El busulfán como agente mielosupresor para Generación estable de alto nivel de Médula Ósea quimerismo en ratones

Medicine

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Peake, K., Manning, J., Lewis, C. A., Barr, C., Rossi, F., Krieger, C. Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice. J. Vis. Exp. (98), e52553, doi:10.3791/52553 (2015).

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Abstract

Protocol

NOTA: Ética Declaración: Este protocolo ha sido revisado y aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Simon Fraser (UACC; permitir números 1037K-12 y 1060K-03) y está en conformidad con el Consejo Canadiense de los Animales, la Guía del NIH para la la Directiva CEE Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y.

1. Consideraciones especiales

NOTA: El busulfán es citotóxica. Manipule y deseche de acuerdo a la hoja de datos de seguridad de materiales y directrices institucionales.

  1. Realice todas las técnicas asépticamente en una campana de flujo laminar.
  2. Esterilizar los instrumentos antes de su uso envolviendo en un material de envasado apropiado, tal como un paquete de la cáscara, y tratamiento en autoclave.
  3. Mientras que el riesgo de infección es menor con busulfán acondicionado en comparación con la irradiación, manejar animales sólo en una campana de flujo laminar para las primeras 2 semanas después del trasplante.

2. Acondicionamiento deLos ratones receptores

  1. Diluir busulfán a 3 mg / ml con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS).
    NOTA: Es importante hacer una dilución fresca de busulfán justo antes de su uso cada día de la inyección.
  2. Administrar 20 mg / kg de busulfan diluida a ratones receptores mediante inyección IP diaria.
  3. Repetir las inyecciones IP diarias de 20 mg / kg busulfán hasta una dosis total de 60-100 mg / kg ha sido entregado (es decir, para un / kg dosis total de 80 mg, administrar 20 mg / kg de busulfan durante 4 días consecutivos).

3. Aislamiento de células de médula ósea de donantes

NOTA: Este protocolo ha sido utilizado con éxito para aislar y preparar células BM de hasta 5 ratones donantes. Típicamente, el rendimiento de células por ratón es de aproximadamente 30-40 million BMDCs, lo cual es suficiente para trasplantar 12-16 ratones receptores. Si se necesitan más ratones donantes puede ser necesario ajustar en consecuencia el protocolo.

  1. Tras el último día de busulfán acondicionado euthanize un ratón donante GFP (uno a seis meses de edad) con CO 2 (o por otro procedimiento de eutanasia aceptado en la institución). Para evitar complicaciones injerto utilizan donantes singénicos que son del mismo sexo que los destinatarios.
  2. Pulverizar ratón con etanol al 70%. La piel de elevación con las tijeras quirúrgicas abdomen y utilizando hacer una incisión a través de la piel de la cavidad abdominal arriba de la pierna hacia el tobillo. Sosteniendo el pie, tire firmemente la piel desde el tobillo hacia la cadera exponiendo el tejido de la pierna.
  3. Recorte el tejido muscular y grasa del fémur para exponer la articulación de la cadera.
  4. Mientras tira suavemente con el pie para extender la pierna, pulse la tijera contra la articulación de la cadera. Cortar justo por encima de la cabeza del fémur con cuidado de no cortar el propio fémur.
  5. Para ayudar a mantener la esterilidad, mantenga la pierna con el pie y limpiar cualquier resto de tejido de los huesos por el roce de la superficie del hueso con tejidos tratados en autoclave.
  6. Separar el fémur y la tibia mediante el corte a través de la articulación de la rodilla ycolocar el fémur en una placa de cultivo que contiene PBS estéril. Incubar en hielo.
  7. Retire y deseche el peroné por el corte en los puntos donde el peroné se conecta a la tibia. Coloque la tibia en la placa de cultivo con el fémur y se incuba en hielo.
  8. Repita los pasos 3.2 a 3.7 de la otra pierna, y si es necesario, ratones donantes adicionales. Después de la eliminación de los huesos, esterilizar los instrumentos quirúrgicos con un esterilizador de cuentas caliente o utilizar un nuevo conjunto de herramientas estériles para las etapas ulteriores.
  9. Para los fémures, mantenga el fémur con pinzas y con unas tijeras quirúrgicas cuidadosamente 'afeitado' los extremos distales de los huesos. Retire tan poco del hueso como sea necesario para exponer la cavidad BM.
  10. Llene una jeringa con 3 ml de PBS estéril y adjuntar una aguja de calibre 23. Taladro con cuidado la aguja en la cavidad BM y lave el BM en una placa de cultivo estéril. Asegúrese de raspar la cavidad medular con la punta de la aguja para asegurar la eliminación de todas las células deseadas. Después de la extracción,asegúrese de que el BM rojo ya no es visible y el hueso aparece ahora blanco.
  11. Repita los pasos 3.9 a 3.10 para fémures posteriores, puesta en común de todo el BM en la misma placa de cultivo.
  12. Para las tibias, mantenga la tibia con unas pinzas y con cuidado 'afeitado' el final, donde la tibia se adjuntó a la rodilla para exponer la cavidad BM. Haga un segundo corte a lo largo del hueso donde termina el BM roja visible.
  13. Llene una jeringa con 3 ml de PBS estéril y adjuntar una aguja de calibre 25. Suavemente inserte la aguja en la cavidad BM (desde el extremo que se adjuntó a la rodilla) y enjuagar el BM en la placa de cultivo que contiene el BM de los fémures. Raspe las paredes de la cavidad BM con la aguja para eliminar todas las células. Después de la extracción, asegúrese de que el BM rojo ya no es visible y el hueso aparece ahora blanco.
  14. Repita los pasos 3.12 a 3.13 para la posterior tibias, puesta en común de todo el BM en la misma placa de cultivo.
  15. Tritura suavemente el BM con una punta de pipeta de 1 ml para disociar el cells.
  16. Pasar la suspensión celular a través de un filtro de cesta 40 mM en un tubo de centrífuga de 50 ml estéril. Enjuague el plato con PBS para obtener las células restantes y transferir este a través del filtro en el tubo de centrífuga.
  17. Centrifugar durante 5 min a 450 xg a 4 ° C. Retirar y desechar el sobrenadante.
  18. Vuelva a suspender el sedimento en 3 ml de tampón de lisis de los eritrocitos. Incubar en hielo durante 8,5 min.
  19. Añadir ~ 30 ml de PBS estéril para saciar el buffer de lisis.
  20. Centrifugar durante 5 min a 450 xg a 4 ° C. Retirar y desechar el sobrenadante.
  21. Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de PBS estéril. Mantener en hielo.
  22. Tomar una pequeña alícuota del homogeneizado celular y se diluye con PBS (1: 100 para ratón 1; 1: 200 para 2 ratones, etc.) para cuantificar el número de células usando un hemocitómetro.
  23. Diluir la suspensión de células a 8 x 10 6 células / ml y se incuba en hielo hasta la inyección.

4. Trasplante de Médula Ósea

  1. Fill una jeringa de 0,5 ml (con una aguja de insulina 28 G) con 300 l de suspensión celular diluida para cada ratón a inyectar. Asegúrese de eliminar las burbujas de aire presentes en la jeringa.
  2. Coloque la jaula del ratón contiene los ratones receptores acondicionado en una almohadilla eléctrica y permitir que las venas de la cola se dilaten.
  3. Tome un ratón receptor y colocar en el dispositivo de retención. Limpiar la cola con una gasa quirúrgica empapada con etanol al 70%.
  4. Sostenga firmemente la cola y con el bisel hacia arriba, inserte suavemente la aguja en una de las venas de la cola laterales e inyectar la suspensión celular.
  5. Mantenga gasa quirúrgica en el sitio de la inyección hasta que el sangrado se detiene antes de introducir el ratón en una nueva jaula limpia.

5. Estimación de la Extensión de la BM quimerismo

NOTA: Los niveles de quimerismo suelen ser variable en la sangre periférica en 1 semana post-trasplante de médula ósea, y como tal, los niveles de quimerismo normalmente se estiman al menos 2 semanas post-TMO. Los niveles de chimerism debe alcanzar> 80% GFP + células en la sangre periférica dentro de 3-4 semanas después del trasplante de médula ósea.

  1. Preparar tampón FACS (mM EDTA suero bovino fetal al 2 + 2% en PBS).
    NOTA: tampón FACS se puede almacenar a 4 ° C durante varias semanas.
  2. Coloca el ratón en un tubo de restricción y afeitar el pelo de la pierna posterior para exponer la vena safena lateral.
  3. Capa finamente la pierna con vaselina y perforar la vena safena con una aguja de 25 G.
  4. Recoger aproximadamente 50 l de sangre con un tubo capilar recubierto con heparina. Añadir la sangre a un tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de tampón FACS. Mezclar el tubo por inversión y almacenar en hielo.
  5. Mantenga gasa quirúrgica en el sitio de la inyección hasta que el sangrado se detiene antes de volver ratón de nuevo a la jaula.
  6. Centrifugar las muestras de sangre durante 5 min a 900 x g. Retirar y desechar el sobrenadante.
  7. Vuelva a suspender el sedimento en 500 l de tampón de lisis de los eritrocitos. Incubar en hielo durante 8,5 min.
  8. Añadir 1 ml de tampón FACS para saciar el tampón de lisis.
  9. Centrifugar las muestras durante 5 min a 900 x g. Retirar y desechar el sobrenadante.
  10. Realizar una segunda etapa de lisis en 500 l de tampón de lisis de eritrocitos. Incubar en hielo durante 8,5 min.
  11. Añadir 1 ml de tampón FACS para saciar el tampón de lisis.
  12. Centrifugar las muestras durante 5 min a 900 x g. Retirar y desechar el sobrenadante. Compruebe que la pastilla es ahora blanco.
    NOTA: Si el pellet todavía aparece rojo, puede ser necesaria una etapa de lisis adicional antes de proceder al siguiente paso.
  13. Vuelva a suspender el sedimento en 1 ml de tampón FACS. Centrifugar las muestras durante 5 min a 900 x g. Retirar y desechar el sobrenadante.
  14. Vuelva a suspender el sedimento en 300 l de tampón FACS y cuantificar células GFP + mediante citometría de flujo (NOTA: En este punto cualquier inmunotinción deseada de las células se puede realizar, utilizando técnicas estándar, antes del análisis de citometría de flujo).

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Representative Results

La administración de 60-100 mg / kg de busulfan es generalmente bien tolerada por los ratones. Sin embargo, los animales suelen perder peso durante la fase de acondicionamiento (~ 10.5%) y por lo tanto la dieta puede ser necesario complementar con golosinas como las semillas de girasol irradiadas para promover la alimentación. Los niveles de quimerismo de> 80% GFP + células en la sangre periférica y BM deben ser sistemáticamente alcanzable utilizando 60-100 mg / kg busulfán 7. Nuestro laboratorio ha utilizado con éxito este protocolo para generar más de 100 ratones quiméricos con> 80% GFP + células en la sangre periférica y BM, y prácticamente todos nuestros BMTs tienen éxito cuando se utilizan donantes singénicos y receptores. La figura 1 muestra los niveles de quimerismo cuantificados semanal en la sangre periférica de los ratones acondicionados con 100 mg / kg busulfán recibir un éxito BMT singénico (n = 3) y de los ratones acondicionados con 80 mg / kg busulfán que reciben un TMO alogénico éxito (n = 3). Niveles de quimerismo> 80% son typically estableció por 3-4 semanas post-TMO. Figura 2 es FACS datos representativos de sangre periférica muestra un éxito y de fracaso BMT. La figura 3 muestra que este quimerismo permanece establecido durante al menos un año en el BM (n = 3), y que el condicionamiento con vehículo no es suficiente para inducir quimerismo BM (n = 3). Si bien no hay diferencias significativas en los niveles de quimerismo BM lograr utilizando dosis de 60-100 mg / kg busulfán, las células GFP + se acumulan dentro del SNC en una forma dependiente de la dosis. Además, esta acumulación se incrementa dramáticamente en trastornos neurodegenerativos tales como ALS 7. La Figura 4 ilustra GFP + acumulación de células dentro de la región lumbar de la médula espinal en una de tipo salvaje (n> 20) y modelo de ratón ALS (n> 20).

Figura 1
Figura 1. Los ratones receptores condicionadoscon busulfán y trasplantados con células GFP + de médula ósea de un donante singénico lograr un alto nivel de quimerismo sostenida en la sangre. datos de citometría de flujo semanales que muestran GFP + quimerismo en la sangre periférica de ratones trasplantados con éxito acondicionado con 100 mg / kg de busulfan seguido por singénico trasplante de médula ósea (negro) y los ratones trasplantados sin éxito condicionados con 80 mg / kg de busulfan seguida de trasplante de médula ósea alogénico (gris). Los resultados son medias de n = 3 ratones / grupo, las barras de error representan SEM.

Figura 2
Figura 2. Los datos de citometría de flujo representativo que muestra GFP + células en la sangre periférica 3 semanas después del trasplante de médula ósea en ratones acondicionado con 100 mg / kg de busulfan. (A) Diagrama de dispersión que muestra la estrategia de gating, (B) un allogen éxitotrasplante de médula ósea EIC, y (C) un trasplante de médula ósea singénico éxito. Los resultados son representativos de n> 3 ratones. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Los datos de citometría de flujo representativo que muestra GFP + células en el trasplante de médula ósea 1 año después de la médula ósea. (A) Diagrama de dispersión que muestra gating estrategia, (b) de vehículos acondicionado ratones, y los ratones (C) 100 mg / kg busulfán acondicionado. Los resultados son representativos de n = 3 ratones. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Células derivadas de la médula ósea Figura 4. acumulan en el SNC de busulfán acondicionado ratones que recibieron un trasplante de médula ósea. El análisis inmunohistoquímico de secciones de la región lumbar de la médula espinal aislada de (A, C) ratones de tipo salvaje y (B, D) finales estadio de la enfermedad ratones con ELA. Células GFP + se muestran en verde. Los resultados son imágenes representativas de n> 20 ratones para cada modelo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Acondicionado Busulfan permite la generación de alto nivel de quimerismo BM en ratones con células hematopoyéticas que son fácilmente detectable. Este acondicionamiento se puede realizar sin la necesidad de instalaciones de irradiación. Además, la mielosupresión con las dosis de busulfán se describe en este protocolo es bien tolerada, se minimizan los efectos secundarios tóxicos provocados por dosis mieloablativos de la irradiación, y por lo tanto puede ser una técnica más adecuada para generar BM quimerismo en ratones jóvenes, viejos, o enfermo que son más susceptibles a mieloablativo irradiación. Algunos protocolos RIC usan dosis bajas, no myleoablative de irradiación corporal total para minimizar los efectos secundarios adversos, pero estos protocolos aún requieren instalaciones de irradiación y, dependiendo de la dosis de irradiación, puede resultar en niveles de quimerismo que son menores que las alcanzables con busulfán acondicionado 13. Recientemente, treosulfan se ha utilizado para BM acondicionado 8,14. Al igual que el busulfán, conditi treosulfanocañoning y BMT es capaz de generar ratones con un alto grado de quimerismo en el BM 14. Sin embargo, treosulfan no es fácilmente alcanzable en América del Norte, y la dosis de treosulfan requerida para alcanzar niveles comparables de quimerismo a acondicionado busulfán es significativamente mayor que el busulfán (~ 5-10 veces) 14. Por otra parte, a estas dosis eficaces treosulfano parece tener más efectos secundarios tóxicos en ratones en comparación con busulfán (K. Peake, J. Manning, y C. Krieger, observaciones no publicadas). Quimerismo en la sangre periférica también se puede establecer a través de la generación de los ratones parabiotic, que implica unir quirúrgicamente la circulación de un ratón receptor a un ratón donante. A diferencia de los trasplantes BM enteros, parabiosis permite quimerismo en la sangre periférica que se establezca de una manera más fisiológica sin introducir células progenitoras restringidas-BM en la circulación, aunque parabiosis es un procedimiento técnicamente difícil que sólo resulta en ~ 50% de células donantes en los peripheral sangre de ratones receptores 15.

El protocolo descrito aquí se basa en el uso de ratones receptores y donantes que son del mismo sexo, así como el uso de cepas receptoras y donantes singénicos de ratón, con el fin de minimizar la posibilidad de rechazo del trasplante. Aunque muchas cepas donantes y receptores adecuados están disponibles comercialmente, el establecimiento de quimerismo en ratones alogénicos no coincidentes (es decir, diferir significativamente en haplotipo MHC) puede ser problemático. En tales casos donde los ratones alogénicos son los únicos ratones adecuados, un estudio preliminar primero debe llevarse a cabo en un pequeño grupo de ratones para determinar si acondicionado busulfán es capaz de conducir a un alto grado de quimerismo estable. Hemos tenido algo de éxito del trasplante BMDCs donantes aislados de ratones C57BL / 6-GFP en ratones C57BL / 6; destinatarios SJL, aunque no todos los ratones trasplantados establecieron quimerismo sostenida (~ 30%). La adición de ciclofosfamida, un fuerte agente inmunosupresor menudo used en conjunción con busulfán clínicamente 16, se puede utilizar para mejorar la tasa de éxito de los trasplantes alogénicos. Sin embargo, cuando las células / 6-GFP C57BL fueron trasplantadas en un modelo de ratón transgénico de la enfermedad de Alzheimer de triple en una mezcla de C57BL / 6; 129 genética fondo, busulfán y ciclofosfamida acondicionado fueron insuficientes para generar quimeras BM estables (Figura 2B), mientras que el injerto estable fue posible después de la irradiación letal. Por lo tanto, en situaciones donde se requieren trasplantes alogénicos, la irradiación puede ser un régimen de acondicionamiento más adecuado debido a la mielosupresión completa y la inmunosupresión severa que ocurre.

Varias medidas adicionales se deben tomar con el fin de maximizar el quimerismo y la consistencia de este protocolo. Es crucial que las diluciones frescas de busulfán se preparan para inyección, idealmente justo antes de la administración de busulfán, como la potencia de busulfán parece reducirse con a largo plazoalmacenamiento. Además, cuando triturando el BM para disociar las células, es importante hacerlo con cuidado para no dañar las células BM. Mientras que esto puede resultar en algunos grupos de tejido que no están completamente disociado, y en consecuencia un rendimiento ligeramente inferior, la salud general y la calidad de las células disociadas será mejor. Del mismo modo, las medidas que requieren la resuspensión del sedimento también deben hacerse con cuidado.

Los altos niveles de quimerismo consistentemente pueden alcanzarse con 60, 80 y 100 mg / kg dosis de busulfán 7 (Figuras 1 - 3). Además, hay un aumento dependiente de la dosis en la acumulación de células GFP + en el SNC de tipo salvaje 8,9 y 7 ratones con ELA. Nosotros y otros han observado un aumento en el número de la acumulación de células GFP + en el SNC de los modelos de ratón de la neurodegeneración en comparación con ratones de tipo salvaje 7,8,10. Resultados irradiación letal en un número aún mayor de las buenas prácticas agrarias + BMDCs en comparación con 60-100 mg / kg dosis de busulfán 7 aunque un estudio reciente sugiere que una dosis mieloablativo de busulfán (125 mg / kg) resulta en un mayor número de células GFP + en el cerebro en comparación con la irradiación total del cuerpo 9. La evidencia sugiere que la entrada BMDC en el SNC de ratones letalmente irradiados puede ser debido, al menos en parte, a la interrupción de la barrera sangre-cerebro (BBB). Mientras busulfán no parece alterar la BBB en base a la ausencia de proteínas del suero (albúmina) en el SNC 11, busulfán es capaz de atravesar fácilmente la BBB 17,18 y por lo tanto se ha sugerido que el condicionamiento busulfán puede abrir un espacio nicho dentro de el SNC que posteriormente ocupado por BMDCs 8. Curiosamente, los resultados de Wilkinson et al. Sugieren que las células GFP + se acumulan en el SNC de busulfán acondicionado ratones debido a un mecanismo de reclutamiento de quimioquinas, mientras que la acumulación de células GFP + en ratones irradiados letalmente parece ser debido a inflammatorY mecanismos generados por la irradiación sí 9. Treosulfano no aparece para acondicionar el CNS y por consiguiente pocas células GFP + se encontraron dentro del SNC de ratones treosulfan acondicionado 8. Queda por determinó el efecto de diferentes dosis de busulfán puede tener en tejidos distintos de la CNS, aunque busulfán se conoce para apuntar el hígado, pulmones y riñones 6. Eso busulfán puede condicionar otros tejidos se debe tomar en cuenta al elegir una dosis de busulfán para nuevos experimentos.

Mientras que este protocolo acondicionado busulfán es relativamente simple de realizar, la generación de ratones con quimérico BM es una herramienta poderosa que se puede utilizar para investigar las células hematopoyéticas. La amplia gama de ratones transgénicos disponibles en el mercado, junto con la capacidad de diseñar genéticamente ratones y BMDCs, aumenta dramáticamente el potencial de este protocolo. Por ejemplo, existen diversos modelos de ratones donde la expresión de GFP se limita atipos específicos de células y linajes, tales como ratones CX3CR1-GFP que expresan GFP predominantemente en células del linaje mielomonocítica 19. Estos ratones pueden ser utilizados como donantes que permiten la investigación de las poblaciones de células hematopoyéticas específicas in vivo. Un número de diferentes fluoróforos también existe, además de GFP, que se puede utilizar con el fin de trasplante y el seguimiento BMDCs a partir de dos (o más) donantes distintos, una técnica que puede ser empleada para ensayos de competición 20. Por otra parte, un número de diferentes modelos de ratones transgénicos de la enfermedad existe que se puede utilizar como receptores para investigar el papel de BMDCs en una variedad de trastornos. Después del trasplante, las células del donante se pueden analizar utilizando inmunohistoquímica, o aislados por FACS e investigados usando una gama de técnicas bioquímicas. Además, las tecnologías avanzadas de imagen como la microscopía de dos fotones se pueden implementar para vivir en la detección in vivo de fluoróforos tales como GFP 21. En última instancia,Se prevé que BMDCs podrían ser diseñados y utilizados para entregar moléculas terapéuticas a los tejidos diana, como el sistema nervioso central en los receptores de busulfán acondicionado genéticamente.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Busulfex Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. DIN 02240602 Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01 Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483-020

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References

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