La inmunohistoquímica y Etiquetado múltiple con anticuerpos de la misma especie anfitrión para adultos estudio del hipocampo neurogénesis

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Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. J. Vis. Exp. (98), e52551, doi:10.3791/52551 (2015).

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Abstract

Neurogénesis adulta es un proceso multi-etapa altamente regulado en el que las nuevas neuronas se generan a partir de una célula madre neural activado a través de cada vez más comprometida subtipos progenitoras intermedias. Cada uno de estos subtipos expresa un conjunto de marcadores moleculares específicos que, junto con los criterios morfológicos específicos, pueden ser utilizados para su identificación. Por lo general, las técnicas de inmunofluorescencia se aplican implica anticuerpos específicos de subtipo en combinación con marcadores de proliferación exo o endógenos. Nosotros describimos en la presente memoria métodos para la detección y cuantificación de todas las etapas de neurogénesis en el hipocampo adulto immunolabeling. Estos comprenden la aplicación de los análogos de timidina, perfusión transcardial, procesamiento de tejido, de recuperación de epítopo inducida por calor, ABC de inmunohistoquímica, inmunofluorescencia indirecta múltiple, microscopía confocal y cuantificación de células. Además se presenta un protocolo de inmunofluorescencia secuencial múltiple que evita problemas usually que surge de la necesidad de la utilización de anticuerpos primarios planteados en la misma especie hospedadora. Se permite una identificación precisa de todos los subtipos progenitoras del hipocampo, junto con un marcador de proliferación dentro de una sola sección. Estas técnicas son una poderosa herramienta para estudiar la regulación de los diferentes subtipos progenitoras en paralelo, su implicación en patologías cerebrales y su papel en las funciones específicas del cerebro.

Introduction

Dos regiones del cerebro generar nuevas neuronas constitutivamente largo de la vida, la zona subventricular de los ventrículos laterales y la zona subgranular (SGZ) del giro dentado del hipocampo (DG). Las neuronas recién nacidas se derivan de las células progenitoras neurales y pasan por diferentes etapas de desarrollo morfológico y fisiológico antes de alcanzar la madurez 1,2. Desde un dividiendo lentamente-glía radial como células madre (tipo 1) etapas consecutivas de tránsito amplificar surgen células progenitoras intermedias. Los subtipos más indiferenciados (tipo 2a y 2b tipo) tienen una forma irregular con cortos, procesos tangenciales. Generan neuroblastos (tipo 3) que salen gradualmente del ciclo celular para convertirse en neuronas inmaduras (con dendritas extienden hacia la capa molecular) y finalmente integrar en la red del hipocampo células granulares como maduros. Debido a sus características fisiológicas estas células proporcionan los circuitos con una mejora de la plasticidad 3 sugeting un papel único en la función del hipocampo. En realidad, los estudios de la última década generado evidencia sustancial de que la neurogénesis adulta contribuye a la memoria espacial, la separación patrón de comportamiento emocional y 4,5.

Neurogénesis adulta se puede estudiar utilizando diferentes enfoques. Análogos de timidina incorporan en el ADN durante la fase S del ciclo celular y permiten nacimiento de citas, la cuantificación y el destino análisis de las células recién nacidos 6-8. La aplicación secuencial de los diferentes análogos de timidina (por ejemplo, CldU, EdU o IDU) puede ser usado para estudiar la renovación celular o poblaciones de células nacidos en diferentes puntos de tiempo durante el curso de un experimento 9. Una alternativa, marcador endógeno para la proliferación celular es Ki67. Se expresa en las células en división durante todas las fases del ciclo celular (G1, S, G2, M) excepto la fase de reposo (G0) y el comienzo de G1 10,11. Para analizar el fenotipo de las poblaciones de células recién nacidas en el adulto dentate gyrus varios marcadores moleculares específicos de la etapa se pueden utilizar como GFAP, nestina, DCX y NeuN 1,6. GFAP es un marcador de astrocitos maduros pero también se expresa en células gliales-como radiales en el cerebro anterior adulto. Nestin es un filamento intermedio específico para células gliales como radiales y células progenitoras intermedios tempranos. DCX es una proteína asociada a microtúbulos expresado en progenitores intermedios, los neuroblastos y las neuronas inmaduras. Sobre la base de la (co) expresión de estos tres marcadores y las características morfológicas de las células marcadas cuatro subtipos de células progenitoras se pueden identificar diferentes: tipo 1 (GFAP +, nestina +, DCX -), tipo 2a (GFAP -, nestina + , DCX -), el tipo 2b (GFAP -, nestina +, DCX +) y tipo 3 (GFAP -, nestina -, DCX +) 1. Co-etiquetado de DCX junto con NeuN, que se expresa en las neuronas postmitóticas, permite la diferenciación de immature (DCX +, NeuN +) y maduros (DCX -, NeuN +) neuronas granulares.

