Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren * These authors contributed equally

Immunology and Infection
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Toxoplasma gondii (T. gondii) is een obligaat intracellulaire, protozoaal ziekteverwekker. Het is de verwekker van toxoplasmose, een gevaar voor de gezondheid in immuungecompromitteerde personen. Ook is het modelsysteem voor andere apicomplexa pathogenen die personen zoals Cryptosporidium en Cyclospora infecteren. Toxoplasmose wordt meestal verkregen door het eten van voedsel of water besmet met de bradyzoite of oocyst stadium van de parasiet. Bij inname, deze stadia te zetten naar de tachyzoite stadium van de parasiet die repliceert binnen gastheercellen en verspreidt systemisch. T-cellen, IFN-γ en, in mindere mate, stikstofmonoxide 1-4, zijn belangrijk voor de controle van de infectie, maar zijn niet in staat elimineren van de ziekte, als percentage van tachyzoïeten converteren naar het bradyzoite fase die beschermd in weefsel cysten resulterend in een langlevende chronische infectie. In feite zijn er geen therapieën effectief tegen chronische cyste stage van de ziekte. Ernstige toxoplasmose is meestal te wijten aan de reactivering van persisterende infectie, met de bradyzoite stadium van de parasiet het omzetten terug naar de snel repliceren tachyzoite stadium kenmerk van primaire en acute infectie.

Overleving in gezicht van de aangeboren immuunrespons is belangrijk dat de parasiet voldoende aantal parasieten te bereiken, alsook distale plaatsen te bereiken, de vestiging van chronische infectie mogelijk. T. gondii geëvolueerd strategieën gastheer afweermechanismen die waarschijnlijk bijdragen aan het vermogen tot replicatie en verspreiding vroeg in infectie tegengaan. Ten eerste, T. gondii vormt een unieke PV tijdens parasiet invasie die grotendeels gescheiden van de endocytische en exocytose proces van de gastheercel in vergelijking met andere intracellulaire pathogenen 5-9. Ook, net als alle succesvolle intracellulaire pathogenen T. gondii wijzigt haar gastheercel om een tolerante omgeving te creëren fof groei. Dit omvat herprogrammering gastheercel genexpressie door het veranderen gastheercel transcriptiefactoren waaronder die belangrijk voor het reguleren celactivering 10-15. ROP16 16-19 GRA15 20, GRA16 21 en GRA24 22 zijn allemaal aangetoond belangrijk te zijn bij het ​​reguleren van de transcriptionele respons en signaaltransductie cascades gastheercellen geïnfecteerd met T. gondii. Recente studies met behulp van genetische kruisingen tussen parasiet stammen met verschillende fenotypes zijn uiterst productief op het identificeren van de parasiet genen die parasiet genotype-afhankelijke eigenschappen, waaronder ontduiking van de immuniteit gerelateerde GTPasen (IRGs) 16,19,23-26 grondslag liggen geweest. Bij muizen immuniteits- GTPases (IRGs) cruciaal zijn voor de bestrijding van type II en III genotypen van de parasiet, terwijl het virulente type I genotypen mechanismen hebben ontwikkeld om de murine IRGs onttrekken. Het is echter ook duidelijk dat de parasiet mechanismen geëvolueerd antimicrobiële media onttrekkentors naast de IRGs en sommige van deze mechanismen kunnen worden bewaard in parasiet genotypen 27,28. Daarnaast, zeer weinig bekend over de kritische mediatoren van cel autonome immuniteit tegen T. gondii tijdens menselijk toxoplasmose. Parasite genen betrokken resistentie tegen bemiddelaars van cel- autonome immuniteit kunnen ook belangrijk zijn voor overleving gedurende tachyzoite conversie die ook kan worden veroorzaakt door gastheer immuunreacties bradyzoite. Zo kan stikstofmonoxide hoog niveau parasiet replicatie in geïnfecteerde macrofagen onderdrukken maar kan ook tachyzoite stimuleren omzetting resulteert in cystenproduktie 30-32 bradyzoite.

ToxoDB is een functionele genomische databank voor T. gondii, dat functioneert als een belangrijk hulpmiddel voor het gebied in termen van het verstrekken van sequentie-informatie voor de parasiet genoom en de toegang tot gepubliceerde en ongepubliceerde genomische schaal gegevens inclusief gemeenschap annotaties, gen exp ression en proteomics data 33. Net als vele protozoaire pathogenen, het merendeel van het genoom bestaat hypothetische genen zonder informatie gebaseerd op gen homologie inzicht verschaffen in de mogelijke functies. Dus vooruit genetica is een krachtig instrument om nieuwe parasiet genen belangrijk zijn voor het immuunsysteem fraude, cyste conversie en andere functies van cruciaal belang voor parasiet pathogenese, alsook voor de omrekening tussen verschillende ontwikkelingsstadia te identificeren. Een extra sterke forward genetics is dat het kan worden gebruikt als een relatief niet-voorgespannen benadering van de parasiet ondervragen om de genen die belangrijk zijn voor specifieke taken in pathogenese, waaronder immuun fraude en vorming van cysten zijn. Recente verbeteringen in next generation sequencing voor mutatie-profilering hebben het tot een methode van keuze voor de identificatie van de verantwoordelijke parasiet genen van forward genetics studies met behulp van zowel chemische als insertiemutagenese 34-37 gemaakt.

ntent "> Het is belangrijk om kwetsbaarheden T. gondii die kunnen worden benut om de doeltreffendheid van cel autonome afweermechanismen tegen de parasiet name die ook actief tegen de resistente cyste fase zijn. Tegen dit doel een in vitro muizen kan worden verbeterd macrofaag infectie en activering model ontwikkeld om mutaties in de parasiet die specifiek beïnvloeden T. gondii conditie na activering van geïnfecteerde macrofagen maar niet in naïeve macrofagen herkennen. Deze macrofaag scherm werd toegepast om een bibliotheek van T. gondii insertie mutanten ondervragen om uiteindelijk identificeren T. gondii genen betrokken resistentie tegen stikstofoxide 27,28. De isolatie van een panel van T. gondii mutanten met verminderde weerstand activering van geïnfecteerde macrofagen, in het bijzonder een duidelijke gevoeligheid voor stikstofoxide, bleek het nut van het scherm te identificeren parasiet genen die belangrijk zijn voor de weerstandbemiddelaars van cel- autonome immuniteit dan de resistentiemechanismen beschreven voor muizen IRGs 28. Mutagenese heeft voordelen boven chemische mutagenese in termen van het genereren van een beperkt aantal willekeurige mutaties in elke kloon en parasieten, in theorie, snellere identificatie van de plaats van mutatie. Het identificeren van de genomische plaats van plasmide invoeging in T. gondii insertie mutanten, in de praktijk is verrassenderwijs moeilijk in veel gevallen 37. Het inbrengen van een plasmide in een gen waarschijnlijk ook de functie van een gen te verstoren in tegenstelling tot chemische mutagenese die resulteert gewoonlijk in enkele nucleotide veranderingen. Echter, chemische mutagenese met ofwel N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) of ethylmethaansulfonaat (EMS) een versterkt vermogen om een ​​groter deel van de parasiet genoom analyse bieden, vergeleken mutagenese, zoals maakt meerdere single nucleotide polymorphisms ( geschat op 10 -100) per mutant 34, 38. Bovendien recente vooruitgang geheel genoom profilering heeft het mogelijk gemaakt de volgende generatie sequencing gebruiken om de meest waarschijnlijke kandidaat genen voor de geïdentificeerde fenotype van een gemuteerde parasiet 34,38 identificeren. Ongeacht de mutagenesebenadering bevestiging van de rol van de parasiet gen resistentie tegen macrofaag activatie uiteindelijk vereist gendeletie en complementatie moleculaire Koch's postulaten voldoen.

De mogelijkheid om de functie van een gen door genetische manipulatie van zowel de parasiet en de macrofaag ontleden is belangrijk omdat vele genen geïdentificeerd via forward genetics T. gondii, evenals andere pathogenen, nog steeds sprake als hypothetisch genen met weinig tot geen sequentie homologie met andere eiwitten met bekende functies. Het huidige document wordt een algemene aanpak die kan worden gebruikt voor het identificeren of het verstoorde gen in een mutant is belangrijk voor resistentie tegen bekende ofonbekend mediator van cel autonome immuniteit. De eerste analyse van gastheer antimicrobiële factoren wordt uitgevoerd door het evalueren van de overleving van wild-type en mutante parasieten in macrofagen van wild-type muizen versus die met een specifiek gen deleties in induceerbare stikstofmonoxide synthase (iNOS), gp-91 phox (NADPH oxidase), en specifieke immuniteit gerelateerde GTPasen (IRGs). Dit bepaalt of de geïdentificeerde parasiet genen belangrijk voor resistentie stikstofoxide, reactieve zuurstofintermediairen respectievelijk of een onbekend immuun mechanisme betrokken immuniteit gerelateerde GTPases 28. Activering van geïnfecteerde macrofagen zowel IFN-γ en LPS in het huidige protocol beschreven, resulteert voornamelijk in de isolatie van genen betrokken parasiet resistentie tegen stikstofmonoxide 28. Het gebruik van farmacologische middelen die stikstofoxide induceren in de afwezigheid van activering van macrofagen (stikstofoxide donoren) bevestigden dat de meerderheid van de genen die belangrijk waren voor hergebruikresistentie tegen stikstofoxide in plaats van stikstofmonoxide in overleg met extra mediators in verband met macrofaagactivering 28.

Stap één en twee beschrijven een forward genetics scherm ontworpen om parasiet mutanten te isoleren met een fitness defect na activering van geïnfecteerde beenmerg-afgeleide macrofagen in vitro. Stap één beschrijft een dosistitratie analyse een dosis van IFN-γ en LPS empirisch bepaald moet worden voor macrofaag activatie parasiet replicatie vermindert maar niet volledig replicatie van de wildtype T. remmen gondii ouderlijke stam die wordt gebruikt voor het maken van de bibliotheek van mutanten parasiet. Stap twee beschrijft de voorwaartse genetische screen van de mutante klonen in macrofagen in 96-well platen. Stap drie schetst een aanpak die het fenotype van elke mutant die in het scherm van de 96 putjes en beoordelen of het defect in elke mutant beïnvloedt parasiet overleving, replicatie bevestigenof cyste productie in respons op macrofaag activatie. Stap vier beschrijft het gebruik van beenmerg afgeleide macrofagen van muizen met deleties specifieke antimicrobiële routes naar de immuunmediatoren waarop het parasiet mutant specifiek gevoelig identificeren. Stap vijf schetst een benadering te bepalen of een parasiet mutant ook gecompromitteerd in vivo pathogenese geëvalueerd door cystenproduktie in de hersenen van geïnfecteerde muizen.

Protocol

LET OP: Alle protocollen die het gebruik van dieren te betrekken werden uitgevoerd in overeenstemming met de uiteengezet door de New York Medical College's Animal Care en gebruik Comite richtlijnen en voorschriften.
OPMERKING: Gedetailleerde protocollen voor chemische mutagenese 38 isolatie van parasieten door beperkende verdunning 38, isolatie van muizen beenmerg afgeleide macrofagen 39, groei van T. gondii in menselijke voorhuid fibroblast (HFF) cellen en cyste productie in macrofagen en basic immunofluorescentieanalyse (IFA) 32 wordt verwezen. Voer alle celkweek bij 37 ° C in 5% CO2 in D10 medium (Dulbecco's gemodificeerd High Glucose Eagle Medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine) . Houd alle reagentia steriele hele cel isolaties en celkweek.

1. Dosis Titratie van IFN-γ en LPS aan Bepaal de Concentraties te gebruiken om Infected Macrofagen voor de Forward Genetica scherm te activeren

  1. Cultuur muizen beenmerg afgeleide macrofagen O / N in acht kamer objectglaasjes in een concentratie van 3 x 10 5 cellen / ml in 250 pl D10 media per kamer. Gebruik macrofagen 1-2 weken na isolatie uit beenmerg.
    OPMERKING: Kamer dia's worden gekocht die een groeibevorderende RS wassen hebben.
  2. Gebruik een hemocytometer met wild type parasieten geoogst uit menselijke voorhuid fibroblast (HFF) cellen gekweekt in een T25 weefselkweekkolf tellen. Resuspendeer parasieten bij een concentratie van 5 x 10 5 wildtype parasieten per ml in D10 media. Deze concentratie zal leiden tot een multipliciteit van infectie van ongeveer 1: 1 als macrofagen zal verspreid O / N. Gebruik polystyreen of PET-buizen voor alle manipulaties met parasieten als de parasiet stokken te polypropyleen.
  3. Verwijder de D10 media in de kamer glijbanen en vervangen door 250 ul van deopschorting van wild type parasieten. Voeg voorzichtig de parasiet schorsing voor elke kamer van de dia door te laten stromen naar beneden de binnenkant van elke kamer. Sta niet toe dat macrofagen uit te drogen op enig moment tijdens het protocol.
  4. Cover kamer dia's besmet met parasieten bij de kamer schuif deksel en plaats het in een incubator bij 37 ° C in 5% CO 2 voor 4 uur de tijd te geven de parasiet binnen te vallen en stellen een PV.
  5. Maak verdunningen van LPS en IFN-γ in 1 ml D10 medium in steriele buizen voor doseringstitraties. Voor doseringstitraties houden ofwel LPS of IFN concentratie constant en variëren van de andere stimulus 40.
    1. Bijvoorbeeld, constant houden LPS bij 10 ng LPS per ml en varieert de concentratie van IFN-γ (0, 1 eenheid / ml, 10 eenheden / ml, 100 eenheden / ml, 1,000 eenheden / ml). Houd IFN γ constant op 100 eenheden / ml en varieert de concentratie van LPS (0, 0,1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml). Kort sonicaat LPS voorraad voor 2 min zonderverwarming in een badsonificeerinrichting (niet met een tip sonicator) voorafgaand aan verdunning.
      OPMERKING: Sonicatie wordt aanbevolen om micellen aggregaten gevormd door LPS die niet goed binden aan gastheercellen verstoren.
  6. 4 uur na aanvang van de co-cultuur tussen de parasieten en aanhanger macrofagen in de kamer glijbaan, gooi de D10 media in elke kamer en te vervangen door 300 pl van de geschikte verdunningen van IFN-γ en LPS in D10 media. Neem een ​​controle met alleen D10 media parasieten replicatie evalueren afwezigheid van macrofaag activatie.
  7. Re-cover kamer dia's met de kamer schuif deksel en plaats het in een incubator bij 37 ° C in 5% CO 2 voor 24 tot 30 extra uur.
    OPMERKING: Incubatietijd is afhankelijk van de verdubbelingstijd van het wildtype stam parasiet die kan variëren 6-12 uur, afhankelijk van de parasiet stam. Een tijdstip wordt vooraf gekozen om lysis van naïeve macrofagen parasiet, maar lang genoeg om minstens 3-4 dou mogelijkbling tijden.
  8. Voeg een 2,5% formaldehyde oplossing in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Gooi de media in de kamer glijbaan en te vervangen door 300 ul van de 2,5% formaldehyde-oplossing. Oplossing voor 20 min bij kamertemperatuur.
  9. Rinse slide (s) tweemaal met 300 ul van PBS per kamer. Voor elke spoeling, gooi het PBS in de dia en voeg nieuwe PBS voorzichtig langs de binnenkant van elke dia kamer om te voorkomen dat het verstoren van de macrofagen gehandeld op grond van de dia. Voeg 300 ul van PBS per kamer en plaats deksel op kamer dia naar dia's niet uitdroogt voorafgaand aan kleuring.
    OPMERKING: slides kunnen worden geplaatst bij 4 C gedurende maximaal 3 dagen op dit punt voor de kleurreactie.
  10. Kleuringsprotocol voor T. gondii detectie door immunofluorescentie microscopie (IFA).
    1. Voeg een 0,2% Triton X-100 oplossing in PBS (permeabilisatie buffer). Plaats de oplossing in een buis in een 37 ° C waterbad en kort vortex om de verzekering de Triton X-100 in oplossing gaat. Gooi dePBS in de kamer glijbanen en vervangen door 300 ul van de permeabilisatie buffer. Laat bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
    2. Voeg een oplossing van 10% geit serum in PBS (blokkerende oplossing). Gooi de permeabilisatie buffer in de glijbaan en te vervangen door 300 ul van het blokkeren oplossing per kamer. Laat bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
      OPMERKING: Foetaal kalfsserum kan vervangen geit serum in alle kleuringsprotocollen.
    3. Voor één stap IFA kleuringsprotocol, maak een 1: 1000 verdunning van een fluorescerend geconjugeerd antilichaam tegen T. gondii in blokkeeroplossing. Verwijder het blokkeren oplossing van dia en voeg 150 ul van antilichaam-oplossing per kamer. Plaats het deksel dia op kamer dia om cellen niet uitdrogen. Incubeer gedurende 1 uur bij KT.
      OPMERKING: Antilichaam concentratie moet empirisch worden bepaald afhankelijk van de bron. Antilichaam wordt gekocht rechtstreeks geconjugeerd aan een fluorochroom of geconjugeerd aan een fluorochroom door de gebruiker.
      1. Voor een twee-staps IFA vlekkenprotocol met een geconjugeerd antilichaam tegen T. gondii en een fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam, vlek dia's met 150 ul van ongeconjugeerde primaire antilichaam tegen T. gondii in blokkerende buffer gedurende 1 uur bij KT. Spoel 3x met 300 ul van PBS plus 1% geit serum (wasbuffer).
      2. Voeg 150 ul van fluorescent-geconjugeerd secundair antilichaam specifiek voor de soort van oorsprong voor het primaire antilichaam. Plaats het deksel dia op kamer dia om cellen niet uitdrogen. Incubeer gedurende 1 uur bij KT.
    4. Spoel de objectglaasjes 3x met PBS plus 1% geit serum (wassen buffer). Voor elke spoeling, verwijdert u de oplossing in de kamer dia's door storting op de inhoud en te vervangen door 300 ul van het wassen buffer.
    5. Spoel de objectglaasjes 2x met 300 pi PBS.
    6. Verwijder de kamer uit de kamer glijbaan volgens de instructies van de fabrikant.
    7. Mount glijdt met montage media met DAPI (4'6-diamidino-2-fenylindool, dilactate) en een 22 mm x 50 mm dekglaasje.
  11. Onderzoeken dia's met behulp fase contrast en fluorescentie microscopie. Bepaal het gemiddelde aantal parasieten per vacuole door het onderzoeken van een minimum van 100 PV's per kamer ook. De gekozen dosis IFN-γ en LPS voor het scherm moet voldoende onderdrukken, maar niet voorkomen replicatie van wildtype parasieten (zie figuur 1).

2. Isolatie van Parasite Mutanten met een fitnesscentrum Defect na activering van geïnfecteerde macrofagen

OPMERKING: Een bibliotheek van willekeurige T. gondii mutanten is vereist voor de voorwaartse genetica scherm. Willekeurige mutagenese van T. gondii kan worden uitgevoerd door chemische (ENU / EMS) of insertiemutagenese 27,28,38. Na mutagenese, kloon parasieten door beperkende verdunning en groeien afzonderlijke klonen in 96 putjes bevattende hechtende HFF cellen in een volume van 200 ui D10 media 32,38.Het is essentieel dat 96-well platen voor het screenen van parasieten in macrofagen door microscopie moeten optische bodems microscopisch onderzoek mogelijk. Fase contrast en fluorescentie microscopie screenen gekleurd met 96 putjes vereist een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met fasecontrast 4, 10, 20 of 40x objectief uitgerust lange werkafstand. Een 4X doelstelling is handig voor het zien van de gehele aardig maar betere resolutie van de parasieten wordt bereikt met de 20X objectief.

  1. Breng 50 pl tachyzoite mutanten gekweekt in confluente HFF cellen in 96-putjes weefselkweekplaten in twee repliceren 96 putjes bevattende murine beenmerg afgeleide macrofagen (1-2 weken na isolatie) in 100 pl D10 media.
    Opmerking: Voer het beginscherm in 96-putjesplaten van de parasiet op basis van volume van parasiet cultuur te voorkomen dat het aantal parasieten overgedragen per elk putje te tellen. Zo wordt de microscopie analyse in 2.6 kwalitatief gebaseerd op whether parasieten algemeen gerepliceerd of niet gerepliceerd. Stap 3 beschrijft de aanpak van het fenotype van de mutanten in kamer slides bevestig met gelijke aantallen wilde type of mutant parasieten macrofagen infecteren.
    1. Direct parasieten toe te voegen aan de D10 media reeds in elk putje. Infect twee putjes met wildtype tachyzoiten als een positieve controle voor parasiet replicatie.
  2. Plaats de geïnfecteerde cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO2) gedurende 4 uur tot parasieten voldoende tijd om de cellen binnendringen en creëren hun PV.
  3. Verwijder het afdrukmateriaal uit één plaat door het dumpen van de inhoud van de plaat. Gebruik één polsbeweging naar de media in de plaat te dumpen in een discard bassin met daarin een reinigingsmiddel cide voor de parasieten.
    1. Voeg 100 ul van "macrofaagactivering media" met behulp van een steriele bassin voor de media en een multichannel pipet. Met de optimale concentratie van LPS en IFN-γ bepaald uit stap 1 van de macrophage activering media. Zo ook materiaal uit de dubbele controle bord en te vervangen door 100 ul van D10 media.
  4. Plaats de geïnfecteerde cellen in een incubator (37 ° C en 5% CO2) gedurende nog 24-30 uur.
  5. Kleuringsprotocol 96-well platen voor IFA.
    1. Gooi de media in de plaat en vervangen door 100 ui 2,5% formaldehyde in PBS. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik een steriele bassin voor de formaldehyde en een multichannel pipet.
    2. Gooi de formaldehyde oplossing in de plaat en voeg 100 ul PBS om de formaldehyde van de plaat te spoelen.
    3. Gooi de oplossing in de plaat en voeg 100 pl permeabilisatie buffer (PBS met 0,2% Triton X-100) aan elk putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Gooi de oplossing in de plaat en voeg 100 ul van blokkeeroplossing (PBS met 10% geit serum) aan elk putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Gooi de oplossing in de plaat. Voeg 50 ul / putje van een fluorescent-geconjugeerde anti- T. gondii antilichaam verdund 1: 1000 in PBS plus 1% geit serum. Incubeer gedurende 1 uur bij KT met de plaatafdekking op en op een rocker.
      1. U kunt ook gebruik maken van een niet-geconjugeerd primair antilichaam tegen T. gondii gevolgd door kleuring met fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam zoals beschreven in 1.10.3.1.
    6. Gooi het antilichaam oplossing in de plaat en vervangen door 100 ul / putje PBS + 1% geit serum. Voer deze spoeling 3x gevolgd door 2 extra spoelgangen met PBS alleen. Verlaat 200 ul van PBS in elk putje en plaats de deksel op de plaat met 96 om te voorkomen dat de putten uit drogen.
      OPMERKING: De plaat met het deksel op kan worden verpakt in parafilm en geplaatst bij 4 ° C gedurende maximaal 3 dagen vóór analyse door microscopie.
  6. Onderzoek cellen onder een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop met een 20-40X doel. Selecteer mutanten die repliceren in de na &# 239; ve macrofaag plaat maar vooral niet te repliceren dan een parasiet / vacuole in "geactiveerde macrofagen" of dat amorf of afgebroken in "geactiveerde macrofagen" verschijnen.
    Opmerking: Het aantal wildtype parasieten per vacuole is afhankelijk van de dosis van IFN-γ en LPS gebruikt, maar idealiter ongeveer 4 parasieten per vacuole; een getal die de groei onderdrukken, maar niet volledige remming van replicatie van het activeringsstimulus weerspiegelt.

3. Evalueer de mutanten te bepalen of het defect wordt op het niveau van Parasite Survival of Replication Na activering van geïnfecteerde macrofagen

  1. Transfer gekozen parasiet mutanten van 96-well platen (volledige inhoud van het putje) aan T25s die HFF cellen en laat replicatie.
  2. Cultuur beenmerg afgeleide macrofagen O / N 8 kamer objectglaasjes in een concentratie van 3 x 10 5 cellen / ml in 250 pl D10 media. Bereid een dia om te vergelijken parasite replicatie in naïeve macrofagen en een extra dia om te vergelijken parasiet replicatie na activering van geïnfecteerde macrofagen.
  3. Oogst tachyzoite parasieten en te tellen in een hemocytometer. Voeg 5 × 10 4 T. gondii parasieten naar een kamer putje met macrofagen in D10 media en cultuur voor 4 uur. Inclusief een putje met wildtype ouderlijke parasieten als controle. Te enten een identieke repliceren dia met dezelfde parasiet kloon die niet activering media zullen ontvangen om replicatie van parasieten in naïeve macrofagen bewaken.
  4. Gooi D10 media uit 1 van de repliceren kamer glijbanen en te vervangen door 250 ul van "activering media". Gooi D10 media uit de andere repliceren kamer glijbaan en te vervangen door 250 ul van D10 media. Incubeer zowel "geactiveerd" en "naïeve" macrofaag dia met de kamer schuif op bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende een additionale 24-30 uur.
  5. Fix, doorlaatbaar en blok glijbanen voor IFA kleuring en analyse van parasieten zoals beschreven in stap 1. Voer IFA kleuring met de kamers intact.
    1. Co-vlek cellen met een antilichaam aan membraangebonden 1 (LAMP1) of Lysotracker en antilichaam lysosomale T. gondii te beoordelen of activatie van geïnfecteerde macrofagen activeert fusie van de mutant PV met lysosomen (figuur 4).
    2. Gebruik antilichamen tegen specifieke vakken / organellen binnen de parasiet / PV voor het kleuren door IFA aan veranderingen in de parasiet mutant die evident zijn begin volgende macrofaagactivering 28 identificeren.
      OPMERKING: Dergelijke wijzigingen kunnen inzicht geven in het mechanisme dat de gebrekkige survival / replicatie van de mutant volgende macrofaagactivering ten grondslag ligt.
  6. Onderzoeken dia's met behulp van een 100X fase olie objectief en fluorescentie microscopie.
    1. Evalueer parasiet replicatie door bepaling van deaantal parasieten per PV in 100 willekeurige vacuolen. Voer tenminste 2 tellingen van 100 vacuolen elk voor statistische analyse.
    2. Evalueer algemene parasiet morfologie met behulp van zowel fluorescentie analyse als fasecontrastmicroscopie. Bekijk parasieten onder fase 100x objectief. Gezonde parasieten hebben parasieten strak omsloten door een nauwsluitende parasitophorous vacuole. Parasieten die amorfe ruime vacuolen met fase dichte velgen of amorf parasieten hebben suggereren parasiet dood in plaats van alleen een defect in replicatie (figuren 1 en 3).

4. Evalueer of de gevoeligheid van Mutant Parasieten aan Activering van geïnfecteerde macrofagen wordt geassocieerd met bekende anti-microbiële Mediators

  1. Isoleer beenmerg-afgeleide macrofagen van wild-type C57 / BL6 muizen, iNOS - / -, Gp91-phox - / - of Irgm1 / Irgm3 - / - muizen 32.
  2. Cultuur respectieve beenmerg afgeleide macmacrofagen van muizen O / N 8 kamer objectglaasjes in een concentratie van 3 x 10 5 cellen / ml in 250 pl D10 media.
  3. Doorgaan met parasiet uitdaging, IFA vlekken, en de analyse zoals beschreven in stap 3.
  4. Bepaal of het vermogen van de mutant parasieten te overleven en repliceren na activering van geïnfecteerde macrofagen wordt hersteld in afwezigheid van reactieve zuurstof of stikstof species of specifieke immuniteit gerelateerde GTPases 28.
  5. Gebruik farmacologische middelen, zoals stikstofoxide donoren te beoordelen of specifieke anti-microbiële mediators zich volstaan ​​om mutant parasieten in HFF cellen of macrofagen naïeve aantasting of ze werken alleen samen met andere mediatoren van macrofagen activeren 28.

5. Evalueer of het defect in de Mutant Parasite Compromissen chronische infectie

  1. Isoleer tachyzoiten van wild-type, mutant of gerichte gen verwijderd parasieten geteeld in T25s containing HFF cellen. Parasieten moeten vers worden gelyseerd van HFF culturen.
  2. Telling parasieten met een hemocytometer. Resuspendeer parasieten in Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) in een concentratie per ml geschikt voor een subletale dosis van de parasiet geleverd in 200 pl door intraperitoneale (IP) injectie.
  3. Gebruik een 1 ml tuberculinespuit en 25 G naald om parasieten met een 200 ul volume intraperitoneaal (IP) te injecteren. De dosis is afhankelijk van de wild type stam van de parasiet en de muis genotype.
    OPMERKING: Type I genotypen van de parasiet zijn dodelijk voor muizen tijdens de acute fase van de infectie ongeacht parasiet dosis en zijn niet geschikt voor studies van chronische infectie in afwezigheid van chemotherapie voor T. gondii om parasiet replicatie te onderdrukken.
  4. Dertig dagen na parasiet uitdaging, offeren muizen door inademing van CO 2 uit een onder druk tank in een rustige kamer (een standaard formaat muis kooi mag niet meer dan 5 m bevattenice) gevolgd door cervicale dislocatie.
  5. Isoleer de hersenen van de muis volgens vaste procedures 41-43.
    1. Leg de muis op de voorzijde. Spuit de kop met 70% ethanol om het gebied te steriliseren.
    2. Gebruik een scherpe schaar door de hersenstam te snijden. Gebruik Prepareerschaar een ondiepe snede lateraal rond de rechter en de linker kant van de schedel vanaf de basis van de hersenstam maken. Gebruik een tang om voorzichtig te schillen terug de schedel naar de hersenen bloot te leggen.
    3. Til de hersenen en plaats een schaar tussen de hersenen en de basis van de schedel naar de olfactorische zenuw naar de hersenen vrij te snijden. Til de hersenen met een steriel pincet of een spatel en plaats in een bacteriologische Petri plaat met 10 ml steriel PBS.
  6. Snijd de hersenen helft met een steriele scalpel door het midden tussen de rechter en linker hemisferen.
  7. Voeg de helft van de hersenen om een ​​kleine mortier met 1 ml PBS. Met de vijzel en stamper ommaak een fijne weefsel schorsing van de hersenen dat kan passeren door een wijde boring 20-200 ul pipet tip.
    OPMERKING: De andere helft van de hersenen moet 2.5% formaldehyde worden vastgesteld gedurende 1 uur of weefselsecties nodig voor histopathologie.
  8. Breng 100 ui van de hersenen lysaat in een 1,7 ml microcentrifugebuis. Voeg 1 ml 2,5% formaldehyde in PBS in de buis bevattende de hersenen lysaat naar de hersenen suspensie vast voor kleuring. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  9. Centrifugeer het lysaat bij 8000 xg gedurende 5 minuten in een microcentrifuge en de bovenstaande vloeistof voorzichtig verwijderen.
  10. Voeg 1 ml permeabilisatie / blokkeerbuffer aan het lysaat (10% geit serum, 0,2% Triton X-100 in PBS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min.
  11. Centrifuge lysaat bij 8000 xg gedurende 5 minuten en verwijder supernatant.
  12. Voeg 200 ul FITC-geconjugeerd Dolichos biflorus agglutin (DBA). Gebruik een 1: 100 verdunning van het lectine in PBS plus 10% geit serum. Voorzichtig resuspendeer de lysaat door pipetteren. Broedengedurende 1 uur bij KT.
    OPMERKING: DBA is een ligand dat bindt aan CST1 de parasiet cystewand.
  13. Centrifuge lysaat bij 8000 xg gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant. Voeg 1 ml PBS aan de pellet. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Herhaal PBS wassen 3x. Verwijder de bovenstaande vloeistof na de laatste wassing met een pipet.
  14. Gebruik een wijde boring 20-200 ul pipettip tot het opstellen van 5 pl van de gebrandschilderde hersenen lysate en leg ze op een microscoop dia. Monteer de dia met een 25 x 25 mm dekglas op een natte mount te maken van de hersenen lysaat. Voeg 3 repliceren objectglaasjes met 5 gl van elk lysaat hersenen.
  15. Tel het aantal cysten per elke 5 pl aliquot van fluorescentie microscopie met een 10X objectief (figuur 6).
    OPMERKING: Sommige cysten zijn groot (8 of meer parasieten ongeveer) terwijl sommige zijn erg klein (1-2 parasieten per cyste). Count totaal aantal cysten per elke dia maar documentnummer van grote versus aantal kleine cysten.
  16. Voeg het aantal cysten detecteerd in drie verschillende 5 ul aliquots en vermenigvuldigen met de totale verdunningsfactor x 2 (slechts de helft van de hersenen werd een lysaat) het schatten van het totale aantal cysten per brein.

Representative Results

Toxoplasma gondii repliceert vrij in naïeve macrofagen en een verdubbelingstijd tussen 6-12 uur afhankelijk van de stam van de parasiet. Figuur 1 toont representatieve parasieten in naïeve versus geactiveerde beenmerg afgeleide macrofagen. Figuur 2 toont de algemene morfologie van parasieten in HFF gastheercellen aan 2, 4, 8, 16 en 32 parasieten / PV. In het huidige protocol, wordt de parasiet mag naïef macrofagen binnen te vallen en stellen een ontluikende parasitophorous vacuole (PV) voorafgaand aan de levering van een krachtige activering stimulus, LPS en IFN, om de geïnfecteerde macrofagen. In dit model wordt de replicatie van wild type parasieten vertraagd, maar parasiet replicatie gaat nog steeds voor ongeveer 24 uur gedurende welke tijd de macrofagen worden geleidelijk meer bedreven in het remmen parasiet replicatie. Het scherm is ontworpen als een gemodificeerde mededingingsmodel tussen de tijd die potente macrofaag eenctivation functie van de tijd gedurende welke het wildtype parasiet of parasiet mutant kan blijven repliceren de PV. De eerste stap in het scherm om een ​​dosis LPS kiezen en IFN- γ te gebruiken voor het activeren van geïnfecteerde macrofagen. De dosis wordt empirisch bepaald door het evalueren parasiet replicatie in macrofagen geactiveerd met ofwel een constante dosis IFN γ in combinatie met een reeks van concentraties LPS of een constante dosis LPS met een bereik van IFN-concentraties (stap 1). De dosis van de immuunstimulerende moet worden gecontroleerd op de ouderlijke wildtype parasieten gebruikt voor het maken van de parasiet mutanten door chemische of insertie mutagenese. Idealiter zou de dosis LPS en IFN γ zal parasiet replicatie toestaan ​​gemiddeld 2-8 parasieten per PV 24-30 uur na activering in vergelijking met 8-16 parasieten per PV in naïeve macrofagen (figuren 1 en 2).

Zodra de juiste concentratie van LPS en IFN ^7; is bepaald, worden de mutanten vertoond in 96-well optische bodem weefselkweekplaten. De optische bodem in de platen is belangrijk omdat onregelmatigheden in de kunststof die wordt gebruikt voor traditionele weefselkweekplaten maakt het moeilijk om de juiste oplossing te bereiken voor de parasieten door fase contrast en fluorescentie microscopie screenen. Fase contrast en fluorescentie microscopie van de 96-well platen vereist ook een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met fasecontrast 4, 10, 20 of 40x objectief uitgerust lange werkafstand. Mutanten worden vertoond in replicaplaten met muizen beenmerg-afgeleide macrofagen. Na challenge met parasiet mutanten, worden geïnfecteerde macrofagen in de putjes van een plaat geactiveerd met LPS en IFN-γ, terwijl de andere plaat met besmette macrofagen is gekweekt in slechts D10 media. De platen worden geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24-30 uur na toevoeging van LPS en IFN-γ. Na incubatie cellen fivaste-, gekleurd voor parasieten en IFA geanalyseerd met zowel fluorescentie en fasecontrast microscopie. Mutanten worden geselecteerd die normaal parasiet aantallen en replicatie in naïeve macrofagen, maar minder parasieten of kleinere vacuolen met minder parasieten in geïnfecteerde macrofagen die worden geactiveerd hebben. Zodra mutanten worden geselecteerd moeten ze worden opnieuw gescreend in kamer slides (stap 3) in naïeve en geactiveerde macrofagen in twee onafhankelijke experimenten om de analyse van parasiet morfologie bij hogere vergrotingen (100X objectieve en olie) mogelijk te maken en om te bevestigen dat ze hebben normale replicatie in naïeve macrofagen maar een defect in de replicatie / overleving na macrofaag activatie.

De fenotypen van de mutanten met defecten in resistentie activering van geïnfecteerde macrofagen meestal vallen in twee brede categorieën: parasieten die morfologisch intact lijken, maar niet kunnen repliceren dan één parasiet per PV; en parasieten die lijken te Degraded en kunnen ook in ruime amorfe PV (figuren 1 en 3). De morfologie en ultrastructuur van de parasiet en PV wordt het best bekeken op dia's met behulp van een 100x objectief en olie en door fasecontrastmicroscopie gecombineerd met fluorescentie analyse. Kleuring van parasieten IFA met een antilichaam tegen lysosomale membraan geassocieerde eiwit-1 (LAMP1) bruikbaar om te bepalen of het defect in de mutant is gekoppeld aan een onvermogen van de PV fusie met lysosomen te voorkomen. In figuur 4 is een parasiet binnen fagolysosoom (LAMP1 positief) versus een parasiet die een PV die grotendeels gescheiden van de endocytische systeem van de gastheercel (LAMP1 negatief). De fagolysosoom is duidelijk door een dichte rand van LAMP1 spannen rond de hele parasiet. Daarentegen, een PV vaak lysosoom organellen in de buurt maar geen doorlopende rand van LAMP1 kleuring rond zijn omtrek. Het gebruik van antilichamen tegen gedefinieerde structuren / organellen binnen tHij parasiet en / of PV zijn nuttig in de follow-up IFA studies naar anomalieën in elke mutant geassocieerd met de activatie van geïnfecteerde macrofagen identificeren. Dergelijke ondervragingen met antilichamen kunnen inzicht verschaffen in de mechanismen die de replicatie / survival defect ten grondslag liggen in een mutant. Bijvoorbeeld, Figuur 5 toont de T. gondii mitochondrion gekleurd met monoklonaal antilichaam 5F4 anti-F1 ATPase beta subunit (een soort geschenk van Peter Bradley) 24 uur na activatie van macrofagen geïnfecteerd met wild type parasieten of parasiet mutanten. T. gondii werd co-gekleurd met een monoklonaal anti- T. gondii antilichaam. Wild-type T. gondii is een mitochondrion dat zich uitstrekt rond de omtrek van de parasiet. De parasiet's eigen mitochondrion in wild type parasieten na activering van geïnfecteerde macrofagen intact was in vergelijking met een gefragmenteerd mitochondrion in gemuteerde parasieten. Mitochondriën fragmentatie was duidelijk niet alleen in gedegradeerde / amorfeparasieten maar ook parasieten normale morfologie weergegeven zoals geëvalueerd door fasecontrast microscopie. Dit suggereert dat het defect in de parasiet mutant de gevoeligheid van de parasiet mitochondrion toenemen naar cel mediatoren geïnduceerd door macrofaagactivering gastheer.

Het huidige model gebruikt een combinatie van IFN-γ en LPS geïnfecteerde macrofagen activeren. IFN-γ stimuleert de transcriptiefactor STAT 1. LPS, zoals TNF-α, stimuleert de transcriptiefactor NF-KB. Bekend IFN-γ -afhankelijk antimicrobiële bemiddelaars belangrijk in cel autonome immuniteit tegen T. gondii omvatten een reeks van IFN-γ afhankelijke immuniteit gerelateerde GTPases (IRGs, Gbps) en reactieve stikstof en zuurstof species naast andere middelen. Om om te bepalen of het defect in elke mutant specifiek aan productie van IFN-γ bekende induceerbare antimicrobiële mediatoren zijn beenmerg-afgeleide macrofagen geïsoleerd uitiNOS - / -, gp 91 phOx - ​​/ - of specifieke IRG / GBP gen geschrapt muizen en getest op activiteit tegen mutant parasieten. De combinatie van IFN-γ en LPS geïnfecteerde macrofagen activeren voorkeur resulteert in mutanten met verhoogde gevoeligheid voor stikstofoxide vergelijking met wildtype parasieten 28.

Activering van geïnfecteerde macrofagen fase differentiatie van de parasieten van tachyzoiten tot bradyzoïten die zijn opgenomen in weefsel cysten te induceren. Dergelijke cysten zijn kenmerkend chronische infectie. Zo kan parasiet mutanten die defect voor replicatie / survival zijn na activering van geïnfecteerde macrofagen ook defect voor de conversie naar cysten tijdens de in vivo infectie. Om cystenproduktie evalueren tijdens chronische infectie worden muizen intraperitoneaal (ip) uitgedaagd met een niet-letale dosis van de ouderlijke stam parasiet of de mutant kloon. Cysten in de hersenen variëren in grootte van minder dan 10 _6,. M diameter groter dan 50 urn zoals getoond in figuur 6 Tel het aantal grote en kleine cysten IFA maar houdt de tellingen gescheiden om te bepalen of de parasiet mutant inbreuk totale cystenproduktie of voor vestiging en het onderhoud van grote cysten.

Figuur 1
Figuur 1. Naïve muizen beenmerg-afgeleide macrofagen zijn facultatief voor de replicatie van T. gondii maar activering met IFN-γ en LPS hoofdzaak remt replicatie. (A) A parasitophorous vacuole (PV) van wildtype T. gondii 24 uur na de invasie van naïeve muizen beenmerg-afgeleide macrofagen. (B) Een PV van wild type T. gondii parasieten bestaande uit vier parasieten per vacuole 24 uur na activatie van geïnfecteerde macrofagen.(C) Een voorbeeld van een mutante parasiet niet repliceren en nog steeds een parasiet / PV 24 uur na activatie van geïnfecteerde macrofagen. (D) Een voorbeeld van een mutante parasiet die is laag in een amorfe PV 24 uur na activatie van geïnfecteerde macrofagen . De bovenste rij toont fase beelden van de parasieten en de onderste rij toont tl-beelden met behulp van een polyklonale anti-serum tegen T. gondii. De schaal balk vertegenwoordigt 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Parasite replicatie geëvalueerd door het aantal parasieten per PV. De foto's tonen 2, 4, 8, 16 en 32 parasieten per PV HFF cellen. Elke foto is een samengevoegde afbeelding fase thbij toont polyklonaal antilichaam kleuring van de parasiet in rood en het HFF kern in blauw (DAPI). De schaal balk vertegenwoordigt 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. mutanten vertonen een reeks fenotypen na activering van geïnfecteerde macrofagen. De kolom aan de linkerkant is een fasebeeld van de parasiet in macrofagen, de middelste kolom een fluorescent beeld met een antilichaam tegen T. gondii, en de rechterkant is een samenvoeging van de fase en tl-imago. De parasiet wordt getoond in groen en de macrofaag kern in het blauw. De schaal balk vertegenwoordigt 5 micrometer. Klik hier voor een grotere weergaveversie van deze figuur.

Figuur 4
Figuur 4. LAMP1 vlekken onderscheidt PV's uit phagolysomes bevattende parasieten. Parasieten zijn gekleurd met een polyklonale anti-T. gondii antilichaam (rood) en LAMP1 met de mAb 1D4B (groen). Een pijl markeert een parasiet PV die is versmolten met lysosomen. De parasiet zonder de pijl is in een parasitophorous vacuole (PV) die niet heeft versmolten met lysosomen. De schaal balk vertegenwoordigt 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. De wilde soort parasieten houden een intacte mitochondrion terwijl de mitochondriop wordt afgebroken in parasiet mutanten na activering van geïnfecteerde macrofagen. Mitochond (groen) in wild type parasieten (bovenste paneel) in vergelijking met drie verschillende mutant T. gondii parasieten in verschillende stadia van afbraak (onderste drie panelen) 24 uur na activatie van geïnfecteerde macrofagen. De schaal balk vertegenwoordigt 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. Detectie van parasitaire cysten in de hersenen met behulp van FITC-geconjugeerd Dolichos biflorus lectine. De cystewand gelabeld met het lectine wordt getoond in groen. De schaal balk vertegenwoordigt 50 micrometer. Klik hier om een grotere Versio bekijkenn van deze figuur.

Discussion

De beschreven protocol verschaft een onbevooroordeelde benadering dat activatie van muizen beenmerg afgeleide macrofagen en forward genetics isoleren T. gebruikt gondii mutanten met een defect in hun vermogen om activering van geïnfecteerde macrofagen overleven. Het fenotype van de mutanten volgende macrofaag activatie valt gewoonlijk in een van twee categorieën: 1) De parasieten verschijnen intact maar niet repliceren dan 1 parasiet per PV; 2) De parasieten verschijnen afgebroken en kan in ruime, amorfe PV's. Het feit dat de mutanten een fenotype als wildtype parasieten in naïeve macrofagen in de afwezigheid van activering bewijst het protocol kan specifiek worden gebruikt om mutanten die specifiek in hun vermogen om activering van macrofagen weerstaan ​​worden aangetast identificeren. Het gebruik van primaire beenmerg-afgeleide macrofagen wordt aanbevolen ten opzichte van de RAW 264,7 macrofaagcellijn voor het scherm, omdat de morfologie van de parasieten en parasiet aantal per vacuole kunnen gemakkelijker gevisualiseerd in beenmerg afgeleide macrofagen.

De beschreven scherm gecombineerd met forward genetics biedt een veelzijdige tool om parasiet genen en uiteindelijk genetische wegen belangrijk voor de weerstand tegen specifieke bemiddelaars van cel autonome immuniteit ontleden. Dergelijke forward genetica studies zijn belangrijk parasiet genen die kunnen worden gevolgd als een tekenreeks beginnen ontrafelen parasiet wegen belangrijk weerstaan ​​specifieke anti-microbiële mediators zowel in vitro als tijdens pathogenese identificeren. Een eerdere moeite met vooruit genetische benaderingen was de identificatie van de belangrijkste gen verstoord in elke mutant. Cosmide bibliotheek complementatie T. gondii is zeer effectief voor functionele complementatie van celdeling mutanten geweest. Het feit dat de replicatie van wildtype parasieten ook worden onderdrukt door IFN-γ en LPS slechts in mindere mate dan de mutanten maakt functionele complementatie moeilijker than voor celdeling mutanten. Volledige genoomanalyse mutatie profilering voor zowel chemische als insertie mutanten T. gondii is onlangs naar voren gekomen als een productieve, en zelfs kosteneffectief, laan naar de genen die verantwoordelijk zijn voor de fenotypes van mutanten in forward genetics schermen 34,36,37,44 identificeren. Bijgevolg hele genoom mutatie profileren met behulp van next generation sequencing heeft verbeterd de gebruiksmogelijkheden van chemische mutagenese van T. gondii in voorwaartse genetische studies genen betrokken specifieke functies te identificeren. Een dergelijke voorwaartse genetische benadering zoals beschreven in het huidige protocol is belangrijk aangezien de meeste van de genoom van T. gondii blijft hypothetisch met een meerderheid van de voorspelde genen die geen homologie met andere genen of functionele domeinen die kunnen bijdragen tot de identificatie van kandidaat parasiet genen betrokken immune fraude.

IFA analyse van 96 putjes wordt niet algemeen als high throughput screening voldaanhod. In onze ervaring is het redelijk voor een persoon om vlekken en het scherm 10 96 putjes in een dag of ongeveer 960 mutanten. In het artikel van Skariah et al., Werden ongeveer 8.000 mutanten geanalyseerd en 14 onafhankelijke mutanten werden geïsoleerd die significant waren aangetast om te overleven / replicatie in geactiveerde maar niet naïef macrofagen 28. De verminderde overleving van de mutanten was voornamelijk het gevolg van de toegenomen gevoeligheid voor stikstofmonoxide. De beperking van de algemene methode vooral op het niveau verkrijgen enkelvoudige klonen van de parasiet in plaats screening door microscopie het beginscherm in 96 putjesplaten is kwalitatief en redelijk snel. Bevestiging van het fenotype van de mutanten die in het scherm van de plaat met 96 putjes gevolgd wordt bij stap 3 door kwantitatieve en kwalitatieve analyse met macrofagen in kamer glijbanen en door toevoeging evenveel wildtype of mutant parasieten. Het gebruik van andere analytische screeningmethodenzoals fluorometrie Voor de hele hoogte van parasieten, in plaats van de afzonderlijke parasiet niveau geëvalueerd door microscopie, problematisch in het huidige protocol zoveel van het gedegradeerde parasieten kleuren met het polyklonale antilichaam tegen T. gondii zo krachtig als wildtype parasieten met het verschil in de mutant die meer kwalitatief dan kwantitatief op het niveau van fluorescentie intensiteit. Ook de dosis van IFN-γ en LPS vereist om mutanten te isoleren met een defect in weerstand activering van geïnfecteerde macrofagen leidt tot onderdrukte replicatie van wildtype parasieten zij op latere tijdstippen. Daarom meten van de totale parasiet nummer van de forward genetics scherm zoals het gebruik van luminescerende parasieten problematisch. Het is echter mogelijk de kleuring protocol kan worden geëlimineerd in de screeningsstap Indien de ouderlijke parasiet klonen voor chemische of mutagenese geuit constitutief of induceerbaar fluorescente of luciferase marker. De beschreven protocol met IFA en microscopie screenen van macrofagen in 96 putjesplaten maakt isolatie van mutanten te overleven / replicatie in geactiveerde macrofagen maar ook duidelijk mist aantal potentiële mutanten vanwege de beperkte microscopische resolutie haalbaar met de 96-well plaat formaat bij deze resolutie amorfe gezwollen vacuolen die vlek voor parasiet antigen aangezien voor gezonde repliceren parasieten binnen een normale PV kan zijn. Substitutie van 96 putdeksel glasplaten, in plaats van 96 well platen met een optisch oppervlak, waarschijnlijk grotere resolutie in het scherm van geïnfecteerde macrofagen in 96 putjesplaten bereiken.

De overgrote meerderheid van de geïdentificeerde mutanten met IFN-γ en LPS in het protocol beschreven macrofagen na parasiet invasie activeert een defect in hun vermogen om zichzelf te beschermen tegen stikstofmonoxide 28. In dit opzicht, het scherm hoewel beoogde onbevooroordeelde zijn,kan verrijken de isolatie van parasiet mutanten met verhoogde gevoeligheid voor specifieke anti-microbiële mediators afhankelijk van de activering, het soort en species van macrofagen en de timing van parasiet invasie opzichte van macrofaag activatie die gekozen is voor het scherm. Dus de aangeboren immuuncellen gekozen voor het scherm en de immuunstimulerende toegepaste kritische parameters die invloed hebben op de aard van antimicrobiële mediatoren waarin het resulterende parasiet mutanten waarschijnlijk gevoelig zijn. Het genotype van de parasiet is een kritische parameter Type I genotypen van de parasiet zijn relatief resistent tegen immuniteits- GTPases (IRGs) geïnduceerd in respons op IFN-γ terwijl het Type II en III genotypen zijn gevoeliger 26,45,46. In het beschreven protocol worden macrofagen geactiveerd na parasiet invasie. Hoewel type II genotype, Prugnaud stam, die in de beschreven scherm is gevoelig voor de inwerking van immuniteitsfuncties GTPases, eenllowing de parasiet om macrofagen binnenvallen eerste maakt replicatie van wild type parasieten voordat volledige inductie van de IRGs. Ook is het niet duidelijk dat IRGs effectief tegen parasieten als ze geïnduceerd in macrofagen na invasie en initiatie van replicatie parasiet.

De beschreven protocol gebruikt macrofagen parasiet genen betrokken resistentie tegen IFN-γ-afhankelijke mediatoren cel autonoom immuniteit, met name stikstofoxide identificeren. De isolatie van een pool van parasiet mutanten die een duidelijke gevoeligheid voor stikstofoxide en een gemeenschappelijk fenotype van stikstofoxide-afhankelijke mitochondriale fragmentatie delen een unieke set tools parasieten genen en wegen belangrijk resistentieproteïnen stikstofoxide en begrip de werking van stikstofmonoxide breder tegen T. gondii en andere eukaryote pathogens.The beschreven protocol met kleine aanpassingen kan worden gebruikt voor voorwaartse genetische studies om parasiet genen belangrijk zijn voor resistentie tegen verschillende mediatoren van cel autonome immuniteit te identificeren. Mogelijke modificaties omvatten het veranderen van het type gastheercel geïnfecteerd, de immuunstimulerende of het tijdstip van activering ten opzichte invasie parasiet. Bijvoorbeeld, pre-activatie van murine macrofagen met IFN-γ vóór toevoeging van parasieten leiden tot activering van immuniteitsfuncties GTPases. Een dergelijk model kan worden gebruikt om parasieten genen in type I gegeven genotypen van T. gondii die kunnen bijdragen tot de resistentie gemedieerd door ROP18 en ROP5 aan immuniteits- GTPases 24,25. Mediatoren van cel autonome immuniteit tegen T. gondii in menselijke aangeboren immuuncellen niet zo goed gedefinieerd als in knaagdieren. Zo is het gebruik van humane perifeer bloed monocyten chemische mutanten van T. screenen gondii misschien tijdens menselijke besmetting in het aangeboren immuunsysteem cellen, evenals mechanismen belangrijk bij mensen fo zowel parasiet genen die belangrijk zijn voor de overleving te identificerenr antimicrobiële resistentie tegen T. gondii. Parasite genen betrokken resistentie tegen specifieke antimicrobiële mediatoren kunnen worden geïdentificeerd door het isoleren van mutanten kan belichting van geïnfecteerde gastheercellen farmacologische agentia overleven zoals reactieve zuurstof of stikstof species. Ook het protocol kan worden aangepast om parasiet mutanten te isoleren die gevoeliger zijn voor activatie 47-49 ATP stimulatie van de macrofaag purinerge receptoren 50 inflammasoom.

Samen genomen, de protocollen beschrijven een aanpak met behulp voren genetica en aangeboren immuunsysteem cellen om parasiet mutanten belangrijk voor T. isoleren gondii weerstand tegen IFN-γ-afhankelijke cel-autonome immuniteit. Belangrijk is dat de aanpak stak is veelzijdig en kan gemakkelijk worden aangepast om parasiet genen isoleren van belang voor het ontwijken specifieke antimicrobiële mediators, parasiet overleven in specifieke soorten gastheercellen of weerstand tegen voorwaarden encounte benadrukkenrood tijdens toxoplasmose. Bovendien parasiet genen betrokken weerstaan ​​gastheercel activatie in veel gevallen kan een rol direct of indirect spelen cystenproduktie in vivo tijdens infectie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Hyclone SH3008101 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29101&productId=3255471&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone FBS Thermo SH3091003 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=11737973&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone DPBS Thermo SH3002802  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2434305&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone L-glutamine Thermo SH3003401  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3311957&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone Pen strep Thermo SV30010  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6&catalogId=29104&matchedCat
No=SV30010&fromSearch=1&
searchKey=SV30010&highlightPro
ductsItemsFlag=Y&endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings= 0.0&xrefEvent=1407777949003_0
&searchType=PROD&hasPromo=0
Hyclone Hanks BSS Thermo SH3003002 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3064595&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
LPS LIST biologicals 201 http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-γ Pepro Tech Inc 50-813-664 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494&catalogId=29
104&matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1&searchKey=murine+ifn+pepro+tech&highlightProductsItemsFlag
=Y&endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778210608_
12&searchType=PROD&hasPromo
=0
Chamber slides Thermo 177402 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2164545&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well optical plates Thermo 165306 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3010670&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well tissue culture plates Fisher 353072 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3158736&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Tissue culture flast T25 Fisher 156367 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67&catalogId=29104&matchedCat
No=12565351&fromSearch=1&
searchKey=156367&highlightProdu
ctsItemsFlag=Y&endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778974800_
0&searchType=PROD&hasPromo
=0
Ted Pella EM grade formaldehyde Ted Pella 18505 http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712
Triton X-100 Fisher BP151 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3425922&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Alexa 488 - protein conjugation kit Life Technologies A20181 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235
goat serum MP Biomedicals ICN19135680 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2133236&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&crossRefData
=ICN19135680=2&searchType
=PROD&hasPromo=0
Vectashield mounting media Vector Labs H1200 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428
FITC-conjugated dolichos Vector Labs FL-1031 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
Antibody to LAMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
LysoTracker Life Technologies L-7526 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product
C57BL6 mice Jackson Laboratories 664 http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
gp91 phox knock out mice Jackson Labaoratories 2365 http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html
iNOS knock out mice Jackson Laboratories 2609 http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html
sodium nitroprusside ACROS Organics AC21164-0250  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2627727&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
DETA NONOate ACROS Organics AC32865-0250 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2252389&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab Fitzgerald Industries International 10T19A http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185, (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162, (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156, (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190, (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159, (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125, (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249, (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84, (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178, (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483 (2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172, (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182, (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589 (2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100, (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. e1002236 (2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285, (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445, (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9, (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208, (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13, (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210, (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14 (2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15, (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784 (2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182, (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63, (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188, (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62, (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61, (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091 (2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354 (2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335, (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180 (2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175, (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807 (2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147, (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8, (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348 (2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171, (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8, (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358 (2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927 (2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82, (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5, (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184, (12), 7040-7046 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics