Farelerde Kararlı Yüksek seviyeli Kemik İliği Kimerizm Yaratma için miyelosupresif Ajan olarak Busulfan

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peake, K., Manning, J., Lewis, C. A., Barr, C., Rossi, F., Krieger, C. Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice. J. Vis. Exp. (98), e52553, doi:10.3791/52553 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

NOT: Etik Beyanı: Bu protokol gözden ve Simon Fraser Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı (UACC; izin numaraları 1037K-1060K-12 ve 03) ve Hayvan Bakımı, NIH Kılavuzu için Kanada Konseyi ile uyumlu olduğunu Bakım ve Laboratuvar Hayvanları Kullanım ve AET Konsey Direktifi.

1. Özel Hususlar

NOT: Busulfan sitotoksik olduğunu. Kulp ve malzeme güvenlik bilgi formunda ve kurumsal kurallarına göre imha ediniz.

  1. Bir laminar akış başlığı içinde aseptik tüm teknikleri yapın.
  2. Bu tür bir çekme paketi, ve bunun otoklavlama gibi uygun bir ambalaj malzemesi içinde sararak kullanımdan önce aletleri sterilize edin.
  3. Enfeksiyon için risk ışınlama göre busülfan klima ile düşük olsa da, sadece nakli sonrası ilk 2 hafta boyunca bir laminer akış kaputu hayvanları anlaştım.

2. KlimaAlıcı Fareler

  1. Steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir çözelti, 3 mg / busulfan seyreltin.
    NOT: Bu enjeksiyon her gün kullanımdan hemen önce busulfan taze seyreltme yapmak önemlidir.
  2. Günlük olarak IP enjeksiyon yoluyla alıcı farelere seyreltildi busulfan, 20 mg / kg uygulayın.
  3. 60-100 mg toplam doz kadar 20 mg / kg busulfan günlük olarak IP enjeksiyonları tekrar / kg (örneğin, bir 80 mg / kg toplam doz, birbirini takip eden 4 gün boyunca busulfan, 20 mg / kg, tatbik) teslim edilmiştir.

Donör Kemik İliği Hücrelerinin İzolasyonu 3.

NOT: Bu protokol, başarılı bir şekilde 5 donör farelerden yukarıdan BM hücrelerinin izole edilmesi ve hazırlanması için kullanılmıştır. Tipik fare başına hücre verimi 12-16 alıcı fareler nakli için yeterli yaklaşık 30-40.000.000 BMDCs vardır. Da daha fazla verici farenin gerekli ise protokol buna göre ayarlanması gerekebilir.

  1. Busülfan klima euth son gününde ardındanCO 2 kullanılarak (1-6 aylık) bir GFP donör fare anize (ya da kurumda kabul edilen diğer ötenazi prosedürü ile). Greft komplikasyonlar alıcı olarak aynı cinsiyetten olan singenik bağışçılara kullanmak önlemek için.
  2. % 70 etanol ile fare püskürtün. Karın ve kullanma cerrahi makas lift cilt yukarı karın boşluğuna ayak bileği doğru bacak deri yoluyla bir kesi yapmak. Ayak Holding, sıkıca bacak dokusu açığa kalça doğru ayak bileği cildi çekin.
  3. Kalça eklemi maruz femur kas ve yağ dokusu uzak Trim.
  4. Yavaşça bacak uzatmak için yürüyerek çekerken, kalça eklemi karşı makas basın. Sadece femur kendisi kesmek için değil femur alma bakım başının üstünde kesin.
  5. , Sterilite korumak yürüyerek bacak tutun ve otoklava dokuları ile kemik yüzeyi ovularak kemikleri kalan doku temizlemek yardımcı olmak için.
  6. Diz eklemi ile keserek femur ve tibia ayırın vesteril PBS içeren bir kültür çanak femur yerleştirin. Buz üzerinde inkübe edin.
  7. Çıkarın ve fibula, tibia bağlanır noktalarda keserek fibula atın. Femur ile kültür çanak tibia yerleştirin ve buz üzerinde kuluçkaya yatmaktadır.
  8. Dier bacak için 3,2-3,7 adımları, ve gerekirse, ek donör fareler. Kemiklerin çıkarılmasının ardından, sıcak bir boncuk sterilizatör ile cerrahi aletleri sterilize veya sonraki adımlar için steril araçlar yeni bir dizi kullanın.
  9. Femur için, forseps ile femur tutun ve dikkatli bir şekilde 'tıraş' cerrahi makas kullanarak uzak kemik kapalı biter. BM boşluğu ortaya çıkarmak için gerekli kemik az çıkarın.
  10. Steril PBS 3 ml olan bir şırınga doldurun ve bir 23 G iğne takılır. Dikkatle BM boşluğuna iğne deliği ve steril bir kültür kabına BM yıkayın. İstenen tüm hücrelerin çıkarılmasını sağlamak için iğne noktası ile medüller kavite kazımak için emin olun. Ekstraksiyon sonrasında,Kırmızı BM artık görünür ve kemik artık beyaz görünür emin olun.
  11. Tekrar aynı kültür çanak BM tüm havuzu, sonraki femur için 3,9-3,10 adımları.
  12. Tibia'daki için, dikkatle forseps ile kaval ve 'tıraş' tibia BM boşluğu açığa diz bağlı olduğu uç tutun. Görünür kırmızı BM biter kemik boyunca ikinci bir kesim olun.
  13. Steril PBS 3 ml olan bir şırınga doldurun ve bir 25 G iğne takılır. Yavaşça (diz bağlı olan ucundan) BM boşluğuna iğne takın ve femur gelen BM içeren kültür çanak içine BM yıkayın. Tüm hücreleri çıkarmak için iğne ile BM boşluğun duvarları kazıyın. Çıkarma ardından, kırmızı BM artık görünür ve kemik artık beyaz görünür emin olun.
  14. Tekrar aynı kültür çanak BM tüm havuzu, sonraki tibia'daki için 3,12-3,13 adımları.
  15. Yavaşça c ayırmak için 1 ml pipet ile BM çiğnemekarşın.
  16. Steril bir 50 ml lik santrifüj tüpüne 40 uM sepete filtre içinden hücre süspansiyonu geçirin. Kalan hücreleri almak ve santrifüj tüpüne filtresi aracılığıyla bu aktarmak için PBS ile çanak durulayın.
  17. 4 ° C'de 450 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. Süpernatantı çıkarın ve atın.
  18. Eritrosit yokedici tamponda 3 ml pelet yeniden askıya. 8.5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  19. Yokedici tampon sönmesi için steril PBS ile 30 ml ilave edilir.
  20. 4 ° C'de 450 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje. Süpernatantı çıkarın ve atın.
  21. Steril PBS içinde 1 ml pelet yeniden askıya. Buz üzerinde tutun.
  22. Hücre homojenatının küçük bir kısım almak ve PBS ile seyreltilmiş (1: 100 1 fare, 1: 200 2 fareler için, vs.), bir hemositometre kullanılarak, hücre sayısını belirlemek için.
  23. 8 x 10 6 hücre / ml hücre süspansiyonu seyreltin ve enjeksiyona kadar buz üzerinde inkübe edilir.

4. Kemik İliği Transplantasyonu

  1. FiLl her bir fare için seyreltilmiş hücre süspansiyonu 300 ul (28 G, insülin iğne ile) bir 0.5 mi şırınga enjekte edilecek. Şırınga mevcut herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için emin olun.
  2. Bir ısıtma yastığı şartına alıcı fareler içeren fare kafes yerleştirin ve kuyruk damarları genişletmek için izin verir.
  3. Frenleyici cihazda bir alıcı fare ve yerinizi alın. % 70 etanol ile ıslatılmış cerrahi gazlı bez ile silin kuyruk.
  4. Sıkıca kuyruk tutun ve konik yukarı, nazikçe yanal kuyruk damarlarından birinin içine iğne takın ve hücre süspansiyonu enjekte.
  5. Kanama, yeni bir temiz bir kafesin içine fare tanıtan önce durana kadar enjeksiyon yerinde cerrahi gazlı bez tutun.

5. BM Kimerizm Kapsamının tahmin

NOT: Kimerizm seviyeleri 1 hafta sonrası BMT de periferik kanda tipik değişken, ve bu kimerizmi düzeyleri normal en az 2 hafta sonrası BMT tahmin gibidir. Chim Düzeylerierism sonrası BMT 3-4 hafta içinde periferik kan>% 80 GFP + hücreler ulaşması gerekir.

  1. FACS tampon (PBS içinde 2 mM EDTA +% 2 fetal sığır serumu) hazırlayın.
    Not: FACS tamponda birkaç hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
  2. Bir yasaklama tüp fareyi yerleştirin ve yanal safen ven maruz arka bacak kürk tıraş.
  3. Ince kat vazelin ve delme 25 G iğne ile safen ven ile bacak.
  4. Bir heparin kaplı kılcal tüp ile kanın yaklaşık 50 ul toplayın. FACS tampon 1 ml ihtiva eden bir mikro santrifüj tüpüne kan ekleyin. Çevirerek tüp karıştırın ve buz üzerinde saklayın.
  5. Geri kafesine fareyi dönmeden önce kanama durana kadar enjeksiyon yerinde cerrahi gazlı bez tutun.
  6. X g'de 900 ° C'de 5 dakika için kan santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve atın.
  7. Eritrosit yokedici tampon 500 ul pelet yeniden askıya. 8.5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  8. Yokedici tampon sönmesi için FACS tampon 1 ml ilave edilir.
  9. X g 900 ° C'da 5 dakika boyunca numune santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve atın.
  10. Eritrosit yokedici tamponda 500 ul ikinci parçalama adımı gerçekleştirir. 8.5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  11. Yokedici tampon sönmesi için FACS tampon 1 ml ilave edilir.
  12. X g 900 ° C'da 5 dakika boyunca numune santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve atın. Pelet artık beyaz olup olmadığını kontrol edin.
    NOT: Pelet hala kırmızı görünüyorsa, ek bir parçalama aşaması bir sonraki adıma geçmeden önce gerekli olabilir.
  13. FACS tampon 1 ml pelet yeniden askıya. X g 900 ° C'da 5 dakika boyunca numune santrifüjleyin. Süpernatantı çıkarın ve atın.
  14. FACS tampon 300 ul pelet yeniden askıya ve akış sitometri kullanılarak GFP + hücreleri ölçmek (NOT: Bu noktada hücrelerin istenilen immun standart teknikler kullanılarak, yapılabilir, önceki sitometri analizi akış).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

60-100 mg verilmesi / busulfan kg genellikle iyi tolere edilir fareler tarafından. Ancak, hayvanlar tipik olarak yeme teşvik etmek ışınlanmış ayçiçeği tohumu gibi davranır ile takviye gerekebilir Klima fazı (~% 5-10) ve dolayısıyla diyet sırasında kilo. Periferik kanda>% 80 GFP + hücrelerinin kimerizmin ve BM Düzeyleri 60-100 mg / kg busulfan 7 kullanarak sürekli ulaşılabilir olmalıdır. Laboratuvarımız başarıyla periferik kan ve kemik iliğinde>% 80 GFP + hücreler ile 100'den fazla kimerik fareler oluşturmak için bu protokolü kullandı ve singenik donör ve alıcı kullanırken bizim BMTS hemen hemen tüm başarılı. Şekil 1 kimerizmin seviyeleri haftalık miktarı gösterir Başarılı bir singeneik BMT alıcı 100 mg / kg busulfan ile şartlandırılmış farelerin periferal kan (n = 3) ve başarısız allojenik kemik iliği nakli alan 80 mg / kg busulfan ile şartlandırılmış fareleri (n = 3). >% 80 Kimerizm seviyeleri typicall olany 3-4 hafta tarafından kurulan sonrası BMT. Şekil 2 periferik kan başarılı ve başarısız BMT gösteren temsili FACS veridir. 3 Bu kimerizmi BM en az bir yıl süreyle kurulan kalır olduğunu göstermektedir (n = 3), ve Şekil araç ile bu condition BM şimerizmi oluşturmak için yeterli değildir (n = 3). Olsa da BM kimerizmin seviyelerinde önemli bir fark 60-100 mg / kg busulfan, GFP + hücreler, doza bağımlı bir şekilde merkezi sinir sistemi içinde birikir dozlarını kullanarak elde etti. Ayrıca, bu birikimi önemli ölçüde ALS 7 gibi nörodejeneratif hastalıklarda artar. 4, bir vahşi tip (n> 20), ALS fare modelinde (n> 20) 'de omuriliğin bel bölgesi içinde GFP + hücre birikimi göstermektedir Şekil.

Şekil 1,
Şekil 1. Alıcı fareler klimalıbusulfan ve bir singeneik verici GFP + kemik iliği hücreleri ile transplante kan sürekli kimerizmin yüksek düzeyde elde. singeneik ardından busulfan, 100 mg / kg şartına başarılı bir şekilde nakledilen farelerin periferal kan GFP + şimerizmi gösteren haftalık akış sitometrik veriler Kemik iliği nakli (siyah) ve başarısız nakledilen fareler allojenik kemik iliği transplantasyonu (gri) izledi busulfan 80 mg / kg ile klimalı. Sonuçlar, n = 3 fare / grup anlamına gelir, hata çubukları SEM'i temsil etmektedir.

Şekil 2,
Şekil 100 mg / busulfan kg (A). Saçılım gösteren yolluk strateji, (B) bir başarısız allogen ile şartlandırılmış farelerde 3 hafta, kemik iliği transplantasyonundan sonra, dış kanda GFP + hücreleri yok 2. Örnek akış sitometrik verilerABM kemik iliği nakli, ve (C) Başarılı bir singenik kemik iliği nakli. Sonuçlar n> 3 fareden temsilcisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil kemik iliği 1 yıl sonra kemik iliği nakli GFP + hücreler gösteren 3. Temsilcisi akım sitometri verileri. (A), dağılım (B) araç şartlandırılmış fareleri strateji yolluk gösteren, ve (C), 100 mg / kg busulfan nin önemini belirtmişlerdir. Sonuçlar n = 3 fareden temsilcisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 4. Kemik iliğinden elde edilen hücreler, bir kemik iliği nakli verilen busülfan şartlandırılmış farelerin CNS'lerinde birikir. (A, C), vahşi tipli fare ve geç (B, D), izole omuriliğin bel bölgesi kesitlerinin immünohistokimyasal analizi hastalık evresi ALS fareler. GFP + hücreler yeşil gösterilmiştir. Sonuçlar, her model için n> 20 fareden alınan temsili görüntüler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Busülfan condition kolaylıkla saptanabilen hematopoietik hücrelerin farelerde yüksek düzeyde BM kimerizmin üretimi sağlar. Bu koşullandırma ışınlama tesisleri için gerek kalmadan gerçekleştirilebilir. Üstelik, bu protokolde belirtilen busulfan dozlarda myelosupresyon iyi ışınlama miyeloablatif dozlarda neden toksik yan etkileri en aza indirerek, tolere edilir, ve böylece daha vardır, genç yaşlı, ya da hastalıklı farelerde BM şimerizmi üretmek için daha uygun bir teknik olabilir ışınlama miyeloablatif duyarlı. Busulfan ile elde daha düşük kimerizmi seviyelerinde neden olabilir Bazı RIC protokoller olumsuz yan etkileri en aza indirmek için total vücut ışınlaması düşük olmayan myleoablative dozlarda kullanımı, ancak bu protokoller hala ışınlama dozuna bağlı olarak, ışınlama tesisleri gerektirir ve Klima 13. Son zamanlarda, treosülfan BM klima 8,14 için kullanılır olmuştur. Busulfan gibi, treosülfan conditioning BMT BM 14 kimerizmin yüksek derecede fareler üretme yeteneğine sahiptir. Bununla birlikte, treosülfan Kuzey Amerika'da kolayca ulaşılabilir değildir ve busülfan şartlandırmaya kimerizmin benzer seviyeleri elde etmek için gerekli olan treosülfan dozu busulfan (~ 5-10 kat) 14 daha yüksektir. Ayrıca, busulfan göre farelerde daha toksik yan etkileri (K. Peake, J. Manning, ve C. Krieger, yayınlanmamış gözlemler) var görünüyor treosülfan bu etkili dozlarda. Periferal kan kimerizmi da cerrahi, verici bir fare için bir alıcı farenin dolaşımı bağlama içerir Parabiyotik farelerin üretilmesi ile kurulabilir. Parabiosis sadece peri% 50 donör hücreleri ~ sonuçlanan bir teknik olarak oldukça zor bir işlemdir, ancak tüm BM nakli aksine, parabiosis, dolaşıma BM-kısıtlı progenitör hücreler tanıtan olmadan daha fizyolojik bir şekilde kurulacak periferik kan kimerizmin sağlarAlıcı fareler 15 pheral kan.

Burada açıklanan protokol nakli reddi olasılığını en aza indirmek amacıyla, aynı cinsten olan alıcı ve verici fareler kullanılarak, hem de genetik olarak özdeş alıcı ve verici fare suşları kullanılarak dayanır. Birçok uygun verici ve alıcı suşları ticari olarak temin edilebilir, ancak, birbiri ile uyumsuz allojenik farelerde şimerizmi oluşturulması (örneğin, MHC haplotipi önemli ölçüde farklılık taşıyan) sorunlu olabilir. Allojenik fareler sadece uygun fareler kullanılabilir Bu gibi durumlarda, bir ön çalışma ilk busülfan condition sabit kimerizmin yüksek derecede önemli yeteneğine sahip olup olmadığını belirlemek için fareler küçük bir grup üzerinde yapılmalıdır. Tüm nakledilen fareler sürekli şimerizmi (~% 30) kurulan olsa, SJL alıcıları; Biz C57BL / 6 içine C57BL / 6-GFP farelerden izole donör BMDCs nakli, bazı başarı oldu. siklofosfamid ek olarak, genellikle, güçlü bir bağışıklık bastırıcı madde, Ubusulfan, klinik olarak 16 ile bağlantılı olarak sed allojenik nakillerinin başarı oranını artırmak için kullanılabilir. C57BL / 6-GFP hücreleri karışık C57BL / 6 Alzheimer hastalığının üçlü transjenik fare modeli içine transplante edildi, ancak, 129, genetik geçmişi, busülfan, siklofosfamid klima sabit engraftment ise sabit dengeleme kimeraları (Şekil 2B) üretilmesi için yetersiz olduğunu öldürücü irradyasyonu takiben mümkündü. Böylece, allojenik nakli gerekli durumlarda, ışınlama nedeniyle oluşur tam miyeloablasyon ve şiddetli immünsüpresyona daha uygun bir klima rejimi olabilir.

Birkaç ek önlemler bu protokolün şimerizmi ve tutarlılık maksimize etmek amacıyla alınmalıdır. Bu busulfan gücü ile uzun süre azaltılabilir görünen busulfan taze seyreltileri, ideal olarak hemen önce busülfan tatbikat için, enjeksiyon için hazırlanan çok önemlidirDepolama. Hücreleri ayırmak için BM triturating Ayrıca, bu BM hücrelere zarar vermemek için bu kadar nazikçe yapmak önemlidir. Bu tamamen iyi olacaktır dolayısıyla ayrışmış hücrelerinin biraz daha düşük bir verim, genel sağlık ve kalite ayrıldı ve değildir dokusunun bir kısmı yığınlarda yol açabilir. Benzer şekilde, pelet yeniden süspansiyon gerektiren herhangi bir adım da yavaşça yapılması gerekmektedir.

Kimerizmin yüksek düzeyde sürekli olarak elde edilebilir olan 60, 80 ve 100 mg / busulfan 7 kg doz (Şekil 1-3). Ayrıca, yabani tip 8,9 ALS fareler 7 CNS'de GFP + hücrelerinin birikimi ile doza bağımlı bir artış vardır. Biz ve diğerleri, aynı zamanda, vahşi tip farelerden 7,8,10 göre nörodejenerasyon fare modelleri CNS içindeki GFP + hücreleri biriktirme sayısında bir artış gözlemledik. GFP + BM daha da büyük bir sayıda ölümcül ışınlama sonuçlarıDCler 60-100 mg / kg dozları busulfan 7 bir son çalışmada beyin GFP + hücreler daha yüksek bir sayıda busulfan (125 mg / kg) bir sonuç miyeloablatif dozun toplam vücut ışınlama 9 ile karşılaştırıldığında göstermesine rağmen göre. Kanıt öldürücü ışınlanmış farelerin CNS'ye BMDC girişi kan-beyin bariyeri (BBB) ​​bozulması, en azından kısmen, olabileceğini düşündürmektedir. Busülfan CNS 11 içinde serum proteinleri (albümin) yokluğunda dayalı BBB bozmak için görünmüyor olsa da, busulfan kolayca BBB 17,18 geçmek mümkün ve böylece busülfan klima içinde niş yer açabilir ileri sürülmüştür sonradan BMDCs 8 ile doldurulur MSS. İlginç bir şekilde, Wilkinson vd. Bulguları öldürücü ışınlanmış farelerde GFP + hücre birikimi iltihabik bağlı olduğu görünürken GFP + hücreler, bir kemokin alım mekanizması busülfan şartlandırılmış farelerin CNS'lerinde birikir düşündürmektedirIşınlama kendisi 9 tarafından üretilen y mekanizmaları. Treosülfan MSS kondisyon görünmüyor ve dolayısıyla az GFP + hücreler treosülfan klimalı farelerin 8 CNS içinde bulundu. Busülfan, karaciğer, akciğer ve böbrekler 6 hedef bilinmektedir rağmen, merkezi sinir sistemi dışındaki dokularda olabilir busulfan etkisi farklı dozlarını tespit edilmesi gerekmektedir. Yeni deneyler için busulfan bir doz seçerken diğer dokulara kondisyon olabilir busülfan dikkate alınmalıdır.