Los marcadores mencionados anteriormente se utilizan con frecuencia para inmunofluorescencia co-etiquetado y microscopía confocal posterior para analizar el número y la identidad de las células recién nacidos. Esto requiere típicamente anticuerpos de diferentes especies huésped para evitar anticuerpo no deseado reactividad cruzada. Sin embargo, la mayoría de los anticuerpos primarios adecuados para la investigación neurogénesis resucitan ya sea en conejos o ratones (por ejemplo, ratón α-BrdU, ratón α-NeuN, conejo α-Ki67, conejo α-GFAP). Esto conduce a graves limitaciones en el número y la combinación de antígenos que se pudieron evaluar en una sola porción. Esto a su vez no sólo aumenta el esfuerzo de tinción, como múltiples coloraciones tienen que ser realizadas, pero también podría comprometer la fiabilidad de los resultados. Además, algunos antígenos son susceptibles a la formalina enmascaramiento epítopo inducida por la fijación (por ejemplo, Ki67, Nestina). Esta revisión se describen las modificaciones de los protocolos immunolabeling múltiple y simple clásicos (por ejemplo, la recuperación de epítopo, inmunotinción secuencial múltiple, uso de nestin-GFP ratones transgénicos 12) que superar muchas de estas cuestiones. En particular, el protocolo de inmunofluorescencia secuencial múltiple permite tinción contra un máximo de cuatro antígenos diferentes, incluso si una parte de los anticuerpos se deriva de la misma máquina. Esto permite la detección simultánea de tipo 1, tipo 2a, tipo 2b y tipo de células progenitoras 3, así como su actividad proliferativa dentro de una sola sección.

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Protocol

NOTA: Todos los procedimientos con animales vivos se llevaron a cabo de acuerdo con la directiva de la CE 86/609 / CEE directrices sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio y aprobado por el comité de ética local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).

1. inyección intraperitoneal de la timidina análogos

  1. Pesar los animales el día antes de la inyección. Calcular la cantidad de análogo de timidina requerido para todas las inyecciones previstas en el día siguiente, así como los volúmenes de inyección en función del peso individuales de una solución madre de 10 mg / ml.
  2. Preparar 10 mg / ml solución timidina valores. (NOTA: Los análogos de timidina son tóxicos. Siga las hojas de seguridad específicas (MSDS) proporcionadas por los proveedores, es decir, usar bata de laboratorio y guantes, use una campana química).
    1. Tome análogo de la timidina del congelador y llevarlo a RT, aprox. 21 ° C. Pesar 10 mg y añadirsolución salina estéril (para BrdU y CldU) o 0,04 N NaOH (en solución salina estéril; para IDU), vórtice. Durante, por lo menos 10 - 15 minutos en un baño de agua a 50 ° C y agitar cada 2 - 3 minutos para disolver el polvo.
      NOTA: Utilice las soluciones para un máximo de 24 horas cuando se almacena a temperatura ambiente y durante varias semanas a -20 ° C. Proteja las soluciones de la luz (cubierta con papel de aluminio). Siempre verifique precipitados y volver a disolver si es necesario.
  3. Restringir el ratón por la piel y por vía intraperitoneal inyectar un volumen apropiado, ajustada al peso de la solución madre (a temperatura ambiente) con una jeringa de dosificación fina con una aguja de 30 G.
    NOTA: En caso de CldU e IDU tienen que ser administrados secuencialmente en el mismo animal, consideran para inyectar concentraciones equimolares (por ejemplo, 42,5 mg / kg CldU y 57,5 mg / kg IdU, que corresponden a 50 mg / kg de BrdU). Por lo tanto, ajustar los volúmenes de inyección de las soluciones de 10 mg / ml de solución madre en consecuencia.

2. Preparación del tejido

  1. Prepare formaldehído al 4% en 0,1 M tampón fosfato pH 7,4 en el día antes de la perfusión. Almacenar a 4 ° C.
  2. Transcardially perfundir los ratones profundamente anestesiados (3,5% de isoflurano) a través del ventrículo izquierdo con PBS 10 ml de hielo-frío, luego con 40 ml de formaldehído enfriada con hielo (tasa de flujo de 5 ml / min). Diseccionar el cerebro y post-fix en el mismo fijador durante 24 horas a 4 ° C.
  3. Transferir los cerebros consecutivamente en 10% (24 horas a 4 ° C) y 30% de sacarosa (hasta que los sumideros cerebrales, aprox. 48 h). Para la congelación, sumergir lentamente los cerebros crioprotegidas en -25 ° C hasta que no queden burbujas de isopentano emergen del tejido. Almacenar a -80 ° C.
  4. Los cortes de secciones coronales de 40 m de espesor en un micrótomo de congelación (temperatura del bloque a -25 hasta -16 ° C). Secciones de transferencia secuencialmente en solución anticongelante que contiene los pocillos de una placa de cultivo celular de 24 pocillos (véase la Figura 1). Almacenar a -20 ° C.

"Figura Figura 1. Esquema de transferencia de rebanadas de microtomo en una placa de 24 pocillos. Comienza en A1 y ​​colocar rodajas posteriores en la fila A, después A6 ir a la siguiente fila B y así sucesivamente. Al llegar a D6, volver a A1 y continuar. Esta disposición de las rebanadas permite para la cuantificación de cada n-ésima sección de todo un cerebro. Para la cuantificación de células recién nacidas tomar cada 6 th sección cerebro (equivalente al contenido de una columna), por el fenotipo de inmunofluorescencia tomar cada sección 12ª (equivalente al contenido de 2 filas alternas de una columna).

3. La inmunotinción

NOTA: Las secciones se procesan de flotación libre, generalmente en placas de 6 pocillos equipadas con placa de apoyo e inserciones de malla. Como excepción, el bloqueo, las incubaciones de anticuerpos y la reacción ABC se hacen en 12 ó 24 pocillos sin inserciones de malla (de 0,5 a 1 ml por well es suficiente, en función del número de rebanadas que tienen que ser manchado). Durante estos pasos, transferir secciones con la ayuda de un pincel fino (enjuagar con cada nueva solución). Todas las incubaciones se realizan con agitación continua (max 150 rpm).

  1. La inmunohistoquímica (método ABC)
    1. Traslado secciones de anticongelante en TBS y enjuagar bien (una vez O / N a 4 ° C, 5 veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno) para eliminar por completo el anticongelante.
    2. Incubar durante 30 min en 1,5% de H 2 O 2 en TBS-T para apagar la actividad de la peroxidasa endógena. Preste atención a la formación de burbujas y volver a sumergirse secciones si fuera necesario. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
    3. Opcional: Mientras tanto precalentar un armario de calefacción y de 2 N HCl a 37 ° C. Incubar las secciones durante 30 min a 37 ° C en 2 N HCl para desnaturalizar el ADN. Gently secciones separadas con la ayuda de un pincel.
    4. Opcional: Neutralizar secciones durante 10 minutos en 0,1 M de borato de pH del tampón8,5, RT. Durante la transferencia, limpie brevemente las inserciones de malla que contienen las secciones sobre una toalla de papel para eliminar las sobras HCl. Enjuague 2 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
    5. Incubar en TBSplus para permeabilizar el tejido y para bloquear los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos, 1 hr a RT.
    6. Incubar en anticuerpo primario diluido en TBSplus, O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
    7. Incubar en anticuerpo secundario biotinilado diluido en TBSplus, 3 horas a temperatura ambiente. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno. Mientras tanto ...
    8. Preparar complejo ABC según el protocolo del fabricante (1% A + B al 1% en TBS-T). Dejar reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de su uso. Incubar las secciones de reactivo AB durante 1 hora a RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
    9. Preparar 50 ml 0.5 mg / ml DAB en TBS-T por 6 ó 12 pocillos placa, dividido en dos mitades y pipetas 4 ml o 2 ml por pocillo, respectivamente. Secciones de transferencia en solución DAB (PRECAUCIÓN! DAB es tóxico. Siga el específic MSDS proporcionados por el proveedor, es decir, usar bata de laboratorio y guantes, use una campana química).
    10. Añadir 0,5 ml 1% H 2 O 2 a la solución DAB 25 ml restantes, mezclar y volúmenes de pipeta equivalentes como anteriormente a cada pocillo para iniciar la reacción de la peroxidasa. Incubar durante 12 min. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
    11. Mount secciones a las diapositivas de la gelatina, secar al aire O / N. Cubreobjetos con medio de montaje permanente.
    12. Opcional: Contratinción antes de colocar el cubreobjetos (ver sección 3.5).
      NOTA: Si la relación señal-ruido es bajo debido a la alta fondo, repita H 2 O 2 de tratamiento después de la incubación con AB reactivo (paso 3.1.8).
  2. Multiple-inmunofluorescencia
    1. Individual o simultánea inmunofluorescencia múltiple
      1. Traslado secciones de anticongelante en TBS y enjuagar bien (una vez O / N a 4 ° C, 5 veces a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno) para eliminar completamente unanticongelante.
      2. Opcional: que en los pasos 3.1.3 - 3.1.4.
      3. Incubar en TBSplus para permeabilizar el tejido y bloquear los sitios de unión de anticuerpos inespecíficos, 1 hr a RT.
      4. Incubar en cóctel primaria de anticuerpos (por ejemplo, α-BrdU rata, cobaya α-DCX, cabra α-GFP) diluidas en TBSplus, O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
      5. Incubar en cóctel de anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo (por ejemplo, Rodamina Red α-rata, Alexa-647 α-cobaya, Alexa-488 α-cabra, todo derivado en burro) diluido en TBSplus, 3 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. De ahora en proteger las secciones de la luz. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 minutos cada uno.
      6. Mount secciones a las diapositivas de la gelatina, secar al aire O / N. Cubreobjetos con medio de montaje acuoso.
    2. Inmunofluorescencia múltiple secuencial con anticuerpos primarios de misma especie hospedadora
      1. Como pasos 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. Incubar en fiprimer anticuerpo primario (por ejemplo, conejo α-antígeno A), O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      3. Incubar en primer anticuerpo conjugado a un fluorocromo secundaria (por ejemplo, Rodamina Red-conj. Burro α-conejo), 3 horas RT. De ahora en proteger las secciones de la luz. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      4. Incubar en 10% de suero normal de mismo host que los anticuerpos primarios (por ejemplo, suero de conejo) para RT 3 horas para saturar paratopos abiertas en el primer anticuerpo secundario. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      5. Incubar en TBSplus con 50 g / ml fragmentos Fab monovalentes no conjugado dirigido contra el anfitrión de los anticuerpos primarios (por ejemplo, α-conejo IgG (H + L)) para cubrir epítopos que podrían ser reconocidos por el segundo anticuerpo secundario, O / N en 4 ° C.
      6. Enjuague al menos 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 min cada uno. Durante la transferencia, la SWA brevementeb las inserciones de malla que contienen las secciones sobre una toalla de papel para eliminar las sobras Fab.
      7. Incubar en segundo anticuerpo primario (por ejemplo, conejo α-antígeno B), O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      8. Incubar en segundo anticuerpo conjugado a un fluorocromo secundaria (por ejemplo, Alexa-488-conj. Burro α-conejo), 3 hr RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 min cada uno, montar y el cubreobjetos como anteriormente.
        NOTA: Para etiquetar antígenos con anticuerpos de diferentes especies huésped que añadir al paso 3.2.2.2 y los respectivos anticuerpos secundarios al paso 3.2.2.3.
    3. Uno de los anticuerpos secundarios a partir de una misma especie como uno de los anticuerpos primarios
      NOTA: Este protocolo es adecuado para cuádruple tinción contra BrdU o Ki67 junto con GFAP, nestin-GFP y DCX.
      1. Siga estrictamente el protocolo pasos 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Hasta este punto, utilizar sólo suero burro en TBSplus.
      2. Incubar en TBSplus que contiene 3% de suero de cabra durante 1 hora a RT. Esto cubre paratopos abiertas en el anticuerpo secundario-α de cabra. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      3. Incubar en AMCA-conj. cabra α-conejo diluido en TBSplus, RT 3 hr o O / N 4 ° C. Enjuague tres veces en TBS durante 15 min cada uno, montar y el cubreobjetos como anteriormente.
    4. CldU, IdU co-tinción
      1. Enjuague, desnaturaliza y neutralizar secciones como se describe en la sección 3.2.1 (pasos 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. Incubar con 20 g / ml fragmentos Fab no conjugados α-ratón IgG (H + L) en TBSplus, 1 hr a RT. Enjuague 4 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      3. Incubar en cóctel de anticuerpos primario que contiene α-BrdU de rata (1: 400; purificado IgG2) y α-BrdU de ratón (1: 350) diluido en TBSplus, O / N a 4 ° C. Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      4. Incubar en cóctel de anticuerpo secundario que contiene burro biotinilados α-rata (1: 500) y FITC-conj. burro α-ratón fragmentos Fab (1: 100). Enjuagar 3 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno.
      5. Incubar en Rodamina Red-conj. Estreptavidina, 2 horas a RT. Enjuagar 3 veces en TBS durante 15 min cada uno, montar y el cubreobjetos como anteriormente.
    5. La amplificación de señal de fluorescencia en ratones nestin-GFP
      1. Añadir cabra α-GFP al cóctel de anticuerpo primario.
      2. Añadir un anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo con propiedades espectrales similares a GFP (como Alexa 488 conj. Burro α-cabra) al cóctel de anticuerpo secundario.
  3. Recuperación del epítopo
    1. Llevar a cabo la recuperación de epítopo después de aclarar el anticongelante. Precalentar el vapor con 6 ó 12 pocillos que contenían tampón 0,1 M de citrato de pH de 6,0 a 95 a 99 ° C (aproximadamente 25 min).
    2. Transferir las secciones en el tampón de citrato caliente y vapor durante 30 minutos (cubrir las placas con papel de aluminio como el plástico lIDs no se calientan-resistente).
    3. Inmediatamente colocar las placas en un baño de hielo para refrescarse. Esto ayuda a proteger la morfología del tejido, lo cual es de particular importancia cuando se trabaja con secciones de cerebro de animales postnatales.
    4. Enjuagar 3 veces en TBS durante 10 minutos cada uno para enjuagar y neutralizar el citrato y continuar tinción.
  4. Ratón anticuerpos en tejido de ratón
    1. Añadir 20 g / ml fragmentos Fab monovalentes α-ratón IgG (H + L; mismo host-especies que anticuerpo secundario) para la primera etapa de bloqueo (por ejemplo, paso 3.1.5 o 3.2.1.3).
    2. Enjuague 4 veces en TBS y una vez en TBS-T durante 10 minutos cada uno, y proceda con el protocolo respectivo.
  5. Cresil violeta counterstaining
    1. Solución de Precalienta cresil violeta a 60 ° C (en frasco de vidrio). Incubar los portaobjetos en la solución caliente durante 3 minutos.
    2. Enjuague en ac. dest. y deshidratar 2 veces durante 1 min cada uno en 70%, 96% y 100% de isopropanol. Borrar para 5 - 6 min en xileno o un sustituto de xileno y el cubreobjetos con un medio de montaje permanente compatible.

Análisis 4. Datos

  1. Contar las células recién nacidos peroxidasa teñidas en cada sección a lo largo de toda la extensión rostrocaudal del giro dentado. Utilice un microscopio de luz con un aumento de 400X.
  2. Multiplicar el número de células resultantes con el intervalo de intersección para obtener una estimación del número total de células recién nacidos.
  3. Imagen de la fluorescencia etiquetada secciones con un microscopio láser confocal equipado con láseres y sistemas de filtros adecuados. Tome pilas de imágenes en posiciones aleatorias a lo largo de toda la extensión de la circunvolución dentada con una ampliación de 400X y analizar al menos 50 celdas seleccionadas al azar de interés por hemisferio para co-etiquetado con otros marcadores.
  4. Multiplique los porcentajes resultantes de las células co-etiquetado (% / 100) con el número total de células recién nacidas para calcular absolutanúmero de poblaciones específicas de células recién nacidas.

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Representative Results

Se aplicaron los métodos descritos anteriormente para cuantificar y caracterizar las células recién nacidas en el hipocampo postnatal y adulto. Por lo tanto, hemos utilizado de tipo salvaje y la neurogénesis deficiente ciclina D2 knock out (KO) CCND2 ratones alojados en condiciones conocidas por afectar la tasa de neurogénesis (es decir, el medio ambiente enriquecido, EE) 13,14. Tinción inmunohistoquímica DAB contra cualquiera de Ki67, BrdU, CldU o IdU reveló consistentemente diferencias en el número de células recién nacidas entre tipo salvaje y ratones CCND2 KO (Figura 3) 15. Por otra parte, con inyecciones equimolares consecutivos de CldU y IdU pudimos discriminar poblaciones celulares nacidos durante períodos específicos de EE (Figura 3 C, D). Sección 3.2.4 Adoptar podríamos detectar con éxito la intensidad de señal iguales y excelente superposición de CldU y IdU después de su entrega simultánea (Figura 4). BrdU marcado células recién nacidos pueden ser fenotipados con un Stanmétodo de inmunofluorescencia Dard por cualquiera de aplicar simultáneamente BrdU y NeuN, (Figura 5) o BrdU, GFAP, nestin-GFP y anticuerpos DCX (Figura 6B). Esta técnica permitió tipo identificación exitosa 1, 2a, 2b y 3 células progenitoras dentro de una sola muestra (Figura 6B, D). Co-etiquetado de Ki67 con marcadores progenitoras requiere la aplicación secuencial de anticuerpos como anticuerpos primarios contra Ki67 y GFAP se suscitaron en el conejo (se aplica a la sección 3.2.2), por otra parte uno de los anticuerpos primarios (cabra α-GFP) fue producido en el mismo host que uno de los anticuerpos secundarios (AMCA conj. de cabra α-conejo). Una combinación de las secciones 3.2.2 y 3.2.3 perfectamente funcionaba si las secciones se incubaron primero en Ki67 junto con anticuerpo nestin-GFP, y en segundo lugar en el anticuerpo GFAP pero no viceversa (Figura 6C). Figura 2B se resumen los esquemas de aplicación aprobados.


Figura 2. secuencial múltiple de inmunofluorescencia con anticuerpos primarios derivados de la misma especie hospedadora. (A) Esquema ilustración. (B) combinaciones exitosas de anticuerpos y su orden cronológico en la inmunofluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Imágenes de microscopía de luz de ABC-inmunohistoquímica para la cuantificación de las células recién nacidos en el giro dentado. Se representan las comparaciones de diferentes marcadores de proliferación en WT y ratones CCND2 KO-neurogénesis deficiente en un aumento de 100X y 400X. (A) g> tinción Ki67-DAB muestra racimos de células proliferantes en la zona subgranular del giro dentado (día postnatal 35). El número de células proliferantes se ve disminuida en ratones CCND2 KO en comparación con los ratones WT. (B) células recién nacidos a los 28 días después de BrdU-administración (esquema de inyección por encima de imágenes), que confirma la tasa de proliferación reducida en los ratones KO. CCND2 (C) CldU administración durante la sexta semana de EE (esquema de inyección la imagen) reveló un aumento en el número de células recién nacidas en el giro dentado del WT, pero no ratones CCND2 KO. (D) IdU administración durante la octava semana de EE mostró resultados similares. La barra de escala representa 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

fig4.jpg "/>
Figura 4. Inmunofluorescencia co-tinción de CldU e IDU después de la entrega simultánea de concentraciones equimolares. Amplificación de la señal de las células marcadas CldU resultó en una excelente superposición de CldU e IDU. La barra de escala representa 20 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Inmunofluorescencia co-etiquetado de NeuN y BrdU. (A) BrdU se administró 6 veces cada 8 h durante 2 días consecutivos comenzando en el día postnatal 14. Los animales se sacrificaron 28 días más tarde. (B) Inmunofluorescencia co-etiquetado de la proliferación de células con el marcador neuronal NeuN madura muestra un número reducido de proliferación células en CCND2 KO en comparación con WAnimales t. La barra de escala representa 50 micras. (C) Vista ampliada de (B) muestra células co-marcado en los dos genotipos. La barra de escala representa 20 micras. (D) ejemplo de alta magnificación de un compañero de la etiqueta / NeuN células BrdU en el giro dentado. La barra de escala representa 10 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. inmunofluorescencia Cuádruple co-etiquetado de los diferentes marcadores de proliferación con GFAP, nestin-GFP y DCX para el fenotipo de las células granulares recién nacidos en la circunvolución dentada de los ratones nestin-GFP. (A) BrdU se administró 3 veces cada 2 horas a día postnatal 70 . Los animales se sacrificaron 2 h más tarde. (B) imagen representativa de un co-tinción para BrdU, GFAP,nestin-GFP y DCX. (C) Imagen Representante de inmunofluorescencia cuádruple para Ki67, GFAP, nestin-GFP y DCX. (D) Clasificación de los tipos de células progenitoras de acuerdo con su etiquetado inmunofluorescencia. Sobre la base de la co-expresión de diferentes marcadores y las características morfológicas de las células marcadas cuatro subtipos de células progenitoras se pueden identificar diferentes: tipo 1 (GFAP +, nestina +, DCX -), tipo 2 bis (GFAP -, nestina +, DCX - ), el tipo 2b (GFAP -, nestina +, DCX +) y tipo 3 (GFAP -, nestina -, DCX +). La barra de escala representa 20 micras. (E) Esquema general de las diferentes etapas de la neurogénesis del hipocampo adulto. Ilustra los tipos 4 progenitoras de células, las neuronas inmaduras y células granulares maduras, su expresión característica de los marcadores y su capacidad proliferativa. ML - capa celular molecular, GCL -capa de células granulares, SGL -. capa de células subgranular Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. Ejemplo de tinciones secuenciales exitosos y no exitosos con dos anticuerpos primarios planteadas en la misma especie, dependiendo de la secuencia de anticuerpos de incubación. Las micrografías confocales muestran el resultado de un co-tinción secuencial contra Ki67 y GFAP con anticuerpos primarios tanto derivado de conejo. En (A) inmunohistoquímica se completó primero para GFAP seguido de tinción Ki67 contra lo que condujo a un solapamiento pronunciada de las dos señales. En particular, la señal de Ki67 era atípico y se parecía a la señal de la tinción GFAP. (B) muestra los resultados de la inversasecuencia de tinción con la tinción de Ki67 completó primera y la posterior tinción contra GFAP. Aquí, las señales para ambos antígenos se parecían el patrón de expresión esperado: La señal de Ki67 se restringió a los núcleos dentro de la zona subgranular mientras la señal de GFAP se encontró cytoplasmatically, principalmente en los procesos celulares derivadas de la zona subgranular. La barra de escala representa 20 micras. RHX - Rodamina X. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8
Figura 8. La especificidad de los anticuerpos α-BrdU utilizados para detectar y CldU. IdU ratones fueron inyectados ya sea con CldU o con IdU (aplicación no simultánea). En los ratones (A) secciones cerebrales de CldU (A1) o IdU (A2) inyectados eran immunostained utilizando el anticuerpo de rata purificada α-BrdU que debería específicamente reacciona de forma cruzada a CldU, pero no a IDU. (B) muestra los resultados de la tinción de los cerebros de CldU (B1) o IdU (B2) ratones inyectados con el ratón α-BrdU anticuerpo que se espera que reaccionan de forma cruzada con IdU, pero no CldU. La barra de escala representa 20 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La cuantificación e identificación de las subpoblaciones de células recién nacidas es un tema central en la investigación neurogénesis adulta. Combinando marcadores de proliferación y anticuerpos contra las proteínas expresadas durante etapas específicas de la neurogénesis adulta permite la detección inmunohistoquímica de estas subpoblaciones. Algunos de los anticuerpos o combinaciones de anticuerpos requieren condiciones de tinción específicas.

Etiquetado de células que se dividen con análogos de la timidina sintéticos sigue siendo el estándar de oro para el estudio de la neurogénesis del hipocampo adulto. Es crucial tener en cuenta el protocolo de inyección apropiado antes de iniciar el experimento. Por lo general, administrar 50 mg / kg (peso corporal, ip) BrdU, pero las concentraciones pueden variar en función de las necesidades experimentales (hasta 300 mg / kg para una inyección en bolo) 8,16. Si IdU y CldU tienen que ser inyectado de forma secuencial para la discriminación temporal de las poblaciones de células es obligatorio para inyectar concentraciones equimolares ( 16. Otra desventaja es que se requiere la desnaturalización del ADN para la detección inmunohistoquímica de los análogos de timidina que puedan interferir con la antigenicidad de anticuerpos u otras técnicas de marcaje de ADN (por ejemplo, DAPI, Hoechst 33258). La detección inmunohistoquímica de marcadores de proliferación Ki67 endógenos como puede ser una alternativa adecuada 10,11. Sin embargo, esto sólo permite una instantánea de la actividad proliferativa en el momento de la perfusión, retrospectivo de citas nacimiento y análisis de destino son imposibles.

Por inmunoticción, secciones generalmente se procesan de flotación libre, generalmente en placas de 6 pocillos equipada con placa de apoyo e inserciones que simplifica su traslado de una solución a otra malla. Como excepción, el bloqueo, se realizan incubaciones de anticuerpos y la reacción ABCen 12 o 24 pocillos sin insertos de malla para economizar soluciones costosas (de 0,5 a 1 ml por pocillo es suficiente, en función del número de rebanadas que tienen que ser manchado). Durante estos pasos, transferir secciones con la ayuda de un pincel fino que necesita ser enjuagado al cambiar soluciones. Evitar secciones de la desecación y realizar incubaciones que tienen> 1 hora en una cámara de humidificado. Todas las incubaciones se tienen que hacer con agitación continua (máximo 150 rpm). Siempre pruebe y se valora cada nuevo lote de anticuerpos. Tiempos de incubación de anticuerpos más largos (hasta 2 días a 4 ° C) pueden mejorar la coloración. En caso de que sólo los anticuerpos de ratón están disponibles contra los antígenos que desea visualizar en tejidos de ratón, es aconsejable bloquear inmunoglobulinas endógenas con monovalentes altamente concentrado fragmentos Fab α-ratón (sección 3.4). Cada vez que se utiliza esta técnica extender las siguientes etapas de aclarado. De lo contrario, los fragmentos Fab no consolidados podría obligar a su anticuerpo primario de ratón. HCl pretratamiento y boratola neutralización se requiere sólo para la detección de análogos de timidina. La reacción de la peroxidasa 12 min resulta en una relación óptima de señal a ruido con las condiciones y anticuerpos aplicados en nuestro protocolo. Como con cualquier reacción enzimática, la tasa de la reacción de la peroxidasa depende de muchos factores (por ejemplo, temperatura, pH, concentración de enzima y sustrato). En consecuencia, los tiempos de reacción deben ser optimizado para cualquier nuevo conjunto de anticuerpos. Para visualizar las estructuras anatómicas en manchas DAB con fondo muy débil (por ejemplo, CldU), rebanadas pueden ser contrastados. El método de violeta de cresilo describe en la sección 3.5 los resultados en una counterstain muy débil que no comprometa la señal DAB específica.

Para múltiples inmunofluorescencia, utilice anticuerpos primarios que se plantean en diferentes especies o de diferentes isotipos y siga la sección 3.2.1. De lo contrario, realizar una immunolabeling secuencial múltiple que ha sido optimizado para detectar múltiples anticuerpos primariosde la misma especie huésped (es decir, el ratón o conejo, sección 3.2.2). El principio básico de este método ha sido inventado por Ferguson y colegas que tiñe con éxito diferentes marcadores musculares con dos ratón anticuerpos primarios 17. Los fragmentos Fab utilizados para el bloqueo en el paso 3.2.2.5 deben derivarse de la misma especie hospedadora como los anticuerpos secundarios. Las concentraciones y tiempos de incubación se describen en el apartado 3.2.2 se han optimizado para los anticuerpos específicos descritos en el presente documento y se deben ajustar, para cualquier nueva combinación de anticuerpos. Tenga en cuenta que la secuencia de incubación del anticuerpo primario puede influir fuertemente en el resultado (como se indica en la figura 7A). Siempre que sea aplicable, los antígenos detectados por los anticuerpos primarios que se derivan de la misma especie deben mostrar un patrón de expresión diferente, lo que simplifica la detección de bloqueo insuficiente. Para eliminar cualquier posibilidad de anticuerpos reacción cruzada o falsos positivos es essencial para incluir controles apropiados (es decir, controles de sólo-anticuerpo secundario; inmunohistoquímica completa para primer antígeno seguido de una incubación con el segundo anticuerpo primario o segundo anticuerpo secundario solo). 18 La Figura 2B muestra combinaciones de anticuerpos que funcionaron bien en nuestras manos. Para múltiples inmunofluorescencia también es recomendable utilizar anticuerpos secundarios que se plantean en la misma especie (por ejemplo, en burro) y tienen una reactividad cruzada mínima a su tejido y al suero de proteínas de otras especies (es decir, pre-adsorbidos). De lo contrario la sección 3.2.3 puede ayudar a prevenir cualquier interespecies inesperados reactividad cruzada. Seleccione fluorocromos con un mínimo solapamiento espectral correspondiente a su sistema de detección (por ejemplo, AMCA, Alexa Fluor 488, Rodamina Red, Alexa Fluor 647). Si se requiere una contratinción nuclear, añadir DAPI o Hoechst 33342 (10 mg / ml) al cóctel de anticuerpo secundario (entonces, no cerca de UV-anticuerpo secundario puede ser nosotrosed). Estos contratinciones nucleares no funcionan si el tejido ha sido tratado previamente con HCl. Del mismo modo, el tratamiento HCl puede comprometer la detección de algunos antígenos y, por tanto, su influencia en el rendimiento individual de anticuerpos debe ser probado. Una vez que los anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo se han aplicado secciones protegerlo de la luz.

CldU e IDU se pueden visualizar con la ayuda de dos anticuerpos diferentes BrdU que reaccionan de forma cruzada, ya sea con CldU (rata α-BrdU) o IdU (ratón α-BrdU) 9,19. Si ambos análogos de timidina han sido inyectadas en un animal que es absolutamente esencial para usar el anticuerpo de rata α-BrdU purificada para detectar CldU debido a que el anticuerpo no reacciona de forma cruzada purificado a IDU. Según lo descrito por Vega et al. 9 la señal CldU necesita ser amplificada por inmunofluorescencia co-etiquetado para lograr la detección equivalente de dos análogos de la timidina. Por lo tanto, en lugar de un anticuerpo secundario conjugado a un fluorocromo (α-rata) una estreptavidina conjugada con fluorocromo se añade después de la incubación en un anticuerpo secundario biotinilado (α-rata; la sección 3.2.4). Para excluir cualquier anticuerpo no deseado reacciones cruzadas incluyen secciones de control de ratones que recibieron ya sea IdU o CldU (por separado; véase la Figura 8). Para verificar la detección equivalente de la UDI y CldU secciones uso de animales que fueron inyectados simultáneamente con cantidades equimolares de CldU y IdU (ver Figura 4).

Para el estudio de tipo 1 y tipo 2 células progenitoras preferimos utilizar nestin-GFP ratones transgénicos 12 como anticuerpos nestin frecuencia no proporcionaron resultados satisfactorios. Ratones Nestin GFP tienen la ventaja de visualizar de forma fiable las células progenitoras nestina positiva y sus características morfológicas en una etapa particular del desarrollo. La señal GFP necesita ser amplificada a través de inmunofluorescencia indirecta con un anticuerpo α-GFP. El anticuerpo secundario debe ser acoplado a un fluorochrome con propiedades espectrales similares a las buenas prácticas agrarias. Si es necesario, los ratones-nestina GFP pueden cruzaron con otras líneas de ratones mutantes para investigar la participación de determinados genes en la neurogénesis. Por ahora, la mejora de anticuerpos nestina que se suministran los cuerpos celulares de la etiqueta así como los procesos y pueden ser utilizados como una alternativa al enfoque transgénico (véase la lista de materiales).

Es fundamental para cumplir con la fijación de 24 horas para evitar overfixation. Los participantes en la reacción química de formaldehído en el tejido son principalmente proteínas y formaldehído genera grupos hidroximetilo reactivos en sus cadenas laterales que conducen a la reticulación de aminoácidos adyacentes (por la formación de puentes de metileno). Esto puede hacer que el enmascaramiento de antígeno-epítopos y pérdida de inmunorreactividad (ver comentarios a anticuerpos específicos en la Lista de Materiales). Para recuperar inmunorreactividad perdido, existen varios métodos de recuperación de epítopo que la proteína ruptura inducida por formaldehído-enlaces cruzados a través del correoXposure para calentar 20. En este protocolo, el método de tampón citrato trabaja superiores a los demás para la detección de la neurogénesis en el hipocampo postnatal y adulto (sección 3.3). Tenga en cuenta que las rebanadas de animales muy jóvenes (<P21) pueden llegar a ser muy frágiles o distorsionada y deben ser manejados con cuidado especial. Además, recuperación del epítopo puede ser perjudicial para algunos epítopos y por lo tanto anticuerpos individuales que se deben probar si son adecuados para la tinción múltiple que requiere este pre-tratamiento.

En resumen, este protocolo es un conjunto de técnicas básicas y elaborados que facilitan el análisis de la neurogénesis del hipocampo adulto. En particular, permite una identificación inequívoca de todas las subpoblaciones progenitoras hipocampo junto con una proliferación o marcador nacimiento data de una sola sección. Estas técnicas se pueden adaptar a cualquier combinación de anticuerpos o para otras especies para estudiar el desarrollo y la regulación de hippocamcélulas progenitoras pal en respuesta a estímulos específicos y su participación en las funciones cerebrales particulares.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thymidine analog administration
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU Sigma-Aldrich C6891 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU MP Biomedicals 2105478 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU MP Biomedicals 2100357 toxic (mutagenic, teratogenic)
Tissue preparation
Isoflurane-Actavis Piramal Healthcare 700211
Paraformaldehyde powder (PFA) Riedel-De Häen 16005 toxic, flammable
Perfusion pump PD5206 Heidolph Instruments 523-52060-00
Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm Thermo Fischer Scientific 06409-13
Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm Agnthos 1036
Freezing microtome Microm HM 400 Thermo Fischer Scientific
24-well Cell culture multiwell plates Greiner Bio-One 662160
Immunohistochemistry
Tefal vitacuisine steamer Tefal VS 4001
Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3479 pre-loaded in 6-well culture plates
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3477 pre-loaded in 12-well culture plates
Netwell plastic 6-well carrier kit Corning 3521 for 24 mm polyester mesh membrane inserts
Netwell plastic 12-well carrier kit Corning 3520 for 15 mm polyester mesh membrane inserts
Vectastain Elite ABC kit Vector Laboratories PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) Sigma-Aldrich D-5637 carcinogenic, light sensitive
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Primary antibodies
Rabbit IgG1 α-Ki67 Novocastra/ Leica Biosystems NCL-L-Ki67MM1 DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval
Rabbit α-GFAP, AS-3-GF Synaptic Systems 173 002 1:500
Goat IgG (H+L) α-GFP Acris Antibodies R1091P 1:300
Mouse IgG1 α-nestin Abcam ab6142 1:200; requires epitope retrieval
Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin Merck Millipore AB2253 1:500
Rat IgG2a α-BrdU (ascites) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030CX for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Rat IgG2a α-BrdU (purified) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030   for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Mouse IgG1 α-NeuN Merck Millipore MAB377 1:500
mouse IgG1κ α-BrdU BD Biosciences 347580 For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Secondary antibodies
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin Dianova 711-065-152 1:500
Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin Dianova 712-065-150 1:500
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin Dianova 715-065-151 1:500
Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 1:250
Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11055 1:250
Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment Dianova 715-097-003 1:100
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 715-605-151 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 706-605-148 1:250
Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 712-295-150 1:250
Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 711-295-152 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 706-296-148 1:250
Streptavidin-rhodamine Red-X Dianova 016-290-084 1:500
Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA Dianova 111-155-144 1:250, works only with rabbit α-GFAP
Hoechst 33342 Molecular Probes H3570 1:1000
DAPI Molecular Probes D1306 1:1000
Blocking
Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) Dianova 715-007-003 1:20
Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) Dianova 711-007-003 1:20
Normal donkey serum Merck Millipore S30
Normal rabbit serum Dianova 011-000-010
Normal goat serum Dianova 005-000-001
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Histology
Cresyl violet Sigma-Aldrich C5042
Neo-Clear Merck Millipore 109843 non-toxic xylene substitute
Neo-Mount Merck Millipore 109016 permanent mounting medium
Microscopy
Axioskop 2 Carl Zeiss Microscopy
LSM 710 Carl Zeiss Microscopy

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References

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