Immunohistokemi och Multiple Märkning med antikroppar från samma värdart att studera Adult hippocampus Neurogenesis

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. J. Vis. Exp. (98), e52551, doi:10.3791/52551 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Adult neurogenes är en starkt reglerad, flerstegsprocess där nya nervceller genereras från en aktiverad neural stamcell via alltmer engagerade mellangångar subtyper. Var och en av dessa subtyper uttrycker en uppsättning särskilda molekylära markörer som, tillsammans med specifika morfologiska kriterier, kan användas för att identifiera. Normalt är immunofluorescerande teknik tillämpas involverar subtyp-specifika antikroppar i kombination med exo- eller endogena spridningsmarkörer. Vi beskriver häri immunomärkning metoder för påvisande och kvantifiering av alla stadier av vuxen hippocampus neurogenes. Dessa består av tillämpningen av tymidinanaloger, transcardial perfusion, mjukpapper bearbetning, värme epitopretrieval, ABC immunohistokemi, multipel indirekt immunofluorescens, konfokalmikroskopi och cell kvantifiering. Dessutom presenterar vi en sekventiell multipel immunofluorescens protokoll som kringgår problemen usually härrör från behovet av att använda primära antikroppar som tas upp i samma värdarter. Det gör en korrekt identifiering av alla hippocampus gångar subtyper tillsammans med en spridning markör inom ett enda avsnitt. Dessa tekniker är ett kraftfullt verktyg för att studera regleringen av olika gångar subtyper parallellt, deras deltagande i hjärn patologier och deras roll i specifika hjärnfunktioner.

Introduction

Två hjärnregioner konstitutivt generera nya nervceller under hela livet, den subventrikulära zonen av de laterala ventriklarna och subgranular zonen (SGZ) i hippocampus gyrus dentatus (GD). De nyfödda nervceller härrör från neurala progenitorceller och gå igenom olika stadier av morfologiska och fysiologiska utveckling innan den når mognad 1,2. Från ett långsamt dela radiell glia liknande stamcell (typ 1) på varandra följande steg transit förstärka mellan progenitorceller uppstår. De mer odifferentierade subtyper (typ 2a och typ 2b) har en oregelbunden form med korta, tangentiella processer. De genererar neuroblaster (typ 3) som gradvis lämna cellcykeln blir omogna nervceller (med dendriter utsträckt mot den molekylära skikt) och slutligen integreras i hippocampus nätverk som mogna granulceller. På grund av deras särskilda fysiologiska egenskaper dessa celler ger kretsen med förbättrade plasticitet 3 suggesting en unik roll i hippocampus funktion. Egentligen studier av det senaste decenniet genererade betydande bevis för att vuxna neurogenes bidrar till rumsliga minne, mönster separation och emotionella beteenden 4,5.

Adult neurogenes kan studeras med hjälp av olika metoder. Tymidinanaloger införliva i DNA under S-fasen av cellcykeln och låta födelse dejting, kvantifiering och öde analys av nyfödda celler 6-8. Sekventiell tillämpning av olika tymidinanaloger (t.ex. CldU, EDU eller IDU) kan användas för att studera cellomsättning eller cellpopulationer födda vid olika tidpunkter under ett experiment 9. Ett alternativ, endogen markör för celltillväxt är Ki67. Den uttrycks i delande celler under alla faser av cellcykeln (G1, S, G2, M) förutom vilofasen (G0) och början av G1 10,11. För att analysera fenotypen av nyfödda cellpopulationer i den vuxna dentate gyrus flera stadiespecifika molekylära markörer kan användas, såsom GFAP, nestin, DCX och NeuN 1,6. GFAP är en markör av mogna astrocyter men uttrycks också i radiella glia-liknande celler i den vuxna framhjäman. Nestin är en mellanfilament specifikt för radiella glia-liknande celler och tidiga mellan progenitorceller. DCX är en mikrotubuli-associerat protein som uttrycks i mellan progenitorceller, neuroblaster och omogna nervceller. Baserat på den (med) uttryck av dessa tre markörer och de morfologiska egenskaperna hos de märkta cellerna fyra distinkta progenitorceller subtyper kan identifieras: typ 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), typ 2a (GFAP -, nestin + , DCX -), typ 2b (GFAP -, nestin +, DCX +) och typ 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-märkning av DCX tillsammans med NeuN, som uttrycks i postmitotiska nervceller tillåter differentiering av immature (DCX +, Neun +) och mogna (DCX -, Neun +) granulat nervceller.

De ovan nämnda markörer används ofta för immunfluorescerande samarbete märkning och efterföljande konfokalmikroskopi att analysera antal och identitet nyfödda celler. Detta kräver typiskt antikroppar från olika värdarter att förhindra oönskad antikropp korsreaktivitet. Dock är majoriteten av primära antikroppar lämpliga för neurogenes forskning upp antingen i kaniner eller möss (t.ex. mus α-BrdU, mus α-NeuN, kanin α-Ki67, kanin α-GFAP). Detta leder till allvarliga begränsningar i antalet och kombinationen av antigener som kan utvärderas i en enda skiva. Detta i sin tur ökar inte bara färgning ansträngning, som flera färgningar måste utföras, men kan också äventyra resultatens tillförlitlighet. Dessutom kan vissa antigener är mottagliga för formalinfixering-inducerad epitop maskering (t.ex. Ki67, Nestin). Vi beskriver häri modifieringar från de klassiska enkel- och multipel immunomärkning protokoll (t.ex. epitopretrieval, multipel sekventiell immunfärgning, användning av nestin-GFP transgena möss 12) som övervinna många av dessa frågor. I synnerhet tillåter processerna med flera immunofluorescens protokoll färgning mot upp till fyra olika antigener, även om en del av antikropparna härrör från samma värd. Detta möjliggör samtidig detektion av typ 1, typ 2a, typ 2b och typ 3 progenitorceller, såväl som deras proliferativa aktivitet inom en enda sektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla förfaranden som involverar levande djur utfördes i enlighet med EG-direktivet 86/609 / EEG riktlinjer för vård och användning av försöksdjur och godkänts av den lokala etiska kommittén (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).

1. intraperitoneal injektion av tymidinanaloger

  1. Väg djur dagen före injektion. Beräkna mängden tymidinanalogen krävs för alla injektioner planeras på nästa dag samt individuella viktjusterade injektionsvolymer på 10 mg / ml stamlösning.
  2. Bered 10 mg / ml tymidin stamlösning. (OBS! Tymidinanaloger är giftiga. Följ specifika materialsäkerhet (MSDS) som tillhandahålls av leverantörerna, dvs slitskyddsrock och handskar, använd en kemisk dragskåp).
    1. Ta tymidinanalogen från frysen och ta med den till RT, ca. 21 ° C. Väg 10 mg och läggsteril koksaltlösning (för BrdU och CldU) eller 0,04 N NaOH (i steril saltlösning, för IDU), virvel. Placera under minst 10-15 min i en 50 ° C vattenbad och skaka varje 2-3 min för att lösa upp pulvret.
      OBS: Använd lösningar för upp till 24 timmar vid förvaring vid rumstemperatur och under flera veckor vid -20 ° C. Skydda lösningar från ljus (täck med aluminiumfolie). Kontrollera alltid fällningar och åter upplösa om det behövs.
  3. Hindra musen i nackskinnet och intraperitonealt injicera ett lämpligt, viktanpassad volym stamlösning (vid RT) med en fin dos spruta med en 30 G nål.
    OBS: Vid CldU och IDU måste administreras sekventiellt inom samma djur, överväga att injicera ekvimolära koncentrationer (t.ex., 42,5 mg / kg CldU och 57,5 mg / kg IDU, vilket motsvarar 50 mg / kg BrdU). Därför justerar injektionsvolymer på de 10 mg / ml stamlösningar i enlighet därmed.

2. Vävnadsberedning

  1. Prepare 4% formaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert pH 7,4 på dag före perfusion. Förvaras vid 4 ° C.
  2. Transcardially BEGJUTA de djupt sövda möss (3,5% isofluran) via den vänstra ventrikeln med 10 ml iskall PBS, sedan med 40 ml iskall formaldehyd (flödeshastighet 5 ml / min). Dissekera hjärnan och post-fix i samma fixativ under 24 h vid 4 ° C.
  3. Överför hjärnorna konsekutivt i 10% (24 h vid 4 ° C) och 30% sackaros (tills hjärn sänkor, ca. 48 h). För frysning, sakta dränka de cryoprotected hjärnor till -25 ° C isopentan tills inga bubblor ur vävnaden. Förvara vid -80 ° C.
  4. Skär koronala sektioner av 40 um tjocklek på en frysning mikrotom (blocktemperaturen vid -25 till -16 ° C). Sekventiellt överföringssektioner i frostskyddsmedel lösning innehållande brunnar i en 24-brunnars cellodlingsplatta (se Figur 1). Förvara vid -20 ° C.

"Figur Figur 1. Schematisk illustration av överföring mikrotomen skivor i en 24-brunnar. Start vid A1 och placera efterföljande skivor i rad A, efter A6 gå till nästa rad B och så vidare. När når D6, gå tillbaka till A1 och fortsätta. Detta arrangemang av skivor möjliggör kvantifiering av varje n: te avsnitt av en hel hjärna. För kvantifiering av nyfödda celler ta varje 6: e hjärnsektion (motsvarande innehållet i en kolumn), för immunofluorescens fenotypning tar varje 12: e avsnittet (motsvarande innehållet i två alternerande rader av en kolumn).

3. Immunfärgning

OBS: Sektioner bearbetas fritt flytande, vanligen i 6-brunnsplattor utrustade med en bärplatta och mesh skär. Som ett undantag, blockering, inkubationer antikropps och ABC reaktion görs i 12- eller 24-hålsplattor utan maskinsatser (0,5-1 ml per wEll är tillräcklig, beroende på det antal skivor som måste färgas). Under dessa steg, överför sektioner med hjälp av en fin pensel (skölj med varje ny lösning). Alla inkubationer görs med kontinuerlig omrörning (max 150 rpm).

  1. Immunohistokemi (ABC-metod)
    1. Överför sektioner från frostskyddsmedel i TBS och skölj noga (en gång O / N vid 4 ° C, 5 gånger vid RT i 10 min vardera) för att helt ta bort frostskyddsmedel.
    2. Inkubera under 30 minuter i 1,5% H 2 O 2 i TBS-T för att släcka endogen peroxidasaktivitet. Var uppmärksam på bubblande och åter dränka sektioner vid behov. Skölj tre gånger i TBS under 15 min vardera.
    3. Valfritt: Under tiden förvärma ett värmeskåp och 2 N HCl till 37 ° C. Inkubera sektioner under 30 min vid 37 ° C i 2 N HCl för att denaturera DNA. Försiktigt separata sektioner med hjälp av en borste.
    4. Tillval: Neutralisera sektioner i 10 min i 0,1 M boratbuffert pH8,5, RT. Medan överföring, kort svabba maskinlägg innehåller avsnitten om en pappershandduk för att avlägsna HCl leavings. Skölj två gånger i TBS under 15 min vardera.
    5. Inkubera i TBSplus att permeabilize vävnaden och att blockera ospecifika antikroppsbindningsställen, 1 timme vid RT.
    6. Inkubera i primär antikropp utspädd i TBSplus, O / N vid 4 ° C. Skölj tre gånger i TBS under 15 min vardera.
    7. Inkubera i biotinylerad sekundär antikropp utspädd i TBSplus, 3 h vid RT. Skölj tre gånger i TBS under 15 min vardera. Under tiden ...
    8. Förbered ABC komplex enligt tillverkarens protokoll (1% A + 1% B i TBS-T). Låt stå i 30 min vid RT före användning. Inkubera sektioner i AB-reagens under 1 h vid RT. Skölj tre gånger i TBS under 15 min vardera.
    9. Bered 50 ml 0,5 mg / ml DAB i TBS-T per 6- eller 12-brunnars platta, delas upp i två halvor och pipett 4 ml eller 2 ml per brunn, respektive. Överför sektioner i DAB-lösning (VARNING! DAB är giftigt. Följ specific SDB från leverantören, det vill säga, bära skyddsrock och handskar, använd en kemisk dragskåp).
    10. Lägg 0,5 ml 1% H2O 2 till de återstående 25 ml DAB-lösning, blanda och pipett ekvivalenta volymer som ovan till varje brunn för att starta peroxidasreaktion. Inkubera under 12 min. Skölj tre gånger i TBS under 15 min vardera.
    11. Montera sektionerna till diabilder i gelatin, lufttorka O / N. Täckglas med permanent monteringsmedel.
    12. Tillval: motfärg innan du placerar täck (se avsnitt 3.5).
      OBS: Om signal-till-brusförhållandet är lågt på grund av hög bakgrund, upprepat H 2 O 2 behandling efter inkubationen med AB-reagens (steg 3.1.8).
  2. Fler immunofluorescens
    1. Singel eller samtidig multipel immunofluorescens
      1. Överför sektioner från frostskyddsmedel i TBS och skölj noga (en gång O / N vid 4 ° C, 5 gånger på RT för 10 minuter vardera) för att helt ta bort entifreeze.
      2. Tillval: som steg 3.1.3 - 3.1.4.
      3. Inkubera i TBSplus att permeabilize vävnaden och blockera ospecifika antikroppsbindningsställen, 1 timme vid RT.
      4. Inkubera i primär antikropp cocktail (t.ex. rått α-BrdU, marsvin α-DCX, get α-GFP) utspädda i TBSplus, O / N vid 4 ° C. Skölj tre gånger i TBS under 15 min vardera.
      5. Inkubera i cocktail av fluorokromkonjugerade sekundära antikroppar (t.ex. Rhodamine Red α-råtta, Alexa-647 α-marsvin, Alexa-488 α-get, allt härstammar i åsna) utspädd i TBSplus, 3 h vid RT eller O / N vid 4 ° C. Från och med nu skyddar sektioner från ljus. Skölj tre gånger i TBS under 15 min vardera.
      6. Montera sektionerna till diabilder i gelatin, lufttorka O / N. Täckglas med vattenhaltigt monteringsmedium.
    2. Processerna med flera immunofluorescens med primära antikroppar från samma värdarter
      1. Som steg 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. Inkubera i fiRST primär antikropp (t ex kanin α-antigen A), O / N vid 4 ° C. Skölj tre gånger i TBS och en gång i TBS-T under 10 min vardera.
      3. Inkubera i första fluorokromkonjugerade sekundär antikropp (t.ex. Rhodamine Red-konj. Åsna α-kanin), 3 h RT. Från och med nu skyddar sektioner från ljus. Skölj tre gånger i TBS och en gång i TBS-T under 10 min vardera.
      4. Inkubera i 10% normalt serum från samma värd som de primära antikropparna (t.ex. kaninserum) under 3 h RT för att mätta öppna paratoper på den första sekundära antikroppen. Skölj tre gånger i TBS och en gång i TBS-T under 10 min vardera.
      5. Inkubera i TBSplus med 50 mikrogram / ​​ml okonjugerat monovalenta Fab-fragment riktade mot värd av de primära antikropparna (t.ex. α-kanin-IgG (H + L)) för att täcka epitoper som kan godtas av den andra sekundär antikropp, O / N vid 4 ° C.
      6. Skölj minst 3 gånger i TBS och en gång i TBS-T under 10 min vardera. Medan överföring, kort swab maskinlägg innehåller avsnitten på en pappershandduk för att avlägsna eventuella Fab leavings.
      7. Inkubera i andra primära antikroppen (t.ex. kanin α-antigen B), O / N vid 4 ° C. Skölj tre gånger i TBS och en gång i TBS-T under 10 min vardera.
      8. Inkubera i andra fluorokromkonjugerade sekundär antikropp (t.ex. Alexa-488-konj. Åsna α-kanin), 3 h RT. Skölj 3 gånger i TBS i 15 minuter vardera, montera och täckglas som ovan.
        OBS: För att märka antigener med antikroppar från olika värdarter lägga dem till steg 3.2.2.2 och respektive sekundära antikroppar till steg 3.2.2.3.
    3. Ett av de sekundära antikroppar från samma art som en av de primära antikropparna
      OBS: Detta protokoll är lämpligt för fyrdubbel-färgning mot BrdU eller Ki67 tillsammans med GFAP, nestin-GFP och DCX.
      1. Följ strikt protokoll steg 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Tills denna punkt endast använda åsna serum i TBSplus.
      2. Inkubera i TBSplus innehållande 3% getserum under 1 h vid RT. Detta omfattar öppna paratoper på α-get sekundär antikropp. Skölj tre gånger i TBS och en gång i TBS-T under 10 min vardera.
      3. Inkubera i AMCA-konj. get α-kanin utspätt i TBSplus, 3 hr RT eller O / N 4 ° C. Skölj tre gånger i TBS i 15 minuter vardera, montera och täckglas som ovan.
    4. CldU, IDU sam-färgning
      1. Skölj, denaturera och neutralisera sektioner som beskrivs i avsnitt 3.2.1 (steg 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. Inkubera med 20 ug / ml okonjugerade Fab-fragment α-mus IgG (H + L) i TBSplus, 1 h vid RT. Skölj 4 gånger i TBS och en gång i TBS-T under 10 min vardera.
      3. Inkubera i primär antikroppscocktail innehållande rått α-BrdU (1: 400; renat IgG2) och mus-α-BrdU (1: 350) utspädd i TBSplus, O / N vid 4 ° C. Skölj tre gånger i TBS och en gång i TBS-T under 10 min vardera.
      4. Inkubera i sekundär antikropp cocktail innehållande biotinylerade åsna α-råtta (1: 500) och FITC-konj. åsna α-mus Fab-fragment (1: 100). Skölj tre gånger i TBS och en gång i TBS-T under 10 min vardera.
      5. Inkubera i Rodamin Röd-konj. Streptavidin, 2 h vid RT. Skölj 3 gånger i TBS i 15 minuter vardera, montera och täckglas som ovan.
    5. Amplifiering av fluorescenssignal i nestin-GFP-möss
      1. Lägg get α-GFP till den primära antikroppen cocktail.
      2. Lägg en fluorokrom konjugerad sekundär antikropp med spektrala egenskaper liknande GFP (såsom Alexa 488 konj. Donkey α-get) till den sekundära antikroppen cocktail.
  3. Epitopretrieval
    1. Utför epitopretrieval efter sköljning ut frostskyddsmedel. Värm ångare med 6- eller 12-brunnsplattor innehållande 0,1 M citrat-buffert pH 6,0 till 95-99 ° C (ca 25 min).
    2. Överför avsnitten i den heta citratbuffert och ånga i 30 minuter (täcka plattorna med aluminiumfolie som plast lids inte är värmebeständiga).
    3. Placera omedelbart plattorna i ett isbad för att kyla ner. Detta hjälper till att skydda vävnads morfologi, vilket är av särskild betydelse när man arbetar med hjärnsektioner från postnatala djur.
    4. Skölj tre gånger i TBS under 10 minuter vardera för att skölja ur och neutralisera citrat och fortsätta färgning.
  4. Musantikroppar på musvävnad
    1. Lägg 20 mikrogram / ​​ml monovalenta Fab-fragment α-mus IgG (H + L; samma värdarter än sekundär antikropp) till den första blockeringssteget (t.ex. steg 3.1.5 eller 3.2.1.3).
    2. Skölj 4 gånger i TBS och en gång i TBS-T under 10 minuter vardera, och fortsätt med respektive protokoll.
  5. Kresylviolett motfärgning
    1. Värm kresylviolett lösningen till 60 ° C (i glasburk). Inkubera glasen i den varma lösningen för 3 min.
    2. Skölj i aq. dest. och dehydratisera två gånger under 1 minut vardera i 70%, 96% och 100% isopropanol. Klart 5 - 6 min i xylen eller ett xylensubstitut och täckglas med en kompatibel permanent monteringsmedium.

4. Dataanalys

  1. Räkna peroxidas färgade nyfödda celler i varje 6: e avsnittet längs hela rostrocaudal omfattningen av gyrus gyrus. Använd ett ljusmikroskop vid 400 gångers förstoring.
  2. Multiplicera de resulterande cellantal med korsningen intervallet för att få en uppskattning av totala antalet nyfödda celler.
  3. Bild fluorescens märkta sektioner med ett konfokalt lasermikroskop utrustad med lämpliga lasrar och filtersystem. Ta bildstaplar vid slumpmässiga positioner längs hela omfattningen av gyrus dentatus 400 gångers förstoring och analysera minst 50 slumpvis utvalda celler av intresse per halvklotet för samarbete märkning med andra markörer.
  4. Multiplicera de resulterande procentsatserna för co-märkta celler (% / 100) med det totala antalet nyfödda celler för att beräkna absolutaantal specifika nyfödda cellpopulationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi tillämpade de metoder som beskrivs ovan för att kvantifiera och karakterisera nyfödda celler i postnatal och vuxna hippocampus. Därför använde vi vildtyp och neurogenes fattiga cyklin D2 knock out (Ccnd2 KO) möss inrymda under förhållanden som är kända för att påverka graden av neurogenes (dvs, berikad miljö, EE) 13,14. Immunohistokemisk DAB färgning mot antingen Ki67, BrdU, CldU eller IDU konsekvent avslöjade skillnader i nyfödda cellantal mellan vildtyp och Ccnd2 KO möss (Figur 3) 15. Dessutom med konsekutiva ekvimolära injektioner av CldU och IDU vi kunde diskriminera cellpopulationer födda under vissa perioder av EE (figur 3C, D). Att anta avsnitt 3.2.4 kan vi framgångsrikt upptäcka lika signalintensiteter och utmärkt överlappning av CldU och IDU efter deras samtidiga leverans (Figur 4). BrdU märkta nyfödda celler kunde phenotyped med en standard immunofluorescens metod antingen samtidigt tillämpa BrdU och NeuN, (Figur 5) eller BrdU, GFAP, nestin-GFP och DCX antikroppar (Figur 6B). Denna teknik tillät framgångsrik identifiering typ 1, 2a, 2b och 3 progenitorceller inom ett enda exemplar (Figur 6B, D). Co-märkning av Ki67 med gångar markörer krävs sekventiell tillämpning av antikroppar som primära antikroppar mot Ki67 och GFAP har uppkommit i kanin (gäller avsnitt 3.2.2), dessutom en av de primära antikroppar (get α-GFP) producerades i samma värd som en av de sekundära antikropparna (AMCA konj. get α-kanin). En kombination av avsnitten 3.2.2 och 3.2.3 perfekt fungerat om sektionerna inkuberades först i Ki67 tillsammans med nestin-GFP-antikropp, och för det andra i GFAP antikropp men inte tvärtom (figur 6C). Figur 2B sammanfattar de godkända applikationsprogram.


Figur 2. Sekventiell multipel immunofluorescens med primära antikroppar som härrör från samma värdart. (A) Schematisk illustration. (B) Framgångsrika kombinationer av antikroppar och deras kronologiska ordning i immunofluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Ljusmikroskopi bilder av ABC-immunohistokemi för kvantifiering av nyfödda celler i gyrus dentatus. Avbildade är jämförelser av olika spridningsmarkörer i WT och neurogenes-brist Ccnd2 KO möss vid 100X och 400X förstoring. (A) g> Ki67-DAB-färgning visar kluster av prolifererande celler i subgranular zonen av gyrus dentatus (postnatal dag 35). Antalet prolifererande celler minskar i Ccnd2 KO möss jämfört med WT möss. (B) Nyfödda celler vid 28 dagar efter BrdU-administrering (injektion schema över bilder) bekräftar den reducerade spridningstakten i Ccnd2 KO möss. (C) CldU-administration under 6. veckan i EE (injektionsschemat ovan bild) avslöjade en ökning i antalet nyfödda celler i gyrus dentatus i WT men inte Ccnd2 KO-möss. (D) IDU-administrering under den 8: e veckan av EE visade liknande resultat. Skala stapel representerar 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

fig4.jpg "/>
Figur 4. Immunofluorescens co-färgning av CldU och IDU efter samtidig leverans av ekvimolära koncentrationer. Signalförstärkning av CldU märkta celler resulterade i en utmärkt överlappning av CldU och IDU. Skala stapel representerar 20 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Immunfluorescens co-märkning av NeuN och BrdU. (A) BrdU administrerades 6 gånger varje 8 tim för 2 dagar i följd med början på postnatal dag 14. Djuren avlivades 28 dagar senare. (B) Immunofluorescens co-märkning av prolifererande celler med mogna neuronal markör NeuN visar ett minskat antal prolifererande celler i Ccnd2 KO jämfört med WT djur. Skala stapel representerar 50 | im. (C) Förstorad bild av (B) som visar sam-märkta celler i båda genotyper. Skala stapel representerar 20 pm. (D) Hög förstoring exempel på en BrdU / NeuN co-märkta cell i gyrus dentatus. Skala stapel representerar 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Quadruple immunofluorescens co-märkning av olika spridnings markörer med GFAP, nestin-GFP och DCX för fenotypning nyfödda granulceller i gyrus dentatus av nestin-GFP möss. (A) BrdU administrerades 3 gånger varje 2 tim vid postnatal dag 70 . Djuren avlivades 2 timmar senare. (B) representant bild av en co-färgning för BrdU, GFAP,nestin-GFP och DCX. (C) representant bild av fyrdubbla immunofluorescens för Ki67, GFAP, nestin-GFP och DCX. (D) Klassificering av typer stamceller enligt deras immunofluorescens märkning. Baserat på samtidigt uttryck av olika markörer och de morfologiska egenskaperna hos de märkta cellerna fyra distinkta progenitorceller subtyper kan identifieras: typ 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), typ 2a (GFAP -, nestin +, DCX - ), typ 2b (GFAP -, nestin +, DCX +) och typ 3 (GFAP -, nestin -, DCX +). Skala stapel representerar 20 pm. (E) Schematisk översikt över de olika stadierna av vuxna hippocampus neurogenes. Den illustrerar de celltyper 4 progenitorceller, omogna nervceller och mogna granulceller, deras karakteristiska uttryck av markörer och deras proliferativa kapacitet. ML - molekylär cellager, GCL -granulat cellager, SGL -. subgranular cellagret Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7. Exempel på framgångsrika och icke-framgångsrika sekventiella färgningar med två primära antikroppar som tas upp i samma art, beroende på sekvensen av antikropps inkubation. De konfokala mikrofotografier visar resultatet av en sekventiell co-färgning mot Ki67 och GFAP med primära antikroppar både härledd från kanin. I (A) immunohistokemi först fylldes för GFAP, följt av färgning mot Ki67 vilket ledde till en uttalad överlappning av de två signalerna. I synnerhet Ki67 signalen var atypisk och liknade signalen från GFAP-färgning. (B) visar resultaten från den omvändafärgning sekvens med Ki67 färgning avslutade första och efterföljande färgning mot GFAP. Här, signalerna för både antigener liknade det förväntade uttrycksmönster: The Ki67 signalen begränsades till kärnor inom subgranular zonen medan GFAP signal hittades cytoplasmatically, främst i de cellulära processer som följer av subgranular zonen. Skala stapel representerar 20 mikrometer. RHX - Rodamin X. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8. Specificitet av α-BrdU-antikroppar används för att detektera CldU och IDU. Möss injicerades med antingen CldU eller med IDU (icke-samtidig applicering). I (A) hjärnsektioner av CldU (A1) eller IDU (A2) injicerade möss var IMMUnostained använder det renade rått α-BrdU-antikropp som bör specifikt korsreagerar till CldU, men inte till IDU. (B) visar resultaten från färgning hjärnor från CldU (B1) eller IDU (B2) injicerades möss med mus α-BrdU antikropp som förväntas korsreagera med IDU, men inte CldU. Skala stapel representerar 20 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvantifiering och identifiering av subpopulationer av nyfödda celler är en central fråga i vuxen neurogenes forskning. Kombinera spridning markörer och antikroppar mot proteiner som uttrycks under vissa stadier av vuxenneurogenes medger immunhistokemisk detektion av dessa subpopulationer. Några av antikroppar eller kombinationer antikropps kräver särskilda färgningsförhållanden.

Märkning av delande celler med syntetiska tymidinanaloger är fortfarande den gyllene standarden för att studera vuxna hippocampus neurogenes. Det är viktigt att överväga lämplig injektionsprotokoll före start av experimentet. Vi administrerar vanligen 50 mg / kg (kroppsvikt, ip) BrdU, men halterna kan variera beroende på experimentella krav (upp till 300 mg / kg för en bolusinjektion) 8,16. Om IDU och CldU har att injiceras sekventiellt för tids diskriminering av cellpopulationer är det obligatoriskt att injicera ekvimolära koncentrationer ( 16. En annan nackdel är att DNA-denaturering erfordras för immunhistokemisk detektion av tymidinanaloger som skulle kunna störa antigeniciteten av antikroppar eller andra tekniker DNA-märknings (t.ex., DAPI, Hoechst 33258). Immunhistokemisk detektion av endogena spridningsmarkörer som Ki67 kan vara ett lämpligt alternativ 10,11. Men detta endast tillåter en ögonblicksbild av proliferativ aktivitet vid tidpunkten för perfusion, retrospektiv födelse dejting och öde analys är omöjliga.

För immunfärgning, är sektionerna allmänhet bearbetas fritt flytande, vanligen i 6-hålsplattor utrustade med en bärplatta och Mesh-inläggningar som förenklar deras överföring från en lösning till en annan. Som ett undantag, blockering, inkubationer antikropps och ABC reaktion är klari 12- eller 24-brunnars plattor utan mesh skär att hushålla dyra lösningar (0,5-1 ml per brunn är tillräcklig, beroende på det antal skivor som måste färgas). Under dessa steg, överför sektioner med hjälp av en fin pensel som behöver sköljas vid byte lösningar. Förhindra sektioner från uttorkning och utföra inkubationer som tar> 1 tim i en humified kammare. Alla inkubationer måste göras med kontinuerlig omrörning (max 150 rpm). Testa alltid och titrera varje ny antikropps parti. Längre antikropps inkubationstider (upp till 2 dagar vid 4 ° C) kan förbättra färgning. Om bara musantikroppar finns mot antigener som du vill visualisera i mus vävnad är det lämpligt att blockera endogena immunoglobuliner med högkoncentrerad monovalenta Fab-fragment α-mus (avsnitt 3.4). När du använder denna teknik förlänga följande sköljningssteg. Annars kanske obundna Fab-fragment binder till din primära mus antikropp. HCI förbehandling och boratneutralisering krävs endast för detektion av tymidinanaloger. Den 12 min peroxidasreaktion resultera i ett optimalt signal-brusförhållande med de villkor och antikroppar som tillämpas i våra protokoll. Som med alla enzymatiska reaktionen, graden av peroxidaset reaktionen beror på många faktorer (t.ex. temperatur, pH, koncentration av enzym och substrat). Följaktligen reaktionstider måste optimeras för varje nytt antikroppsuppsättning. Att visualisera anatomiska strukturer i DAB fläckar med mycket svag bakgrund (t.ex. CldU), kan skivor vara motfärgas. Den kresylviolett metod som beskrivs i avsnitt 3.5 resulterar i en mycket svag motfärg som inte äventyrar specifika DAB-signalen.

För flera immunofluorescens, använder primära antikroppar som tas upp i olika arter eller av olika isotyper och följ avsnitt 3.2.1. Annars utför en sekventiell multipel immunomärkning som har optimerats för att upptäcka om flera primära antikropparfrån samma värd arter (dvs., mus eller kanin, avsnitt 3.2.2). Den grundläggande principen för denna metod har uppfunnits av Ferguson och kollegor som framgångsrikt färgas olika muskelmarkörer med två mus primära antikroppar 17. De Fab-fragment som används för blockering i steg 3.2.2.5 bör härledas från samma värdarten som de sekundära antikropparna. Halterna och inkubationstider som beskrivs i avsnitt 3.2.2 är optimerade för de specifika antikroppar som beskrivs här och måste justeras för eventuella nya kombinations antikropp. Var medveten om att den sekvens av primär antikropp inkubation starkt kan påverka resultatet (såsom anges i figur 7A). Förekommande fall, åtföljas antigenerna detekteras av de primära antikroppar som härrör från samma art visar en annan uttrycksmönster som förenklar detektering av otillräcklig blockering. För att eliminera alla möjligheter till antikropp korsreaktion eller falskt positiva är essential att inkludera lämpliga kontroller (dvs endast gymnasiala-antikroppskontroll, komplett immunohistokemi för första antigen följt av en inkubation med andra primära antikroppen eller andra sekundär antikropp ensam). 18 Figur 2B visar kombinationer antikropps som fungerade bra i våra händer. För flera immunofluorescens är det också lämpligt att använda sekundära antikroppar som tas upp i samma art (t.ex. åsna) och har minimal korsreaktivitet till din vävnad och till serumproteiner från andra arter (dvs pre-adsorberat). Annars avsnitt 3.2.3 kan bidra till att förhindra eventuella oväntade mellan arterna korsreaktivitet. Välj fluorokromer med minimal spektral överlappning lämplig till din detektionssystem (t.ex. AMCA, Alexa Fluor 488, Rhodamine röd, Alexa Fluor 647). Om en nukleär motfärg krävs, lägga DAPI eller Hoechst 33342 (10 | ig / ml) till den sekundära antikroppen cocktail (då, ingen nära UV sekundär antikropp kan vara ossed). Dessa kärn counterstains inte fungera om vävnad har förbehandlats med HCl. På samma sätt kan HCI behandling äventyra upptäckten av vissa antigener och därmed dess påverkan på enskilda antikroppsprestanda måste testas. När fluorokromkonjugerade sekundära antikroppar har tillämpats Protect sektioner från ljus.

CldU och IDU kan visualiseras med hjälp av två olika BrdU antikroppar som korsreagerar med antingen CldU (rått α-BrdU) eller IDU (mus α-BrdU) 9,19. Om båda tymidinanaloger har injicerats i ett djur är det absolut nödvändigt att använda det renade rått α-BrdU antikropp för att detektera CldU eftersom den icke-renad antikropp korsreagerar till IDU. Som beskrivs av Vega et al. 9 CldU signalen måste förstärkas för immunfluorescerande samarbete märkning för att uppnå likvärdig upptäckt av båda tymidinanaloger. Därför, i stället för en fluorokrom-konjugerad sekundär antikropp (α-råtta) en fluorokrom konjugerad streptavidin tillsätts efter inkubation i en biotinylerad sekundär antikropp (α-råtta, avsnitt 3.2.4). För att utesluta eventuella oönskade antikroppar korsreaktioner inkluderar kontrollsektioner från möss som fick antingen IDU eller CldU (separat, se figur 8). För att verifiera likvärdig upptäckt av IDU och CldU sektionerna användning från djur som samtidigt injicerats med ekvimolära mängder CldU och IDU (se figur 4).

Att studera typ 1 och typ 2 progenitorceller föredrar vi att använda nestin-GFP transgena möss 12 som nestin antikroppar ofta inte gav tillfredsställande resultat. Nestin-GFP möss har fördelen att ett tillförlitligt visualisera nestin-positiva progenitorceller och deras morfologiska egenskaper vid ett särskilt utvecklingsstadium. GFP-signalen måste amplifieras genom indirekt immunofluorescens med ett α-GFP-antikropp. Den sekundära antikroppen bör vara kopplad till en fluorochrome med spektrala egenskaper liknande GFP. Vid behov kan nestin-GFP möss korsades med andra muterade mus linjer för att undersöka medverkan av vissa gener i neurogenes. Vid det här laget, är förbättrade nestin antikroppar levereras som etikettcellkroppar samt processer och kan användas som ett alternativ till den transgena tillvägagångssätt (se materiallista).

Det är kritiskt för att följa den 24 hr fixering för att förhindra overfixation. De kemiska ämnen som reagerar med formaldehyd i vävnad är primärt proteiner och formaldehyd alstrar reaktiva hydroximetylgrupper på sina sidokedjor som leder till tvärbindning av intilliggande aminosyror (genom bildning av metylenbryggor). Detta kan orsaka maskering av antigen-epitoper och förlust av immunoreaktivitet (se kommentarerna till specifika antikroppar i Materials List). Att återvinna förlorade immunreaktivitet, flera epitopretrieval metoder finns att break formaldehyd-inducerad protein tvärbindningar via eXposure att värma 20. I detta protokoll fungerar citratbufferten metoden överlägsen andra för detektion av neurogenes i postnatal och vuxna hippocampus (avsnitt 3.3). Observera att skivor av mycket unga djur (<P21) kan bli väldigt sköra eller förvrängd och måste hanteras med särskild omsorg. Vidare kan epitopretrieval vara skadligt för vissa epitoper och därmed individuella antikroppar bör testas om de är lämpliga för flerfaldig färgning som kräver denna förbehandling.

Sammanfattningsvis är detta protokoll en samling av grundläggande och utarbetade metoder som underlättar analysen av vuxna hippocampus neurogenes. Det gör speciellt en entydig identifiering av alla hippocampus gångar subpopulationer tillsammans med en spridning eller födelse-dating markör från ett enda avsnitt. Dessa tekniker kan anpassas till vilken som helst kombination av antikroppar eller till andra arter för att studera utvecklingen och regleringen av hippocampal progenitorceller som svar på specifika stimuli och deras medverkan i synnerhet hjärnfunktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thymidine analog administration
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU Sigma-Aldrich C6891 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU MP Biomedicals 2105478 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU MP Biomedicals 2100357 toxic (mutagenic, teratogenic)
Tissue preparation
Isoflurane-Actavis Piramal Healthcare 700211
Paraformaldehyde powder (PFA) Riedel-De Häen 16005 toxic, flammable
Perfusion pump PD5206 Heidolph Instruments 523-52060-00
Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm Thermo Fischer Scientific 06409-13
Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm Agnthos 1036
Freezing microtome Microm HM 400 Thermo Fischer Scientific
24-well Cell culture multiwell plates Greiner Bio-One 662160
Immunohistochemistry
Tefal vitacuisine steamer Tefal VS 4001
Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3479 pre-loaded in 6-well culture plates
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3477 pre-loaded in 12-well culture plates
Netwell plastic 6-well carrier kit Corning 3521 for 24 mm polyester mesh membrane inserts
Netwell plastic 12-well carrier kit Corning 3520 for 15 mm polyester mesh membrane inserts
Vectastain Elite ABC kit Vector Laboratories PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) Sigma-Aldrich D-5637 carcinogenic, light sensitive
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Primary antibodies
Rabbit IgG1 α-Ki67 Novocastra/ Leica Biosystems NCL-L-Ki67MM1 DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval
Rabbit α-GFAP, AS-3-GF Synaptic Systems 173 002 1:500
Goat IgG (H+L) α-GFP Acris Antibodies R1091P 1:300
Mouse IgG1 α-nestin Abcam ab6142 1:200; requires epitope retrieval
Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin Merck Millipore AB2253 1:500
Rat IgG2a α-BrdU (ascites) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030CX for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Rat IgG2a α-BrdU (purified) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030   for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Mouse IgG1 α-NeuN Merck Millipore MAB377 1:500
mouse IgG1κ α-BrdU BD Biosciences 347580 For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Secondary antibodies
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin Dianova 711-065-152 1:500
Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin Dianova 712-065-150 1:500
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin Dianova 715-065-151 1:500
Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 1:250
Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11055 1:250
Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment Dianova 715-097-003 1:100
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 715-605-151 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 706-605-148 1:250
Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 712-295-150 1:250
Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 711-295-152 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 706-296-148 1:250
Streptavidin-rhodamine Red-X Dianova 016-290-084 1:500
Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA Dianova 111-155-144 1:250, works only with rabbit α-GFAP
Hoechst 33342 Molecular Probes H3570 1:1000
DAPI Molecular Probes D1306 1:1000
Blocking
Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) Dianova 715-007-003 1:20
Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) Dianova 711-007-003 1:20
Normal donkey serum Merck Millipore S30
Normal rabbit serum Dianova 011-000-010
Normal goat serum Dianova 005-000-001
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Histology
Cresyl violet Sigma-Aldrich C5042
Neo-Clear Merck Millipore 109843 non-toxic xylene substitute
Neo-Mount Merck Millipore 109016 permanent mounting medium
Microscopy
Axioskop 2 Carl Zeiss Microscopy
LSM 710 Carl Zeiss Microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586, (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54, (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22, (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11, (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21, (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435, (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2, (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182, (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40, (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11, (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384, (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53, (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41, (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59, (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8, (3), 228-235 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics