Atacante Genetics telas usando macrófagos para Identificar * These authors contributed equally

Immunology and Infection
 

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Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).

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Abstract

Introduction

Toxoplasma gondii (T. gondii) é uma intracelular obrigatório, patógeno protozoários. É o agente causador da toxoplasmose, um perigo para a saúde em indivíduos imunocomprometidos. É também o sistema modelo para outros agentes patogénicos apicomplexan que infectam os seres humanos, incluindo o Cryptosporidium e Cyclospora. A toxoplasmose é mais comumente adquirida através da ingestão de alimentos ou água contaminados com a bradyzoite ou oocisto fase do parasita. Após a ingestão, estes estágios converter ao palco taquizoíto do parasita que se replica dentro das células hospedeiras e divulga sistemicamente. As células T, IFN-γ e, em menor grau, o óxido nítrico 1-4, são importantes para o controlo de infecção, mas não são capazes de eliminar a doença, como uma proporção de taquizoítos converter para a fase bradyzoite que estão protegidas no interior dos cistos de tecido resultando numa infecção crónica de longa duração. De facto, não há terapias eficazes contra o cisto s crónicatagem da doença. Toxoplasmose grave é na maioria das vezes, devido à reativação da infecção persistente, com o estágio bradyzoite do parasita converter de volta para o palco rapidamente replicar característica taquizoíto de infecção primária e aguda.

Sobrevivência no início da face da resposta imune inata é importante para permitir que o parasita para alcançar números suficientes de parasitas, assim como para alcançar locais distais, para permitir o estabelecimento de infecção crónica. T. gondii evoluiu estratégias para combater os mecanismos de defesa do hospedeiro que provavelmente contribuem para a sua capacidade de se replicar e propagar no início da infecção. Em primeiro lugar, T. gondii constitui um PV original durante a invasão do parasita que é largamente segregado a partir dos processos de endocitose e exocíticas da célula hospedeira em comparação com outros patogénios intracelulares 5-9. Além disso, como todos bem sucedidos patógenos intracelulares T. gondii altera a sua célula hospedeira para criar um ambiente permissivo fou crescimento. Isso inclui a expressão do gene da célula hospedeira reprogramação alterando fatores de transcrição da célula hospedeira, incluindo os que são importantes para regular a ativação de células 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, 21 e GRA16 GRA24 22 tenham sido mostrados para ser importante na regulação da resposta de transcrição e de sinalização celular em cascata de células hospedeiras infectadas com T. gondii. Estudos recentes utilizando cruzamentos genéticos entre linhagens do parasita com fenótipos distintos têm sido altamente produtivo na identificação de genes do parasita que fundamentam traços genótipo-dependente de parasitas, incluindo a evasão de imunidade relacionada GTPases (IRGs) 16,19,23-26. Em ratinhos, relacionadas com a imunidade GTPases (IRGs) são críticos para o controlo do Tipo II e III genótipos do parasita enquanto o tipo I muito virulento genótipos desenvolveram mecanismos para escapar às IRGs murino. No entanto, também é claro que o parasita se desenvolveram mecanismos para escapar meios antimicrobianares em adição aos IRGs e que alguns destes mecanismos pode ser conservado entre os genótipos de parasitas 27,28. Além disso, muito pouco se sabe sobre os mediadores críticos da imunidade celular autónoma contra T. gondii durante toxoplasmose humana. Genes dos parasitas importantes para a resistência aos mediadores da imunidade celular autónoma pode também ser importante para a sobrevivência durante taquizoíto para bradyzoite conversão que também pode ser desencadeada por respostas imunitárias do hospedeiro. Por exemplo, o óxido nítrico em níveis elevados pode suprimir a replicação do parasita em macrófagos infectados, mas também pode estimular a taquizoíto bradyzoite conversão resultando na produção de cisto 30-32.

ToxoDB é um banco de dados de genômica funcional para T. gondii, que funciona como um recurso crítico para o campo em termos de fornecimento de informações de seqüência do genoma do parasita e acesso a dados em larga escala genômica publicados e não publicados, incluindo anotações da comunidade, exp gene dados ression e proteômica 33. Semelhante a muitos patogénios protozoários, a maior parte do genoma é constituído por genes hipotéticos sem informações disponíveis, com base na homologia de genes para fornecer informações sobre as suas funções potenciais. Assim, a genética para a frente é uma ferramenta poderosa para identificar genes do parasita novos importantes para a evasão imune, conversão de cisto e outras funções críticas para parasita patogenia, bem como para a conversão entre diferentes estágios de desenvolvimento. Uma resistência adicional da genética para a frente é que ele pode ser usado como uma abordagem relativamente não enviesada para interrogar o parasita como para os genes que são importantes para tarefas específicas em patogénese, incluindo a evasão imune e formação de quistos. As recentes melhorias na próxima geração de sequenciamento para perfilamento mutacional fizeram-lhe um método de escolha para identificar os genes do parasita responsáveis ​​de estudos de genética para a frente usando mutagênese tanto química e insercional 34-37.

ntent "> É importante identificar vulnerabilidades no T. gondii que podem ser explorados para reforçar a eficácia das células imunitárias mecanismos autónomos contra o parasita particularmente aqueles que possam também ser activos contra o estágio de cisto resistente. Com este objectivo, in vitro murino infecção de macrófagos e modelo de ativação foi desenvolvido para identificar mutações no parasita que prejudicar especificamente T. gondii aptidão após a ativação dos macrófagos infectados, mas não em macrófagos ingênuos. Essa tela de macrófagos foi usado para interrogar uma biblioteca de T. gondii mutantes de inserção, a fim de, em última instância identificar genes de T. gondii importantes para a resistência ao óxido nítrico 27,28. O isolamento de um painel de mutantes de T. gondii com resistência diminuída à activação de macrófagos infectados, particularmente uma sensibilidade marcada ao óxido nítrico, comprovou a utilidade da tela para identificar genes do parasita importantes para a resistênciaa mediadores da imunidade celular autónoma do que os outros mecanismos de resistência descritos para os 28 IRGs murino. Mutagénese de inserção tem vantagens em relação a mutagénese química em termos de geração de um número limitado de mutações aleatórias em cada clone parasita e, em teoria, mais fácil identificação do local da mutação. No entanto, a identificação do sítio genómico de inserção no plasmídeo T. Os mutantes de inserção gondii, na prática, tem sido surpreendentemente difícil em muitos casos 37. A inserção de um plasmídeo em um gene é também susceptível de perturbar a função de um gene, em contraste com a mutagénese química que tipicamente resulta em alterações de um só nucleótido. No entanto, a mutagénese química com ou N-etil-N-nitrosoureia (ENU) ou sulfonato ethylmethane (EMS) pode oferecer uma maior capacidade de analisar um maior parte do genoma do parasita, em comparação com mutagénese de inserção, uma vez que cria vários polimorfismos de um único nucleótido ( estimado em 10 -100) por 34 mutante, De 38 anos. Além disso, avanços recentes na caracterização do genoma inteiro tornou possível a utilização de sequenciação próxima geração para identificar os genes candidatos mais prováveis ​​responsáveis ​​pelo fenótipo identificado de um parasita mutado 34,38. Independentemente da abordagem de mutagénese, a confirmação da função do gene parasita na resistência a activação de macrófagos em última análise requer a deleção do gene de complementação e para cumprir os postulados de Koch molecular.

A capacidade para dissecar a função de um gene através da manipulação genética de tanto o parasita e o macrófago é importante como muitos dos genes identificados através da genética para a frente em T. gondii, bem como outros agentes patogénicos, são ainda caracterizadas como genes hipotéticos com pouca ou nenhuma homologia de sequência com outras proteínas com funções conhecidas. O papel actual descreve uma abordagem geral que pode ser usado para identificar se o gene interrompido num mutante é importante para a resistência a um ou conhecidadesconhecido mediador da imunidade autônomo celular. A análise inicial do hospedeiro factores antimicrobianos é realizada através da avaliação da sobrevivência de tipo selvagem e mutantes de parasitas em macrófagos dos murganhos do tipo selvagem versus pacientes com deleções de genes específicos em indutível da sintase do óxido nítrico (iNOS), gp-91 phox (NADPH-oxidase), e GTPases específicas relacionadas com a imunidade (IRGs). Isso vai determinar se os genes do parasita identificados são importantes para a resistência ao óxido nítrico, intermediários reativos de oxigênio ou relacionadas com a imunidade GTPases 28, respectivamente, ou se um mecanismo imunológico desconhecido está envolvido. A activação de macrófagos infectados com tanto IFN-γ e LPS, descritos no protocolo de corrente, resulta primeiramente no isolamento de genes de parasitas importantes para a resistência ao óxido nítrico 28. A utilização de agentes farmacológicos que induzem o óxido nítrico na ausência de activação de macrófagos (dadores de óxido nítrico) confirmou que a maioria dos genes identificados, foram importantes para a resistência ao óxido nítrico em vez de óxido nítrico em combinação com mediadores adicionais associados com a activação de macrófagos 28.

Passo um e dois descrevem uma tela genética para a frente destinada a isolar mutantes do parasita com um defeito de fitness a seguir à activação de macrófagos derivados da medula óssea infectadas in vitro. O primeiro passo descreve uma análise de titulação da dose para determinar empiricamente uma dose de LPS e IFN-γ a ser usado para a activação de macrófagos, que reduz a replicação do parasita, mas não inibe completamente a replicação do tipo selvagem T. gondii estirpe parental que é usada para a criação da biblioteca de mutantes do parasita. Passo dois descreve o rastreio genético para a frente dos clones mutantes em macrófagos em placas de 96 poços. Passo três descreve uma abordagem para confirmar o fenótipo de cada mutante identificado na triagem das placas de 96 poços e para avaliar se o defeito em cada mutante afecta a sobrevivência do parasita, replicação,ou a produção de cisto em resposta à activação de macrófagos. Passo quatro descreve a utilização de macrófagos derivados da medula óssea de ratinhos com deleções em vias antimicrobianos específicos para identificar os mediadores imunes ao qual o parasita mutante é especificamente susceptíveis. Passo cinco descreve uma abordagem para determinar se um parasita mutante é também comprometida para patogénese in vivo como avaliado pela produção de quisto nos cérebros de ratos infectados.

Protocol

NOTA: Todos os protocolos que envolvam o uso de animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Animal Care da Faculdade de Medicina de Nova York e do Comitê Use.
NOTA: detalhado protocolos para mutagênese química 38, o isolamento de parasitos por diluição limitante 38, isolamento de macrófagos murino derivadas da medula óssea 39, o crescimento de T. gondii em fibroblastos prepúcio humano (HFF) células e cisto produção em macrófagos e análise básica de imunofluorescência (IFA) 32 são referenciadas. Realizar toda a cultura de células a 37 ° C em 5% de CO 2 em meio D10 (Dulbecco Modificado Alto Teor de Glucose Eagle Médium suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina) . Mantenha todos os reagentes estéreis durante todo isolamentos celulares e cultura de células.

1. A titulação da dose de IFN-γ e LPS para determinar a Concentrções para usar para ativar os macrófagos infectados para a tela Avançado Genetics

  1. Culturas de macrófagos derivados da medula óssea de murideo O / N em oito lâminas de vidro da câmara, a uma concentração de 3 x 10 5 células / ml em 250 ul de meio D10, por secção. Use macrófagos para uma e duas semanas após o isolamento da medula óssea.
    NOTA: lâminas de câmara são comprados que têm um crescimento aumentando RS lavar.
  2. Usar um hemocitómetro para contar os parasitas do tipo selvagem colhidas a partir de fibroblastos de prepúcio humano (HFF) células cultivadas num frasco de cultura de tecidos T25. Ressuspender parasitas a uma concentração de 5 x 10 5 parasitas do tipo selvagem por ml em meio D10. Esta concentração irá resultar numa multiplicidade de infecção de aproximadamente 1: 1 como os macrófagos vai proliferaram S / N. Use isopor ou PET tubos para todas as manipulações com parasitas como as varas parasita para o polipropileno.
  3. Remova a mídia D10 nas lâminas de câmara e substituir por 250 mL dasuspensão de parasitas do tipo selvagem. Adicionar cuidadosamente a suspensão parasita para cada câmara do slide, permitindo que ela flua para baixo a face interna de cada câmara. Não permitir que os macrófagos para secar em qualquer ponto ao longo do protocolo.
  4. Lâminas de câmara de cobertura infectados com parasitas, com a tampa corrediça câmara e em lugar de uma incubadora a 37 ° C em 5% de CO 2 durante 4 horas para dar tempo para o parasita para invadir e estabelecer um PV.
  5. Fazer diluições de LPS e IFN-γ em 1 ml de meio de D10 em tubos esterilizados para as titulações de dose. Para a dose titulações manter tanto LPS ou constante concentração IFN- e variar o outro estímulo 40.
    1. Por exemplo, manter constante o LPS a 10 ng de LPS por mL e variar a concentração de IFN-γ (0, 1 unidade / mL, 10 unidades / ml, 100 unidades / ml, 1.000 unidades / ml). Manter IFN- γ constante a 100 unidades / ml e variar a concentração de LPS (0, 0,1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml). Estoque LPS Resumidamente sonicate para 2 min semaquecimento em banho de ultra-sons (não com um sonicador de ponta), antes da diluição.
      NOTA: A sonicação é recomendado para romper os agregados de micelas formadas por LPS que podem não se ligam a células hospedeiras adequadamente.
  6. 4 horas após o início da co-cultura entre os parasitas e macrófagos aderentes na câmara de corrediça, os meios de comunicação descartar D10 em cada câmara e substituí-la com 300 uL das diluições adequadas de γ LPS e IFN- em meio D10. Incluir um controlo com apenas meios D10 para avaliar a replicação do parasita na ausência de activação de macrófagos.
  7. Re-tampa lâminas de câmaras com a tampa deslizante e câmara lugar numa incubadora a 37 ° C em 5% de CO2 durante 24 a 30 horas adicionais.
    NOTA: O tempo de incubação depende do tempo de duplicação do tipo selvagem estirpe parasita que pode variar de 6-12 horas, dependendo da estirpe do parasita. Um ponto de tempo é escolhido antes de parasitar lise de macrófagos ingênuo, mas o tempo suficiente para permitir, pelo menos, 3-4 douvezes bling.
  8. Adicione uma solução de formaldeído a 2,5% em solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS). Descarte a mídia no slide câmara e substituir por 300 mL da solução de formaldeído 2,5%. Fix durante 20 min à TA.
  9. Slides Rinse (s) duas vezes com 300 mL de PBS por câmara. Para cada lavagem, descartar o PBS no slide e adicionar novo PBS suavemente para baixo a face interna de cada câmara de slides para não perturbar os macrófagos aderiram ao slide. Adicionar 300 mL de PBS por câmara e lugar cobertura no slide câmara para evitar lâminas sequem antes da coloração.
    NOTA: As lâminas podem ser colocadas a 4 C durante até 3 dias a este ponto antes da coloração.
  10. Protocolo de coloração para T. detecção gondii por microscopia de imunofluorescência (IFA).
    1. Adicione uma solução de Triton X-100 0,2% em PBS (tampão de permeabilização). Colocar a solução em um tubo de 37 ° C num banho de água e brevemente vórtex para assegurar que o Triton X-100 entra em solução. Descarte oPBS nas lâminas de câmara e substituir com 300 l do tampão de permeabilização. Deixar a temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Adicione uma solução de 10% de soro de cabra em PBS (solução de bloqueamento). Descarte o tampão permeabilização no slide e substituir por 300 ml de solução por câmara de bloqueio. Deixar a temperatura ambiente durante 30 min.
      NOTA: soro de vitelo fetal pode ser substituído por soro de cabra em todos os protocolos de coloração.
    3. Para um protocolo de coloração IFA um passo, fazer uma diluição de 1: um anticorpo fluorescente conjugado com T. 1000 gondii em solução de bloqueio. Remover solução de bloqueio a partir de slides e adicione 150 ml de solução de anticorpo por câmara. Recoloque a tampa corrediça na corrediça de câmara para evitar que as células de secar. Incubar durante 1 h à TA.
      NOTA: Concentração de anticorpo deve ser determinada empiricamente dependendo da fonte. O anticorpo é comprado directamente conjugado com um fluorocromo ou conjugado com um fluorocromo pelo utilizador.
      1. Para uma de duas etapas IFA coloraçãoprotocolo com um anticorpo não conjugado para T. gondii e um anticorpo secundário conjugado fluorescente, lâminas mancha com 150 ul de anticorpo primário não conjugada contra T. gondii em tampão de bloqueio durante 1 h à TA. Lavar 3x com 300 mL de PBS e 1% de soro de cabra (tampão de lavagem).
      2. Adicionar 150 uL de anticorpo secundário conjugado com fluorescência específicos para as espécies de origem para o anticorpo primário. Recoloque a tampa corrediça na corrediça de câmara para evitar que as células de secar. Incubar durante 1 h à TA.
    4. Lavar as lâminas 3x com PBS mais 1% de soro de cabra (tampão de lavagem). Para cada lavagem, retire a solução nas lâminas de câmara por despejar o seu conteúdo e substituir com 300 mL de tampão de lavagem.
    5. Lavar as lâminas 2x com 300 ul de PBS.
    6. Remover a câmara da câmara de corrediça de acordo com as instruções do fabricante.
    7. Mount slides com meios contendo DAPI montagem (4'6-diamidino-2-fenilindol, dilactato) e um 22 milímetros x 50 mm lamela.
  11. Examinar as lâminas usando contraste de fase e microscopia de fluorescência. Determinar o número médio de parasitas por vacúolo examinando um mínimo de 100 PVs por câmara bem. A dose escolhida de IFN- γ e LPS para a tela deve ser suficiente para suprimir, mas não impedir, a replicação dos parasitas do tipo selvagem (ver Figura 1).

2. Isolamento de Parasite Mutantes com uma aptidão Defeito após a ativação dos macrófagos infectados

NOTA: Uma biblioteca de T. aleatória mutantes gondii é necessário para a tela genética para a frente. A mutagénese aleatória de T. gondii pode ser realizada por meios químicos (PTG / EMS) ou mutagénese de inserção 27,28,38. A seguir à mutagénese, parasitas clones por diluição limitante e os clones individuais crescer em placas de 96 poços contendo células HFF aderentes num volume de 200 ul de meio D10 32,38.É fundamental que as placas de 96 poços para rastreio de parasitas em macrófagos por microscopia óptica têm partes inferiores para permitir o rastreio microscópico. O contraste de fase e microscopia de fluorescência para o rastreio coradas placas de 96 poços, é necessário um microscópio de fluorescência invertido com contraste de fase 4, 10, 20 ou objectiva de 40x equipado para longas distâncias de trabalho. Um objectivo 4X é útil para a visualização de todo o bem, mas uma melhor resolução dos parasitas é conseguido com o objectivo de 20X.

  1. Transferir 50 uL de taquizoítas mutantes crescidos em células HFF confluentes em placas de cultura de tecidos de 96 poços em dois replicar placas de 96 poços contendo macrófagos derivados de medula óssea murina (1-2 semanas após o isolamento) em 100 ul de meio D10.
    NOTA: Executar a tela inicial em placas de 96 poços do parasita com base no volume de cultura de parasita a fim de evitar ter de contar o número de parasitas transferidos por cada poço. Assim, a análise de microscopia em 2.6 é baseado qualitativamente em whether parasitas têm geralmente replicado ou não replicado. Passo 3 descreve a abordagem para confirmar o fenótipo dos mutantes em lâminas de câmara usando números iguais de tipo selvagem ou mutantes para os parasitas infectam os macrófagos.
    1. Adicionar diretamente parasitas para a mídia D10 já em cada poço. Infect dois poços com taquizoítos de tipo selvagem como um controlo positivo para a replicação do parasita.
  2. Colocar as células infectadas em uma incubadora (37 ° C e 5% CO 2) durante 4 horas para permitir que os parasitas tempo para invadir as células e criar seu PV.
  3. Remover mídia de uma placa de a despejar o conteúdo da placa. Use uma única sacudidela do pulso para despejar os meios de comunicação na placa em um recipiente de descarte contendo um cidal detergente para os parasitas.
    1. Adicione 100 ml de "media ativação dos macrófagos", com uma bacia estéril para os meios de comunicação e uma pipeta multicanal. Utilizar a concentração óptima de LPS e IFN-γ determinada a partir do Passo 1 para o macmedia ativação rophage. De forma semelhante ao remover a mídia a partir da placa de controle duplicado e substituir com 100 l de media D10.
  4. Colocar as células infectadas em uma incubadora (37 ° C e 5% de CO 2) para um 24-30 horas adicionais.
  5. Protocolo de coloração para placas de 96 poços para IFA.
    1. Descartar os meios de comunicação na placa e substituir por 100 ml de 2,5% de formaldeído em PBS. Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente. Usar uma bacia estéril para o formaldeído e uma pipeta multicanal.
    2. Descartar a solução de formaldeído na placa e adiciona-se 100 ul de PBS para enxaguar o formaldeído a partir da placa.
    3. Descartar a solução na placa e adicionar 100 ul de tampão de permeabilização (PBS com 0,2% de Triton X-100) a cada poço. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
    4. Descartar a solução na placa e adicionar 100 ul de solução de bloqueio (PBS com 10% de soro de cabra) a cada poço. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.
    5. Descartar a solução do ptarde. Adicionam-se 50 ul / cavidade de um anti-conjugado fluorescente T. gondii diluído 1: 1000 em PBS mais 1% de soro de cabra. Incubar durante 1 h à RT com a placa de cobertura e no em um balancim.
      1. Como alternativa, use um anticorpo primário não conjugada contra T. gondii seguido por coloração com um anticorpo secundário conjugado com fluorescência como descrito em 1.10.3.1.
    6. Descartar a solução do anticorpo na placa e substituir com 100 ul / poço de PBS mais 1% de soro de cabra. Realize esta 3x lavagem seguido por 2 lavagens adicionais com apenas PBS. Deixar a 200 ul de PBS em cada poço e recolocar a tampa na placa de 96 poços para evitar que os poços de secagem.
      NOTA: A placa com a tampa no pode ser envolto em parafilme e colocadas a 4 ° C durante até 3 dias antes da análise por microscopia.
  6. Examine células sob um microscópio de fluorescência invertido usando um objetivo 20-40X. Seleccionar mutantes que se replicam no nd &# 239; ve placa macrófagos mas predominantemente não conseguem replicar para além de um parasita / vacúolo em "macrófagos ativados" ou que aparecem amorfo ou degradada "macrófagos ativados".
    NOTA: O número de parasitas do tipo selvagem por vacúolo dependerá da dose de IFN-γ e LPS utilizados, mas de preferência é de cerca de 4 por parasitas vacúolo; um número que reflecte a supressão do crescimento mas não a completa inibição da replicação a partir do estímulo de activação.

3. Avaliar os Mutantes para determinar se o defeito é a nível de sobrevivência do parasita ou replicação após a ativação dos macrófagos infectados

  1. Transferência selecionado mutantes parasita de placas de 96 poços (conteúdo de bem inteira) para T25s contendo células HFF e permitir a replicação.
  2. Culturas de medula óssea macrófagos derivados S / N 8 em lâminas de vidro da câmara, a uma concentração de 3 x 10 5 células / ml em 250 ul de meio D10. Prepare um slide para comparar pareplicação rasite em macrófagos ingênuos e um slide de adicional para comparar a replicação do parasita após a ativação dos macrófagos infectados.
  3. Colheita parasitas taquizoítas e contar em um hemocitômetro. Adicionar 5 × 10 4 T. gondii parasitas para uma câmara contendo macrófagos bem em meios D10 e cultura durante 4 hr. Incluir um bem com tipo selvagem parasitas dos pais como um controle. Inocular uma corrediça idêntico idêntico com o mesmo clone parasita que não receberão meios de activação, a fim de monitorar a replicação dos parasitas em macrófagos naive.
  4. Descarte mídia D10 a partir de 1 de lâminas de câmara replicar e substituir com 250 ul de "media ativação". Descarte mídia D10 do outro slides câmara replicar e substituir com 250 mL de mídia D10. Incubar tanto o "activado" e "ingénuo" corrediça de macrófagos com a tampa deslizante na câmara a 37 ° C e 5% de CO 2 durante um additional 24-30 h.
  5. Fix, permeabilizar, e bloco desliza para a coloração e análise de parasitas IFA como descrito no Passo 1. Realizar coloração IFA com as câmaras intactas.
    1. Células Co-mancha com um anticorpo para lisossômico membrana um associado (LAMP1) ou Lyso Tracker e anticorpos para T. gondii para avaliar se a activação de macrófagos infectados está a provocar a fusão das veias pulmonares mutantes com os lisossomas (Figura 4).
    2. Use anticorpos para compartimentos / organelas específicas dentro do parasita / PV para a coloração por IFA para identificar alterações no mutante parasita que são evidentes no início após a ativação dos macrófagos 28.
      NOTA: Essas alterações podem fornecer informações sobre o mecanismo que está na base da deficiente sobrevivência / replicação do mutante após a ativação dos macrófagos.
  6. Examinar as lâminas utilizando um microscópio de fluorescência e objectiva 100X fase óleo.
    1. Avaliar a replicação do parasita através da determinação danúmero de parasitas por PV em 100 vacúolos aleatórios. Realizar pelo menos duas contagens de 100 vacúolos cada para análise estatística.
    2. Avalie morfologia parasita geral usando tanto a análise de fluorescência, bem como microscopia de contraste de fase. Veja parasitas sob fase objetiva de 100x. Parasitas saudáveis ​​têm parasitas hermeticamente fechada dentro de um vacúolo parasitóforo apertada. Parasitas que têm vacúolos espaçosos amorfos com a fase jantes densas ou parasitas amorfos sugerem morte do parasita ao invés de apenas um defeito na replicação (Figuras 1 e 3).

4. Avalie se a suscetibilidade de Mutant Parasitas a ativação dos macrófagos infectados está associado a conhecidos mediadores anti-microbianos

  1. Isolar os macrófagos derivados da medula óssea de tipo selvagem C57 / BL6, iNOS - / -, gp91-phox - / - ou Irgm1 / Irgm3 - / - ratos 32.
  2. Mac cultura de medula óssea respectivo derivadorophages O / N em oito lâminas de vidro câmara a uma concentração de 3 x 10 5 células / ml em 250 ul de meio D10.
  3. Prossiga com desafio parasita, coloração IFA, e análise, conforme descrito na Etapa 3.
  4. Determinar se a capacidade dos parasitas mutantes para sobreviver e replicar a seguir à activação de macrófagos infectados é restaurada na ausência de oxigénio reactivo ou espécies de azoto ou imunidade específica GTPases 28 relacionada.
  5. Use agentes farmacológicos, tais como dadores de óxido nítrico, para avaliar se mediadores anti-microbianos específicos são suficientes por si só para prejudicar parasitas mutantes em células de HFF ou macrófagos naive ou se apenas actuam em conjunto com outros mediadores de activação de macrófagos 28.

5. Avaliar se o defeito na infecção crônica Mutant Parasite Compromises

  1. Isolar taquizoítos de tipo selvagem, mutante ou parasitas gene eliminado direcionados cresceu em T25s containing células HFF. Parasitas deve ser recém-lise de culturas HFF.
  2. Contagem parasitas usando um hemocitômetro. Ressuspender parasitas em solução de Hanks equilibrada de sal (HBSS) a uma concentração adequada por ml para uma dose sub-letal do parasita entregues em 200 ul por injecção intraperitoneal (IP) de injecção.
  3. Usando uma seringa de tuberculina de 1 ml e agulha de 25 G para injectar parasitas com um volume de 200 uL por via intraperitoneal (IP). A dose depende da cepa selvagem do parasita e do genótipo mouse.
    NOTA: o tipo I genótipos do parasita são letais aos ratos durante a fase aguda da infecção, independentemente da dose parasita e não são apropriados para estudos de infecção crônica na ausência de quimioterapia para T. gondii de suprimir a replicação do parasita.
  4. Trinta dias após o desafio parasita, sacrificar ratos por inalação de CO 2 a partir de um tanque pressurizado em uma câmara sem aglomeração (a gaiola padrão tamanho do mouse pode conter mais de 5 mgelo) seguido por deslocação cervical.
  5. Isolar o cérebro do rato usando procedimentos estabelecidos 41-43.
    1. Coloque o mouse em sua parte frontal. Pulveriza-se a cabeça com etanol a 70% para esterilizar a área.
    2. Use uma tesoura afiada para cortar o tronco cerebral. Use as tesouras de dissecção de fazer um corte raso lateralmente em torno da direita e em seguida o lado esquerdo do crânio a partir da base do tronco cerebral. Use uma pinça para descascar suavemente para trás do crânio para expor o cérebro.
    3. Levante cuidadosamente o cérebro e colocar uma tesoura entre o cérebro e da base do crânio para cortar o nervo olfativo para libertar o cérebro. Retire o cérebro com uma pinça estéril ou uma espátula e coloque em um prato de Petri contendo bacteriológica 10 ml de PBS estéril.
  6. Cortar o cérebro ao meio com um bisturi estéril através do centro entre os hemisférios direito e esquerdo.
  7. Adicionar metade do cérebro de um pequeno almofariz contendo 1 ml de PBS. Use o almofariz e pilão parafazer uma suspensão de tecido fino do cérebro que pode passar por uma grande furo 20-200 ul ponteira.
    NOTA: A outra metade do cérebro deve ser fixado em 2,5% de formaldeído, durante 1 hora, se secções de tecido são necessários para exame histopatológico.
  8. Coloque 100 ul de lisado cérebro num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Adicionar 1 ml de 2,5% de formaldeído em PBS para o tubo contendo o lisado cérebro para fixar a suspensão de cérebro para coloração. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
  9. Centrifuga-se o lisado a 8.000 xg durante 5 minutos numa microcentrífuga e descartar o sobrenadante cuidadosamente.
  10. Adicionar 1 ml de permeabilização / tampão de bloqueio ao ligado (10% de soro de cabra, 0,2% de Triton X-100 em PBS). Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
  11. Lisado Centrifugar a 8.000 xg durante 5 min e remover o sobrenadante.
  12. Adicionar 200 uL de conjugado a FITC Dolichos biflorus agglutin (DBA). Usar uma diluição de 1: 100 da lectina em PBS mais 10% de soro de cabra. Suavemente ressuspender o lisado por pipetagem. Incubardurante 1 h à TA.
    NOTA: DBA é um ligando que se liga a CST1 na parede do cisto parasita.
  13. Lisado Centrifugar a 8.000 xg durante 5 minutos e descartar o sobrenadante. Adicionar 1 ml de PBS para o sedimento. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Repita PBS lavagem 3x. Remover o sobrenadante após a lavagem final, utilizando uma pipeta.
  14. Use uma grande furo 20-200 ul ponteira de elaborar 5 ul do cérebro ligado manchado e coloque em uma lâmina de microscópio. Monte o slide com uma tampa de deslizamento mm 25 x 25 para criar uma montagem molhada do ligado cérebro. Adicione 3 lâminas em replicado utilizando 5 uL de cada lisado cérebro.
  15. Contar o número de cistos por cada alíquota de 5 ul por microscopia de fluorescência, utilizando uma objectiva 10X (Figura 6).
    NOTA: Alguns cistos são grandes (8 ou mais parasitas aproximadamente), enquanto alguns são muito pequenos (1-2 parasitas por cisto). Contar o número total de cistos por cada número de slide, mas documento de grande versus o número de pequenos cistos.
  16. Adicione o número de cistos detected nos três diferentes alíquotas de 5 ul e multiplicar pelo fator de diluição total x 2 (apenas metade do cérebro foi feita em um ligado) para estimar o número total de cistos por cérebro.

Representative Results

Toxoplasma gondii replica livremente em macrófagos naive e tem um tempo de duplicação entre 6-12 horas, dependendo da estirpe do parasita. A Figura 1 mostra parasitas representativos nos ingénuos contra macrófagos derivados da medula óssea activados. A Figura 2 mostra a morfologia geral de parasitas em HFF células hospedeiras em 2, 4, 8, 16 e 32 parasitas / PV. No protocolo atual, o parasita é permitido invadir macrófagos ingênuos e estabelecer um vacúolo parasitóforo nascente (PV) antes da entrega de um estímulo de ativação potente, LPS e IFN, para os macrófagos infectados. Neste modelo, a reprodução de parasitas do tipo selvagem é retardado, mas a replicação do parasita ainda prossegue por cerca de 24 horas durante o qual os macrófagos tornam-se progressivamente mais adeptos a inibição da replicação do parasito. O ecrã destina-se a funcionar como um modelo modificado competição entre o tempo necessário para uma potente macrófagosctivation versus o tempo durante o qual o parasita do tipo selvagem ou mutante parasita pode continuar a replicar no seu PV. O primeiro passo na tela é escolher uma dose de LPS e IFN-γ a ser utilizado para a activação de macrófagos infectados. A dose é determinada empiricamente através da avaliação de replicação do parasita em macrófagos activados, com uma dose constante de IFN- γ em combinação com uma gama de concentrações de LPS ou de uma dose constante de LPS com uma gama de concentrações de IFN- (Passo 1). A dose dos estímulos de activação necessita de ser avaliada para os parasitas do tipo selvagem parental utilizada para a criação de mutantes de parasitas por mutagénese química ou por inserção. Idealmente, a dose de LPS e IFN-γ irá permitir a replicação do parasita com uma média de 2-8 parasitas por PV 24-30 horas após activação em comparação com 8-16 parasitas por PV em macrófagos virgens (Figuras 1 e 2).

Uma vez que a concentração apropriada de LPS e IFN-y ^7; é determinada, os mutantes sejam rastreadas de fundo óptico placas de cultura de tecidos de 96 poços. A parte inferior óptico nas placas é importante porque irregularidades no plástico que é utilizado para as placas de cultura de tecidos tradicionais torna difícil conseguir a resolução apropriado para rastrear os parasitas por contraste de fase e microscopia de fluorescência. O contraste de fase e microscopia de fluorescência das placas de 96 poços também requer um microscópio de fluorescência invertido com contraste de fase 4, 10, 20 ou 40x objectivo equipado para longas distâncias de trabalho. Os mutantes são rastreados em placas replicadas contendo macrófagos derivados da medula óssea de murino. Após o desafio com parasitas mutantes, os macrófagos infectados nos poços de uma placa são activados com LPS e IFN-γ enquanto a outra placa contendo macrófagos infectados é apenas cultivadas em meios D10. As placas são incubadas a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24-30 horas após a adição de LPS e IFN-γ. Após a incubação, as células são fixo, manchado por parasitas e analisadas por IFA utilizando tanto fluorescência e microscopia de contraste de fase. Os mutantes são selecionados que têm números normais de parasitas e replicação em macrófagos ingênuo, mas menos parasitas ou vacúolos menores, com menor número de parasitas em macrófagos infectados que são ativadas. Uma vez que os mutantes são selecionados devem ser reavaliados em lâminas de câmara (passo 3) em naïve e ativado macrófagos em dois experimentos independentes para permitir a análise da morfologia parasita em maior aumento (objetiva 100X e óleo) e para confirmar que eles têm de replicação normal em macrófagos ingênuos mas um defeito na replicação / sobrevivência após a ativação dos macrófagos.

Os fenótipos dos mutantes com defeitos de resistência à activação de macrófagos infectados tipicamente caem em duas grandes categorias: os parasitas que aparecem morfologicamente intactos, mas são incapazes de se replicar além de um único parasita por PV; e parasitas que parecem estar Degraded e também podem estar em amorfos PVs espaçosos (Figuras 1 e 3). A morfologia e ultra-estrutura do parasita e PV é melhor visualizado em lâminas com um objetivo e óleo de 100X e por microscopia de contraste de fase, combinada com análise de fluorescência. Coloração de parasitas para IFA com um anticorpo para a proteína de membrana lisossomal associada-1 (LAMP1) é útil para determinar se o defeito no mutante está associada a uma incapacidade do PV para evitar a fusão com lisossomas. Mostrado na Figura 4 é um parasita dentro de um fagolisossomo (LAMP1 positivo) contra um parasita que está em um PV que é largamente segregado a partir do sistema de endocitose da célula hospedeira (LAMP1 negativo). O fagolisossomo é evidente por uma borda sólida contínua de LAMP1 esticar em torno de todo o parasita. Em contraste, um PV muitas vezes tem organelas lisossomas na vizinhança, mas sem aro contínuo de coloração LAMP1 em torno da sua circunferência. A utilização de anticorpos para definidas estruturas / organelos dentro tele parasita e / ou PV são úteis em estudos de acompanhamento para identificar anomalias IFA em cada mutante associado com a activação de macrófagos infectados. Tais interrogatórios com anticorpos pode fornecer insights sobre os mecanismos que estão por trás do defeito replicação / sobrevivência em um mutante. Por exemplo, a Figura 5 mostra o T. mitocôndria gondii coradas com anticorpo monoclonal 5F4 anti-F1 ATPase subunidade beta (uma gentil oferta de Peter Bradley) 24 horas após a activação de macrófagos infectados com parasitas do tipo selvagem ou mutantes de parasitas. T. gondii foi co-coradas com um anticorpo monoclonal anti-T. gondii. Tipo selvagem T. gondii tem uma única mitocôndria que se estende em torno da circunferência do parasita. Única mitocôndria do parasita em parasitas do tipo selvagem após a ativação dos macrófagos infectados estava intacta em comparação com uma mitocôndria fragmentado em parasitas mutantes. Fragmentação mitocôndrias era evidente não só no degradada / amorfoparasitas, mas também em parasitas que apresentaram morfologia normal, avaliada por microscopia de contraste de fase. Isto sugere que o defeito no mutante parasita pode aumentar a susceptibilidade das mitocôndrias do parasita para acolher mediadores celulares induzidas pela activação de macrófagos.

O modelo actual utiliza uma combinação de IFN-γ e LPS para activar macrófagos infectados. IFN-γ estimula a STAT1 factor de transcrição. LPS, como o TNF-α, estimula o factor de transcrição NF-kB. IFN-γ Conhecido mediadores antimicrobianos -dependentes importantes na imunidade celular autónoma contra T. gondii incluem uma variedade de IFN-γ -dependentes GTPases relacionadas com a imunidade (IRGs, GBPs) e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, além de outros agentes. A fim de determinar se o defeito de cada mutante está especificamente relacionado com a produção de IFN-γ conhecido mediadores -inducible antimicrobianos, os macrófagos derivados da medula óssea são isoladas a partir deiNOS - / -, 91 phox GP - ou mouses específicos IRG / GBP gene suprimido e analisadas quanto à actividade contra os parasitas mutantes - /. A combinação de IFN-γ e LPS para activar macrófagos infectados preferencialmente resulta em mutantes com susceptibilidade aumentada para óxido nítrico em comparação com o tipo selvagem parasitas 28.

A activação de macrófagos infectados pode induzir a diferenciação fase dos parasitas de taquizoítos de bradizoítos que estão contidos em cistos de tecido. Esses cistos são característicos de infecção crônica. Assim, os mutantes de parasitas que são defeituosos para a replicação / sobrevivência após a ativação dos macrófagos infectados também podem estar com defeito para a conversão para cistos durante a infecção in vivo. A fim de avaliar a produção de cisto durante a infecção crónica, os ratos são desafiados intraperitonealmente (ip) com uma dose não letal da estirpe de parasita parental ou o clone mutante. Cistos no cérebro gama em tamanho de menos do que 10 _6;. M de diâmetro superior a 50 mm, como mostrado na Figura 6 Contar o número de pequenas e grandes cistos por IFA mas manter as contagens de separar a fim de determinar se o mutante parasita é prejudicada por cisto produção total ou apenas para o estabelecimento e manutenção de grandes cistos.

Figura 1
Figura 1. Os macrófagos derivados de medula óssea murina naive são permissivos para replicação de T. gondii, mas a ativação com LPS e IFN-γ inibe substancialmente replicação. (A) A vacúolo parasitóforo (PV) do tipo selvagem T. gondii 24 h após a invasão de macrófagos derivados de medula óssea murina naive. (B) Um sistema fotovoltaico de tipo selvagem T. gondii parasitas que consiste em quatro espécies de parasitas por vacúolo 24 horas após a activação dos macrófagos infectados.(C) Um exemplo de um parasita mutante incapaz de se replicar e ainda a um parasita / PV 24 horas após a activação dos macrófagos infectados. (D) Um exemplo de um parasita mutante que aparece degradado dentro de uma amorfo PV 24 h após a activação de macrófagos infectados . A linha superior mostra imagens de fase dos parasitas e a linha inferior mostra imagens fluorescentes usando um anti-soro policlonal contra T. gondii. A barra de escala representa 5 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. replicação do parasita avaliada pelo número de parasitas por PV. As imagens mostram 2, 4, 8, 16 e 32 parasitas por PV em células HFF. Cada imagem é uma imagem mesclada fase tha mostra coloração anticorpo policlonal do parasita em vermelho eo núcleo HFF em azul (DAPI). A barra de escala representa 5 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Os mutantes exibem uma gama de fenótipos a seguir à activação de macrófagos infectados. A coluna do lado esquerdo é uma imagem de fase do parasita em macrófagos, a coluna central é uma imagem fluorescente, utilizando um anticorpo para T. gondii, e na coluna da direita é uma fusão da fase e imagem fluorescente. O parasita é mostrada em verde e no núcleo de macrófagos em azul. A barra de escala representa 5 um. Por favor, clique aqui para ver um maiorversão desta figura.

Figura 4
Figura 4. LAMP1 coloração distingue PVs de phagolysomes-contenham parasitas. Os parasitas são marcadas com um policlonal anti- T. gondii (vermelho) e LAMP1 com o mAb 1D4B (verde). Uma seta marca um PV parasita que se fundiu com os lisossomos. O parasita sem a seta está em um vacúolo parasitóforo (PV), que não se fundiu com os lisossomos. A barra de escala representa 5 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. parasitas do tipo selvagem manter uma mitocôndria intacta, enquanto as mitochondriem é degradada em mutantes do parasita a seguir a activação de macrófagos infectados. Mitocôndria (verde) em parasitas do tipo selvagem (painel superior) em comparação com três diferentes mutante T. gondii parasita em diferentes estágios de degradação (em baixo) três painéis 24 horas após a activação dos macrófagos infectados. A barra de escala representa 5 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. A detecção de cistos de parasitas no cérebro usando dolichos conjugados com FITC biflorus lectina. A parede do cisto marcado com a lectina é mostrado em verde. A barra de escala representa 50 um. Por favor, clique aqui para ver uma versio maiorn desta figura.

Discussion

O protocolo descrito fornece uma abordagem não-tendenciosa que usa a ativação dos macrófagos derivadas da medula óssea de camundongos e genética para a frente para isolar T. gondii mutantes com um defeito na sua capacidade de sobreviver a activação de macrófagos infectados. O fenótipo dos mutantes após a ativação dos macrófagos normalmente cai em uma das duas grandes categorias: 1) Os parasitas parecem intactos, mas não conseguem replicar para além de 1 parasita por PV; 2) Os parasitas parecem degradada e pode estar em espaçosos, PVs amorfos. O facto de os mutantes têm um fenótipo do tipo selvagem como parasitas em macrófagos naive na ausência de activação prova especificamente o protocolo pode ser utilizado para identificar mutantes que são deficientes especificamente na sua capacidade para resistir a activação dos macrófagos. A utilização de macrófagos derivados de medula óssea primária é recomendado contra a linha de células de macrófagos RAW 264.7 para a tela, porque a morfologia dos parasitas, o número de parasitas por vacuole são mais facilmente visualizados em macrófagos derivados da medula óssea.

A tela descrito combinado com a genética para a frente fornece uma ferramenta versátil para dissecar genes do parasita e caminhos em última análise genéticas importantes para a resistência aos mediadores específicos de imunidade autônomo celular. Tais estudos de genética para a frente são importantes para identificar genes de parasitas que podem ser seguidas como uma corda para começar a desvendar caminhos parasitas importantes para resistir mediadores antimicrobianos específicos, tanto in vitro e durante a patogênese. Uma dificuldade anterior com abordagens genéticas para a frente foi a identificação do gene interrompido chave em cada mutante. O cosmídeo de complementação biblioteca em T. gondii tem sido bastante eficaz para a complementação funcional de mutantes de divisão celular. No entanto, o facto de a replicação de parasitas do tipo selvagem são também suprimida por IFN-γ e LPS apenas para uma menor extensão do que os mutantes, torna mais difícil a complementação funcional than para os mutantes de divisão celular. Do genoma inteiro de perfis mutacional para ambos os mutantes de inserção e químicos em T. gondii surgiu recentemente como um produtivo, e mesmo rentável, avenida para identificar os genes responsáveis ​​por fenótipos dos mutantes em frente genética telas 34,36,37,44. Consequentemente, profiling mutacional genoma inteiro utilizando próxima geração seqüenciamento tem reforçado os usos potenciais de mutagênese química de T. gondii em estudos genéticos para a frente para identificar genes importantes para funções específicas. Tal abordagem genética para a frente, tal como descrito no protocolo de corrente são importantes como a maior parte do genoma de T. gondii permanece hipotético com uma maioria dos genes previstos possuindo homologia com outros genes ou domínios funcionais que podem auxiliar na identificação de genes candidatos parasitas importantes para a evasão da resposta imune.

Análise de IFA de placas de 96 poços não é geralmente considerada um rastreio de alto rendimento method. Em nossa experiência, é razoável para uma pessoa para manchar e tela de 10 placas de 96 poços em um dia ou cerca de 960 mutantes. No artigo de Skariah et al., Aproximadamente 8.000 mutantes foram analisados ​​e 14 mutantes independentes foram isolados que foram significativamente prejudicada pela sobrevivência / replicação em ativados, mas não ingênuos macrófagos 28. A sobrevivência prejudicada dos mutantes era predominantemente o resultado de um aumento da susceptibilidade para óxido nítrico. A limitação no método global é principalmente ao nível da obtenção de clones individuais do parasita, em vez do que a triagem por microscopia como o ecrã inicial em placas de 96 poços é qualitativa e razoavelmente rápida. Confirmação do fenótipo dos mutantes identificados no ecrã da placa de 96 poços é seguido no Passo 3 por análise quantitativa e qualitativa utilizando macrófagos em lâminas de câmara e através da adição de um número igual de tipo selvagem ou mutantes parasitas. O uso de outros métodos de rastreio analíticoscomo fluorometria a nível da população total de parasitas, ao invés do nível parasita indivíduo como avaliados por microscopia, são problemáticos no protocolo atual como muitos dos parasitas degradadas manchar com o anticorpo policlonal contra T. gondii como robustamente como parasitas do tipo selvagem com a diferença de o mutante ser mais qualitativa do que quantitativa ao nível da intensidade de fluorescência. Além disso, a dose de IFN-γ e LPS necessários para isolar mutantes com um defeito na resistência à activação de macrófagos infectados resulta em replicação suprimida de parasitas do tipo selvagem, embora a pontos de tempo posteriores. Assim, a medida do número total parasita para a tela genética para a frente, incluindo o uso de parasitas luminescentes é problemática. No entanto, é possível que o protocolo de coloração pode ser eliminada na etapa de rastreio se os clones parentais do parasita utilizados para a mutagénese química ou por inserção expressa um marcador fluorescente ou lucifer constitutivo ou induzívelmarcador ase. O protocolo descrito utilizando IFA e microscopia de rastreio de macrófagos em placas de 96 poços permite o isolamento de mutantes defeituosos para a sobrevivência / replicação em macrófagos activados, mas também perde claramente alguns mutantes potenciais devido à resolução limitada microscópica alcançável utilizando o formato de placas de 96 poços quanto com esta resolução vacúolos inchados amorfas que mancham para antígeno parasita pode ser confundido com parasitas replicando saudáveis ​​dentro de um PV normal. Substituição de 96 poços placas de vidro tampa, em vez de placas de 96 poços com uma superfície óptica, é susceptível de alcançar uma maior resolução durante a tela de macrófagos infectados em placas de 96 poços.

A grande maioria dos mutantes identificados por meio de IFN-γ e LPS no protocolo descrito para ativar macrófagos seguintes invasão do parasita tem um defeito na sua capacidade de se proteger de óxido nítrico 28. A este respeito, embora a tela destina-se a ser não enviesada,pode enriquecer para o isolamento de mutantes com aumento da susceptibilidade do parasita para mediadores antimicrobianos específicos, dependendo das condições de activação, o tipo e espécie de macrófagos e a temporização de invasão do parasita em relação à activação dos macrófagos, que são escolhidos para o ecrã. Assim, a célula imune inata escolhido para a tela e os estímulos de activação são aplicados parâmetros críticos que afetam o tipo de mediadores antimicrobianos para que os mutantes de parasitas resultantes são susceptíveis de ser susceptível. O genótipo do parasita também é um parâmetro crítico como Tipo I genótipos do parasita são relativamente resistentes a imunidade relacionada GTPases (IRGs) induzidas em resposta ao IFN-γ enquanto os genótipos II e III de tipo são mais susceptíveis 26,45,46. No protocolo descrito, os macrófagos são activados após a invasão do parasita. Embora o genótipo de tipo II, Prugnaud estirpe, utilizado na tela descrita é susceptível à acção de GTPases relacionadas com a imunidade, umallowing o parasita para invadir macrófagos permite primeiro a reprodução de parasitas do tipo selvagem antes da indução completa dos IRGs. Além disso, não está claro que IRGs são eficazes contra o parasita se eles são induzidos em macrófagos subsequentes a invasão do parasita e iniciação da replicação.

O protocolo descrito utiliza macrófagos para identificar genes importantes para a resistência do parasita ao IFN-dependente γ mediadores da imunidade celular autónoma, particularmente óxido nítrico. O isolamento de um banco de mutantes de parasitas que partilham uma grande susceptibilidade ao óxido nítrico, assim como um fenotipo compartilhado de fragmentação mitocondrial dependente de óxido nítrico proporciona um único conjunto de ferramentas para a identificação de genes e vias de parasitas importantes para a resistência ao óxido nítrico e para compreensão a acção do óxido nítrico de forma mais ampla contra o T. gondii e outra pathogens.The eucariótica protocolo descrito com pequenas modificações, pode ser utilizada para a frente genética studies para identificar genes importantes para a resistência do parasita às diferentes mediadores da imunidade celular autónoma. Modificações potenciais incluem alterar o tipo de célula hospedeira infectada, os estímulos de activação, ou o momento de activação relativo a invasão do parasita. Por exemplo, a pré-activação de macrófagos murinos com IFN-γ antes da adição dos parasitas que resultaria na activação de GTPases relacionadas com a imunidade. Tal modelo poderia ser utilizado para identificar genes de parasitas em Tipo I genótipos de T. gondii que pode contribuir para a resistência mediada por ROP18 e ROP5 a imunidade GTPases relacionados 24,25. Mediadores da imunidade celular autónoma contra T. gondii em células imunitárias inatas humanos não são tão bem definido como em roedores. Assim, a utilização de monócitos do sangue periférico humano para o rastreio de mutantes de T. químicos gondii pode identificar ambos os genes do parasita importantes para a sobrevivência durante a infecção humana em células do sistema imunológico inato, bem como mecanismos importantes em humanos for resistência antimicrobiana para T. gondii. Genes dos parasitas importantes para a resistência aos mediadores antimicrobianos específicos podem ser identificados através do isolamento de mutantes incapazes de sobreviver à exposição de células hospedeiras infectadas a agentes farmacológicos, tais como as espécies reactivas de oxigénio ou de azoto. Da mesma forma o protocolo pode ser modificado para isolar mutantes de parasitas com susceptibilidade aumentada para 47-49 inflammasome activação ou estimulação de ATP dos receptores purinérgicos macrófagos 50.

Tomados em conjunto, os protocolos de descrever uma abordagem usando a frente genética e células imunitárias inatas para isolar mutantes parasitas importantes para T. resistência gondii ao IFN-γ dependente de imunidade autônomo celular. É importante ressaltar que a abordagem colocar diante é versátil e pode ser facilmente modificado para isolar genes do parasita importante para fugir mediadores antimicrobianos específicos, a sobrevivência do parasita em tipos específicos de células hospedeiras ou resistência a condições de estresse encountevermelho durante a toxoplasmose. Além disso, os genes de parasitas importantes para resistir a activação da célula hospedeira em muitos casos, também podem desempenhar um papel directamente ou indirectamente na produção de cisto in vivo durante a infecção.

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Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab Fitzgerald Industries International 10T19A http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

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