Bu busülfan condition protokolü gerçekleştirmek için nispeten basit olmasına rağmen, kimerik BM ile farelerin üretimi hematopoietik hücrelerin araştırmak için kullanılan bir güçlü bir araçtır. genetik mühendisi fareler ve BMDCs yeteneği ile birlikte piyasada mevcut transgenik farelerin, geniş ölçüde bu protokolün potansiyelini arttırır. Örneğin, çeşitli fare modelleri GFP tanımı ile sınırlandırılmıştır burada ana kadarmyelomonositik soy hücreleri 19 ağırlıklı GFP ifade gibi CX3CR1-GFP fareler gibi özel hücre tipleri ve soy. Bu fareler, in vivo spesifik hematopoietik hücre popülasyonlarının araştırılması için izin verici olarak da kullanılabilir. Farklı flüoroforlar bir kısmı da, rekabet deneyleri 20 için kullanılabilecek bir teknik nakli ve iki (veya daha fazla) farklı vericilerden BMDCs izlemek amacıyla kullanılabilir GFP'ye ilaveten, bulunmaktadır. Ayrıca, hastalığın farklı transjenik fare modelleri sayısı, bu bozuklukların çeşitli BMDCs rolünü araştırmak için alıcılar olarak kullanılabilir mevcuttur. Transplantasyonu sonrasında donör hücreleri immünohistokimya kullanılarak analiz edilebilir, ya da FACS ile izole edilmiş ve biyokimyasal tekniklerle bir dizi kullanılarak incelenmiştir. Ayrıca, bu tür iki-fotonlu mikroskopi gibi gelişmiş görüntüleme teknolojileri gibi GFP 21 gibi florofor in vivo tespiti canlı için uygulanabilir. Sonuçta, oBMDCs genetik olarak ve busülfan klimalı alıcıları gibi merkezi sinir sistemi gibi hedef dokulara terapötik moleküller sağlamak için kullanılabilir öngörülmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Busulfex Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. DIN 02240602 Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines.
ACK Lysing Buffer Life Technologies A10492-01 Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly
Fetal Bovine Serum Life Technologies 12483-020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ginhoux, F., et al. Fate Mapping Analysis Reveals That Adult Microglia Derive from Primitive Macrophages. Science. 330, (6005), 841-845 (2010).
  2. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the CNS are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science (New York, N. Y.). 239, (4837), 290-292 (1988).
  3. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 48, (1), 11-22 (2009).
  4. Jimenez, M., Ercilla, G., Martinez, C. Immune reconstitution after allogeneic stem cell transplantation with reduced-intensity conditioning regimens. Leukemia. 21, (8), 1628-1637 (2007).
  5. Ellen Nath, C., John Shaw, P. Busulphan in blood and marrow transplantation: dose, route, frequency and role of therapeutic drug monitoring. Current clinical pharmacology. 2, (1), 75-91 (2007).
  6. Galaup, A., Paci, A. Pharmacology of dimethanesulfonate alkylating agents: busulfan and treosulfan. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 9, (3), 333-347 (2013).
  7. Lewis, C. -A. B., et al. Myelosuppressive Conditioning Using Busulfan Enables Bone Marrow Cell Accumulation in the Spinal Cord of a Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. PLoS ONE. 8, (4), e60661 (2013).
  8. Capotondo, A., et al. Brain conditioning is instrumental for successful microglia reconstitution following hematopoietic stem cell transplantation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, (37), 15018-15023 (2012).
  9. Wilkinson, F. L., Sergijenko, A., Langford-Smith, K. J., Malinowska, M., Wynn, R. F., Bigger, B. W. Busulfan Conditioning Enhances Engraftment of Hematopoietic Donor-derived Cells in the Brain Compared With Irradiation. Molecular Therapy. 21, (4), 868-876 (2013).
  10. Lampron, A., Pimentel-Coelho, P. M., Rivest, S. Migration of bone marrow-derived cells into the CNS in models of neurodegeneration: Naturally Occurring Migration of BMDC into the CNS. Journal of Comparative Neurology. 3863-3876 (2013).
  11. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Prinz, M. Bone Marrow Cell Recruitment to the Brain in the Absence of Irradiation or Parabiosis Bias. PLoS ONE. 8, (3), e58544 (2013).
  12. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. V. Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool. Nature Neuroscience. 14, (9), 1142-1149 (2011).
  13. Down, J. D., Tarbell, N. J., Thames, H. D., Mauch, P. M. Syngeneic and allogeneic bone marrow engraftment after total body irradiation: dependence on dose, dose rate, and fractionation. Blood. 77, (3), 661-669 (1991).
  14. Van Pel, M., van Breugel, D. W. J. G., Vos, W., Ploemacher, R. E., Boog, C. J. P. Towards a myeloablative regimen with clinical potential: I. Treosulfan conditioning and bone marrow transplantation allow induction of donor-specific tolerance for skin grafts across full MHC barriers. Bone Marrow Transplantation. 32, (1), 15-22 (2003).
  15. Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., Tetzlaff, W., Rossi, F. M. V. Local self-renewal can sustain CNS microglia maintenance and function throughout adult life. Nature Neuroscience. 10, (12), 1538-1543 (2007).
  16. Andersson, B. S., et al. Conditioning therapy with intravenous busulfan and cyclophosphamide (IV BuCy2) for hematologic malignancies prior to allogeneic stem cell transplantation: a phase II study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 8, (3), 145-154 (2002).
  17. Hassan, M., et al. Cerebrospinal fluid and plasma concentrations of busulfan during high-dose therapy. Bone Marrow Transplantation. 4, (1), 113-114 (1989).
  18. Hassan, M., et al. In vivo distribution of [11C]-busulfan in cynomolgus monkey and in the brain of a human patient. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 30, (2), 81-85 (1992).
  19. Jung, S., et al. Analysis of Fractalkine Receptor CX3CR1 Function by Targeted Deletion and Green Fluorescent Protein Reporter Gene Insertion. Molecular and Cellular Biology. 20, (11), 4106-4114 (2000).
  20. Harrison, D. E. Competitive repopulation: a new assay for long-term stem cell functional capacity. Blood. 55, (1), 77-81 (1980).
  21. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Experimental Neurology. 254, 109-120 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics