표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리

Immunology and Infection

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He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

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Abstract

인간의 피부는 중요한 장벽 기능을 가지고 있으며, 병원균에서 조직의 항상성 및 보호에 기여하는 다양한 면역 세포가 포함되어 있습니다. 피부 액세스 비교적 용이하기 때문에, 이는 주변 면역 조절 메카니즘을 연구하기위한 이상적인 플랫폼을 제공한다. 면역 상주 건강한 피부 실시 immunosurveillance 세포 있지만는 건선과 같은 염증성 피부 질환의 발달에서 중요한 역할을한다. 새로운 통찰력에도 불구하고, 다양한 염증성 피부 질환의 기초가되는 생물학에 대한 우리의 이해는 여전히 제한된다. 피부 생검 샘플로부터 분리 된 양질의 (하나의) 세포 집단이 필요하다. 지금까지 분리 절차 심각한 생존 세포의 충분한 수를 얻기의 부족에 의해 방해되어왔다. 분리 및 후속 분석 인해 수득 현재 분리 절차에 의해 야기되는 기계적 및 화학적 스트레스, 면역 세포 계통 마커의 손실에 의해 영향을받은단일 세포 현탁액. 여기서는 자동 조직 dissociator 및 콜라게나 제 처리를 사용하여 기계적 피부 분리를 조합하여 건강 관련 건선 모두 인간 피부 T 세포를 분리하는 개질 방법을 설명한다. 이 방법은 단일 세포 현탁액의 준비 시점에 CD4, CD8, Foxp3의와의 CD11c 대부분의 면역 계통 마커의 발현을 유지합니다. 성공적인 CD4 + T 세포의 분리 및 후속 표현형 및 기능 분석의 예는 도시된다.

Introduction

피부는 몸과 환경 사이의 기본 인터페이스로, 외부의 물리적, 화학적 및 상처, 자외선 및 미생물 등의 생물 모욕에 대한 방어의 첫 번째 라인을 제공합니다. 피부는 두 개의 주요 구획, 표피 및 진피를 포함하고, 랑게르한스 세포, 대 식세포, 수지상 세포, 및 약 200 억 메모리 T 세포를 포함하여 면역 세포의 다양한 전체 혈액량 거의 두 배가 존재를 포함 2. 증가하는 데이터 기관은 피부 조직의 항상성 동안 다양한 병리 적 상태 모두에서 중요한 면역 기능이 개념을 지원한다. 정상 피부에 상주 면역 세포 immunosurveillance 3을 수행하는 것으로 생각되고, 이러한 4 건선 같은 염증성 질환의 발달에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 건선 병변 피부에서 CD4 +와 CD8 + 모두 T 세포가 OBS했다 침투erved하고는 CD4 및 CD8의 비율은 질병 상태 (5)에 따라 다르다는 것을 나타내었다. 그러나, 이러한 세포의 집단은 기존의 기술은 단지 소수의 세포를 분리 할 수​​ 있기 때문에 연구하기가 어렵다.

인간 피부 T 세포의 분리를위한 현재 널리 사용되는 기술은 효소 처리로 기계적 피부 분리를 결합한다. 인간의 피부 조직 검사는 광범위하게 다진 및 트립신, 콜라게나 제 및 / 또는 EDTA 6-8와 같은 효소와 함께 배양한다. 피부 인장력 기계적 세분화에 매우 내성이 배리어 티슈 인 것을 고려하면, T 세포의 분리의 설정 방법은이 세포 집단 어렵고 생체 외 세포 배양한다 거의 세포 및 생존 세포의 더 낮은 수를 생산 도전적인.

여기, 우리는 mechan을 결합하여 건강하고 참여 모두 건선 인간의 피부에서 림프구를 분리하는 수정 방법을보고효소 소화 콜라 사용과 함께, 자동화 조직 dissociator 닦지 않고 광범위의 기존 방법을 사용하여 피부의 iCal 해리. 수지상 세포 및 T 세포를 포함하는 다양한 면역 세포 생존 서브 세트는 단일 세포 현탁액을 제조 한 후 관찰되었다. 중요한 것은 표면 마커 CD3, CD4 및 CD8의 발현이 잘 보존되었다. 이와 같이 제조 된 세포를 생체 외 세포 배양 또는 유세포 분석에 사용하기위한 준비가되어있다. 이 프로토콜은 성공적 건선 환자의 피부 병변에서 유래 된 단일 피부 생검 (4 ㎜)의 분석을 위해 사용되어왔다. 결과는 피부 거주 환자의 T 세포가 건강한 지원자 9 비교하여 IL-17, IFNγ와 같은 더 많은 염증성 사이토 카인을 생산 것으로 나타났다.

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Protocol

참고 : 건강한 사람에서 피부 조직 검사가 과학적 사용을위한 구두 또는 서면 동의서 후 선택 과목 성형 수술을받은 개인의 복부 피부에 남은에서 얻었다. 인간의 피부의 사용은 승인 된 Radboud 대학 의료 센터, 네이 메헨, 네덜란드, 독일 에센 대학의 인간 연구를위한 의료 윤​​리위원회가 설정 한 규정에 따라한다.

인간의 피부에서 단일 세포 현탁액 1. 준비 (흐름 캐비닛에서 작업 멸균 이후 세포 배양 경우 필수)

  1. 세포 배양 배지를 준비 : 없음 혈청 RPMI 1640 + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (ml의 최종 농도 100 단위 / 100 μg의 / ㎖, 각각) + 피루 베이트 (0.02 밀리미터)와 루타 (0.02 mM)을 추가.
  2. 완전 배지 준비 : 배양액 단계 1.1 + 10 % 인간 혈청 풀 (HPS)에서 제조; 4 ℃에서 저장한다. 우리 앞에 20 ° C ± 2 중간 가져와ING.
  3. 4mm 라운드 생검 펀치기구를 사용하여 피부 조직 검사를 구하여 최대 4 시간 동안 4 ° C ON에서 20 ° C ± 2에서 RPMI1640 전체 문화 매체에 보관합니다. 실험실에 도착하면 가능한 한 빨리 조직 검사를 처리합니다.
    참고 : 피부의 이상 저장 셀 수율 및 세포 생존에 영향을 미칠 것이다.
  4. 푸른 덮인 해리 튜브 레이블과 레이블이 튜브에 5 ml의에게 완전한 문화 매체를 추가 할 수 있습니다.
  5. 멸균 6 웰 배양 판 (총 3 웰)를 각 웰에 완전 배지 2 ㎖를 추가합니다. 따라서 세 린스의 총을 달성, 단일 잘으로 조직 검사를 배치 린스, 두 번째 아니라 그것을 통해 이동하고이 단계를 한 번 더 반복 살균 도구를 사용합니다.
  6. 멸균 페트리 접시로 잘 헹구고 피부 생검 전송 생검의 위에 완전 배지 100 ㎕를 추가하고, 신중 스테인리스 일회용 무균 메스를 이용한 피하 지방층을 긁어.
    참고 : 목하는 중요한 단계입니다.
  7. 멸균 페트리 접시에 4 작은 조각으로 각각의 피부 조직 검사를 잘라. 전송 샘플 (튜브 당 최대 4mm 생검 네) 완전 배지 5 ㎖를 함유하는 제조 해리 튜브.
  8. 단단히 캡 튜브를 닫고, 자동화 된 조직 dissociator의 소매에 거꾸로 연결합니다. 모든 샘플 재료는 회 전자의 지역에 위치하고 있는지 확인합니다.
  9. "프로그램 m_spleen의 _01"56 초에 해당하는 회전 속도로 조직 검사를 해리 (첨부 된 프로그램 카드 기기의 내부 메모리 또는 제공하는 미리 정의 된 프로그램)을 실행하여 해리 프로세스를 시작합니다.
  10. 처리 후, dissociator에서 분리 튜브를 분리하고 모든 해리 물질이 튜브의 바닥에서 수집되어 있는지 확인하십시오.
  11. 37 진탕 수조에서 분리 튜브에 콜라게나 IA (80 ㎎ / ㎖) μL (150)를 추가하고 샘플을 품어60 분 동안 C를 °. thedissociation 튜브에의 DNase I 100 ㎕ (5 MU / ㎖)를 추가, 잘 섞는다.
    주 : 콜라게나 제 또는 세포 생존을 변경한다 긴 배양 시간의 고농도.
  12. 자동화 된 조직 dissociator의 슬리브로 분리 튜브를 연결하고 조직 검사를 한 번 더 해리하려면 "프로그램 M_ 비장 _01"를 실행합니다.
  13. 50 ㎖의 팔콘 튜브의 상단에 70 μm의 나일론 셀 스트레이너를 놓습니다. 세포 덩어리 / 조직 파편을 제거하기 위해 셀 스트레이너에 해리 샘플 자료를 적용합니다.
  14. 완전한 배지 5 ㎖로 한 번 셀 스트레이너를 씻으십시오. 20 °에서 원심 분리기 C ± 2, 10 분, 흡인 상층 액 450 XG.
  15. 세척 단계를 한 번 더 반복합니다. 전체 문화 매체의 300 μL에 재현 탁 세포 펠렛. 단일 세포 현탁액은 추가 분석을 위해 준비; 생체 세포 배양을위한 프로토콜을 계속하거나 분석 유동 세포 계측법.
  16. 상기 난 경우ntracellular 사이토 카인 염색은 37 ℃에서 4 시간 동안 PMA (12.5 NG / ㎖), 이오 노마 이신 (500 ng의 / mL) 및 Brefeldine A (5 μg의 / ml)로 세포를 자극하고, 5 % CO 2 인큐베이터 플로우를 실행하기 전에 4 시간 동안 세포 계측법 분석.

피부 주민 T 세포의 2 클론 활성화 (예 생체 세포 배양)

  1. 둥근 바닥 96 웰 플레이트에 100 μL 분취 단일 세포 현탁액 (1.15 단계에서 제조).
    주 : 4mm 피부 생검 각각에 대해 획득 된 단일 세포 현탁액을 96- 웰 플레이트 중 적어도 두 개의 우물로 분할 될 수있다.
  2. 항 -CD3 / 항 CD28 단클론 항체 - 코팅 된 마이크로 비드 (웰 당 25,000 비드), 재조합 인간 사이토 카인 RIL -2- (최종 농도 25 U / ml) 및 RIL-1β (50 ng의 최종 농도 / ㎖)을 추가한다.
  3. 5 % CO 2에서, 100 % 습도, 37 부화 잘 표지 접시 뚜껑 배양 플레이트 커버 C 배양기를 °. 중간 색상이 노란색으로 변합니다 때 매체를 변경합니다.

3. 주요의 유동 세포 계측법 분석 / 배양 된 피부 주민 T 세포

  1. PBS + 0.2 % BSA : FACS 버퍼를 준비합니다.
  2. V 바닥 96 웰 플레이트에 관심의 세포를 전송합니다. 20 ° C ± 2, 2 분 동안 450 XG에 원심 분리기하고, 기음 뜨는.
  3. PBS 100 ㎕에서 펠렛을 재현 탁. 20 ° C ± 2, 2 분 동안 450 XG에 원심 분리기하고, 기음 뜨는.
  4. (: PBS를 사용하여 1,000 희석 1) 4 ° C에서 30 분 동안 고칠 가능성 염료를 결합 준비 eFluorescence780 100 ㎕와 얼룩 세포. 20 ° C ± 2, 450 2 분 XG 및 대기음 뜨는에 FACS 버퍼, 원심 분리기 100 μl를 추가합니다.
  5. , 필요한 세포 표면 마커 모노클로 날 항체를 선택 예를 들면 : CD45-BV421 (HI30 1:20), CD3-ECD (UCHT1 1:50), CD4-PC5.5 (1388.2, 1 : 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1 : 400), CD14-FITC (TUK4 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-1191:50), CD56-PE (MEM-188 1:50), CD25-PeCy7 (BC96 1:50)의 CD11c-PeCy7 (BU15 1:10), 및 CD1c-APC (AD5-8E7, 1시 10분) 시험 각 단클론 항체 희석 배수에 의한 FACS 완충액을 사용하여 모노클로 날 항체 - 혼합물을 제조한다. 비 얼룩 샘플과 함께 항체의 아이소 타입 컨트롤을 사용하여 게이트 설정을 정의합니다.
  6. 각 웰에 준비 단클론 항체 - 혼합물의 25 μl를 추가합니다. 빛으로부터 보호, 20 ° C ± 2시 20 분을 품어.
  7. 20 ° C ± 2, 450 2 분 XG 및 대기음 뜨는에 FACS 버퍼, 원심 분리기 100 μl를 추가합니다.
  8. 단지 세포 표면의 얼룩을 필요로 샘플 단계 3.16를 계속합니다.
  9. Foxp3의 세포 내 염색시 :
    1. 희석제 3 부를 농축액의 일부를 혼합하여 고정하고 permeabilization 버퍼를 준비한다.
    2. 1 배 permeabilization 버퍼를 준비 : 멸균 H 2 O 1 부 10 배의 permeabilization 버퍼 + 9 부
  10. 고정 및 permeabili 100 ㎕에 재현 탁 펠릿zation 버퍼는, 잘 혼합, 4 부화 30 분 동안 C를 °.
  11. 450 2 분 동안 실온에서 XG 및 대기음 뜨는에서 각 웰, 원심 분리기 100 μL permeabilization 버퍼를 추가합니다.
  12. permeabilization 버퍼를 한 번 더와 세포를 씻으십시오.
  13. 예를 들어 필요한 세포 내 모노클로 날 항체를 선택 Foxp3를-eFluo450 (PCH101 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1 1:50) 및 IFNγ-PeCy7 (4S.B3, 1 : 400). 각 시험 단클론 항체 희석 인자에 따라 2 % 정상 쥐의 혈청을 함유 permeabilization 완충액을 사용하여 모노클로 날 항체 혼합물을 준비한다. 비 얼룩 샘플과 함께 항체의 아이소 타입 컨트롤을 사용하여 게이트 설정을 정의합니다.
  14. 각 웰에 준비 단클론 항체 - 혼합물의 20 μl를 추가합니다. 4 품다 빛으로부터 보호 30 분 동안 C를 °.
  15. 30 분 부화 후, 각 웰에 permeabilization 버퍼의 100 μl를 추가합니다. 20 ° C ± 2, 2 분 동안 450 XG에 원심 분리기하고, 기음 뜨는.
  16. permeabilization의 buffe와 세포를 씻으십시오R 한 번 더. microFACS 튜브에 110 FACS 완충액 μL 및 전송 세포 현탁액에 재현 탁 펠릿.
    참고 : 샘플 10 색 유동 세포 계측법 사용하여 측정을위한 준비가되어 있습니다.
  17. 필요한 정확한 세포 수의 경우, 즉시 유동 세포 계측법 사용하여 측정을 수행하기 전에 각 샘플에 fluorospheres의 잘 혼합 된 균일 한 현탁액의 10 μl를 추가합니다.

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Representative Results

여기에 제시된 프로토콜은 단일 4mm 피부 조직 검사를 사용하는 경우 760 ± 178,000까지 615 (± SEM, 건강한 지원자의 피부를 평균) ± 2,200 사이는 인간의 피부에서 가능한 림프구 (± SEM, 건선 환자의 피부 병변을 의미) 얻을 것입니다.

CD45 + 세포의 종류는 CD4 + T 세포 (~ 45 %), CD8 + T 세포 (~ 30 %)을 포함 건강한 사람의 피부에서 유래 된 단일 세포 현탁액의 식별과의 CD11c + 수지상 세포 (~ 5 %했다 ) 몇 B 세포 (CD19 +의), NK 세포 (CD56 + CD3 반면, -), 또는 단핵구 / 대 식세포 (CD14 + 또는 CD1c +)가 관찰되었다 (도 1A). 이 방법은 인간의 피부 생검에서 CD4 + CD25 + Foxp3의 + 세포의 분석을 위해 수 있습니다. 고정 및 permeabilization 후 세포 내 염색을 사용함으로써, 전사 FAC의 발현을 입증 할 수있다CD25 + T 세포 토르 Foxp3를 (도 1a).

인간의 피부 생검으로부터 유래 단일 세포 현탁액 (데이타 미기재) FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD) FL9 (태평양 블루) 및 FL10 (크롬 오렌지)를 세포 계수기를 사용하여 채널에서 높은 자기 형광 배경을 보였다 . 림프구 인구의 적절한 분석을 위해, 우리는 따라서 림프구 인구 및 autofluorescent 세포 인구 (그림 1B)의 배제의 게이팅을위한 화려한 바이올렛 (421) 형광 색소가 결합 항 - 인간 CD45 단클론 항체의 사용을 권장합니다. 인간의 피부에 상주 세포의 대부분은 CD3 + T 세포 (도 1c)이었다. 세포 생존 분석을 위해 그것은 죽은 / 죽어가는 세포 (그림 1C)에서 가능한 구별하기 위해 고칠 가능성 염료를 사용하는 것이 좋습니다. 7.7 (평균은 ± SD) 가능한 세포 ± 65.3 %에서 일반적으로이 프로토콜 결과. 데이터 유세포의 추가 분석을 위해, advis 인죽어가는 또는 죽은 세포 보낸 생존 세포 집단의 게이트에 ED는 세포막 완전성을 상실하고, 이에 비특이적 백그라운드 염색을 증가 공액 된 항체를 결합 할 수있다.

이 프로토콜에 의해 고립 된 T 세포는 추가 기능 분석에 적합하다. 건선 환자의 피부 병변의 단일 4mm 생검을 사용함으로써, 생검 유도 T 세포 Brefeldin (A)의 존재하에 PMA / 이오 노마 이신과 함께 4 시간 자극 (도 2) 다음의 IL-17A 및 IFNγ 생산 것으로 나타났다.

관련 건선 피부 병변으로부터 새로 제조 된 단일 셀 피부 현탁액은 또한 생체 외 세포 배양 이후의 기능 분석을 위해 사용될 수도있다. 친 염증성 사이토 카인 IL-1β 또는 IL-23에 대한 팔일의 존재 하에서 항 CD3 / 항 CD28 단클론 항체가 코팅 된 마이크로 비드와 클론 자극 후 팽창 후, 세포를 예를 들면 그들의 cytok에 대해 분석 할 수있다오프라인 용량 (그림 3) 생산. 이렇게함으로써, 건강 및 건선 개인의 피부에서 유래 된 세포의 사이토 카인 생산 전위 사이에 명확한 차이를 관찰 하였다. 건선 개인의 T 세포는 건선 관련 시토 킨 IL17A하고 IFNγ을 생성하는 더 높은 용량을 나타내었다. 이것도 생체 외 배양 후 본보기 건선 사이토킨 표현형이없는 정상인의 경우에는, 유지되는 것을 의미한다.

그림 1
그림 1. 백혈구의 종류는 텍스트에 기술 된 프로토콜을 사용하여 격리 된 건강한 사람의 피부에 상주 림프구 피부에서 유래 된 단일 세포 현탁액에서 식별 관심 플러스 정착 생존 염료, 형광 접합 된 모노클로 날 항체로 염색하고 즉시 분석 하였다 유동 세포 계측법. (A) 흐름 CY, CD4 +, CD8 + 및 CD25 + Foxp3의 피부에 상주 림프구에서 + 서브 세트 - 단핵 세포 (CD14), 수지상 세포 (중 CD11c), B 세포 (CD19), NK 세포 (CD56 + CD3)의 tometric 검출. 반대로 인간 CD45 / BV421 단클론 항체는 autofluorescent 세포에서 림프구를 구분합니다. CD45 + 세포를 사용 게이팅 전략은 (B)에 도시한다. 분리 후 가능한 CD45 + CD3 + T 세포의 (C) 비율입니다. 번호 양성 세포의 비율을 나타낸다. 세 가지 실험 / 기증자 중 대표적인 실험이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 : 건선 환자의 피부 병변에서 유래 된 T 세포 수 PRODU가전 ​​IL-17A와 IFNγ는. 단일 4mm 피부 조직 검사는 구두에 건선 환자의 피부 병변에서 촬영 또는 과학적 사용을위한 동의서를 작성되었습니다. 피부 상주 T 세포는 본문에 설명 된 프로토콜을 사용하여 단리 하였다. 피부 상주 T 세포에 의한 IL-17A와 IFNγ의 생산. Brefeldin (A)의 존재하에 PMA / 이오 노마 이신과 함께 4 시간 자극에 응답하여 사이토 카인의 세포 내 축적을 유동 세포 계측법으로 측정 하였다. 사이토 카인 양성 세포의 백분율이 표시됩니다. 세 가지 다른 환자의 데이터가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
도 3 : 피부에 상주하는 T 세포가 IL-17A 및 IFNγ 다음 생체를 생산할 수있는 A) 또는 IL-23 (50 ng를 / ㎖, B) δ 일간 자극 하였다. 이어서, 세포 Brefeldin (A)의 존재하에 PMA / 이오 노마 이신과 함께 4 시간 동안 자극 한 후, 유동 세포 계측법에 의해 세포 내 사이토 카인 생산을 분석. 3 개의 독립적 인 실험 / 기부자 중 대표적인 예는 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기서는 효율적으로 인간의 피부 생검으로부터 피부 상주 T 세포를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜의 장점은 가능한 림프구의 상대적으로 높은 수의 분리이고, 관련 표면 마커를 발현. 식별 된 셀의 서브 세트가 있었다 :하는 CD11c + 수지상 세포, CD4 + 및 CD8 + T 세포와 Foxp3의 + CD25 + 세포를 포함한다. 중요한 것은, 절연 피부 상주 T 세포의 생체 외 배양 잘 실현 후속 기능적 분석 하였다.

인간의 피부 조직의 구조적 일체 성을 유지하는 기능 외 부착 단백질의 분해 효소로 분해 기계적 결합하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 될 수있다. 표피 및 진피의 디스 파제 기질 층 분리 이들 각 스킨 층의 세포 침투를 결정하기 위해 널리 사용되는 방법이지만, 우리는 디스 파제 처리 t 주도 눈치OA CD25 및 CD27의 세포 표면 발현의 중요한 감소 (도시되지 않음). 이러한 마커 림프구의 부분 집합의 특성을하는 것이 중요합니다, 우리는 그 디스 파제 처리의 영향 이후의 면역 표현형을 믿습니다. 이 분 T 세포의 숫자는 표피 (10)에 존재하면서 진피의 제거는 T 세포의 대부분 진피에 편재되어 건강한 사람의 피부 때문에, CD25 또는 CD27 발현 세포에서 관찰 된 감소에 대한 책임이 있다는 것 같지 않다 -12. 격리 된 각화 세포의 증식 능력의 디스 파제의 해로운 효과는 이전에보고되었다 (13). 세포 기능이 연구의 목적은 따라서, 디스 파제의 신중한 사용을 보장한다. 우리의 프로토콜에서 우리는 내가 피부 생검의 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 콜라게나 유형을 사용하고있다. 콜라게나 I 콜라게나 제 IV에 비해 높은 트립신 활성을 가지고 있으며, 따라서 더 가혹한하지만 그것은 테 되었기 때문에, 우리는이 특정 콜라게나을 선택한세포 배양에 대한 적합성에 대한 STED. 세포 배양에 적합하다 콜라게나 제 IV의 사용은 상기 현재 프로토콜을 최적화 할 수있는 미래의 단계가 될 수도있다.

그것의 특성으로 피부 인장력 및 기계 세분화에 매우 강하다. 지금까지 인간의 피부에서의 면역 세포의 포괄적 인 분석은 비교적 열악한 소화 프로토콜을 사용할 때 충분한 세포 수를 획득하는 기술적 과제에 의해 방해되어왔다. 그 결과, 현재까지 발표 대부분의 연구는 면역 분석에 의존한다. 피부 생검으로부터 CD4 + T 세포의 직접적인 분리는 일반적으로 복잡 여겨진다. 다른 방법은 피부 이식편의 사용은 배양 물 (10)를 크롤링 할 것이다. 그러나, 이러한 문화 2 ~ 3 주가 걸릴, 피부 이식편 배양 배지는 특정 T 세포 하위 집합 중 우선 크롤링으로 이어질 수있는 사이토 카인과 케모카인의 선택 세트가 포함되어 있습니다. 또한 배양 기간은 affec 수 있습니다세포의 표현형에서 t. 현재 프로토콜 표현형 직접 분리 한 후 T 세포 개체군의 기능적 연구를 모두 가능하게 첨가 사이토 카인 또는 케모카인과 CD4 (및 다른 세포 마커)의 발현을 잘 분리 한 후 보존하고, 사용하지 않는다.

시판 자동화 조직 dissociator이 열화 외 기질에 필요한 콜라겐과의 인큐베이션 전 피부 단편의 분리에 사용된다. 세포 외 기질로부터 세포의 후속 릴리스는 자동화 dissociator 다시 사용된다. 피부의 광범위한 설명서 절단 (데이터 미도시)와 유사한 세포 수를 얻을 수 있지만, 그 결과는 이하와 일치 연주자의 경험에 의존한다. 기기에 의해 제공되는 사전 정의 된 절차를 사용하여 피부의 해리 더욱 재현 가능한 결과를 산출 할 것이다. 그 피부를 보여주는 이전의 연구와 일치하는 다양한 리터를 포함eukocytes는 2,14, 중 CD11c + 수지상 세포, CD8 + 및 CD4 + T 세포 서브 세트 및 Foxp3의 + 세포는 여기에 제시된 프로토콜에 의해 제조 된 단일 세포 집단에서 관찰되었다. 중요한 것은,이 프로토콜은 가능한 림프구의 비교적 높은 수율을 산출한다. 때문에 프로토콜의 효율로, 단지 하나의 4mm 피부 생검 얻을 수 종종 환자 물질을 유용 공부 때. 상기 방법을 사용하여, 우리는 건선 환자의 피부 병변에서 분리 한 T 세포는 건강한 피부 9에 비해 IL-17A 및 IFNγ 생산하는 높은 용량을 보여 주었다 표시 할 수 있었다.

연구의 질문에 따라, 상기 단일 세포 현탁액을 제조 한 후 특정 셀의 서브 세트를 정화 할 필요가있다. 이 경우, 피부의 큰 조각 일부 분석에 충분한 셀의 수율을 보장하기 위해 사용될 수있다. 이렇게하면 피부가 작은 파이로 절단되어야한다는 것을, 확인분리 프로토콜을 시작하기 전에 X 2mm 약 2mm의 eces.

결론적으로, 본 프로토콜은 피부 면역 반응하여 우리 통찰력을 향상 단일 세포 수준에서 의미 표현형 및 기능 분석을 용이하게 피부에 상주하는 세포를 분리하는 개선 된 방법을 제공한다.

해리 튜브 이상의 생검 처리 특히 현재 프로토콜의 중요한 단계는, 피하 지방 조직의 적절한 제거하고 작은 조각으로 피부의 절단이다. 지방 조직 및 / 또는 큰 조직 조각은 dissociator가 다시 실행을 요청, 제대로 작동하게됩니다. 이 심각 세포 생존 해를 끼칠 것입니다. 기술의 한계는 단일 4mm 피부 생검 유래의 세포 수는 셀의 서브 세트의 후속 분리를위한 충분하지 않은 점이다.

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Acknowledgements

건선 환자의 피부 조직 검사는 친절 박사 안드레아스 Koerber 과학적인 사용을위한 구두 또는 서면 동의서 후 (에센, 독일의 대학 피부과 부서)에 의해 제공되었다.

XH도 NSFC 61263039과 NSFC 11101321에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

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References

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