Forward Genetics vinduene ved hjelp Makrofager å identifisere * These authors contributed equally

Immunology and Infection
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Toxoplasma gondii (T. gondii) er en obligat intracellulær, protozo- patogen. Det er den utløsende agent for toksoplasmose, en helsefare i immunsupprimerte individer. Det er også modellsystemet for andre apicomplexan patogener som infiserer mennesker inkludert Cryptosporidium og Cyclospora. Toksoplasmose er oftest ervervet gjennom inntak av mat eller vann som er forurenset med bradyzoite eller oocyst stadiet av parasitten. Ved inntak, disse stadiene konvertere til tachyzoite stadiet av parasitten som reproduserer innenfor vertsceller og formidler systemisk. T-celler, IFN-γ og, i mindre grad, nitrogenoksid 1-4, er viktige for kontroll av infeksjon, men er ikke i stand til å eliminere sykdommen, som en andel av tachyzoites konvertere til bradyzoite trinn som er beskyttet innenfor vev cyster resulterer i en langlivet kronisk infeksjon. Faktisk er det ingen therapeutics effektiv mot kronisk cyste stage av sykdommen. Alvorlig toksoplasmose er som oftest på grunn av reaktivering av vedvarende infeksjon, med bradyzoite stadium av parasitten omdannelse tilbake til den hurtig replikerende tachyzoite stadium karakteristisk for primær og akutt infeksjon.

Tidlig overlevelse i ansiktet på den medfødte immunrespons er viktig for å tillate at parasitten å nå tilstrekkelig parasitt tall, samt for å nå fjerntliggende områder, for å muliggjøre etablering av kronisk infeksjon. T. gondii har utviklet seg strategier for å motvirke vertsforsvarsmekanismer som sannsynligvis bidrar til dens evne til å replikere og spre tidlig i infeksjonen. Først, T. gondii danner et unikt PV under parasitt invasjon som i stor grad er adskilt fra de endocytiske og exocytic prosesser av vertscellen i forhold til andre intracellulære patogener 5-9. Også, i likhet med all vellykket intracellulære patogener T. gondii modifiserer sin vertscelle for å skape en ettergivende miljø feller vekst. Dette inkluderer omprogrammering vertscelle genuttrykk ved å endre vertscelle transkripsjonsfaktorer, inkludert de viktige for å regulere celleaktivering 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, GRA16 21 og GRA24 22 har alle blitt vist å være viktige i reguleringen av transkripsjonen respons og cellesignaleringskaskader vertsceller infisert med T. gondii. Nyere studier ved hjelp av genetiske krysser mellom parasitt stammer med forskjellige fenotyper har vært svært produktiv i å identifisere parasitt gener som ligger til grunn parasitt genotype avhengige egenskaper inkludert unndragelse av immunitetsrelaterte GTPases (IRGs) 16,19,23-26. Hos mus, immunitetsrelaterte GTPases (IRGs) er kritisk for kontroll av type II og III genotyper av parasitten mens svært virulente type jeg genotyper har utviklet mekanismer for å unngå de murine IRGs. Men det er også klart at parasitten har utviklet mekanismer for å unngå antimikrobiell mediatorer i tillegg til de IRGs og at noen av disse mekanismene kan bevares på tvers parasitt genotyper 27,28. I tillegg, er meget lite kjent om de kritiske mediatorer av celleautonome immunitet mot T. gondii under human toksoplasmose. Parasitt gener viktige for motstand mot meklere av celle autonome immunitet kan også være viktig for å overleve under tachyzoite å bradyzoite konvertering som også kan utløses av vertsimmunresponser. For eksempel kan nitrogenoksid ved høye nivåer undertrykke parasittreplikasjon i infiserte makrofager, men det kan også stimulere tachyzoite å bradyzoite omdannelse resulterer i produksjon cyste 30-32.

ToxoDB er en funksjonell genomisk database for T. gondii som fungerer som en kritisk ressurs for feltet i form av å gi sekvensinformasjon for parasitten genomet og tilgang til publiserte og upubliserte genomisk skala data inkludert samfunnet merknader, genet exp ression og proteomikk data 33. I likhet med mange protozo patogener, flertallet av genomet består av hypotetiske gener med ingen informasjon er tilgjengelig basert på genet homologi for å gi innsikt i deres potensielle funksjoner. Således er termin genetikk et kraftig verktøy for å identifisere nye parasitt gener som er viktige for immunsvik, cyste omdannelse og andre funksjoner kritiske for parasitt patogenesen samt for omdannelse mellom forskjellige utviklingsstadier. En ekstra styrke av termin genetikk er at den kan brukes som en relativt ikke-partisk tilnærming å avhøre parasitten som til de gener som er viktige for spesifikke oppgaver i patogenesen, inkludert immununndragelser og cyste formasjon. Nylige forbedringer i neste generasjons sekvensering for mutasjons profilering har gjort det en metode for valg for å identifisere de ansvarlige parasitt gener fra termin genetiske studier ved hjelp av både kjemisk og insertional mutagenese 34-37.

ntent "> Det er viktig å identifisere sårbarheter i T. gondii som kan utnyttes for å forbedre effektiviteten av cellestyrte immunmekanismer mot parasitten spesielt de som kan også være aktiv mot resistente cyste scenen. Mot dette målet, en in vitro murine makrofag-infeksjon og aktivering modell ble utviklet for å identifisere mutasjoner i parasitten som spesifikt svekker T. gondii kondisjon etter aktivering av infiserte makrofager, men ikke i naive makrofager. Denne makrofag-skjermen ble brukt til å avhøre et bibliotek av T. gondii insertional mutanter for å til slutt T. gondii identifisere gener som er viktige for resistens mot nitrogenoksid 27,28. Isoleringen av et panel av T. gondii-mutanter med redusert motstand mot aktivering av infiserte makrofager, spesielt en markert sensitivitet overfor nitrogenoksid, viste anvendeligheten av skjermen for å identifisere parasitt gener viktige for motstandtil meklere av celle autonome immunitet annet enn resistensmekanismer som er beskrevet for de murine IRGs 28. Insertional mutagenese har fordeler fremfor kjemisk mutagenese når det gjelder å generere et begrenset antall tilfeldige mutasjoner i hver parasitt klone og i teorien enklere identifisering av stedet for mutasjon. Men å identifisere den genomiske sete av plasmid innsetting i T. gondii insertional mutanter, i praksis, har vært overraskende vanskelig i mange tilfeller 37. Innsetting av et plasmid inn i et gen er også sannsynlig å forstyrre funksjonen av et gen i motsetning til kjemisk mutagenese, som vanligvis resulterer i enkle nukleotid-endringer. Imidlertid kjemisk mutagenese med enten N-etyl-N-nitrosourea (ENU) eller etylmetansulfonat (EMS) kan gi en øket evne til å analysere en større del av parasitten genomet, sammenlignet med insertional mutagenese, som det skaper flere enkelt-nukleotid polymorfismer ( anslått til 10 -100) per mutant 34, 38. Dessuten har nylige fremskritt i hele genomet profilering gjort det mulig å bruke neste generasjon sekvensering for å identifisere de mest sannsynlige kandidat gener som er ansvarlige for den identifiserte fenotypen av en mutert parasitt 34,38. Uavhengig av mutagenese tilnærming, bekreftelse av rollen til parasitten genet i motstand mot makrofagaktivering slutt krever genet delesjon og komplemente å oppfylle molekyl Koch postulater.

Evnen til å dissekere funksjonen av et gen ved genetisk manipulering av både parasitten og makrofag er viktig da mange av de gener som er identifisert via termingenetikk T. gondii, så vel som andre patogener, er fortsatt karakterisert som hypotetiske gener med liten eller ingen sekvenshomologi med andre proteiner med kjente funksjoner. Den nåværende papir skisserer en generell metode som kan brukes til å identifisere hvorvidt forstyrret genet i en mutant som er viktig for motstanden til en kjent ellerukjent formidler av celle autonome immunitet. Den første analyse av verts antimikrobielle faktorer utføres ved evaluering av overlevelsen av villtype og mutante parasitter i makrofager fra mus av villtype versus de med spesielle gendelesjoner i induserbar nitrogenoksid syntase (iNOS), gp-91 phox (NADPH oksidase), og spesifikk immunitet relatert GTPases (IRGs). Dette vil avgjøre om de identifiserte parasitt gener er viktige for motstand mot nitrogenoksid, reaktive oksygenmellom eller immunitetsrelaterte GTPases 28 henholdsvis eller hvis en ukjent immunsystemet er involvert. Aktivering av infiserte makrofager med både IFN-γ og LPS, som er beskrevet i den aktuelle protokoll, resulterer primært i isolering av parasitt-gener som er viktige for motstand mot nitrogenoksid 28. Bruken av farmakologiske midler som induserer nitrogenoksid i fravær av makrofagaktivering (nitrogenoksiddonorer) bekreftet at flertallet av de gener som er identifisert var viktig for gjenmotstandsevne til nitrogenoksid i stedet for nitrogenoksid i konsert med flere meglere tilknyttet makrofagaktivering 28.

Trinn en og to beskrive en fremover genetikk skjermen er utformet for å isolere parasitt mutanter med trenings defekt som følge av aktivering av infiserte benmarg-avledede makrofager in vitro. Trinn man beskriver en dosetitrering analyse for å empirisk å bestemme en dose av IFN-γ og LPS til bruk for makrofagaktivering som reduserer parasittreplikasjon, men ikke fullt inhiberer replikasjon av villtype T. gondii foreldrestamme som brukes for opprettelse av biblioteket av parasitt-mutanter. Trinn to beskriver videre genetisk skjermen av de mutante kloner i makrofager i 96-brønners plater. Trinn tre skisserer en tilnærming for å bekrefte fenotype av hver mutant identifisert i skjermen av de 96 brønners plater og å vurdere om feilen i hver mutant påvirker parasitt overlevelse, replikering,eller cyste produksjon som respons makrofagaktivering. Trinn fire beskriver bruk av benmarg-avledede makrofager fra mus med delesjoner i bestemte antimikrobielle veier å identifisere de immunmediatorer som parasitten mutanten er spesielt utsatt. Trinn fem skisserer en tilnærming for å avgjøre om en parasitt mutant er også kompromittert for in vivo patogenesen som vurderes av cyste produksjon i hjernen hos infiserte mus.

Protocol

MERK: Alle protokoller som innebærer bruk av dyr ble utført i samsvar med de retningslinjer og bestemmelser fastsatt av New York Medical College Animal Care og bruk komité.
Merk: Detaljert protokoller for kjemisk mutagenese 38, isolering av parasitter ved begrensende fortynning 38, isolering av muse-benmargsmakrofager avledet 39, veksten av T. gondii i menneskelig forhuden fibroblast (HFF) celler og cyste produksjon i makrofager og grunnleggende immunofluorescensanalyse (IFA) 32 er referert. Utføre alle cellekultur ved 37 ° C i 5% CO2 i D10 medium (Dulbeccos modifiserte høy glukose Eagle-medium supplert med 10% føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin) . Hold alle reagenser sterile gjennom celle isoleringer og cellekultur.

1. Dosetitrering av IFN-γ og LPS å bestemme konsentrasjonerasjon å bruke til å aktivere Infiserte Makrofager for Forward Genetics Screen

  1. Kultur murine benmargavledede makrofager O / N i åtte kammer glassplater i en konsentrasjon på 3 × 10 5 celler / ml i 250 mL av D10 media per kammer. Bruk makrofager ett til to uker etter isolasjon fra benmarg.
    MERK: Chamber lysbilder er kjøpt som har en vekst styrke RS vaske.
  2. Bruke et hemocytometer for å telle villtype parasitter høstet fra human forhud fibroblast (HFF) celler dyrket i en T25 vevskulturkolbe. Resuspender parasitter i en konsentrasjon på 5 x 10 5 villtype parasitter pr ml i D10 medier. Denne konsentrasjonen vil resultere i en multiplisitet for infeksjon på ca. 1: 1 som makrofager, vil ha proliferert O / N. Bruke isopor eller PET-rør for alle manipulasjoner med parasitter som parasitten pinner til polypropylen.
  3. Ta av D10 media i kammeret lysbilder og erstatte med 250 mL avsuspensjon av vill-type-parasitter. Tilsett parasitten suspensjon til hvert kammer av sleiden ved å tillate den å strømme ned den indre flate av hvert kammer. Ikke la makrofager til å tørke ut på noe tidspunkt under protokollen.
  4. Cover kammer lysbilder infisert med parasitter med kammeret skyvedekselet og plasser i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO 2 for 4 timer for å gi tid for parasitten å invadere og etablere en PV.
  5. Gjør fortynninger av LPS og IFN-γ i en ml D10 media i sterile rør for dose titreringer. For dose titreringer beholde enten LPS eller IFN-konsentrasjonen konstant og variere den andre stimulus 40.
    1. Holder for eksempel LPS konstant på 10 ng LPS pr ml og variere konsentrasjonen av IFN-γ (0, 1 enhet / ml, 10 enheter / ml, 100 enheter / ml, 1000 enheter / ml). Holde IFN γ konstant ved 100 enheter / ml og variere konsentrasjonen av LPS (0, 0,1 ng / ml 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml). Kort sonikere LPS lager for 2 min utenoppvarming i et bad sonicator (ikke med en spiss sonicator) før fortynning.
      MERK: Sonikering anbefales å forstyrre micell aggregater dannet av LPS som kanskje ikke binder riktig vertsceller.
  6. 4 timer etter oppstart av co-kultur mellom parasitter og tilhenger makrofager i kammeret lysbilde, kast D10 media i hvert kammer og erstatte den med 300 ul de riktige fortynninger av IFN-γ og LPS i D10 media. Omfatte en styre med bare D10 media for å evaluere parasitt-replikasjon i fravær av makrofagaktivering.
  7. Re-cover kammer lysbilder med kammeret skyvedekselet og plasser i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO 2 for 24-30 ekstra hr.
    MERK: Inkubasjonstid avhenger av doblingstiden for villtype-parasitt-stamme som kan ligge i området 6-12 timer, avhengig av parasitt-stamme. En tids punkt er valgt før parasitt lyse av naive makrofager, men lenge nok til at minst 3-4 doubling ganger.
  8. Gjør en 2,5% formaldehydoppløsning i Dulbeccos fosfatbufret saltvann (PBS). Forkaste media i kammeret lysbilde og erstatte med 300 mL av 2,5% formaldehyd løsning. Fix i 20 min ved RT.
  9. Skyll lysbilde (s) to ganger med 300 mL PBS per kammer. For hver skylling, forkaste PBS i raset og legge ny PBS forsiktig nedover innsiden av hver sleidekammeret å unngå å forstyrre makrofagene festet til raset. Legg 300 mL PBS per kammer og plass dekselet på kammeret lysbilde for å hindre lysbilder tørker ut før farging.
    MERK: Slides kan plasseres ved 4 C i opp til tre dager på dette punktet før farging.
  10. Farging protokoll for T. gondii deteksjon av immunfluorescens mikroskopi (IFA).
    1. Lag en 0,2% Triton X-100-løsning i PBS (permeabilization buffer). Plassere løsningen i et rør i et 37 ° C vannbad og kort vortex den for å sikre at Triton X-100 går i oppløsning. KastPBS i kammeret lysbilder og erstatte med 300 mL av permeabilization buffer. La ved RT i 30 min.
    2. Foreta en løsning av 10% geiteserum i PBS (blokkeringsløsning). Kast permeabilization buffer i raset og erstatte med 300 mL av blokkering løsning per kammer. La ved RT i 30 min.
      MERK: Føtalt kalveserum kan erstattes for geiteserum i alle fargingsprotokoller.
    3. For en ett-trinns IFA farging protokoll, blir en 1: 1000 fortynning av et fluorescensmerket antistoff til T. gondii i blokkering løsning. Fjern blokkering løsning fra lysbilde og legge 150 mL av antistoff løsning per kammer. Sett dekslet lysbilde på kammeret lysbilde for å hindre cellene i å tørke ut. Inkuber i 1 time ved RT.
      MERK: Antistoff-konsentrasjon må bestemmes empirisk, avhengig av kilden. Antistoff blir kjøpt direkte konjugert til et fluorokrom eller konjugert til et fluorokrom av brukeren.
      1. For en to-trinns IFA fargingprotokollen med en konjugert antistoff til T. gondii og en fluorescently konjugert sekundært antistoff, beis lysbilder med 150 mL av ukonjugert primære antistoff mot T. gondii i blokkeringsbuffer i 1 time ved RT. Skyll 3x med 300 ul av PBS pluss 1% geiteserum (vaskebuffer).
      2. Legg 150 ul fluorescently-konjugert sekundært antistoff spesifikke for arten opprinnelsesland, for det primære antistoffet. Sett dekslet lysbilde på kammeret lysbilde for å hindre cellene i å tørke ut. Inkuber i 1 time ved RT.
    4. Skyll lysbilder 3x med PBS pluss 1% geiteserum (vaskebuffer). For hver skylling, fjern løsning i kammeret lysbilder ved å dumpe ut innholdet og erstatte med 300 mL vaskebuffer.
    5. Skyll lysbilder 2x med 300 mL PBS.
    6. Fjern kammeret fra kammeret lysbildet som i henhold til produsentens instruksjoner.
    7. Mount lysbilder med montering medier som inneholder DAPI (4'6-diamidino-2-fenylindol, dilactate) og en 22 mm x 50 mm dekkglass.
  11. Undersøke lysbilder ved hjelp av fasekontrast og fluorescens mikroskopi. Bestem gjennomsnittlig antall parasitter per vakuole ved å undersøke minimum 100 musikkvideoer per kammer også. Den valgte dose av IFN-γ og LPS for skjermen må være tilstrekkelig til å undertrykke, men ikke forhindre replikasjon av villtype parasitter (se figur 1).

2. Isolering av Parasite Mutants med en Fitness Defekt Etter Aktivering av Infected Makrofager

MERK: Et bibliotek av tilfeldig T. mutanter gondii er nødvendig for forover genetikk skjermen. Tilfeldig mutagenese av T. gondii kan utføres ved kjemisk (ENU / EMS) eller insertional mutagenese 27,28,38. Etter mutagenese, klone parasitter ved begrensende fortynning og vokse individuelle kloner i 96-brønners plater inneholdende festede HFF-celler i et volum på 200 ul D10 medier 32,38.Det er avgjørende at 96-brønners plater for screening av parasitter i makrofager ved mikroskopi har optiske bunner å aktivere mikroskopisk screening. Fasekontrast og fluorescensmikroskopi for screening farget 96-brønners plater krever en invertert fluorescensmikroskop med fasekontrast 4, 10, 20 eller 40X objektiv utstyrt for lange arbeidsavstander. En 4X mål er nyttig for å se hele brønnen, men bedre oppløsning av de parasitter oppnås med 20x objektiv.

  1. Overfør 50 ul tachyzoite mutanter dyrkes i konfluente HFF-celler i 96-brønners vevskulturplater i to kopiere 96-brønners plater inneholdende murin benmarg-avledede makrofager (1-2 uker etter isolering) i 100 ul av D10 medier.
    MERK: Utfør det første skjermbildet i 96-brønners plater av parasitten basert på volumet av parasitt kultur for å unngå å måtte telle antall parasitter som overføres per hver brønn. Således er mikros analysen i 2,6 basert kvalitativt på whether parasitter har generelt replikeres eller ikke kopieres. Trinn 3 beskriver tilnærming for å bekrefte fenotype av mutantene i kammer lysbilder ved hjelp av like mange villtype eller mutante parasitter å infisere makrofagene.
    1. Direkte legge parasitter til D10 media allerede i hver brønn. Infisere to brønner med villtype tachyzoites som en positiv kontroll for parasitt replikering.
  2. Plasser de infiserte cellene i en inkubator (37 ° C og 5% CO2) i 4 timer for å tillate parasitter tid til å invadere cellene og skape deres PV.
  3. Fjern mediet fra en plate ved dumping av innholdet i platen. Bruke et enkelt flip av håndleddet for å dumpe media i platen til et utkast bassenget inneholder et vaskemiddel cidal for parasitter.
    1. Tilsett 100 ul "makrofagaktivering medier" ved hjelp av en steril servant for media og en multikanalspipette. Bruke den optimale konsentrasjon av LPS og IFN-γ bestemt fra trinn 1 for macrophage aktivering media. Tilsvar fjerne media fra duplikat kontroll plate og erstatte med 100 ul av D10 media.
  4. Plasser de infiserte cellene i en inkubator (37 ° C og 5% CO2) i ytterligere 24-30 timer.
  5. Farging protokoll for 96-brønners plater for IFA.
    1. Forkaste media i platen og erstatte med 100 mL av 2,5% formaldehyd i PBS. Inkuber i 20 min ved RT. Bruk en steril bassenget for formaldehyd og en multikanalspipette.
    2. Kast formaldehydoppløsning i platen og tilsett 100 ul PBS for å skylle formaldehyd fra platen.
    3. Kast løsningen i platen og tilsett 100 ul av permeabilization buffer (PBS med 0,2% Triton X-100) til hver brønn. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
    4. Kast løsningen i platen og tilsett 100 ul blokkeringsløsning (PBS med 10% geiteserum) i hver brønn. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
    5. Kast oppløsningen i psent. Tilsett 50 ul / brønn av en fluorescent-konjugert anti-T. gondii-antistoff fortynnet 1: 1000 i PBS pluss 1% geiteserum. Inkuber i 1 time ved RT med platedeksel og på en vugge.
      1. Alternativt kan du bruke en ukonjugert primære antistoff mot T. gondii, etterfulgt av farging med et fluorescensmerket-konjugert sekundært antistoff som beskrevet i 1.10.3.1.
    6. Kast antistoffoppløsning i platen og erstatt med 100 ul / brønn med PBS pluss 1% geiteserum. Utfør denne skylle 3x etterfulgt av to ekstra skyllinger med PBS alene. La 200 mL PBS i hver brønn og sett på dekselet på 96 brønners plate for å hindre brønnene tørker.
      MERK: Platen med dekselet på kan være pakket inn i parafilm og plassert ved 4 ° C i opp til 3 dager før analysen ved mikroskopi.
  6. Undersøke cellene under en invertert fluorescerende mikroskop ved hjelp av en 20-40X objektiv. Velg mutanter som kopierer i na &# 239; ve makrofag plate, men hovedsakelig ikke klarer å gjenskape utover en parasitt / vakuole i "aktiverte makrofager" eller som synes amorf eller degradert i "aktiverte makrofager".
    MERK: Antallet villtype parasitter per vakuole vil avhenge av dosen av IFN-γ og LPS brukes, men ideelt sett er rundt 4 parasitter per vakuole; et tall som reflekterer veksthemming, men ikke fullstendig inhibering av replikasjon av aktiverings stimulus.

3. Vurdere Mutants ut om Defekten er på nivå med Parasite Survival eller Replication Etter Aktivering av Infected Makrofager

  1. Transfer valgt parasitt mutanter fra 96-brønners plater (innholdet i hele godt) til T25s inneholder HFF celler og tillate replikering.
  2. Kultur benmargmakrofager avledet O / N i åtte kammer glassplater ved en konsentrasjon på 3 x 10 5 celler / ml i 250 ul av D10 medier. Forberede ett lysbilde å sammenligne parasite replikering i naive makrofager og en ekstra lysbilde å sammenligne parasitt replikering etter aktivering av infiserte makrofager.
  3. Slakte tachyzoite parasitter og telle i en hemocytometer. Tilsett 5 × 10 4 T. gondii parasitter til et kammer brønn som inneholder makrofager i D10 media og kultur i 4 timer. Inkluder en brønn med villtype foreldre parasitter som en kontroll. Vaksinere en identisk gjengivelse lysbilde med samme parasitt klone som ikke vil motta aktivering media for å overvåke replikering av parasitter i naive makrofager.
  4. Kast D10 media fra en av de replikere kammer lysbilder og erstatte med 250 mL av "aktivering media". Kast D10 media fra den andre replikere kammer lysbilde og erstatte med 250 mL av D10 media. Inkuber både "aktivert" og "naive" makrofag lysbilde med kammeret glidedekselet ved 37 ° C og 5% CO2 i en additional 24-30 hr.
  5. Fix, permeabilize, og blokk lysbilder for IFA farging og analyse av parasitter som beskrevet i trinn 1. Utfør IFA farging med kamrene intakte.
    1. Co-flekk celler med et antistoff til lysosomal membranassosiert 1 (LAMP1) eller Lysotracker og antistoff til T. gondii å vurdere om aktivering av infiserte makrofager utløser fusjon av de muterte musikkvideoer med lysosomer (figur 4).
    2. Bruk antistoffer mot spesifikke avdelinger / organeller innen parasitten / PV for farging av IFA for å identifisere endringer i parasitten mutant som er tydelig tidlig følgende makrofagaktivering 28.
      MERK: Slike endringer kan gi innsikt i den mekanismen som ligger bak den mangel overlevelse / replikering av mutant følgende makrofagaktivering.
  6. Undersøke lysbilder ved hjelp av en 100X fase olje objektiv og fluorescens mikroskopi.
    1. Evaluere parasitt-replikasjon ved å bestemmeantall parasitter per PV i 100 tilfeldige vakuoler. Utføre minst to tellinger av 100 vakuoler hver for statistisk analyse.
    2. Evaluere generell parasitt morfologi bruke både fluorescens analyse samt fase kontrast mikroskopi. Se parasitter henhold 100x objektiv fase. Sunn parasitter har parasitter tett inni en tettsittende parasitophorous vakuole. Parasitter som har amorfe store vakuoler med fase tette felger eller amorfe parasitter foreslår parasitt døden snarere enn bare en defekt i replikering (figur 1 og 3).

4. Vurdere om Følsomhet av Mutant Parasitter til Aktivering av Infected Makrofager er assosiert med kjente anti-mikrobielle Meklere

  1. Isolere benmargavledede makrofager fra villtype C57 / BL6 mus, iNOS- - / -, gp91-phox - / - eller Irgm1 / Irgm3 - / - mus 32.
  2. Kultur respektive benmarg avledet macrophages O / N 8 kammer glassplater ved en konsentrasjon på 3 x 10 5 celler / ml i 250 ul av D10 medier.
  3. Fortsett med parasitt utfordring, IFA flekker, og analyse som beskrevet i trinn 3.
  4. Bestemme om evnen til de mutante parasitter å overleve og replikere etter aktivering av infiserte makrofager er gjenopprettet i fravær av reaktive oksygen- eller nitrogenforbindelser eller spesifikk immunitet relatert GTPases 28.
  5. Bruke farmakologiske midler, som for eksempel nitrogenoksid-donorer, for å vurdere om spesifikke anti-mikrobielle meklere er tilstrekkelig i seg selv til å svekke mutant parasitter i HFF celler eller naive makrofager eller om de bare opptre sammen med andre formidlere av makrofager aktivering 28.

5. Vurder om Defekten i Mutant Parasite Kompromisser kronisk infeksjon

  1. Isolere tachyzoites fra villtype, mutant eller målrettede genet slettet parasitter vokst i T25s containing HFF celler. Parasitter må være ferskt lysert fra HFF kulturer.
  2. Telle parasitter ved hjelp av en hemocytometer. Resuspender parasitter i Hanks balanserte saltløsning (HBSS) ved en konsentrasjon per ml passende for en sub-letal dose av parasitten levert i 200 ul ved intraperitoneal (IP) injeksjon.
  3. Bruke en 1 ml tuberkulinsprøyte og 25 G nål for å injisere parasitter med en 200 ul volum intraperitonealt (IP). Dosen avhenger av den ville type stamme av parasitten og musen genotype.
    MERK: Type I genotyper av parasitten er dødelig for mus i den akutte fasen av infeksjon uavhengig av parasitt dose og er ikke egnet for studier av kronisk infeksjon i fravær av kjemoterapi for T. gondii å undertrykke parasitt replikering.
  4. Tredve dager etter utfordring parasitt, ofre mus ved inhalering av CO2 fra en trykktank i en urørte kammer (en standard størrelse mus bur kan inneholde ikke mer enn 5 mis) etterfulgt av cervikal dislokasjon.
  5. Isoler hjernen fra musen med etablerte prosedyrer 41-43.
    1. Lå musen på sin forside. Spray hodet med 70% etanol for å sterilisere området.
    2. Bruk skarp saks til å skjære gjennom hjernestammen. Bruk disseksjonssaksen å lage et grunt kutt lateralt rundt den høyre og den venstre siden av hodeskallen starter fra bunnen av hjernestammen. Bruk pinsett til forsiktig skrelle tilbake skallen å avsløre hjernen.
    3. Forsiktig løft hjernen og plassere saks mellom hjernen og skallebasis til å kutte luktenerven å frigjøre hjernen. Løft ut hjernen med steril pinsett eller en slikkepott, og plasser i en bakteriologisk Petri plate som inneholder 10 ml steril PBS.
  6. Skjær hjernen i to med en steril skalpell gjennom sentrum mellom høyre og venstre hjernehalvdelen.
  7. Tilsett halvparten av hjernen til et lite mørtel inneholdende 1 ml PBS. Bruk av morter og pistill tilforeta en fin vev suspensjon av hjernen som kan passere gjennom et bredt boring 20-200 ul pipette.
    NB: Den andre halvparten av hjernen skal være løst i 2,5% formaldehyd i 1 time hvis vevssnitt er nødvendig for histopatologi.
  8. Plasser 100 ul av hjernen lysat i et 1,7 ml mikrosentrifugerør. Tilsett 1 ml av 2,5% formaldehyd i PBS i røret inneholdende hjernen lysat å fiksere suspensjon hjernen for farging. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
  9. Sentrifugere lysatet ved 8000 xg i 5 min i en mikrosentrifuge og nøye kast supernatanten.
  10. Tilsett 1 ml permeabilization / blokkeringsbuffer til lysatet (10% geiteserum, 0,2% Triton X-100 i PBS). Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
  11. Sentrifuger lysat ved 8000 xg i 5 minutter og fjerne supernatanten.
  12. Tilsett 200 mL av FITC-konjugert Dolichos biflorus agglutin (DBA). Bruk av en 1: 100 fortynning av lektin i PBS plus 10% geiteserum. Forsiktig resuspender lysatet ved pipettering. Inkuberi 1 time ved RT.
    MERK: DBA er en ligand som binder seg til CST1 på parasitten cyste veggen.
  13. Sentrifuger lysat ved 8000 xg i 5 min, og supernatanten kastes. Tilsett 1 ml PBS til pelleten. Inkuber ved RT i 5 min. Gjenta PBS vask 3x. Fjern supernatanten etter den siste vaskingen ved hjelp av en pipette.
  14. Bruke et bredt boring 20-200 mL pipette til å trekke opp 5 mL av farget hjernen lysatet og sted på et objektglass. Montere lysbilde med en 25 x 25 mm dekkglass for å lage en våt mount av hjernen lysatet. Gjør 3 replikatplater lysbilder ved hjelp av 5 mL av hjernen lysat hver.
  15. Tell antall cyster per hver 5 ul delmengde av fluorescensmikroskopi ved bruk av et 10X objektiv (figur 6).
    MERK: Noen cyster er store (8 eller flere parasitter ca.) mens noen er veldig små (1-2 parasitter per cyste). Telle totalt antall cyster per hvert lysbilde, men dokumentet rekke store versus antall små cyster.
  16. Legg antall cyster Fondetected i de tre forskjellige 5 ul porsjoner og multipliser med total fortynningsfaktoren x 2 (bare halvparten av hjernen ble gjort om til et lysat) for å anslå det totale antallet cyster per hjernen.

Representative Results

Toxoplasma gondii replikerer fritt i naive makrofager og har en dobling tid mellom 6-12 timer avhengig av belastningen av parasitten. Figur 1 viser representative parasitter i naive versus aktiverte benmargavledede makrofager. Figur 2 viser den generelle morfologi av parasitter i HFF vertsceller ved 2, 4, 8, 16 og 32 parasitter / PV. I den aktuelle protokoll, er parasitten lov til å invadere naive makrofager og etablere en begynnende parasitophorous vakuole (PV) forut for levering av et potent aktiverings stimulus, LPS og IFN-y, til de infiserte makrofager. I denne modellen er replikering av villtype parasitter bremset, men parasitt replikering likevel fortsetter for ca 24 timer i løpet av denne tiden makrofagene blitt stadig flinkere til å hemme parasitt replikering. Skjermen er laget for å fungere som en modifisert konkurranse modell mellom den tiden som kreves for potent makrofag enctivation versus tid i løpet av hvilken villtype parasitt eller parasitt mutant kan fortsette å replikere innenfor dens PV. Det første trinnet i skjermen er å velge en dose av LPS og IFN-γ som skal brukes for aktivering av infiserte makrofager. Dosen bestemmes empirisk ved å evaluere parasitt-replikasjon i makrofager aktiveres enten med en konstant dose av IFN-γ i kombinasjon med et utvalg av LPS-konsentrasjoner eller en konstant dose av LPS med et utvalg av IFN-konsentrasjoner (trinn 1). Dosen av aktiverings stimuli må vurderes for foreldrevilltype parasitter som brukes til etablering av parasitten mutanter ved kjemisk eller insertional mutagenese. Ideelt dose av LPS og IFN-y γ vil tillate replikasjon parasitt til et gjennomsnitt på 2-8 parasitter per PV 24 til 30 timer etter aktivering sammenlignet med 8-16 parasitter pr PV i naive makrofager (figur 1 og 2).

Når den passende konsentrasjon av LPS og IFN-y ^7; er bestemt, blir de mutanter screenet i 96-brønners optisk bunn vevskulturplater. Den optiske bunn i platene er viktig fordi uregelmessigheter i plast som anvendes for tradisjonelle vevskulturplater gjør det vanskelig å oppnå den passende oppløsning for å screene parasittene ved fasekontrast og fluorescensmikroskopi. Fasekontrast og fluorescens mikroskopi av de 96-brønners plater krever også en omvendt fluorescensmikroskop med fasekontrast 4, 10, 20 eller 40x objektiv utstyrt for lange arbeidsavstander. Mutanter blir screenet i replikate skåler inneholdende murin benmarg-avledede makrofager. Etter utfordring med parasitt mutanter, blir infiserte makrofager i brønnene av en plate aktivert med LPS og IFN-γ mens den andre plate inneholdende infiserte makrofager er dyrket i bare D10 medier. Platene inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 24-30 timer etter tilsetning av LPS og IFN-γ. Etter inkubering, celler er fifast, farget for parasitter og analysert av IFA bruke både fluorescens og fasekontrastmikroskopi. Mutanter er valgt som har normal parasitt tall og replikering i naive makrofager, men færre parasitter eller mindre vakuoler med færre parasitter i infiserte makrofager som er aktivert. Når mutanter er valgt skal de screenet på nytt i kammer lysbilder (Trinn 3) i naive og aktiverte makrofager i to uavhengige eksperimenter for å muliggjøre analyse av parasitt morfologi ved høyere forstørrelser (100X objektiv og olje), og for å bekrefte at de har normal replikering i naive makrofager men en defekt i replikering / overlevelse etter makrofagaktivering.

De fenotyper av mutanter med defekter i motstand mot aktivering av infiserte makrofager vanligvis faller inn i to hovedkategorier: parasitter som vises morfologisk intakt, men ikke klarer å gjenskape utover en enkelt parasitt per PV; og parasitter som synes å være degraded og kan også være i amorfe romslige musikkvideoer (figur 1 og 3). Morfologi og ultrastructure av parasitten og PV ses best på lysbilder ved hjelp av en 100X objektiv og olje og ved fasekontrastmikros kombinert med fluorescens analyse. Farging av parasitter for IFA med et antistoff til lysosomale tilhørende membranprotein-1 (LAMP1) er nyttig for å fastslå om feil i mutanten er knyttet til en manglende evne til PV for å hindre sammensmelting med lysosomer. Vist i figur 4 er en parasitt i en phagolysosome (LAMP1 positiv) mot en parasitt som er i en PV som er stort sett adskilt fra den endocytiske systemet til vertscellen (LAMP1 negativ). Den phagolysosome er tydelig av en kontinuerlig fast rim av LAMP1 anstreng rundt hele parasitten. I motsetning til dette, har en PV ofte lysosomet organeller i nærheten, men ingen kontinuerlig kant av LAMP1 farging rundt sin omkrets. Anvendelsen av antistoffer mot definerte strukturer / organeller innenfor than parasitt og / eller PV er nyttige i oppfølging IFA studier for å identifisere avvik i hver mutant forbundet med aktivering av infiserte makrofager. Slike avhør med antistoffer kan gi innsikt i hvilke mekanismer som ligger til grunn for replikering / overlevelse defekt i en mutant. For eksempel, figur 5 viser T. gondii mitochondrion farget med monoklonalt antistoff 5F4 anti-F1 ATPase beta subenhet (en slags gave fra Peter Bradley) 24 timer etter aktivering av makrofager infisert med villtype parasitter eller parasitt mutanter. T. gondii ble co-farget med et monoklonalt anti T. gondii antistoff. Vill type T. gondii har en enkelt mitokondrie som strekker seg rundt omkretsen av parasitten. Parasitten eneste mitochondrion i villtype parasitter etter aktivering av infiserte makrofager var intakt i forhold til en fragmentert mitochondrion i mutant parasitter. Mitokondrier fragmentering var tydelig ikke bare i degradert / amorfparasitter, men også i parasitter som viste normal morfologi som vurderes av fase kontrast mikroskopi. Dette tyder på at mangelen på parasitten mutant kan øke følsomheten av parasitten mitokondrie å være vert for celle meklere indusert av makrofagaktivering.

Den nåværende modellen bruker en kombinasjon av IFN-γ og LPS å aktivere infiserte makrofager. IFN-γ stimulerer transkripsjon faktor STAT1. LPS, som TNF-α, stimulerer transkripsjonsfaktor NF-kB. Kjent IFN γ -avhengige antimikrobielle meklere viktige i celle autonom immunitet mot T. gondii inneholder en samling av IFN-γ -avhengige immunitetsrelaterte GTPases (IRGs, GBPs) og reaktive nitrogen og oksygen arter i tillegg til andre agenter. For å finne ut om feilen i hver mutant er spesielt knyttet til produksjon av kjente IFN-γ -inducible antimikrobielle meklere, er benmargavledede makrofager isolert fraiNOS- - / -, gp 91 phox - / - eller bestemte IRG / GBP genet slettet mus og analysert for aktivitet mot de muterte parasitter. Kombinasjonen av IFN-γ og LPS å aktivere infiserte makrofager fortrinnsvis resulterer i mutanter med forbedret mottakelighet for nitrogenoksid sammenlignet med villtype parasitter 28.

Aktivering av infiserte makrofager kan indusere scenen differensiering av parasitter fra tachyzoites til bradyzoites som finnes i vev cyster. Slike cyster er karakteristisk for kronisk infeksjon. Dermed kan parasitt mutanter som er defekt for replikering / overlevelse etter aktivering av infiserte makrofager også være defekt for konvertering til cyster under in vivo infeksjon. For å evaluere cyste produksjon ved kronisk infeksjon, blir musene utfordret intraperitonealt (ip) med en ikke-dødelig dose av foreldre parasitt-stamme eller mutant klon. Cyster i hjernen varierer i størrelse fra mindre enn 10 _6; m. I diameter til større enn 50 mikrometer, som vist i Figur 6 Tell antall både store og små cyster av IFA men holde teller skille for å avgjøre om parasitten mutant er svekket for total cyste produksjon eller bare for etablering og vedlikehold av store cyster.

Figur 1
Figur 1. Naive murine benmargavledede makrofager er givende for replikering av T. gondii, men aktivering med LPS og IFN-γ vesentlig hemmer replikasjon. (A) En parasitophorous vakuole (PV) av villtype-T. gondii 24 timer etter invasjonen av naive murine benmargavledede makrofager. (B) En PV av vill type T. gondii parasitter som består av fire parasitter per vakuole 24 timer etter aktivering av infiserte makrofager.(C) Et eksempel på en mutant parasitt ute av stand til å replikere og fremdeles på en parasitt / PV 24 timer etter aktivering av infiserte makrofager. (D) Et eksempel på en mutant parasitt som vises degradert i løpet av et amorft PV 24 timer etter aktivering av infiserte makrofager . Den øverste raden viser fase bilder av parasitter og den nederste raden viser fluorescerende bilder ved hjelp av en polyklonale anti-serum mot T. gondii. Målestokken representerer fem mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Parasite replikering evaluert ved antallet parasitter pr PV. Bildene viser 2, 4, 8, 16 og 32 parasitter pr PV i HFF-celler. Hvert bilde er en sammenslåtte fase bilde thpå viser polyklonale antistoffarging av parasitten i rødt og HFF kjernen i blått (DAPI). Målestokken representerer fem mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Mutanter vise et utvalg av fenotyper etter aktivering av infiserte makrofager. Kolonnen til venstre er en fase bilde av parasitten i makrofager, er den midterste kolonnen et fluorescerende bilde ved hjelp av et antistoff til T. gondii, og høyre kolonne er en sammenslåing av fasen og fluorescerende bilde. Parasitten er vist i grønt og makrofag kjernen i blått. Målestokken representerer fem mikrometer. Klikk her for å se et størreversjon av denne figur.

Figur 4
Figur 4. LAMP1 flekker skiller musikkvideoer fra phagolysomes-inneholder parasitter. Parasitter er farget med en polyklonale anti T. gondii-antistoff (rød) og LAMP1 med mAb 1D4B (grønn). En pil markerer en parasitt PV som har smeltet sammen med lysosomer. Parasitten uten pilen er en parasitophorous vakuole (PV) som ikke har smeltet sammen med lysosomer. Målestokken representerer fem mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. vill type parasitter opprettholde en intakt mitochondrion mens mitochondripå degraderes i parasitt mutanter etter aktivering av infiserte makrofager. Mitokondrie (grønn) i villtype parasitter (topplaten) sammenlignet med tre forskjellige mutant T. gondii parasitter på ulike stadier av nedbrytnings (tre nederste paneler) 24 timer etter aktivering av infiserte makrofager. Målestokken representerer fem mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Påvisning av parasitten cyster i hjernen ved hjelp FITC-konjugerte Dolichos biflorus lektin. Den cyste vegg merket med lektin vises i grønt. Målestokken representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se et større versjon av dette tallet.

Discussion

Den beskrevne protokoll gir en ikke-forspent tilnærming som benytter aktivering av murine benmargsmakrofager og termin genetikk å isolere T. gondii mutanter med en defekt i deres evne til å overleve aktivering av infiserte makrofager. Fenotypen av mutanter følgende makrofagaktivering faller vanligvis inn i en av to kategorier: 1) De parasitter vises intakt, men mislykkes i å replikere utover en parasitt per PV; 2) Parasittene vises degradert og kan være i romslige, amorfe musikkvideoer. Det faktum at mutantene har en fenotype som villtype parasitter hos naive makrofager i fravær av aktiverings viser protokollen kan spesielt bli anvendt for å identifisere mutanter som er spesielt med svekket i deres evne til å motstå makrofagaktivering. Anvendelsen av primære benmargsmakrofager anbefales versus RAW 264,7 makrofag-cellelinjen for skjermen på grunn av morfologien av parasitter og parasitt antall pr vacuole er lettere visualiseres i benmarg-avledede makrofager.

Den beskrevne skjerm kombinert med termin genetikk gir et allsidig verktøy for å dissekere parasitt gener og til slutt genetiske trasé viktige for motstand mot spesifikke mediatorer av celle autonome immunitet. Slike termin genetiske studier er viktig å identifisere parasitt gener som kan følges som en streng for å begynne å rakne parasitt trasé viktige for å motstå spesifikke antimikrobielle meklere både in vitro og i løpet av patogenesen. En tidligere vanskeligheter med termin genetiske tilnærminger var identifisering av nøkkel genet forstyrret i hver mutant. Kosmid bibliotek complementation i T. gondii har vært ganske effektiv for funksjonell complementation av celledeling mutanter. Imidlertid, det faktum at replikasjon av villtype parasitter undertrykkes også ved IFN-γ og LPS bare i mindre grad enn mutantene gjør funksjonell komplemente vanskeligere than for celledeling mutanter. Hele genomet mutasjons profilering for både kjemiske og insertional mutanter i T. gondii har nylig dukket opp som en produktiv, og enda kostnadseffektiv, avenue å identifisere gener ansvarlig for fenotyper av mutanter i termin genetikk skjermer 34,36,37,44. Derfor har hele genomet mutasjons profilering ved hjelp av neste generasjon sekvense forbedret de potensielle bruksområder for kjemisk mutagenese av T. gondii i termin genetiske studier for å identifisere gener som er viktige for spesifikke funksjoner. En slik termin genetikk tilnærming, som beskrevet i den aktuelle protokoll er viktige som de fleste av genomet av T. gondii forblir hypotetisk med et flertall av predikerte gener har ingen homologi til andre gener eller funksjonelle domener som kan hjelpe til med identifisering av kandidat parasitt gener som er viktige for immununndragelser.

IFA-analyse av 96-brønners plater er ikke generelt ansett som en høy gjennomløpsscreening oppfylthod. Etter vår erfaring er det fornuftig for én person å farge og skjermen ti 96-brønners plater på en dag, eller omtrent 960 mutanter. I en artikkel av Skariah et al., Ble ca 8000 mutanter analysert og 14 frittstående mutanter ble isolert som ble betydelig svekket for overlevelse / replikering i aktivert, men ikke naive makrofager 28. Den svekket overlevelse av mutantene var hovedsakelig et resultat av økt mottakelighet for nitrogenoksid. Begrensningen i den generelle fremgangsmåten er i hovedsak på nivå med å skaffe enkle kloner av parasitten i stedet for screening ved mikroskopi som den første skjermen i 96 brønners plater er kvalitativ og rimelig hurtig. Bekreftelse av fenotype av mutanter identifisert i skjermen på 96 brønns plate blir fulgt opp i trinn 3 av kvantitativ og kvalitativ analyse ved hjelp av makrofager i kammer lysbilder og ved å legge til like mange villtype eller mutante parasitter. Bruken av andre analytiske screeningmetoderslik som fluorometri ved total populasjonsnivå av parasitter, i stedet for den enkelte parasitt nivå som bedømt ved mikroskopi, er problematisk i den aktuelle protokoll som mange av de degraderte parasitter flekken med det polyklonale antistoff mot T. gondii så robust som villtype parasitter med forskjellen i mutanten være mer kvalitativ enn kvantitativ på nivået av fluorescens intensitet. Også den dose av IFN-γ og LPS som kreves for å isolere mutanter med en defekt i motstand mot aktivering av infiserte makrofager fører til trykkes replikasjon av villtype parasitter enn på senere tidspunkter. Derfor, er måling av den totale parasitt nummeret for forover genetikk skjermen inkludert bruk av luminescerende parasitter problematisk. Det er imidlertid mulig fargingen protokollen kan elimineres i screeningtrinn hvis foreldre parasitt-kloner anvendt for kjemisk eller insertional mutagenese uttrykte en konstitutiv eller induserbar fluorescerende eller Luciferase markør. Den beskrevne protokoll ved hjelp av IFA og mikros screening av makrofager i 96 brønners plater tillater isolering av mutanter defekte for overlevelse / replikasjon i aktiverte makrofager, men det er også klart savner noen mulige mutanter på grunn av den begrensede mikroskopisk oppløsning oppnås ved å bruke 96-brønners plateformat så på denne oppløsningen amorfe hovne vakuoler som flekker for parasitt antigen kan forveksles med sunne replikere parasitter innenfor en normal PV. Substitusjon av 96 brønndekslet glassplater, i stedet for 96-brønners plater med en optisk overflate, er egnet til å oppnå høyere oppløsning under skjermen av infiserte makrofager i 96 brønners plater.

De aller fleste av mutantene identifisert ved hjelp IFN-γ og LPS i den beskrevne protokollen for å aktivere makrofager følgende parasitt invasjon har en defekt i deres evne til å beskytte seg mot nitrogenoksid 28. I dette henseende, selv om skjermen er ment å være ikke-forspent,kan anrike for isolering av parasitt-mutanter med økt mottakelighet for spesifikke antimikrobielle mediatorer avhengig av aktiveringsbetingelsene, den type og art av makrofager og timingen av parasitten invasjon i forhold til makrofagaktivering som er valgt for skjermen. Dermed det medfødte immuncelle valgt for skjermen og aktiverings stimuli anvendt er kritiske parametere som påvirker den type antimikrobielle meklere som de resulterende parasitt mutanter er sannsynlig å være utsatt. Genotypen av parasitten er også en viktig parameter som type I-genotyper av parasitten er forholdsvis motstandsdyktig mot immunitetsrelaterte GTPases (IRGs) indusert i respons på IFN-γ mens type II og III genotyper er mer utsatt 26,45,46. I den beskrevne protokoll, er makrofager aktiveres etter parasitt invasjon. Selv om type II-genotype, er utsatt for virkningen av immunitetsrelaterte GTPases Prugnaud-stamme, som brukes i den beskrevne skjerm, enllowing parasitten å invadere makrofager gjør først replikering av villtype parasitter før full stimulering av IRGs. Dessuten er det ikke klart at IRGs er effektive mot de parasitter hvis de er indusert i makrofager etterfølgende å parasitt invasjon og initiering av replikasjon.

Den beskrevne protokoll benytter makrofager for å identifisere parasitt gener som er viktige for resistens overfor IFN-γ avhengige mediatorer for cellestyrte immunforsvar, særlig nitrogenoksid. Isoleringen av en pool av parasitt-mutanter som deler en markert mottakelighet for nitrogenoksyd, samt en felles fenotype av nitrogenoksyd-avhengige mitokondrie fragmentering gir et unikt sett av verktøy for å identifisere gener parasitt og trasé viktige for resistens mot nitrogenoksid og for forståelse handlingen av nitrogenoksid mer bredt mot T. gondii og andre eukaryote pathogens.The beskrevet protokoll med mindre modifikasjoner kan brukes til fremover genetikk studies å identifisere parasitt gener som er viktige for resistens mot forskjellige mediatorer for cellestyrte immunforsvar. Mulige modifikasjoner inkluderer å endre typen av vertscelle infisert, aktiveringsstimuli, eller tidspunktet for aktivering i forhold til parasitt invasjon. For eksempel vil pre-aktivering av murine makrofager med IFN-γ før tilsetning av parasitter fører til aktivering av immunitetsrelaterte GTPases. En slik modell kan bli anvendt for å identifisere gener som parasitt i type I genotyper av T. gondii som kan bidra til motstands mediert av ROP18 og ROP5 til immunitet relaterte GTPases 24,25. Formidlere av celle autonome immunitet mot T. gondii i menneskelige medfødte immunceller er ikke så godt definert som hos gnagere. Således, ved bruk av humane perifere blodmonocytter screene kjemiske mutanter av T. gondii kan identifisere både parasitt gener som er viktige for overlevelse i menneske-smitte i medfødte immunceller samt mekanismer som er viktige i mennesker for antibiotikaresistens til T. gondii. Parasitt gener som er viktige for resistens overfor spesifikke antimikrobielle mediatorer kan bli identifisert ved å isolere mutanter som ikke kan overleve eksponering av infiserte vertsceller til farmakologiske midler slik som reaktive oksygen- eller nitrogenforbindelser. Tilsvar protokollen kan endres for å isolere parasitten mutanter med økt mottakelighet for inflammasome aktivering 47-49 eller ATP stimulering av makro purinergiske reseptorer 50.

Tatt sammen, protokollene beskrive en tilnærming med skrå genetikk og medfødte immunceller til å isolere parasitten mutanter viktige for T. gondii resistens overfor IFN-γ-avhengig celle-autonome immunitet. Viktigere, tilnærmingen legger frem er allsidig og kan lett modifiseres til å isolere parasitten gener viktig for å unndra spesifikke antimikrobielle meklere, parasitt overlevelse i bestemte typer vertsceller eller motstand mot spenningsforhold encounterødt under toksoplasmose. Videre kan parasitt gener som er viktige for å motstå vertscelleaktivering i mange tilfeller også spille en rolle, direkte eller indirekte i cyste produksjon in vivo under infeksjon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Hyclone SH3008101 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29101&productId=3255471&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone FBS Thermo SH3091003 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=11737973&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone DPBS Thermo SH3002802  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2434305&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone L-glutamine Thermo SH3003401  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3311957&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone Pen strep Thermo SV30010  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6&catalogId=29104&matchedCat
No=SV30010&fromSearch=1&
searchKey=SV30010&highlightPro
ductsItemsFlag=Y&endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings= 0.0&xrefEvent=1407777949003_0
&searchType=PROD&hasPromo=0
Hyclone Hanks BSS Thermo SH3003002 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3064595&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
LPS LIST biologicals 201 http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-γ Pepro Tech Inc 50-813-664 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494&catalogId=29
104&matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1&searchKey=murine+ifn+pepro+tech&highlightProductsItemsFlag
=Y&endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778210608_
12&searchType=PROD&hasPromo
=0
Chamber slides Thermo 177402 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2164545&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well optical plates Thermo 165306 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3010670&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well tissue culture plates Fisher 353072 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3158736&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Tissue culture flast T25 Fisher 156367 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67&catalogId=29104&matchedCat
No=12565351&fromSearch=1&
searchKey=156367&highlightProdu
ctsItemsFlag=Y&endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778974800_
0&searchType=PROD&hasPromo
=0
Ted Pella EM grade formaldehyde Ted Pella 18505 http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712
Triton X-100 Fisher BP151 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3425922&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Alexa 488 - protein conjugation kit Life Technologies A20181 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235
goat serum MP Biomedicals ICN19135680 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2133236&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&crossRefData
=ICN19135680=2&searchType
=PROD&hasPromo=0
Vectashield mounting media Vector Labs H1200 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428
FITC-conjugated dolichos Vector Labs FL-1031 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
Antibody to LAMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
LysoTracker Life Technologies L-7526 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product
C57BL6 mice Jackson Laboratories 664 http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
gp91 phox knock out mice Jackson Labaoratories 2365 http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html
iNOS knock out mice Jackson Laboratories 2609 http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html
sodium nitroprusside ACROS Organics AC21164-0250  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2627727&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
DETA NONOate ACROS Organics AC32865-0250 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2252389&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab Fitzgerald Industries International 10T19A http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185, (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162, (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156, (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190, (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159, (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125, (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249, (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84, (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178, (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483 (2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172, (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182, (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589 (2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100, (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. e1002236 (2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285, (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445, (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9, (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208, (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13, (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210, (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14 (2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15, (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784 (2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182, (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63, (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188, (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62, (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61, (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091 (2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354 (2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335, (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180 (2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175, (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807 (2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147, (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8, (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348 (2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171, (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8, (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358 (2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927 (2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82, (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5, (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184, (12), 7040-7046 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics