Immunohistochimie et d'étiquetage multiple avec des anticorps de l'espèce hôte mêmes pour l'étude des adultes hippocampe neurogenèse

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Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. J. Vis. Exp. (98), e52551, doi:10.3791/52551 (2015).

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Abstract

Neurogenèse adulte est un processus très réglementé multi-étape dans laquelle de nouveaux neurones sont générés à partir d'une cellule souche neurale activé par de plus en plus engagés sous-types de souches intermédiaires. Chacun de ces sous-types exprime un ensemble de marqueurs moléculaires spécifiques qui, avec des critères morphologiques spécifiques, peuvent être utilisés pour leur identification. Typiquement, les techniques d'immunofluorescence sont appliqués impliquant des anticorps spécifiques du sous-type en combinaison avec des marqueurs de prolifération exo ou endogènes. Nous décrivons ici immunomarquage méthodes pour la détection et la quantification de tous les stades de la neurogenèse hippocampique adulte. Celles-ci comprennent l'application d'analogues de la thymidine, perfusion transcardial, traitement des tissus, épitope par la chaleur, ABC immunohistochimie, immunofluorescence indirecte multiple, microscopie confocale et de quantification des cellules. En outre, nous présentons un protocole d'immunofluorescence multiple séquentielle qui contourne les problèmes usually découlant de la nécessité d'utiliser des anticorps primaires soulevées dans les mêmes espèces hôtes. Il permet une identification précise de tous les sous-types de souches de l'hippocampe avec un marqueur de prolifération dans une seule section. Ces techniques sont un outil puissant pour étudier la régulation de différents sous-types de souches en parallèle, leur implication dans les pathologies du cerveau et de leur rôle dans les fonctions spécifiques du cerveau.

Introduction

Deux régions du cerveau de manière constitutive générer de nouveaux neurones tout au long de la vie, la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire (SGZ) du gyrus denté de l'hippocampe (DG). Les nouveaux neurones dérivent de cellules progénitrices neurales et passent par différents stades de développement morphologique et physiologique avant d'atteindre la maturité 1,2. A partir d'une cellule souche radiale divisant lentement glie-like (type 1) étages consécutifs de transit amplification de cellules progénitrices intermédiaires se présentent. Les sous-types plus indifférenciées (type 2a et 2b) de type ont une forme irrégulière avec de courtes, les processus tangentielles. Ils génèrent des neuroblastes (type 3) qui sortent graduellement du cycle cellulaire pour devenir neurones immatures (avec dendrites étendus vers la couche moléculaire) et finalement se intégrer dans le réseau de l'hippocampe des cellules granulaires comme matures. En raison de leurs caractéristiques physiologiques particulières ces cellules fournissent les circuits améliorés avec la plasticité 3 suggesTing un rôle unique dans la fonction hippocampique. En fait, les études de la dernière décennie ont généré des preuves substantielles que la neurogenèse adulte contribue à la mémoire spatiale, la séparation de modèle et le comportement émotionnel 4,5.

Neurogenèse adulte peut être étudiée en utilisant des approches différentes. analogues de la thymidine intègrent dans l'ADN au cours de la phase S du cycle cellulaire et permettent la naissance datant, la quantification et le destin analyse des cellules nés 6-8. L'application séquentielle des différents analogues de la thymidine (par exemple, CldU, EdU ou UDI) peut être utilisée pour étudier le renouvellement cellulaire ou populations de cellules nés à différents moments au cours d'une expérience 9. Une alternative, le marqueur endogène pour la prolifération cellulaire est Ki67. Il est exprimé dans les cellules en division au cours de toutes les phases du cycle cellulaire (G1, S, G2, M) à l'exception de la phase de repos (G0) et le début de G1 10,11. Afin d'analyser le phénotype des populations de cellules-nés chez l'adulte dentate gyrus plusieurs marqueurs moléculaires spécifiques de stade peuvent être utilisés tels que GFAP, nestine, DCX et NeuN 1,6. GFAP est un marqueur des astrocytes matures, mais est également exprimé dans les cellules gliales radiales comme dans le cerveau antérieur des adultes. Nestin est un filament intermédiaire spécifique des cellules gliales radiales ressemblant et les cellules progénitrices intermédiaires début. DCX est une protéine associée aux microtubules exprimée dans les progéniteurs intermédiaires, les neuroblastes et les neurones immatures. Basé sur le (co) expression de ces trois marqueurs et les caractéristiques morphologiques des cellules marquées quatre sous-types de cellules souches distinctes peuvent être identifiés: le type 1 (GFAP +, nestine +, DCX -), le type 2a (GFAP -, nestine + , DCX -), le type 2b (GFAP -, nestine +, DCX +) et le type 3 (GFAP -, nestine -, DCX +) 1. Co-marquage de DCX avec NeuN, qui est exprimé dans les neurones post-mitotiques, permet la différenciation des immature (DCX +, NeuN +) et matures (DCX -, NeuN +) neurones granulaires.

Les marqueurs mentionnés ci-dessus sont fréquemment utilisés pour co-marquage immunofluorescent et microscopie confocale ultérieur pour analyser le nombre et l'identité des cellules de nouveau-nés. Cela nécessite habituellement des anticorps de différentes espèces hôtes anticorps pour empêcher une réactivité croisée indésirable. Cependant, la majorité des anticorps primaires appropriés pour la recherche de la neurogenèse sont élevés soit chez le lapin ou souris (par exemple, souris α-BrdU, souris α-NeuN, lapin α-Ki67, lapin α-GFAP). Cela conduit à de sérieuses limitations dans le nombre et la combinaison des antigènes qui peuvent être évalués en une seule tranche. Ceci à son tour augmente non seulement l'effort de coloration, selon colorations multiples doivent être effectuées, mais peut aussi compromettre la fiabilité des résultats. De plus, certains antigènes sont sensibles à la formaline épitope induite par masquage de fixation (par exemple, Ki67, La nestine). Nous décrivons ici modifications des protocoles de immunomarquage simples et multiples classiques (par exemple, la récupération de l'épitope, immunocoloration séquentielle multiples, utilisation de la nestine-GFP souris transgéniques 12) à surmonter bon nombre de ces questions. En particulier, le protocole d'immunofluorescence multiple séquentielle permet coloration contre un maximum de quatre antigènes différents même si une partie des anticorps est dérivé du même hôte. Ceci permet la détection simultanée de type 1, type 2a, 2b et le type des cellules progénitrices de type 3, ainsi que leur activité proliferative dans une seule section.

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Protocol

NOTE: Toutes les procédures impliquant des animaux vivants ont été effectuées conformément à la directive CE 86/609 / CEE des lignes directrices sur le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par le comité d'éthique local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).

1. Injection par voie intrapéritonéale analogues de la thymidine

  1. Peser les animaux le jour avant l'injection. Calculez le montant de la thymidine analogique requise pour toutes les injections prévues le lendemain ainsi que les volumes d'injection individuels poids ajusté d'un / ml solution stock de 10 mg.
  2. Préparer / ml thymidine solution mère à 10 mg. (ATTENTION! Analogues de la thymidine sont toxiques. Suivez les fiches spécifiques de données de sécurité (FDS) fournies par les fournisseurs, ce est à dire, porter une blouse de laboratoire et des gants, utiliser une hotte chimique).
    1. Prenez thymidine analogique du congélateur et l'amener à RT, env. 21 ° C. Peser 10 mg et ajouterune solution saline stérile (pour BrdU et CldU) ou N NaOH 0,04 (dans une solution saline stérile, car UDI), vortex. Placez au moins 10 à 15 min dans un bain tourbillon et 50 ° l'eau tous les 2 à 3 min pour dissoudre la poudre.
      REMARQUE: Utilisez des solutions pour un maximum de 24 heures se il est entreposé à température ambiante et pendant plusieurs semaines à -20 ° C. Protéger solutions de la lumière (couvrir de papier d'aluminium). Toujours vérifier précipités et re-dissoudre si nécessaire.
  3. Retenez la souris par la peau et par voie intrapéritonéale injecter un volume approprié, ajustée au poids de la solution mère (à température ambiante) en utilisant une seringue de dosage de précision avec une aiguille 30 G.
    NOTE: En cas CldU et IdU doivent être administrés de façon séquentielle dans le même animal, considèrent injecter des concentrations équimolaires (par exemple, 42,5 mg / kg et 57,5 CldU mg / kg IdU, ce qui correspond à 50 mg / kg BrdU). Par conséquent, ajuster le volume d'injection des solutions à 10 mg / ml actions en conséquence.

2. Préparation des tissus

  1. Prepare 4% de formaldehyde dans 0,1 M de tampon phosphate pH 7,4 le jour avant la perfusion. Conserver à 4 ° C.
  2. Perfuser transcardiaque les souris profondément anesthésiés (3,5% de l'isoflurane) via le ventricule gauche avec du PBS 10 ml glacée, puis avec 40 ml glacée formaldéhyde (débit de 5 ml / min). On dissèque le cerveau et la post-correction dans le même fixatif pendant 24 heures à 4 ° C.
  3. Transférer les cerveaux consécutivement dans 10% (24 h à 4 ° C) et 30% de saccharose (jusqu'à ce que les puits du cerveau, env. 48 h). Pour la congélation, plonger lentement dans les cerveaux cryoprotégés -25 ° C jusqu'à ce qu'aucune bulle isopentane émergent du tissu. Stocker à -80 ° C.
  4. Couper des coupes coronales de 40 pm d'épaisseur sur un microtome de congélation (température du bloc à -25 et -16 ° C). sections de transfert de manière séquentielle dans une solution d'antigel contenant des puits d'une plaque de culture cellulaire à 24 puits (voir Figure 1). Stocker à -20 ° C.

"Figure Figure 1. Représentation schématique de transférer tranches microtome dans une plaque de 24 puits. Commencez à A1 et placez les tranches ultérieures dans la ligne A, après A6 aller jusqu'à la ligne B et ainsi de suite. En arrivant à D6, revenir à A1 et continuer. Cet agencement permet de tranches pour la quantification de chaque n-ième partie de l'ensemble d'un cerveau. Pour la quantification des cellules nés prendre toutes les 6 e section du cerveau (l'équivalent du contenu d'une colonne), par immunofluorescence phénotypage prendre chaque section 12 e (équivalent au contenu de deux lignes alternées d'une colonne).

3. Immunocoloration

NOTE: Les sections sont traitées flottement libre, généralement dans des plaques 6 puits équipés d'une plaque de support et Mesh. Par exception, le blocage, incubations d'anticorps et la réaction ABC sont faites dans 12 ou 24 puits plaques sans inserts en mesh (0,5 à 1 ml par well est suffisante, en fonction du nombre de tranches qui doivent être colorées). Au cours de ces étapes, transférer sections avec l'aide d'un pinceau (rincer à chaque nouvelle solution). Toutes les incubations sont faites avec agitation continue (max 150 rpm).

  1. Immunohistochimie (méthode ABC)
    1. Transfert sections de l'antigel dans le SCT et bien rincer (une fois O / N à 4 ° C, 5 fois à température ambiante pendant 10 min chacun) pour supprimer complètement l'antigel.
    2. Incuber pendant 30 min dans 1,5% de H 2 O 2 dans du TBS-T pour étancher une activité de peroxydase endogène. Faites attention à bulles et re-plonger sections si nécessaire. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun.
    3. Facultatif: Pendant ce temps, préchauffer une enceinte de chauffage et du HCl 2 N à 37 ° C. Incuber les coupes pendant 30 min à 37 ° C dans du HCl 2 N pour dénaturer l'ADN. Gently sections distinctes à l'aide d'une brosse.
    4. Facultatif: Neutraliser sections pendant 10 min dans 0,1 M tampon borate pH8,5, la température ambiante. Pendant le transfert, tamponner brièvement les inserts en mesh contenant les sections sur une serviette en papier pour enlever restes HCl. Rincer deux fois dans TBS pendant 15 min chacun.
    5. Incuber dans TBSplus pour perméabiliser le tissu et de bloquer les sites de liaison d'anticorps non spécifiques, une heure à température ambiante.
    6. Incuber dans anticorps primaire dilué dans TBSplus, O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun.
    7. Incuber dans anticorps secondaire biotinylé dilué dans TBSplus, 3 heures à température ambiante. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun. Pendant ce temps ...
    8. Préparer complexe ABC selon le protocole du fabricant (A + 1% 1% de B dans du TBS-T). Laisser reposer pendant 30 min à température ambiante avant utilisation. Incuber sections réactif AB pendant 1 heure à température ambiante. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun.
    9. Préparer 50 ml 0,5 mg / ml DAB dans du TBS-T par 6 ou 12 puits plaque, divisé en deux moitiés et pipette 4 ml ou 2 ml par puits, respectivement. sections de transfert en solution DAB (ATTENTION! DAB est toxique. Suivez les spécific FDS fournies par le fournisseur, ce est à dire, de porter une blouse de laboratoire et des gants, utilisent une hotte chimique).
    10. Ajouter 0,5 ml 1% H 2 O 2 à 25 ml de solution de DAB restant, mélanger et volumes pipette équivalentes comme ci-dessus à chaque puits pour démarrer la réaction peroxydase. Incuber pendant 12 min. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun.
    11. Sections de montage aux diapositives de la gélatine, l'air sec O / N. Lamelle avec un milieu de montage permanent.
    12. Facultatif: Counterstain avant de placer la lamelle (voir section 3.5).
      NOTE: Si le rapport signal-bruit est faible en raison de bruit de fond élevé, répéter le traitement H 2 O 2 après l'incubation avec le réactif AB (étape 3.1.8).
  2. Multiple-immunofluorescence
    1. Immunofluorescence multiple unique ou simultanée
      1. Transfert sections de l'antigel dans le SCT et bien rincer (une fois O / N à 4 ° C, 5 fois à température ambiante pendant 10 min chacun) pour supprimer complètement unetifreeze.
      2. En option: que les étapes 3.1.3 - 3.1.4.
      3. Incuber dans TBSplus pour perméabiliser le tissu et de bloquer les sites de liaison d'anticorps non spécifiques, une heure à température ambiante.
      4. Incuber dans un cocktail d'anticorps primaire (par exemple, α-BrdU rats, porcs Guinée α-DCX, chèvre α-GFP) dilués dans TBSplus, O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun.
      5. Incuber dans cocktail d'anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome (par exemple, la rhodamine Rouge α-rat, Alexa-647 α-Guinée porc, Alexa-488 α-chèvre; tous dérivés dans âne) dilué dans TBSplus, 3 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C. A partir de maintenant protéger les sections de la lumière. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun.
      6. Sections de montage aux diapositives de la gélatine, l'air sec O / N. Lamelle avec un milieu de montage aqueux.
    2. Immunofluorescence multiple séquentielle avec des anticorps primaires de même espèce hôte
      1. Comme les étapes 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. Incuber dans fipremier anticorps primaire (par exemple, le lapin α-antigène A), O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      3. Incuber en premier anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome (par exemple, Rhodamine Red-conj. Âne α-lapin), 3 heures TA. A partir de maintenant protéger les sections de la lumière. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      4. Incuber à 10% de sérum normal même hôte que l'anticorps primaire (par exemple, du sérum de lapin) pendant 3 heures à RT saturer paratopes ouvertes sur le premier anticorps secondaire. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      5. Incuber dans TBSplus avec 50 ug / ml monovalents non conjugué de fragments Fab dirigé contre l'hôte des anticorps primaires (par exemple, α-lapin IgG (H + L)) pour couvrir épitopes qui pourraient être reconnus par le deuxième anticorps secondaire, O / N à 4 ° C.
      6. Rincer au moins 3 fois dans du TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun. Pendant le transfert, swa brièvementb les inserts en mesh contenant les sections sur une serviette en papier pour enlever les restes Fab.
      7. Incuber dans secondes anticorps primaire (par exemple, le lapin α-antigène B), O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      8. Incuber en second anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome (par exemple, Alexa-488-conj. Âne α-lapin), 3 heures TA. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus.
        NOTE: Pour étiqueter antigènes avec des anticorps de différentes espèces hôtes les ajouter à l'étape 3.2.2.2 et les anticorps secondaires respectifs à l'étape 3.2.2.3.
    3. L'un des anticorps secondaires de même espèce que l'un des anticorps primaires
      NOTE: Ce protocole est adapté pour quadruple coloration contre BrdU ou Ki67 avec GFAP, nestine-GFP et DCX.
      1. Suivre strictement les étapes protocole 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Jusqu'à ce point ne utiliser que du sérum âne dans TBSplus.
      2. Incuber dans TBSplus contenant du sérum de chèvre à 3% pendant 1 heure à température ambiante. Ce couvre paratopes ouvertes sur l'anticorps secondaire α-chèvre. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      3. Incuber dans AMCA-conj. α-lapin de chèvre dilué à TBSplus, RT 3 h ou O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus.
    4. CldU, IdU co-coloration
      1. Rincer, dénaturer et de neutraliser sections comme décrit dans la section 3.2.1 (étapes 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. Incuber à 20 pg / ml de fragments Fab non conjugués α-IgG de souris (H + L) dans TBSplus, 1 heure à température ambiante. Rincer 4 fois dans du TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      3. Incuber dans un cocktail d'anticorps primaire contenant α-BrdU rat (1: 400; purifié IgG2) et α-BrdU souris (1: 350) dilués dans TBSplus, O / N à 4 ° C. Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      4. Incuber dans un cocktail d'anticorps secondaire biotinylé contenant âne α-rat (1: 500) et FITC-conj. âne α-souris fragments Fab (1: 100). Rincer trois fois dans TBS et une fois en TBS-T pendant 10 minutes chacun.
      5. Incuber dans la rhodamine-Rouge conj. Streptavidine, 2 heures à température ambiante. Rincer trois fois dans TBS pendant 15 min chacun, monter et lamelle comme ci-dessus.
    5. L'amplification du signal de fluorescence dans des souris nestine-GFP
      1. Ajouter chèvre α-GFP au cocktail d'anticorps primaire.
      2. Ajouter un anticorps secondaire conjugué fluorochrome avec des propriétés spectrales similaires à la GFP (comme Alexa 488 conj. Âne α-chèvre) au cocktail d'anticorps secondaire.
  3. épitope
    1. Effectuer épitope après rinçage à l'antigel. Préchauffer vapeur avec 6 ou 12 puits des plaques contenant 0,1 M de tampon citrate pH compris entre 6,0 95 à 99 ° C (environ 25 min).
    2. Transférez les sections dans le tampon citrate chaude et la vapeur pendant 30 min (couvrir les plaques avec du papier d'aluminium que le plastique lidentifiants ne sont pas résistant à la chaleur).
    3. Immédiatement placer les plaques dans un bain de glace pour refroidir. Cela permet de protéger la morphologie du tissu, ce qui est particulièrement important lorsque l'on travaille avec des coupes de cerveau des animaux post-natales.
    4. Rincer trois fois dans TBS pendant 10 minutes chacun pour rincer et neutraliser le citrate et continuer coloration.
  4. Souris anticorps sur des tissus de la souris
    1. Ajouter / ml de fragments Fab monovalents 20 ug de α-souris IgG (H + L; mêmes espèces d'hôtes que l'anticorps secondaire) à la première étape de blocage (par exemple, l'étape 3.1.5 ou 3.2.1.3).
    2. Rincer 4 fois dans du TBS et une fois en TBS-T pendant 10 min chacun, et procéder avec protocole respective.
  5. Le violet de crésyl contre-coloration
    1. Préchauffer solution crésyl violet à 60 ° C (en pot de verre). Incuber les lames dans la solution chaude pendant 3 min.
    2. Rincer à l'aq. dest. déshydrater et deux fois pendant 1 minute chaque à 70%, 96% et 100% d'isopropanol. Ciel de 5-6 min dans du xylène ou un substitut du xylène et lamelle avec un milieu de montage permanent compatible.

4. Analyse des données

  1. Compter les cellules nés peroxydase colorées dans chaque section 6 e sur toute la mesure rostrocaudal du gyrus denté. Utilisez un microscope optique à un grossissement de 400X.
  2. Multiplier les nombres de cellules résultant de l'intervalle d'intersection pour obtenir une estimation du nombre total de cellules-nés.
  3. L'image de la fluorescence sections marqué avec un microscope confocal laser équipé de lasers appropriés et des systèmes de filtrage. Prendre piles d'images à des positions aléatoires le long de la totalité de l'étendue du gyrus denté à un grossissement de 400X et analyser au moins 50 cellules d'intérêt sélectionnés au hasard par hémisphère pour co-marquage avec d'autres marqueurs.
  4. Multiplier les pourcentages résultant de cellules co-marqué (% / 100) avec le nombre total de cellules nés pour calculer absoluenombre de populations spécifiques de cellules nouveau-nés.

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Representative Results

Nous avons appliqué les méthodes décrites ci-dessus pour quantifier et caractériser les cellules de nouveau-nés dans les postnatales et adultes hippocampe. Par conséquent, nous avons utilisé de type sauvage et la neurogenèse déficientes cycline D2 knock out (KO) Ccnd2 souris logées dans des conditions connues pour affecter le taux de la neurogenèse (ie, l'environnement enrichi, EE) 13,14. DAB coloration immunohistochimique soit contre Ki67, BrdU, CldU ou IdU toujours révélé des différences dans le nombre de cellules entre les nouveau-nés de type sauvage et les souris KO Ccnd2 (figure 3) 15. En outre, avec des injections consécutives de équimolaires CldU et IdU nous étions capables de discriminer des populations de cellules nés pendant des périodes spécifiques de l'EE (figure 3C, D). L'adoption de la section 3.2.4 nous avons pu avec succès détecter des intensités de signaux égaux et un excellent recouvrement des CldU et IdU après leur délivrance simultanée (figure 4). cellules nouveau-nés de BrdU marqué pourraient être phénotypées avec un stanProcédé dard d'immunofluorescence, soit par l'application simultanée BrdU et NeuN, (figure 5) ou BrdU, GFAP, la nestine-GFP et DCX des anticorps (figure 6B). Cette technique a permis de type identification réussie 1, 2a, 2b et 3 cellules progénitrices dans un seul spécimen (figure 6B, D). Co-étiquetage des Ki67 avec des marqueurs progénitrices nécessaire l'application séquentielle d'anticorps que des anticorps primaires contre Ki67 et GFAP ont été soulevées dans le lapin (se applique à la section 3.2.2), par ailleurs l'un des anticorps primaires (chèvre α-GFP) a été produit dans le même hôte que l'un des anticorps secondaires (AMCA conj. α-chèvre de lapin). Une combinaison de sections 3.2.2 et 3.2.3 parfaitement travaillé si les articles ont été incubées d'abord dans Ki67 avec anticorps nestine-GFP, et d'autre part des anticorps GFAP mais pas vice versa (Figure 6C). Figure 2B résume les régimes d'application approuvés.


Figure 2. immunofluorescence séquentielle multiples avec des anticorps primaires provenant des mêmes espèces hôtes. (A) Illustration schématique. (B) des combinaisons réussies d'anticorps et leur ordre chronologique en immunofluorescence. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. images légères de microscopie de ABC-immunohistochimie pour la quantification des cellules de nouveau-nés dans le gyrus denté. Représentées sont des comparaisons de différents marqueurs de prolifération dans WT et souris KO Ccnd2 neurogenèse déficient à 100X et 400X grossissement. (A) g> coloration Ki67-DAB montre des grappes de cellules en prolifération dans la zone sous-granulaire du gyrus denté (jour postnatal 35). Le nombre de cellules en prolifération est diminuée chez les souris Ccnd2 KO par rapport aux souris WT. (B) cellules nouveau-né à 28 jours après BrdU-administration (système d'injection images ci-dessus) confirmant le taux de prolifération réduite chez les souris Ccnd2 KO. (C) CldU-administration au cours de la 6ème semaine de EE (schéma d'injection image ci-dessus) a révélé une augmentation du nombre de cellules de nouveau-nés dans le gyrus denté de souris WT mais pas Ccnd2 KO. (D) IdU administration lors de la 8e semaine de EE a montré des résultats similaires. La barre d'échelle représente 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

fig4.jpg "/>
Figure 4. immunofluorescence co-coloration des CldU et IdU après la livraison simultanée des concentrations équimolaires. Amplification du signal de cellules marquées CldU abouti à un excellent recouvrement des CldU et UDI. La barre d'échelle représente 20 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Immunofluorescence co-marquage BrdU et de NeuN. (A) BrdU a été administré 6 fois toutes les 8 h pendant 2 jours consécutifs à partir de jour postnatal 14. Les animaux ont été sacrifiés 28 jours plus tard. (B) immunofluorescence co-étiquetage de la prolifération des cellules avec le marqueur de neurones matures NeuN montre un nombre réduit de proliférer cellules dans Ccnd2 KO comparé à WAnimaux T. La barre d'échelle représente 50 um. (C) de la vue agrandie de (B) montrant des cellules de co-marqué dans les deux génotypes. La barre d'échelle représente 20 um. (D) par exemple à fort grossissement d'une / de cellule NeuN de co-BrdU marqué dans le gyrus denté. La barre d'échelle représente 10 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. immunofluorescence Quadruple co-marquage de différents marqueurs de prolifération avec GFAP, la nestine-GFP et DCX de phénotypage de cellules granulaires du nouveau-né dans le gyrus denté de souris de la nestine-GFP. (A) BrdU a été administrée trois fois toutes les 2 h au jour postnatal 70 . Les animaux ont été sacrifiés deux heures plus tard. (B) Représentant l'image d'un co-coloration pour BrdU, GFAP,nestine-GFP et DCX. (C) Représentant l'image d'immunofluorescence quadruple pour Ki67, GFAP, nestine-GFP et DCX. (D) Classification des types de cellules progénitrices en fonction de leur marquage en immunofluorescence. Basé sur la co-expression de différents marqueurs et les caractéristiques morphologiques des cellules marquées quatre sous-types de cellules souches distinctes peuvent être identifiés: le type 1 (GFAP +, nestine +, DCX -), le type 2a (GFAP -, nestine +, DCX - ), le type 2b (GFAP -, nestine +, DCX +) et le type 3 (GFAP -, nestine -, DCX +). La barre d'échelle représente 20 um. (E) aperçu schématique des différentes étapes de la neurogenèse hippocampique adulte. Il illustre les types 4 progénitrices de cellules, les neurones immatures et matures cellules granulaires, leur expression caractéristique de marqueurs et de leur capacité proliférative. ML - couche cellulaire et moléculaire, GCL -couche de cellules granulaires, SGL -. couche de cellules subgranulaire Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Exemple de colorations successives réussies et non réussies avec deux anticorps primaires soulevées dans la même espèce, en fonction de la séquence de l'anticorps incubation. Les micrographies confocales montrent le résultat d'une co-coloration séquentielle contre Ki67 et GFAP la fois avec des anticorps primaires dérivé de lapin. En (A) l'immunohistochimie a été réalisée pour GFAP suivie d'une coloration contre Ki67 qui a conduit à un chevauchement prononcé des deux signaux. En particulier, le signal Ki67 était atypique et ressemblait le signal de la coloration de la GFAP. (B) montre les résultats de l'inverseséquence de coloration avec la coloration de Ki67 terminé premier et coloration subséquente contre GFAP. Ici, les signaux pour les deux antigènes ressemblaient le profil d'expression attendu: Le signal Ki67 était limitée aux noyaux dans la zone sous-granulaire tandis que le signal a été trouvé cytoplasmatically GFAP, principalement dans les processus cellulaires provenant de la zone sous-granulaire. La barre d'échelle représente 20 um. RhX - rhodamine X. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8. La spécificité des anticorps α-BrdU utilisés pour détecter CldU et UDI. Les souris ont été injectées avec soit CldU ou avec IdU (application non simultanée). Chez les souris (A) des coupes de cerveau de CldU (A1) ou UDI (A2) étaient injectés IMMUnostained en utilisant l'anticorps de rat purifiée α-BrdU qui devrait spécifiquement une réaction croisée à CldU, mais pas aux UDI. (B) montre les résultats de la coloration à partir de cerveaux CldU (B1) ou UDI (B2) des souris injectées avec la souris α-BrdU anticorps qui est prévu à une réaction croisée avec CDI, mais pas CldU. La barre d'échelle représente 20 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Quantification et identification des sous-populations de cellules nouveau-nés est une question centrale dans la recherche de la neurogenèse adulte. Combinant marqueurs de prolifération et des anticorps contre les protéines exprimées au cours des étapes spécifiques de la neurogenèse adulte permet la détection immunohistochimique de ces sous-populations. Certains des anticorps ou des combinaisons d'anticorps de coloration nécessitent des conditions particulières.

Étiquetage des cellules en division avec des analogues de la thymidine synthétiques est encore l'étalon-or pour étudier la neurogenèse hippocampique adulte. Il est crucial de considérer le protocole d'injection appropriée avant le début de l'expérience. Nous administrons habituellement de 50 mg / kg (poids corporel, ip) BrdU, mais les concentrations peuvent varier en fonction des exigences des expériences (jusqu'à 300 mg / kg pour une injection en bolus) 8,16. Si UDI et CldU doivent être injectés séquentiellement pour discrimination temporelle des populations de cellules, il est obligatoire d'injecter des concentrations équimolaires ( 16. Un autre inconvénient est que dénaturation de l'ADN est nécessaire pour la détection immunohistochimique des analogues de la thymidine qui pourrait interférer avec l'antigénicité des anticorps ou d'autres techniques de marquage d'ADN (par exemple, DAPI, Hoechst 33258). Détection immunohistochimique des marqueurs de prolifération Ki67 endogènes comme peut être une alternative adéquate 10,11. Toutefois, cela ne permet un instantané de l'activité proliférative au moment de la perfusion, la naissance et l'analyse rétrospective datant de sort sont impossibles.

Pour immunocoloration, sections sont généralement traitées flottement libre, généralement dans des plaques 6 puits équipés d'une plaque de support et Mesh qui simplifie leur transfert d'une solution à l'autre. Par exception, le blocage, incubations d'anticorps et la réaction ABC sont faitesdans 12 ou 24 puits plaques sans inserts en mesh à économiser des solutions coûteuses (de 0,5 à 1 ml par puits est suffisant, en fonction du nombre de tranches qui doivent être tachée). Au cours de ces étapes, transférer sections avec l'aide d'un pinceau qui doit être rincé lors du changement de solutions. Empêcher sections de dessèchement et effectuer incubations qui prennent> 1 h dans une chambre humidifiée. Toutes les incubations doivent être fait avec agitation continue (max 150 rpm). Toujours tester et titrer chaque nouveau lot d'anticorps. Prolongement de la durée d'incubation anticorps (jusqu'à 2 jours à 4 ° C) peuvent améliorer la coloration. En cas seuls les anticorps de souris sont disponibles contre des antigènes que vous souhaitez visualiser dans le tissu de la souris, il est conseillé de bloquer immunoglobulines endogènes avec des fragments Fab monovalents hautement concentré α-souris (section 3.4). Chaque fois que l'aide de cette technique étendre les étapes de rinçage suivantes. Sinon, fragments Fab non consolidés puissent se lier à votre anticorps de souris primaire. HCl prétraitement et le borateneutralisation sont nécessaires seulement pour la détection des analogues de la thymidine. La réaction de la peroxydase de 12 min aboutir à un rapport optimal signal-sur-bruit avec les conditions et les anticorps appliqués dans notre protocole. Comme pour toute réaction enzymatique, la vitesse de la réaction de la peroxydase dépend de plusieurs facteurs (par exemple, la température, le pH, la concentration de l'enzyme et du substrat). Par conséquent, les temps de réaction doivent être optimisés pour une nouvelle série d'anticorps. Pour visualiser les structures anatomiques dans les taches DAB avec un fond très faible (par exemple, CldU), tranches peuvent être contrecolorées. La méthode crésyl violet décrit dans la section 3.5 des résultats dans un très faible de contraste qui ne compromet pas le signal DAB spécifique.

Pour immunofluorescence multiple, utiliser des anticorps primaires qui sont soulevées dans les différentes espèces ou de différentes isotypes et suivre la section 3.2.1. Sinon, effectuer un immunomarquage séquentielle multiple qui a été optimisé pour détecter les anticorps primaires multiplesde la même espèce hôte (souris ou de lapin; section 3.2.2). Le principe de base de cette méthode a été inventée par Ferguson et ses collègues qui ont taché avec succès différents marqueurs musculaires avec des anticorps primaires de souris deux 17. Les fragments Fab utilisés pour le blocage à l'étape 3.2.2.5 doivent être dérivées de la même espèce hôte que l'anticorps secondaire. Les concentrations et les temps d'incubation décrites à la section 3.2.2 sont optimisés pour les anticorps spécifiques décrits ici et ils doivent être ajustés pour toute nouvelle combinaison d'anticorps. Soyez conscient que la séquence de l'incubation d'anticorps primaire pourrait fortement influencer le résultat (comme indiqué sur la figure 7A). Dans la mesure applicable, les antigènes détectés par les anticorps primaires qui sont dérivés de la même espèce doivent montrer un profil d'expression différent qui simplifie la détection de blocage est insuffisante. Pour éliminer toute possibilité d'anticorps contre-réaction ou faux positifs, il est essentiel d'inclure des contrôles appropriés (par exemple, les contrôles ne-secondaires-anticorps; immunohistochimie complet pour premier antigène suivie par une incubation avec un second anticorps primaire ou second anticorps secondaire seul). 18 Figure 2B montre combinaisons d'anticorps qui ont bien fonctionné dans nos mains. Pour immunofluorescence multiple il est également conseillé d'utiliser des anticorps secondaires qui sont soulevées dans les mêmes espèces (par exemple, ânes) et ont une réactivité croisée minimale à votre tissu et de protéines sériques provenant d'autres espèces (c.-à-pré-adsorbé). Sinon la section 3.2.3 peut aider à prévenir toute interspécifique inattendus réactivité croisée. Sélectionnez fluorochromes avec un minimum spectrale recouvrement approprié à votre système de détection (par exemple, AMCA, Alexa Fluor 488, la rhodamine Rouge, Alexa Fluor 647). Si une contre-coloration nucléaire est nécessaire, ajouter DAPI ou Hoechst 33342 (10 ug / ml) au cocktail d'anticorps secondaire (donc pas de l'UV proche anticorps secondaire peut être noused). Ces contre-colorants nucléaires ne fonctionnent pas si le tissu a été pré-traitée avec HCl. De même, le traitement de HCl peut compromettre la détection de certains antigènes et par conséquent son influence sur la performance individuelle d'anticorps qui doit être testé. Une fois les anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome ont été appliquées sections abri de la lumière.

CldU IdU et peuvent être visualisées à l'aide de deux anticorps différents BrdU qui réagissent soit avec CldU (rat α-BrdU) ou UDI (souris α-BrdU) 9,19. Si les deux analogues de la thymidine ont été injectées dans un animal, il est absolument essentiel d'utiliser l'anticorps rat α-BrdU purifiée pour détecter CldU parce que l'anticorps non purifié réagit de manière croisée à l'UDI. Comme décrit par Vega et al. 9 du signal CldU doit être amplifié pour immunofluorescence co-étiquetage pour atteindre la détection équivalent de deux analogues de la thymidine. Par conséquent, au lieu d'un anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome (α-rat) un conjugué streptavidine fluorochrome est ajouté après incubation dans un anticorps secondaire biotinylé (α-rat; la section 3.2.4). Pour exclure tout anticorps réactions croisées indésirables comprennent des sections de contrôle de souris ayant reçu soit IdU ou CldU (séparément; voir la figure 8). Pour vérifier la détection équivalent de sections d'utilisation UDI et CldU provenant d'animaux qui ont été injectés simultanément avec des quantités équimolaires de CldU et UDI (voir Figure 4).

Pour étudier de type 1 et de type 2 cellules progénitrices nous préférons utiliser nestine-GFP souris transgéniques 12 que des anticorps nestine souvent ne ont pas fourni des résultats satisfaisants. souris Nestin-GFP ont l'avantage de visualiser de manière fiable des cellules progénitrices nestine-positives et leurs caractéristiques morphologiques à un stade de développement particulier. La GFP signal doit être amplifié par immunofluorescence indirecte avec un anticorps α-GFP. L'anticorps secondaire doit être couplé à un fluorochrome avec des propriétés spectrales similaires à la GFP. Si nécessaire, les souris nestine-GFP peuvent être métissés à d'autres lignées de souris mutantes pour enquêter sur l'implication de gènes particuliers dans la neurogenèse. A présent, les anticorps nestine améliorés sont fournis organismes qui cellulaires étiquette ainsi que les processus et peuvent être utilisés comme une alternative à l'approche transgénique (voir liste des matériaux).

Il est essentiel de se conformer à la fixation de 24 heures pour éviter overfixation. Les partenaires de la réaction chimique du formaldéhyde dans les tissus sont principalement des protéines et de formaldéhyde génère des groupes hydroxyméthyle réactifs sur leurs chaînes latérales aboutissant à une réticulation des acides aminés adjacents (par la formation de ponts méthylène). Cela peut provoquer masquage des antigènes-épitopes et la perte d'immunoréactivité (voir les commentaires à des anticorps spécifiques dans la liste des matières). Pour récupérer perdu immunoréactivité, plusieurs méthodes de récupération de l'épitope existent que la protéine induite par le formaldéhyde-break liens transversaux par courrierxposition à la chaleur 20. Dans ce protocole, la méthode de tampon citrate fonctionne supérieur aux autres pour la détection de la neurogenèse dans les postnatales et adultes hippocampe (section 3.3). Notez que des tranches de très jeunes animaux (<P21) peuvent devenir très fragile ou déformée et doivent être manipulés avec un soin particulier. En outre, la récupération de l'épitope peut être préjudiciable pour certains epitopes et donc anticorps individuels doivent être testés se ils sont appropriés pour la coloration multiple qui nécessite ce traitement préalable.

En résumé, ce protocole est un ensemble de techniques de base et élaborées qui facilitent l'analyse de la neurogenèse hippocampique adulte. Il permet notamment une identification sans équivoque de toutes les sous-populations progénitrices hippocampe avec une prolifération ou la naissance datant-marqueur dans une seule section. Ces techniques peuvent être adaptées à ne importe quelle combinaison d'anticorps ou d'autres espèces pour étudier le développement et la réglementation de hippocamcellules progénitrices PAL en réponse à des stimuli spécifiques et leur implication dans certaines fonctions cérébrales.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thymidine analog administration
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU Sigma-Aldrich C6891 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU MP Biomedicals 2105478 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU MP Biomedicals 2100357 toxic (mutagenic, teratogenic)
Tissue preparation
Isoflurane-Actavis Piramal Healthcare 700211
Paraformaldehyde powder (PFA) Riedel-De Häen 16005 toxic, flammable
Perfusion pump PD5206 Heidolph Instruments 523-52060-00
Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm Thermo Fischer Scientific 06409-13
Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm Agnthos 1036
Freezing microtome Microm HM 400 Thermo Fischer Scientific
24-well Cell culture multiwell plates Greiner Bio-One 662160
Immunohistochemistry
Tefal vitacuisine steamer Tefal VS 4001
Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3479 pre-loaded in 6-well culture plates
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3477 pre-loaded in 12-well culture plates
Netwell plastic 6-well carrier kit Corning 3521 for 24 mm polyester mesh membrane inserts
Netwell plastic 12-well carrier kit Corning 3520 for 15 mm polyester mesh membrane inserts
Vectastain Elite ABC kit Vector Laboratories PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) Sigma-Aldrich D-5637 carcinogenic, light sensitive
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Primary antibodies
Rabbit IgG1 α-Ki67 Novocastra/ Leica Biosystems NCL-L-Ki67MM1 DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval
Rabbit α-GFAP, AS-3-GF Synaptic Systems 173 002 1:500
Goat IgG (H+L) α-GFP Acris Antibodies R1091P 1:300
Mouse IgG1 α-nestin Abcam ab6142 1:200; requires epitope retrieval
Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin Merck Millipore AB2253 1:500
Rat IgG2a α-BrdU (ascites) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030CX for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Rat IgG2a α-BrdU (purified) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030   for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Mouse IgG1 α-NeuN Merck Millipore MAB377 1:500
mouse IgG1κ α-BrdU BD Biosciences 347580 For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Secondary antibodies
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin Dianova 711-065-152 1:500
Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin Dianova 712-065-150 1:500
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin Dianova 715-065-151 1:500
Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 1:250
Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11055 1:250
Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment Dianova 715-097-003 1:100
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 715-605-151 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 706-605-148 1:250
Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 712-295-150 1:250
Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 711-295-152 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 706-296-148 1:250
Streptavidin-rhodamine Red-X Dianova 016-290-084 1:500
Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA Dianova 111-155-144 1:250, works only with rabbit α-GFAP
Hoechst 33342 Molecular Probes H3570 1:1000
DAPI Molecular Probes D1306 1:1000
Blocking
Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) Dianova 715-007-003 1:20
Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) Dianova 711-007-003 1:20
Normal donkey serum Merck Millipore S30
Normal rabbit serum Dianova 011-000-010
Normal goat serum Dianova 005-000-001
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Histology
Cresyl violet Sigma-Aldrich C5042
Neo-Clear Merck Millipore 109843 non-toxic xylene substitute
Neo-Mount Merck Millipore 109016 permanent mounting medium
Microscopy
Axioskop 2 Carl Zeiss Microscopy
LSM 710 Carl Zeiss Microscopy

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References

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586, (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54, (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22, (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11, (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21, (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435, (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2, (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182, (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40, (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11, (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384, (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53, (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41, (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59, (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8, (3), 228-235 (2000).

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