Linfociti Isolamento da Pelle umana per l'analisi fenotipica e

Immunology and Infection

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He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

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Abstract

La pelle umana ha una importante funzione di barriera e contiene varie cellule del sistema immunitario che contribuiscono a omeostasi tissutale e la protezione da agenti patogeni. Come la pelle è relativamente facile da accesso, fornisce una piattaforma ideale per lo studio periferici meccanismi di regolazione del sistema immunitario. cellule residenti immunitario in buona salute immunosorveglianza condotta della pelle, ma anche svolgere un ruolo importante nello sviluppo di malattie infiammatorie della pelle, come la psoriasi. Nonostante intuizioni emergenti, la nostra comprensione della biologia di base varie malattie infiammatorie della pelle è ancora limitata. Vi è una necessità di una buona qualità popolazioni (singolo) di cellule isolate da campioni di pelle biopsiati. Finora, procedure di isolamento sono stati gravemente ostacolati dalla mancanza di ottenere un numero sufficiente di cellule vitali. Isolamento e successiva analisi sono stati colpiti dalla perdita di marcatori lignaggio cellule immunitarie, a causa dello stress meccanico e chimico causato dalle procedure di dissociazione correnti averesospensione singola cella. Qui, descriviamo un metodo modificato per isolare le cellule T sia da salutare e coinvolto pelle umana psoriasica combinando dissociazione pelle meccanico utilizzando un dissociatore tessuto automatizzato e il trattamento collagenasi. Questa metodologia conserva espressione della maggior parte dei marcatori lignaggio immunitario come CD4, CD8, Foxp3 e CD11c sulla preparazione di sospensioni di cellule singole. Sono mostrati esempi di isolamento successo + T CD4 cellule e successiva analisi fenotipica e funzionale.

Introduction

La pelle, come l'interfaccia principale tra il corpo e l'ambiente, fornisce la prima linea di difesa contro fisica esterna, chimiche e insulti biologici quali ferite, radiazioni ultraviolette e microrganismi. Pelle è composto da due vani principali, l'epidermide e il derma, e contiene una varietà di cellule del sistema immunitario, tra cui le cellule di Langerhans, macrofagi, cellule dendritiche (DC), e circa 20 miliardi di cellule T di memoria, quasi il doppio del numero di presenti in tutto il volume di sangue 1 , 2. Un numero sempre crescente di dati supporta l'idea che la pelle ha funzioni immunologiche essenziali, sia durante l'omeostasi dei tessuti e in diverse condizioni patologiche. Le cellule immunitarie residenti nella cute normale si pensa di condurre immunosorveglianza 3 e hanno dimostrato di giocare un ruolo nello sviluppo di malattie infiammatorie come la psoriasi 4. Nella cute lesionata psoriasica, sia CD4 + e CD8 + infiltrati cellule T erano osserved ed è stato dimostrato che il rapporto tra il CD4 e CD8 varia a seconda dello stato di malattia 5. Tuttavia, queste popolazioni di cellule sono difficili da studiare perché le tecniche esistenti consentono l'isolamento di solo poche cellule.

Le tecniche attualmente largamente utilizzati per l'isolamento delle cellule T da pelle umana combinano dissociazione pelle meccanica con trattamento enzimatico. Biopsie cutanee umane sono ampiamente tritata e incubate con enzimi come tripsina, collagenasi e / o EDTA 6-8. Considerando che la pelle è un tessuto barriera che è altamente resistente alle forze di trazione e disgregazione meccanica, i metodi stabiliti di isolamento delle cellule T prodotte pochissime cellule, e anche i numeri inferiori di cellule vitali, che rende ex vivo di coltura cellulare di queste popolazioni cellulari difficile e stimolante.

Qui, riportiamo un metodo modificato per isolare i linfociti provenienti sia sano e coinvolto pelle umana psoriasica combinando Mechanla dissociazione iCal della pelle utilizzando un dissociatore tessuto automatizzato invece del metodo stabilito di ampiamente tritare, insieme a digestione enzimatica con collagenasi. sono stati osservati vari sottoinsiemi di cellule immunitarie vitali tra DC e cellule T dopo la preparazione di una cella singola sospensione. È importante sottolineare che l'espressione dei marcatori di superficie CD3, CD4 e CD8 è stato ben conservato. Le cellule così preparate, sono pronte per l'uso in colture cellulari ex vivo o analisi di citometria di flusso. Questo protocollo è stato impiegato con successo per l'analisi di biopsie cutanee singoli (4 mm) derivati ​​dalla cute lesionale di pazienti affetti da psoriasi. I risultati hanno mostrato che le cellule T dei pazienti della pelle residente prodotte citochine infiammatorie come più IL-17 e IFNγ rispetto ai volontari sani 9.

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Protocol

NOTA: Le biopsie cutanee da individui sani sono stati ottenuti da addominale avanzi pelle di individui sottoposti a chirurgia plastica elettiva dopo consenso informato orale o scritta per uso scientifico. L'uso di pelle umana è stato approvato e in conformità con le norme stabilite dai comitati etici medici per la ricerca umana del centro medico dell'Università Radboud, Nijmegen, Paesi Bassi e dell'Università di Essen, in Germania.

1. Preparazione di sospensioni singola cella dalla pelle umana (lavoro sterile in un flusso-armadietto se successiva coltura cellulare è obbligatorio)

  1. Preparare terreno di coltura cellulare: RPMI 1640 + penicillina / streptomicina (concentrazioni finali 100 unità / ml e 100 mg / ml, rispettivamente) + piruvato (0,02 mm) e Glutamax (0,02 mm), senza siero aggiunto.
  2. Preparare terreno di coltura completo: terreno di coltura preparato al punto 1.1 + 10% di siero umano pool (HPS); Conservare a 4 ° C. Portate medie a 20 ° C ± 2 prima di noiing.
  3. Ottenere la biopsia della pelle utilizzando un round strumento biopsia pugno 4 mm e tenerlo in RPMI1640 terreno di coltura completo a 20 ° C ± 2 per un massimo di 4 ore oppure a 4 ° C ON. Elaborare la biopsia appena possibile all'arrivo in laboratorio.
    NOTA: più lunga conservazione di pelle influenzerà il rendimento delle cellule e la vitalità delle cellule.
  4. Etichettare un tubo blu-capped dissociazione e aggiungere 5 ml di terreno di coltura completo nel tubo etichettati.
  5. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura completo in ogni pozzetto (in totale 3 pozzi) di una piastra sterile cultura 6-bene. Utilizzare strumenti sterili per posizionare la biopsia in un singolo pozzetto, lavare, spostarlo verso un secondo pozzo e ripetere questo passo ancora una volta, ottenendo così un totale di tre risciacqui.
  6. Trasferire la biopsia cutanea ben sciacquati ad una piastra di Petri sterile, aggiungere 100 ml di mezzo di coltura completo sulla parte superiore della biopsia, e con attenzione raschiare il tessuto adiposo sottocutaneo utilizzando un bisturi sterile monouso acciaio inox.
    NOTA: Thè è un passaggio fondamentale.
  7. Tagliare ogni biopsia cutanea in 4 pezzi più piccoli su una piastra di Petri sterile. campioni di trasferimento (fino a quattro di biopsie di 4 mm per tubo) al tubo di dissociazione preparato contenente 5 ml di terreno di coltura completo.
  8. Chiudere bene le provette con il tappo, e collegare testa in giù per la manica del dissociatore tessuti automatizzato. Assicurarsi che tutto il materiale di esempio si trova nella zona del rotore.
  9. Avviare il processo di dissociazione eseguendo il "programma di m_spleen _01" (un programma predefinito fornito dalla memoria interna dello strumento o tramite la carta del programma accompagnati) per dissociare la biopsia alla velocità di rotazione appropriato per 56 sec.
  10. Dopo l'elaborazione, staccare il tubo di dissociazione dal dissociatore e assicurarsi che tutto il materiale dissociato viene raccolto sul fondo della provetta.
  11. Aggiungere 150 microlitri collagenasi IA (80 mg / ml) nel tubo di dissociazione e incubare il campione in un bagno d'acqua a 37° C per 60 min. Aggiungere 100 ml di DNasi I (5 MU / ml) nel tubo thedissociation, mescolare bene.
    NOTA: maggiore concentrazione di collagenasi o il tempo di incubazione più lungo altererà la vitalità delle cellule.
  12. Fissare il tubo di dissociazione al manicotto del dissociatore tessuti automatizzati ed eseguire il "programma di m_ milza _01" dissociare la biopsia ancora una volta.
  13. Inserire un 70 mM colino cella nylon sulla parte superiore di un tubo Falcon 50 ml. Applicare materiali campione dissociati a questo filtro per rimuovere cellule grumi di cellule / tessuti detriti.
  14. Lavare setaccio cellule una volta con 5 ml di terreno di coltura completo. Centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 10 minuti e aspirare il surnatante.
  15. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta. pellet cellulari risospendere in 300 ml di terreno di coltura completo. cella singola sospensioni sono pronti per ulteriori analisi; continuare con protocolli per colture cellulari ex vivo o citometria a flusso di analisi.
  16. In caso di ulteriore intracellular citochina colorazione, stimolare cellule con PMA (12,5 ng / ml), Ionomicina (500 ng / ml) e brefeldina a (5 mg / ml) per 4 ore a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per 4 ore prima di eseguire il flusso analisi di citometria.

2. Polyclonal attivazione delle cellule T della pelle-residente (Ex Vivo Cell Culture)

  1. Aliquota sospensioni monocellulari 100 pl (preparata al punto 1.15) in un piatto fondo rotondo a 96 pozzetti.
    NOTA: Per ciascuna mm biopsia 4 pelle, le sospensioni monocellulari acquisiti possono essere suddivisi in almeno due pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
  2. Aggiungere anti-CD3 / anti-CD28 mAb microsfere rivestite (25.000 perle per bene), ricombinante citochina umana rIL-2 (concentrazione finale 25 U / ml) e rIL-1b (concentrazione finale 50 ng / ml).
  3. Coprire la piastra di coltura con un coperchio piatto ben etichettato-, incubare 5% di CO 2, 100% di umidità, 37 ° C incubatore. Cambiare media quando il colore medio si trasforma in giallo.

3. Citometria a flusso Analisi di primaria / coltura le cellule della pelle-Resident T

  1. Preparare FACS buffer: PBS + 0,2% di BSA.
  2. Trasferire le cellule di interesse in una piastra a 96 pozzetti v-bottom. Centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante.
  3. Risospendere il pellet in 100 ml di PBS. Centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante.
  4. cellule macchia con 100 ml di eFluorescence780 preparati coniugati risolvibile colorante vitalità (1: 1000 diluizione utilizzando PBS) a 4 ° C per 30 min. Aggiungere 100 pl di tampone FACS, centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante.
  5. Scegliete il termine anticorpi monoclonali marcatore di superficie delle cellule, per esempio: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 01:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 01:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1,10), e CD1c-APC (AD5-8E7, 1,10), preparare gli anticorpi monoclonali miscela utilizzando tampone FACS in base ad ogni fattore di diluizione mAb testato. Definire le impostazioni del cancello utilizzando il controllo isotipo di anticorpo insieme con il campione non macchia.
  6. Aggiungere 25 ml di anticorpi monoclonali preparato miscela in ciascun pozzetto. Incubare 20 minuti a 20 ° C ± 2, proteggere dalla luce.
  7. Aggiungere 100 pl di tampone FACS, centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante.
  8. Per i campioni che richiedono soltanto la superficie di colorazione delle cellule, continuare con il passo 3.16.
  9. In caso di intracellulare colorazione Foxp3:
    1. Preparare fissazione e tampone permeabilizzazione miscelando una parte di concentrato con 3 parti di diluenti.
    2. Preparare buffer di permeabilizzazione 1x: 1 parte di 10x permeabilizzazione tampone + 9 parti di H 2 O. sterilizzato
  10. pellet Risospendere in 100 ml di fissazione e permeabilitampone zione, mescolare bene e incubare a 4 ° C per 30 min.
  11. Aggiungere 100 microlitri di buffer permeabilizzazione a ciascun pozzetto, centrifugare a 450 xg a temperatura ambiente per 2 minuti, e aspirare il surnatante.
  12. Lavare le cellule con tampone permeabilizzazione ancora una volta.
  13. Selezionare anticorpi monoclonali intracellulari necessario, ad esempio, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) e IFNγ-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Preparare l'impasto mAbs utilizzando tampone permeabilizzazione contenente 2% di siero normale di ratto in base ad ogni fattore di diluizione mAb testato. Definire le impostazioni del cancello utilizzando il controllo isotipo di anticorpo insieme con il campione non macchia.
  14. Aggiungere 20 ml di preparato MAB-composto in ogni pozzetto. Incubare a 4 ° C per 30 minuti, al riparo dalla luce.
  15. Dopo 30 minuti di incubazione, aggiungere 100 ml di tampone permeabilizzazione in tutti i pozzetti. Centrifugare a 20 ° C ± 2, 450 xg per 2 minuti, e aspirare il surnatante.
  16. Lavare le cellule con permeabilizzazione BuffeR ancora una volta. Risospendere il pellet in 110 ml di buffer di FACS, e sospensioni cellulari trasferimento in tubo microFACS.
    NOTA: Il campione è pronto per la misurazione della citometria a flusso a 10 colori.
  17. In caso di numero di cellule esatta richiesta, aggiungere 10 ml di sospensione uniforme ben miscelato di fluorosfere in ciascun campione immediatamente prima di eseguire misurazioni di citometria a flusso.

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Representative Results

Il protocollo presentato qui produrrà tra 2.200 ± 615 (media ± SEM, pelle di volontari sani) fino a 178.000 ± 760 (media ± SEM, cute lesionata dei pazienti affetti da psoriasi) linfociti vitali da pelle umana quando si utilizza un singolo 4 millimetri biopsia cutanea.

Diversi tipi di CD45 + cellule sono state identificate in cella singola sospensioni derivate dalla pelle di individui sani, tra cui CD4 + T-cellule (~ 45%), CD8 + T-cellule (~ 30%), e CD11c + DC (~ 5% ), mentre le poche cellule B (CD19 +), le cellule NK (CD56 + CD3 -), o monociti / macrofagi (CD14 + o CD1c +) sono stati osservati (Figura 1A). La metodologia consente anche per l'analisi di CD4 + CD25 + Foxp3 + cellule nelle biopsie della pelle umana. Utilizzando colorazione intracellulare dopo il fissaggio e permeabilizzazione, è possibile dimostrare espressione del fac trascrizionetor Foxp3 nelle cellule T CD25 + (Figura 1A).

cella singola sospensioni derivate da biopsie cutanee umane hanno mostrato un fondo high autofluorescenza in FL1 (CIC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (Pacific Blue) e FL10 (cromo arancione) canali usando un citofluorimetro (dati non riportati) . Per una corretta analisi della popolazione linfocitaria, si consiglia pertanto l'uso di un CD45 mAb anti-umano coniugato con una brillante Violet 421 fluorocromo per gating della popolazione dei linfociti e l'esclusione della popolazione di cellule autofluorescenti (Figura 1B). La maggior parte delle cellule residenti nella pelle umana erano cellule T CD3 + (Figura 1C). Per l'analisi la vitalità delle cellule, si raccomanda di utilizzare un colorante vitalità fissabile a distinguere praticabile da / cellule morenti morti (Figura 1C). In genere questo protocollo si traduce in 65,3% ± 7,7 (media ± SD) cellule vitali. Per ulteriori analisi di citometria a flusso di dati, è Advised al cancello sulla popolazione di cellule vitali, dal momento che le cellule morte o morenti perdono la loro integrità della membrana cellulare, e può non si legano specificamente anticorpo coniugato, aumentando così la colorazione di fondo.

Le cellule T isolate da questo protocollo sono adatti per ulteriori analisi funzionale. Utilizzando un singolo 4 millimetri biopsia della cute lesionale di pazienti affetti da psoriasi, è stato dimostrato che le cellule T derivate biopsia prodotte IL-17A e IFNγ seguente 4 stimolazione hr con PMA / ionomicina in presenza di brefeldina a (Figura 2).

Appena preparate sospensioni pelle cella singola da coinvolti lesioni cutanee psoriasiche possono anche essere usati per ulteriore ex vivo coltura cellulare e successiva analisi funzionale. Seguendo espansione dopo stimolazione policlonale con microsfere anti-CD3 / anti-CD28 mAb-rivestita in presenza di citochine pro-infiammatorie IL-1b o IL-23 per 8 giorni, le cellule possono ad esempio essere analizzati per la loro cytokine producendo capacità (Figura 3). In questo modo, è stata osservata una netta differenza tra la citochina produzione potenziale di cellule derivate da pelle di individui sani e psoriasi. Le cellule T da persone psoriasiche hanno mostrato una capacità molto più elevata per produrre la psoriasi associata IL17A citochine e IFNγ. Questo implica che, anche dopo ex vivo la cultura viene mantenuto un prototipo fenotipo psoriasi citochine, assente in caso di controlli sani.

Figura 1
Figura 1:. Diversi tipi di leucociti sono identificati in singola sospensioni cellulari derivate da pelle di individui sani linfociti residenti pelle isolato utilizzando il protocollo descritto nel testo sono stati colorati con gli anticorpi monoclonali coniugati a fluorocromi di interesse più colorante vitalità fissabile e immediatamente analizzati da citometria a flusso. (A) Flusso cyrilevazione tometric dei monociti (CD14), DC (CD11c), le cellule B (CD19), le cellule NK (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + e CD25 + Foxp3 + sottoinsiemi all'interno linfociti pelle residenti. CD45 anti-umano / BV421 mAb distingue linfociti dalle cellule autofluorescenti. Le strategie gating utilizzate per le cellule CD45 + è mostrato in (B). (C) percentuale di cellule T CD3 + CD45 + vitali dopo l'isolamento. Numero mostra la percentuale di cellule positive. Un esperimento rappresentativo di tre diversi esperimenti / donatori è mostrato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: le cellule T derivate da cute lesionata dei pazienti affetti da psoriasi possono produce IL-17A e IFNγ. Un solo 4 millimetri biopsia cutanea è stata presa dalla pelle lesionale della psoriasi paziente su via orale o consenso informato scritto per uso scientifico. Le cellule T pelle residenti sono stati isolati utilizzando il protocollo descritto nel testo. La produzione di IL-17A e IFNγ da parte delle cellule T della pelle residenti. accumulo intracellulare di citochine in risposta alla stimolazione 4 ore con PMA / ionomicina in presenza di brefeldina a stato misurato mediante citometria di flusso. è indicata la percentuale di cellule positive citochine. I dati di tre diversi pazienti sono mostrati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: le cellule T della pelle residenti sono in grado di produrre IL-17A e IFNγ seguente ex vivo A) o IL-23 (50 ng / ml, B) per 8 giorni. Successivamente, le cellule sono state stimolate per 4 ore con PMA / ionomicina in presenza di brefeldina a e successivamente analizzati per la produzione di citochine intracellulare mediante citometria di flusso. Un esempio rappresentativo di tre esperimenti indipendenti / donatori è mostrato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare in modo efficace le cellule T della pelle residenti da biopsie cutanee umane. Il vantaggio di questo protocollo è l'isolamento del numero relativamente elevato di linfociti vitali, ed esprimendo marcatori di superficie rilevanti. I sottoinsiemi di cellule identificate sono state: le cellule, CD11c + DCs CD4 + e cellule T CD8 + e Foxp3 + CD25 +. È importante sottolineare che, ex vivo coltura di cellule T della pelle isolato residenti era molto ben fattibile e ha permesso per la successiva analisi funzionale.

La pelle umana può essere dissociato in sospensioni monocellulari combinando dissociazione meccanica con degradazione enzimatica delle proteine ​​di adesione extracellulari che funzionano per mantenere l'integrità strutturale dei tessuti. Anche se dispasi separazione dello strato a base di epidermide e derma è un metodo ampiamente utilizzato per determinare infiltrazione di cellule in tali strati della pelle, abbiamo notato che dispasi trattamento ha portato toa riduzione rilevante superficie cellulare espressione del CD25 e CD27 (non mostrato). Poiché questi marcatori sono importanti per caratterizzare sottopopolazioni linfocitarie, riteniamo che dispasi influenze di trattamento successivo immunofenotipizzazione. Non è probabile che la rimozione del derma è responsabile della riduzione osservata in CD25 o CD27 cellule che esprimono, poiché in pelle di individui sani la maggior parte delle cellule T è localizzato nel derma mentre i numeri di cellule minuto T sono presenti nell'epidermide 10 -12. L'effetto nocivo della dispasi sulla capacità di proliferazione dei cheratinociti isolati stato segnalato in precedenza 13. Pertanto, l'uso prudente degli dispasi è garantito se la funzione delle cellule è l'obiettivo dello studio. Nel nostro protocollo abbiamo utilizzato il tipo Collagenasi I ottenere la sospensione singola cella di biopsie cutanee. Anche se Collagenasi I ha elevata attività rispetto al trittico Collagenasi IV e, quindi, è più dura, abbiamo scelto questa particolare Collagenasi perché è stato TEsted per la sua idoneità alla coltura cellulare. L'uso di un Collagenasi IV che è adatto per coltura cellulare potrebbe essere un futuro passo per ottimizzare ulteriormente il protocollo corrente.

Grazie alla sua natura, la pelle è altamente resistente alle forze di trazione e di disaggregazione meccanica. Finora, un'analisi completa delle cellule immunitarie nella pelle umana è stata ostacolata da difficoltà tecniche per ottenere il numero di cellule sufficiente nell'uso dei protocolli di digestione relativamente dure. Di conseguenza, la maggior parte degli studi pubblicati finora si basano su analisi immunoistochimica. L'isolamento diretto di cellule T CD4 + da biopsie cutanee è generalmente considerato ingombrante. Un'alternativa potrebbe essere l'uso di espianto pelle strisciare fuori culture 10. Tuttavia, questi prendono 2-3 settimane della cultura, e il mezzo espianto pelle contiene una serie selezionata di citochine e chemochine, che potrebbe condurre a scansione preferenziale di specifici sottogruppi di cellule T. Inoltre, il periodo di coltura potrebbe affetto,t il fenotipo delle cellule. Il protocollo attuale non fa uso di citochine aggiunto o chemochine, e l'espressione di CD4 (e anche altri marcatori cellulari) è ben conservata dopo l'isolamento, che consentano, sia fenotipiche e studio funzionale di popolazioni di cellule T direttamente dopo l'isolamento.

Un dissociatore tessuto automatizzato commercialmente disponibile è utilizzato per la dissociazione dei frammenti di pelle prima della loro incubazione con collagenasi, necessaria per la degradazione della matrice extracellulare. Per il successivo rilascio delle cellule dalla matrice extracellulare, dissociatore automatico viene utilizzato nuovamente. Sebbene vasta taglio manuale della pelle può produrre cellule numeri simili (dati non mostrati), i risultati sono meno consistenti e sono più dipendenti dalla esperienza dell'esecutore. La dissociazione della pelle utilizzando la procedura di pre-definita offerto dallo strumento darà risultati molto più riproducibili. In linea con precedenti studi che dimostrano che la pelle contiene vari leukocytes sottoinsiemi cellule DCs, CD8 + e CD4 + 2,14, CD11c +, e le cellule Foxp3 + sono stati osservati in popolazioni unicellulari predisposti dal protocollo presentato qui. È importante sottolineare che il protocollo produce una relativamente alta resa di linfociti vitali. Grazie all'efficienza del protocollo, particolarmente utile quando si studia materiale paziente, dove spesso solo una singola 4 millimetri biopsia cutanea può essere ottenuta. Utilizzando il metodo, siamo stati in grado di dimostrare che le cellule T isolate dalla cute lesionata dei pazienti affetti da psoriasi hanno mostrato una maggiore capacità di produrre IL-17A e IFNγ rispetto alla pelle sana 9.

A seconda della domanda di ricerca, può essere necessario purificare ulteriormente alcuni sottogruppi di cellule dopo la preparazione di sospensioni di cellule singole. In questo caso, più grandi pezzi di pelle possono essere utilizzati per assicurare la resa di cellule sufficiente per le analisi sottoinsieme. Nel fare ciò, assicurarsi che la pelle deve essere tagliato in piccoli piECE di circa 2 mm x 2 mm prima di iniziare il protocollo di isolamento.

In conclusione, il presente protocollo offre un modo migliore per isolare le cellule della pelle residenti, facilitando fenotipica significativa e analisi funzionale su un unico livello cellulare, migliorando in tal modo la nostra visione in pelle risposte immunitarie.

Passaggi critici nel protocollo corrente sono la corretta eliminazione del tessuto adiposo sottocutaneo e il taglio della pelle in pezzi più piccoli, soprattutto quando l'elaborazione più biopsia in un tubo di dissociazione. Il tessuto adiposo e / o grandi pezzi di tessuto farà sì che il dissociatore di lavorare in modo improprio, chiedendo repliche. In questo modo danneggiare gravemente la vitalità delle cellule. La limitazione della tecnica è che il numero di cellule derivate da una singola biopsia cutanea 4 mm sono sufficienti per successivo isolamento di sottoinsiemi di cellule.

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Acknowledgements

biopsie cutanee da pazienti affetti da psoriasi sono stati gentilmente forniti dal Dr. Andreas Koerber (dipartimento di Dermatologia presso l'Università di Essen, Germania) dopo il consenso orale o scritta informato per uso scientifico.

XH è anche supportato da NSFC 61.263.039 e 11.101.321 NSFC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

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References

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