde edilen primer antikorlar ile Şekil 2. Sıralı çoklu immünoflüoresan. (A) şematik gösterimi. (B) antikorlar ve imünofloresansta kronolojik sırayla başarılı kombinasyonları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Dentat girus doğan hücrelerin ölçümü için ABC-immünhistokimyasal Şekil 3. Işık mikroskobu görüntüleri. Tasvir 100X ve 400X büyütmede WT farklı çoğalma belirteçleri ve nöron-eksik Ccnd2 KO farelerin karşılaştırmalar. (A) g> Ki67-DAB boyama kıvrımlarının (doğum sonrası gün 35) subgranular bölge içinde çoğalan hücrelerin kümeleri gösterir. çoğalan hücrelerin sayısı WT farelere kıyasla Ccnd2 KO farelerde azaltılmıştır. (B), BrdU uygulama (görüntüler yukarıda adı geçen enjeksiyon programı) Ccnd2 KO farelerde daha düşük proliferasyon oranına onayladıktan sonra 28 günlük yenidoğan hücreleri. (C) CldU uygulanması EE (yukarıdaki imge enjeksiyon düzeni) 6. haftasında WT dentat girus doğan hücrelerin sayısında bir artış gösterdi, ancak EE 8. haftasında değil Ccnd2 KO fareler. (D) DUK-yönetim benzer sonuçlar gösterdi. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

fig4.jpg "/>
Ekimolar konsantrasyonlarda eşzamanlı doğumdan sonra CldU ve EUK Şekil 4. İmmünofloresan eş-boyama. CldU etiketli hücreleri sinyal amplifikasyon CldU ve EUK mükemmel bir örtüşme sonuçlandı. Ölçek çubuğu 20 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Neun ve BrdU Şekil 5. İmmünofloresan eş-etiketleme. (A), BrdU 2 ardışık gün 14 Hayvanlar 28 gün sonra kurban edilmiştir doğum sonrası başlayan 6 kez her 8 saatte tatbik edilmiştir. (B), olgun nöronal bir işaretleyici ile çoğalan hücrelerin immünofloresan ko-etiketleme neun çoğalan azaltılmış göstermektedir Ccnd2 KO hücreleri W ile karşılaştırıldığındaT hayvanlar. Ölçek çubuğu 50 um. (C) (B) 'nin büyütülmüş görünüşüdür iki genotipten eş-işaretli hücrelerin yok eder. Ölçek çubuğu temsil 20 mikron. (D) dentat girus bir BrdU / neun eş-etiketli hücrenin Yüksek büyütme örneği. Ölçek çubuğu 10 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Nestin-GFP farelerin dentat girus yenidoğan granül hücrelerinin fenotiplendirilmesi için GFAP, Nestin-GFP ve DCX farklı çoğalma belirteçleri Şekil 6. Dört immunofloresan eş-etiketleme. (A) BrdU doğum sonrası günde 70 3 kez her 2 saatte verildi . Hayvanlar 2 saat sonra kurban edilmiştir. BrdU, GFAP için bir ko-lekeleme (B) Örnek görüntüsüNestin-GFP ve Ki67, GFAP, Nestin-GFP ve DCX için dörtlü imünofloresans DCX. (C) Temsilcisi görüntü. (D) kendi immünofluoresans etiketleme göre progenitör hücre tiplerinin sınıflandırılması. Farklı belirteçler ve dört ayrı projenitör hücre alt tipi tespit edilebilir olarak etiketlenmiş hücrelerin morfolojik özellikleri birlikte ekspresyonuna göre: - Tip 2a (GFAP - Nestin + DCX tip 1 (GFAP + Nestin + DCX) - ), tip 2b (GFAP -, Nestin +, DCX +) ve tip 3 (GFAP -, Nestin - DCX +). Ölçek çubuğu 20 mikron temsil eder. (E) yetişkin hipokampal nöron farklı aşamalarında şematik bir bakış. Bu 4 progenitör hücre tipleri, olgunlaşmamış nöronlar ve olgun granül hücreleri, belirteçlerin kendi karakteristik ifadesi ve çoğalma kapasitesi göstermektedir. ML - moleküler hücre tabakası, GCL -granüler hücre tabakası, SGL -. subgranular hücre tabakası , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Şekil 7., aynı türün ortaya çıkan antikor inkübasyon sekansına bağlı olarak, iki primer antikorlar ile başarılı olmayan başarılı ardışık boyamalar Örnek. Odaklı mikrograflar iki primer antikorlar ile Ki67 ve GFAP'ye karşı bir sıralı eş-boyama sonucunu göstermektedir tavşandan elde edilen. (A) immünohistokimya ilk iki sinyalin belirgin bir örtüşme neden Ki67 karşı boyama ve ardından GFAP tamamlanmıştır. Özellikle Ki67 sinyal atipik ve GFAP boyama sinyali benziyordu. (B) ters sonuçlarını göstermektedirKi67 boyama ile boyama dizisi GFAP karşı ilk ve sonraki boyama tamamlandı. Burada, her iki antijen için sinyaller beklenen sentezleme modelini andıran: GFAP sinyali esas subgranular bölgesinden kaynaklanan hücresel süreçlerde, cytoplasmatically saptanırken Ki67 sinyali subgranular bölge içinde çekirdek ile sınırlandırılmıştır. Ölçek çubuğu 20 mikron temsil eder. RHX - Rodamin X. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8,
CldU ve EUK. Fare algılamak için kullanılan α-BrdU antikorlar Şekil 8. Özgünlük CldU veya EUK (non-eşzamanlı uygulaması) ile ya enjekte edildi. (A), CldU (A1) veya enjeksiyon yoluyla madde (A2) olarak beyin kesitleri enjekte edilmiş farelerde immu edildinostained fare α-BrdU farelere enjekte özellikle CldU çapraz reaksiyona gereken saflaştırılmış sıçan α-BrdU antikoru kullanılarak, fakat enjeksiyon yoluyla madde için. (B) 'CldU (B1) ya da enjeksiyon yoluyla madde (B2) beyin boyama sonuçları göstermektedir beklenen antikor CldU Idu ile çapraz reaksiyona değil. Ölçek çubuğu 20 mikron temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kantifikasyon ve yenidoğan hücrelerin alt popülasyonlarının belirlenmesi yetişkin nöron araştırma merkezi konudur. Yetişkin nöron spesifik aşamalarında ifade proteinlere karşı çoğalma belirteçleri ve antikorlar birleştiren bu alt popülasyonlar immünohistokimyasal algılanmasını sağlar. Antikorlar ya da antikor kombinasyonlarının bazı spesifik boyama koşulları gerektirir.

Sentetik timidin analogları ile hücrelerin bölünmesi Etiketleme hala yetişkin hipokampal nöron eğitimi için altın standarttır. Bu deney başlamadan önce, uygun bir enjeksiyon protokolü dikkate için çok önemlidir. Genellikle 50 mg / kg (vücut ağırlığı, i.p.) BrdU yönetmek ama konsantrasyonu deneysel gereksinimlerine bağlı olarak değişebilir 8,16 (300 mg / bir bolus enjeksiyonu için kg). EUK ve CldU hücre popülasyonlarının zamansal ayrımcılık sırayla enjekte edilecek varsa bunu (eş molar konsantrasyonları enjekte etmek zorunludur 16 geçiren hasarlı hücreleri etiketlemek olabilir. Bir diğer dezavantaj, DNA denatürasyon antikorlar ya da başka DNA etiketleme teknikleri antijenite etkileşebilir timidin analogları immünohistokimyasal belirlenmesi için gerekli olduğunu (örneğin, DAPI, Hoechst 33258). Ki67 gibi endojen çoğalma belirteçlerinin immünohistokimyasal tespiti yeterli bir alternatif 10,11 olabilir. Ancak, bu sadece perfüzyon sırasında proliferatif aktivitenin bir çırpıda atış sağlar retrospektif doğum partner ve kader analizi imkansız.

Immun boyama için, bölümler, genel olarak, bir taşıyıcı plaka ile donatılmış 6 oyuklu plakalar içerisinde, genellikle, serbest yüzer işleme ve başka bir çözeltiden transferini kolaylaştırır ekler örgü edilir. Bir istisna olarak, engelleme, antikor inkubasyon ve ABC reaksiyon yapılırörgü malzemesi bulunmayan 12 veya 24 oyuklu plakalar pahalı çözümler tasarruf etmek için (0,5-1 ml de lekeli gereken dilim sayısına bağlı olarak, yeterli başına). Bu basamaklar sırasında, çözümler değiştirirken durulanması gereken ince bir fırça yardımıyla bölümler aktarın. Kurutma-out bölümleri önlemek ve nemli bir odasında> 1 saat almak inkubasyon gerçekleştirin. Bütün inkübasyonlar, sürekli çalkalama (en fazla 150 rpm) ile yapılması gerekir. Her test etmek ve her yeni antikor titre çok. Daha uzun inkübasyon süreleri, antikor (4 ° C 'de 2 gün kadar) boyama iyileştirebilir. Durumda sadece fare antikorları son derece konsantre, tek değerli Fab fragmanları α-fare (bölüm 3.4) ile endojen immünoglobülinleri engellemek için tavsiye edilir fare dokusunda görselleştirmek için istediğiniz antijenlere karşı kullanılabilir. Bu tekniği kullanarak her aşağıdaki durulama adımları uzatmak. Aksi takdirde, bağlanmamış Fab fragmanları, birincil fare antikorunun bağlanma olabilir. HCI öncesi ve boratNötrleştirme sadece timidin benzerlerinin tespit edilebilmesi için gereklidir. 12 dakika peroksidaz reaksiyonu protokolde uygulanan koşullar ve antikorlar ile optimal bir sinyal-gürültü oranı ile sonuçlanır. Herhangi bir enzimatik reaksiyon ile olduğu gibi, peroksidaz reaksiyon oranı pek çok faktöre bağlıdır (örneğin, sıcaklık, pH, enzim ve alt tabaka konsantrasyonu). Sonuç olarak, tepkime süreleri yeni antikor kümesi için optimize edilmesi gerekir. (Örneğin, CldU) çok zayıf arka plan ile DAB lekeleri anatomik yapıları görselleştirmek için, dilim zıt olabilir. kresil menekşe yöntemi belirli DAB sinyali ödün vermez bir çok soluk karşıt bölümünde 3,5 sonuçlar nitelendirdi.

Birden fazla bağışıklık için, farklı türlerdeki ya da farklı izotiplerin yetiştirilir primer antikorlar kullanmak ve bölüm 3.2.1 izleyin. Aksi takdirde, multipl primer antikorları tespit etmek için optimize edilmiş bir sıralı çoklu immün gerçekleştirmekAynı konak türler (; bölüm 3.2.2, yani fare ya da tavşan) den. Bu yöntemin temel prensibi başarıyla iki fare primer antikorlar 17 farklı kas belirteçleri lekeli Ferguson ve arkadaşları tarafından icat edilmiştir. Aşama 3.2.2.5 olarak bloke edilmesi için kullanılan Fab fragmanları, ikincil antikorlar ile aynı ev sahibi türünden türemiş olmalıdır. Bölüm 3.2.2'de tarif edilen konsantrasyonları ve inkübasyon süresi, burada tarif edilen özel antikorlar için optimize edilmiştir ve yeni bir antikor kombinasyonu için ayarlanması var. (Şekil 7A belirtildiği gibi) birincil antikor inkübasyon dizisi kuvvetle sonucunu etkileyebilecek farkında olun. Her yerde uygulanabilir, aynı türlerden türetilen primer antikorlar ile tespit antijenler yeterli engelleme algılamayı basitleştirir farklı sentezleme modelini göstermelidir. Antikor çapraz reaksiyonu veya yanlış-pozitif herhangi olasılığını ortadan kaldırmak için bu essen olduğunutansiyel uygun kontrolleri (yani, sadece ortaöğretim-antikor kontrolleri, ikinci primer antikor veya tek başına ikinci sekonder antikor ile bir inkübasyon tarafından takip ilk antijen için tam immunhistokimya) dahil etmek. 18 Şekil 2B elimizde iyi çalıştı antikor kombinasyonları gösterir. Birden fazla bağışıklık için, aynı türün yetiştirilir sekonder antikor (örneğin, eşek) kullanmak ve dokuya en az çapraz reaktiviteye sahip olduğu ve diğer türlerdeki (örneğin, önceden adsorbe edilmiş), proteinleri serum için tavsiye edilir. Aksi takdirde bölüm 3.2.3 beklenmedik türler arası çapraz reaktivite önlemeye yardımcı olabilir. Senin algılama sistemi minimal spektral örtüşme uygun olan fluorochromes seçin (örneğin, AMCA, Alexa Fluor 488, Rodamin Kırmızı, Alexa Fluor 647). Nükleer karşıt gerekli ise, daha sonra ikincil antikor kokteyli (DAPI veya Hoechst 33342 (10 ug / ml) ekleyin, hiçbir yakın-UV ikincil antikor bize olabilired). Doku HCI ile ön-muamele edilmiş ise bu nükleer counterstains çalışmaz. Benzer şekilde, HCI tedavi bazı antijenlerin tespitini tehlikeye atabilir ve bu nedenle tek tek antikor performansı üzerindeki etkisi test edilmesi gerekmektedir. Florokrom-konjuge sekonder antikor sonra ışıktan korumak bölümleri uygulanmıştır.

CldU ve EUK çapraz reaksiyon iki farklı BrdU antikor yardımı ile görüntülendi olabilir ya CldU (sıçan α-BrdU) veya EUK (fare α-BrdU) 9,19 ile. Her iki timidin analogları bir hayvan içine enjekte edilmiş ise non-saflaştırılmış antikor Idu çapraz reaksiyona girer, çünkü CldU tespit etmek için saflaştırılmış fare α-BrdU antikoru kullanımı kesinlikle gereklidir. Vega ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi. 9 CldU sinyalin timidin analogları eşdeğer algılama ulaşmak için immünofloresan ko-etiketlemesi için amplifiye edilecek olan ihtiyacı vardır. Bu nedenle, bunun yerine bir florokrom-konjuge sekonder antikor (bir α-sıçan) bir florokrom konjuge streptavidin biyotinile edilmiş bir ikincil antikor (α-faresi, inkübasyonu takiben ilave edilir bölüm 3.2.4). Çapraz-reaksiyonlar DUK veya CldU ya alınan farelerin kontrol bölümleri içeren herhangi bir istenmeyen antikor dışlamak için (ayrı ayrı; Şekil 8). Eş zamanlı olarak CldU ve Idu eşit molar miktarlarda enjekte edildi hayvanlardan Idu ve CldU kullanımı bölümlerinin eşdeğer algılama kontrol etmek için (bakınız Şekil 4).

2 progenitör hücreler tip 1 çalışma ve yazın biz Nestin antikorlar sıklıkla tatmin edici sonuçlar vermedi gibi Nestin-GFP transgenik fareler 12 kullanmayı tercih. Nestin-GFP farelerden güvenilir bir şekilde belirli bir gelişim aşamasında Nestin pozitif progenitör hücreleri ve morfolojik özelliklerini görselleştirme avantajına sahiptir. GFP sinyali, bir α-GFP antikor ile dolaylı immünoflüoresans vasıtasıyla amplifiye edilmesi gerekmektedir. İkinci antikor, bir fluorochr bağlanmış olmalıdırGFP benzer spektral özelliklere sahip sayılmaktadır. Gerekirse, Nestin-GFP fareler nöron özellikle genleri araştırmak için diğer mutant fare hatları melez olabilir. Artık, gelişmiş Nestin antikorlar bu, etiket hücre gövdeleri gibi işlemler temin edilir ve (malzeme listesi) transgenik bir yaklaşım bir alternatif olarak kullanılabilir.

Bu overfixation önlemek için 24 saat ile tespit uymak için kritik öneme sahiptir. dokuda formaldehit kimyasal reaksiyon ortakları öncelikle proteinlerdir ve formaldehit (metilen köprü oluşumu ile) komşu amino asitlerin çapraz bağlanması giden, yan zincirleri reaktif hidroksimetil gruplarını oluşturur. Bu (Malzeme Listesi özel antikorlara yorumlara bakınız) antijen epitopları ve imünoreaktivitesinin kaybı gizlenmesini neden olabilir. Kayıp immünoreaktivite kurtarmak için, çeşitli epitop alma yöntemleri ile e arasındaki bu kırılma formaldehit kaynaklı protein çapraz-bağlar varXposure 20 ısı. Bu protokolde, sitrat tampon yöntemi, doğum sonrası ve yetişkin hipokampus nöron tespiti (bölüm 3.3) için diğerlerinden üstün çalışır. Çok genç hayvanların dilimleri (<P21) çok kırılgan ya da bozulabilir ve özel dikkatle ele alınması gerekebilir unutmayın. Ayrıca, epitop bir epitop için zararlı ve bu nedenle tek tek antikorlar, bu ön-tedavi gerektiren çoklu boyanması için uygun olup olmadığını test edilmelidir olabilir.

Özetle, bu protokol yetişkin hipokampal nöron analizini kolaylaştıran temel ve özenli teknikleri bir koleksiyon. Özellikle tek bir bölümünden bir çoğalması ya da doğum-tanışma işareti ile birlikte tüm hipokampal progenitör alt popülasyonlarının kesin bir tanımlama sağlar. Bu teknikler hippocam gelişimini ve düzenlenmesini incelemek için antikorların veya diğer türlere herhangi bir kombinasyonu uyarlanabilirBelirli uyaranlara ve özellikle beyin fonksiyonlarında katılımları yanıt olarak pal progenitör hücreler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thymidine analog administration
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU Sigma-Aldrich C6891 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU MP Biomedicals 2105478 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU MP Biomedicals 2100357 toxic (mutagenic, teratogenic)
Tissue preparation
Isoflurane-Actavis Piramal Healthcare 700211
Paraformaldehyde powder (PFA) Riedel-De Häen 16005 toxic, flammable
Perfusion pump PD5206 Heidolph Instruments 523-52060-00
Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm Thermo Fischer Scientific 06409-13
Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm Agnthos 1036
Freezing microtome Microm HM 400 Thermo Fischer Scientific
24-well Cell culture multiwell plates Greiner Bio-One 662160
Immunohistochemistry
Tefal vitacuisine steamer Tefal VS 4001
Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3479 pre-loaded in 6-well culture plates
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3477 pre-loaded in 12-well culture plates
Netwell plastic 6-well carrier kit Corning 3521 for 24 mm polyester mesh membrane inserts
Netwell plastic 12-well carrier kit Corning 3520 for 15 mm polyester mesh membrane inserts
Vectastain Elite ABC kit Vector Laboratories PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) Sigma-Aldrich D-5637 carcinogenic, light sensitive
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Primary antibodies
Rabbit IgG1 α-Ki67 Novocastra/ Leica Biosystems NCL-L-Ki67MM1 DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval
Rabbit α-GFAP, AS-3-GF Synaptic Systems 173 002 1:500
Goat IgG (H+L) α-GFP Acris Antibodies R1091P 1:300
Mouse IgG1 α-nestin Abcam ab6142 1:200; requires epitope retrieval
Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin Merck Millipore AB2253 1:500
Rat IgG2a α-BrdU (ascites) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030CX for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Rat IgG2a α-BrdU (purified) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030   for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Mouse IgG1 α-NeuN Merck Millipore MAB377 1:500
mouse IgG1κ α-BrdU BD Biosciences 347580 For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Secondary antibodies
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin Dianova 711-065-152 1:500
Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin Dianova 712-065-150 1:500
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin Dianova 715-065-151 1:500
Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 1:250
Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11055 1:250
Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment Dianova 715-097-003 1:100
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 715-605-151 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 706-605-148 1:250
Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 712-295-150 1:250
Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 711-295-152 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 706-296-148 1:250
Streptavidin-rhodamine Red-X Dianova 016-290-084 1:500
Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA Dianova 111-155-144 1:250, works only with rabbit α-GFAP
Hoechst 33342 Molecular Probes H3570 1:1000
DAPI Molecular Probes D1306 1:1000
Blocking
Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) Dianova 715-007-003 1:20
Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) Dianova 711-007-003 1:20
Normal donkey serum Merck Millipore S30
Normal rabbit serum Dianova 011-000-010
Normal goat serum Dianova 005-000-001
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Histology
Cresyl violet Sigma-Aldrich C5042
Neo-Clear Merck Millipore 109843 non-toxic xylene substitute
Neo-Mount Merck Millipore 109016 permanent mounting medium
Microscopy
Axioskop 2 Carl Zeiss Microscopy
LSM 710 Carl Zeiss Microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586, (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54, (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22, (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11, (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21, (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435, (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2, (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182, (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40, (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11, (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384, (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53, (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41, (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59, (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8, (3), 228-235 (2000).

Comments

1 Comment

  1. Dear authors, could you please specify what exactly TBSplus and TBS-T are made of?
    thanks
    Alex

    Reply
    Posted by: Alessandro F.
    July 22, 2019 - 6:55 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics