Lymfocyt Isolering fra menneskehud for Fænotypisk Analyse og

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Menneskelig hud har en vigtig barriere funktion og indeholder forskellige immunceller, der bidrager til vævshomeostase og beskyttelse mod patogener. Da huden er relativt let at få adgang til, det giver en ideel platform til at studere perifere immun reguleringsmekanismer. Immune residente celler i sund hud adfærd immunosurveillance, men også spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​inflammatoriske hudsygdomme, såsom psoriasis. Trods nye indsigter, er vores forståelse af biologien bag forskellige inflammatoriske hudsygdomme stadig begrænset. Der er behov for god kvalitet (single) cellepopulationer isoleret fra biopsi hudprøver. Hidtil har isoleringsprocedurer blevet alvorligt hæmmet af en mangel på at opnå en tilstrækkeligt antal levedygtige celler. Isolering og efterfølgende analyse er også blevet påvirket af tabet af immun celle afstamning markører, som følge af den mekaniske og kemiske stress forårsaget af de nuværende dissociation for at opnåenkelt cellesuspension. Her beskriver vi en modificeret fremgangsmåde til isolering T-celler fra både sundt og involverede psoriatisk menneskehud ved at kombinere mekanisk hud dissociation anvendelse af en automatiseret væv dissociator og collagenase behandling. Denne metode bevarer udtryk for de fleste immune afstamning markører såsom CD4, CD8, Foxp3 og CD11c på udarbejdelsen af ​​enkelte celle suspensioner. Eksempler på vellykket CD4 + T-celle isolation og efterfølgende fænotypisk og funktionel analyse er vist.

Introduction

Huden, som den primære grænseflade mellem kroppen og miljøet, giver den første linje i forsvaret mod ydre fysiske, kemiske og biologiske fornærmelser såsom såret, ultraviolet stråling og mikroorganismer. Hud omfatter to hovedrum, epidermis og dermis, og indeholder en række af immunceller, herunder Langerhans celler, makrofager, dendritiske celler (DC'er), og omkring 20 milliarder hukommelses-T-celler, næsten dobbelt så mange til stede i hele blodvolumen 1 , to. En voksende mængde af data støtter den opfattelse, at huden har væsentlige immunologiske funktioner, både under vævshomeostase og i forskellige patologiske tilstande. Immunceller hjemmehørende i normal hud menes at gennemføre immunosurveillance 3 og er blevet vist at spille en rolle i udviklingen af inflammatoriske lidelser, såsom psoriasis 4. I psoriatisk læsionale hud, både CD4 + og CD8 + T-celler infiltreret var observed og det blev vist, at forholdet mellem CD4 og CD8 varierer afhængigt af sygdomsstatus 5. Men disse populationer af celler er vanskelige at undersøge, fordi eksisterende teknikker tillader isolering af kun få celler.

De for tiden udbredte teknikker til T-celle-isolation fra menneskehud kombinere mekanisk hud dissociation med enzymatisk behandling. Human hud biopsier er udførligt hakket og inkuberet med enzymer såsom trypsin, collagenase og / eller EDTA 6-8. I betragtning af at huden er en barriere væv, som er meget modstandsdygtigt over for trækkræfter og mekanisk opdeling, de etablerede fremgangsmåder til T-celle-isolation produceret meget få celler, og endda lavere antal af levedygtige celler, hvilket gør ex vivo celledyrkning af disse cellepopulationer vanskelig og udfordrende.

Her rapporterer vi en modificeret metode til at isolere lymfocytter fra både sundt og involverede psoriasis menneskelig hud ved at kombinere mechanical dissociation af huden ved hjælp af en automatiseret væv dissociator stedet for den etablerede metode ekstensivt hakning, sammen med enzymatisk fordøjelse ved hjælp af collagenase. Forskellige levedygtige immuncelleundergrupper herunder DC'er og T-celler blev observeret efter fremstilling af en enkelt-cellesuspension. Vigtigere ekspressionen af ​​overflademarkører CD3, CD4 og CD8 blev godt bevaret. Således fremstillede celler, er klar til brug i ex vivo cellekulturer eller flowcytometrisk analyse. Denne protokol er blevet anvendt med held til analyse af enkelte hudbiopsier (4 mm) afledt fra læsionale hud med psoriasis. Resultaterne viste, at huden resident patient T-celler produceret mere inflammatoriske cytokiner såsom IL-17 og IFNy sammenlignet med raske frivillige 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Hud biopsier fra raske individer blev opnået fra abdominal hud sidesten af ​​personer, der underkastes elektiv plastikkirurgi efter mundtlig eller skriftlig informeret samtykke til videnskabelig brug. Brugen af ​​human hud blev godkendt, og i overensstemmelse med reglerne, som de medicinske etiske komitéer fastsat for menneskelige forskning af Radboud University Medical Center, Nijmegen, Holland og universitetet i Essen, Tyskland.

1. Udarbejdelse af enkeltcellesuspensioner fra menneskelig hud (Work Sterile i en Flow-kabinettet, hvis Efterfølgende Cell Culture er påkrævet)

  1. Forbered cellekulturmedium: RPMI 1640 + penicillin / streptomycin (slutkoncentrationer 100 enheder / ml og 100 ug / ml) + pyruvat (0,02 mM) og glutamax (0,02 mM), uden serum tilsat.
  2. Forbered komplet dyrkningsmedium: dyrkningsmedium fremstillet i trin 1,1 + 10% humant poolet serum (HPS); opbevares ved 4 ° C. Bring medium til 20 ° C ± 2 foran osIng.
  3. Anskaf hudbiopsi ved hjælp af en 4 mm rund biopsitang instrument og holde det i RPMI1640 komplet dyrkningsmedium ved 20 ° C ± 2 for op til 4 timer eller ved 4 ° C ON. Proces biopsi så hurtigt som muligt ved ankomsten i laboratoriet.
    BEMÆRK: Længere lagring af huden vil påvirke celle udbytte og cellelevedygtighed.
  4. Mærk en blå-udjævnede dissociation rør og tilsættes 5 ml komplet dyrkningsmedium i den mærkede rør.
  5. Tilsæt 2 ml komplet dyrkningsmedium i hver brønd (i alt 3 brønde) af en steril 6-brønds dyrkningsplade. Brug sterile værktøjer til at placere biopsi i en enkelt brønd, skylles, flytte den over til en anden brønd og gentage dette trin én mere tid og således opnå i alt tre skylninger.
  6. Overfør godt skyllet hudbiopsi til en steril petriskål, tilsættes 100 pi komplet dyrkningsmedium på toppen af ​​biopsi, og omhyggeligt skrabe det subkutane fedtvæv under anvendelse af en rustfri stål engangs steril skalpel.
    BEMÆRK: Ther er et afgørende skridt.
  7. Skær hver hudbiopsi i 4 mindre stykker på en steril petriskål. Overfør prøver (op til fire af 4 mm biopsier pr rør) til den fremstillede dissociation rør indeholdende 5 ml komplet dyrkningsmedium.
  8. Tæt lukke rørene med hætten, og fastgør hovedet for at ærmet på den automatiske væv dissociator. Sikre, at alle prøvematerialet er beliggende i området af rotoren.
  9. Start dissociationsprocessen ved at køre "program m_spleen _01" (en foruddefineret program tilvejebragt af instrumentets interne hukommelse eller ved ledsaget program kort) at dissociere biopsi på et passende rotationshastighed for 56 sek.
  10. Efter bearbejdning afmontere dissociation røret fra dissociator og sikre, at alle de dissocierede materiale opsamles i bunden af ​​røret.
  11. Tilsæt 150 pi collagenase IA (80 mg / ml) i dissociation rør og inkuberes prøven i et rystevandbad ved 37° C i 60 min. Tilsæt 100 pi DNase I (5 MU / ml) i thedissociation rør, bland godt.
    BEMÆRK: Højere koncentration af collagenase eller længere inkubationstid vil ændre cellernes levedygtighed.
  12. Fastgør dissociation rør til ærmet på den automatiserede væv dissociator og køre "programmet m_ milt _01" at adskille biopsi én mere tid.
  13. Placer en 70 uM nylon cellefilter på toppen af ​​en 50 ml Falcon-rør. Påfør dissocierede prøvematerialer til denne celle si for at fjerne celleklumper / vævsrester.
  14. Vask cellefilter en gang med 5 ml komplet dyrkningsmedium. Centrifuge ved 20 ° C ± 2, 450 xg i 10 minutter og aspirat supernatant.
  15. Gentag vasketrinet en gang mere. Resuspender cellepellets i 300 pi komplet dyrkningsmedium. Encellede suspensioner er klar til yderligere analyse; fortsætte med protokoller for ex vivo-cellekultur eller flowcytometri analyse.
  16. I tilfælde af yderligere intracellular cytokin-farvning, stimulere celler med PMA (12,5 ng / ml), ionomycin (500 ng / ml) og Brefeldine A (5 ug / ml) i 4 timer ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 4 timer før udførelse flow cytometrianalyse.

2. Polyklonale Aktivering af Skin-Resident T-celler (Ex Vivo Cell Culture)

  1. Alikvote 100 pi encellede suspensioner (fremstillet i trin 1.15) i en rundbundet 96-brønds plade.
    NB: For hver af 4 mm hudbiopsi, kan de erhvervede enkelt-cellesuspensioner opdeles i mindst to brønde i en plade med 96 brønde.
  2. Tilføj anti-CD3 / anti-CD28 mAb-overtrukne mikroperler (25.000 perler per brønd), rekombinant humant cytokin rIL-2 (slutkoncentration 25 U / ml) og rIL-1 (slutkoncentration 50 ng / ml).
  3. Dæk kultur plade med en brønd-mærket plade låg, inkuberes i 5% CO2, 100% fugtighed, 37 ° C inkubator. Skift medium, når mediet farven bliver til gul.

3. flowcytometri Analyse af Primary / Dyrkede Skin-Resident T-celler

  1. Forbered FACS buffer: PBS + 0,2% BSA.
  2. Overfør celler af interesse i en v-bundplade med 96 brønde. Centrifuge ved 20 ° C ± 2, 450 xg i 2 min, og aspirat supernatant.
  3. Pellet resuspenderes i 100 pi PBS. Centrifuge ved 20 ° C ± 2, 450 xg i 2 min, og aspirat supernatant.
  4. Farv cellerne med 100 pi tilberedte eFluorescence780 konjugeret fixable viabilitetsfarvestoffet (1: 1.000 fortynding ved PBS) ved 4 ° C i 30 minutter. Tilsæt 100 pi FACS buffer, centrifuge ved 20 ° C ± 2, 450 xg i 2 min, og aspirat supernatant.
  5. Vælg ønsket celleoverflademarkør mAb'er, fx: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 01:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 01:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01:50), CD11 c-PeCy7 (BU15, 01:10), og CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), forberede mAbs-blanding ved hjælp FACS-buffer i henhold til hver testet mAb fortyndingsfaktor. Definer gate indstillinger ved hjælp isotypekontrol af antistof sammen med ikke-plet prøve.
  6. 25 pi af tilberedt mAb'er-blanding til hver brønd. Inkuber 20 min ved 20 ° C ± 2, beskytte mod lys.
  7. Tilsæt 100 pi FACS buffer, centrifuge ved 20 ° C ± 2, 450 xg i 2 min, og aspirat supernatant.
  8. For prøver, der kun kræver celleoverfladen farvning, fortsætte med trin 3.16.
  9. I tilfælde af intra-cellulær Foxp3 farvning:
    1. Forbered fiksering og permeabilisering buffer ved at blande en del af koncentratet med 3 dele af fortyndingsmidler.
    2. Forbered 1x permeabilisering buffer: 1 del af 10x permeabilisering puffersystemer + 9 dele steriliseret H 2 O.
  10. Resuspender pellets i 100 ul fiksering og permeabilining buffer, bland godt, og der inkuberes ved 4 ° C i 30 minutter.
  11. Tilsæt 100 pi permeabilisering buffer til hver brønd, centrifugeres ved 450 xg ved stuetemperatur i 2 minutter og aspirat supernatant.
  12. Vask cellerne med permeabilisering puffer en gang mere.
  13. Vælg intracellulære mAb'er, fx Foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) og IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Forbered mAb'er blandingen under anvendelse permeabilisering puffer indeholdende 2% normalt rotteserum henhold til hver mAb testede fortynding faktor. Definer gate indstillinger ved hjælp isotypekontrol af antistof sammen med ikke-plet prøve.
  14. Tilsæt 20 pi forberedt mAb-blanding til hver brønd. Inkuber ved 4 ° C i 30 min, beskytte mod lys.
  15. Efter 30 minutters inkubation tilsættes 100 pi permeabilisering puffer i hver brønd. Centrifuge ved 20 ° C ± 2, 450 xg i 2 min, og aspirat supernatant.
  16. Vask celler med permeabilisering buffer en gang til. Resuspender pellet i 110 pi FACS buffer og overførsel cellesuspensioner i microFACS rør.
    BEMÆRK: Prøven er klar til måling under anvendelse af 10-farve flowcytometri.
  17. I tilfælde af nøjagtige celletal nødvendig, tilsættes 10 pi velblandet ensartet suspension af fluorescerende partikler i hver prøve umiddelbart før udførelsen af ​​målinger ved anvendelse af flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen præsenteres her vil give mellem 2.200 ± 615 (gennemsnit ± SEM, hud raske frivillige) op til 178.000 ± 760 (gennemsnit ± SEM, læsionale hud af psoriasispatienter) levedygtige lymfocytter fra human hud, når du bruger en enkelt 4 mm hudbiopsi.

Forskellige typer af CD45 + celler blev identificeret i enkelt-cellesuspensioner afledt fra hud af raske individer, herunder CD4 + -T-celler (~ 45%), CD8 + T-celler (~ 30%), og CD11c + DC'er (~ 5% ), hvorimod få B-celler (CD19 +), NK-celler (CD56 + CD3 -), eller monocytter / makrofager (CD14 + eller CD1c +) blev observeret (figur 1A). Den metode giver også mulighed for analyse af CD4 + CD25 + Foxp3 + celler i humane hudbiopsier. Ved at anvende intracellulære farvning efter fiksering og permeabilisering, er det muligt at påvise ekspression af transkription factor Foxp3 i CD25 + -T-celler (figur 1A).

Single-cellesuspensioner afledt af humane hudbiopsier viste en høj autofluorescens baggrund i FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (pacific blå) og FL10 (krom orange) kanaler ved hjælp en cytometer (data ikke vist) . For korrekt analyse af lymfocyt befolkning, anbefaler vi derfor brug af en anti-humant CD45 mAb konjugeret med en Brilliant Violet 421 fluorokrom til gating af lymfocyt befolkning og udelukkelse af autofluorescerende cellepopulationen (figur 1B). De fleste af hjemmehørende celler i huden var CD3 + T-celler (Figur 1C). For cellernes levedygtighed analyse anbefales det at bruge en fixable levedygtighed farvestof til at skelne levedygtige fra døde / døende celler (Figur 1C). Typisk protokol resulterer i 65,3% ± 7,7 (middelværdi ± SD) levedygtige celler. For yderligere analyse af flowcytometri data, er det Advised til gate på det levedygtige cellepopulation, idet døde eller døende celler mister deres cellemembran integritet, og kan ikke-specifikt binder konjugeret antistof, og derved øge baggrundsfarvning.

T-celler isoleret ved denne protokol er velegnede til yderligere funktionel analyse. Ved anvendelse af en enkelt 4 mm biopsi af læsionale hud med psoriasis, blev det vist, at biopsi afledte T-celler produceret IL-17A og IFNy efter 4 hr stimulering med PMA / ionomycin i nærvær af Brefeldin A (figur 2).

Frisklavet encellede hud suspensioner fra involverede psoriasishudlæsioner kan også anvendes til yderligere ex vivo cellekultur og efterfølgende funktionel analyse. Efter ekspansion efter polyklonal stimulering med anti-CD3 / anti-CD28 mAb-overtrukne mikroperler i nærvær af de pro-inflammatoriske cytokiner IL-1 eller IL-23 i 8 dage, kan cellerne fx analyseres for deres cytokine producerende kapacitet (figur 3). Ved at gøre dette, blev en klar forskel mellem cytokinproducerende potentiale celler fra hud af sunde og psoriasis individer observeret. T-celler fra psoriatiske individer viste en meget højere kapacitet til at producere psoriasis associerede cytokiner IL17A og IFNy. Dette indebærer, at selv efter ex vivo-dyrkning en prototypisk psoriasis cytokin fænotype bevares, fraværende i tilfælde af raske kontroller.

figur 1
Figur 1:. Forskellige typer af leukocytter er identificeret i enkelt-cellesuspensioner afledt fra hud af raske individer Skin residente lymfocytter isoleret under anvendelse af protokollen beskrevet i teksten blev farvet med fluorokromkonjugerede mAb'er af interesse plus fixable viabilitetsfarvestoffet og straks analyseret ved flowcytometri. (A) Flow cytometric påvisning af monocytterne (CD14), DC'er (CD11), B-celler (CD19), NK-celler (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + og CD25 + Foxp3 + undersæt inden huden residente lymfocytter. Anti-Human CD45 / BV421 mAb skelner lymfocytter fra autofluorescerende celler. Gatingen strategier, der anvendes til CD45 + -celler er vist i (B). (C) Procentdel af levedygtige CD45 + CD3 + T-celler efter isolering. Nummer viser procentdelen af ​​positive celler. Et repræsentativt eksperiment ud af tre forskellige eksperimenter / donorer er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: T celler afledt fra læsionale hud med psoriasis kan produce IL-17A og IFNy. En enkelt 4 mm hudbiopsi blev taget fra læsionale hud psoriasis patient ved oralt eller skriftligt informeret samtykke til videnskabelig brug. De huden residente T-celler blev isoleret under anvendelse af protokollen beskrevet i teksten. Produktion af IL-17A og IFNy af skin residente T-celler. Intracellulær akkumulering af cytokiner som respons på 4 timer stimulering med PMA / ionomycin i nærvær af Brefeldin A blev målt ved flowcytometri. Procentdel af cytokin-positive celler er vist. Data for tre forskellige patienter er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Hud-resident T-celler er i stand til at producere IL-17A og IFNy efter ex vivo A) eller IL-23 (50 ng / ml, B) i 8 dage. Dernæst blev cellerne stimuleret i 4 timer med PMA / ionomycin i nærvær af Brefeldin A og derefter analyseret for intracellulær cytokinproduktion ved flowcytometri. Et repræsentativt eksempel ud af tre uafhængige eksperimenter / donorer er vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her præsenterer vi en protokol til effektivt at isolere huden hjemmehørende T-celler fra humane hud biopsier. Fordelen ved denne protokol er isoleringen af ​​relativt høje antal levedygtige lymfocytter og udtrykker relevante overflademarkører. Celleundergrupperne identificerede var: CD11c + DC'er, CD4 + og CD8 + T-celler og Foxp3 + CD25 + celler. Vigtigere, ex vivo kultur af isolerede hud residente T-celler var meget godt gennemførlig og tilladt til efterfølgende funktionelle analyse.

Menneskehud kan dissocieres i encellede suspensioner ved at kombinere mekanisk dissociation med enzymatisk nedbrydning af de ekstracellulære adhæsionsproteiner, som tjener til at opretholde den strukturelle integritet af væv. Selvom dispase baseret lag adskillelse af epidermis og dermis er en meget anvendt metode til bestemmelse celleinfiltration i disse respektive hudlag, bemærkede vi, at dispase behandling førte toa væsentlig reduktion af celleoverfladeekspression af CD25 og CD27 (ikke vist). Da disse markører er vigtigt at karakterisere lymfocytundergrupper, mener vi, at dispase behandling påvirkninger efterfølgende immunfænotypebestemmelse. Det er ikke sandsynligt, at fjernelsen af dermis er ansvarlig for den observerede reduktion i CD25 eller CD27-udtrykkende celler, eftersom i huden af raske individer størstedelen af T-celler er lokaliseret i dermis mens minut T celletal er til stede i epidermis 10 -12. Den skadelige virkning af dispase på spredning kapacitet isolerede keratinocytter er tidligere 13 blevet rapporteret. Derfor er forsigtig anvendelse af dispase berettiget, hvis cellefunktion er formålet med undersøgelsen. I vores protokol har vi brugt Collagenase type I for at opnå enkelt celle suspension af hud biopsier. Selvom collagenase I har høj tryptisk aktivitet sammenlignet med collagenase IV og er således mere skarpt, har vi valgt denne særlige Collagenase fordi det har været teplace for sin egnethed til cellekultur. Anvendelsen af ​​en collagenase IV, som er egnet til celledyrkning kan være en fremtidig trin for yderligere at optimere vores aktuelle protokol.

På grund af sin natur, huden er meget modstandsdygtigt over for trækkræfter og mekaniske opdeling. Hidtil har en omfattende analyse af immunceller i huden blevet vanskeliggjort af tekniske udfordringer med at få nok celle numre, når du bruger relativt barske fordøjelse protokoller. Som følge heraf er de fleste studier publiceret til dato stole på immunohistokemiske analyser. Den direkte isolering af CD4 + T-celler fra hudbiopsier anses generelt besværlig. Et alternativ kunne være brugen af huden eksplantatet kravle ud kulturer 10. Men disse tage, 2-3 ugers kultur, og huden eksplantation dyrkningsmediet indeholder et sæt valgt af cytokiner og kemokiner, som kunne føre til en privilegeret gennemgang af specifikke T-celle-undergrupper. Desuden kulturperioden kan affect fænotypen af ​​cellerne. Den nuværende protokol ikke gør brug af tilsatte cytokiner eller kemokiner, og ekspressionen af ​​CD4 (og også andre cellemarkører) er velbevaret efter isolering, der gør det muligt både fænotypiske og funktionelle studier af T-celle populationer direkte efter isolation.

Et kommercielt tilgængeligt automatiseret væv dissociator anvendes til dissociation af huden fragmenter før deres inkubation med collagenase, der kræves til nedbrydning af ekstracellulær matrix. For den efterfølgende frigivelse af cellerne fra den ekstracellulære matrix, er den automatiserede dissociator anvendes igen. Selvom omfattende manuel skæring af hud kan give lignende celleantal (data ikke vist), er resultaterne mindre konsekvent og er mere afhængige af kunstnerens oplevelse. Dissociation af huden ved hjælp af foruddefinerede procedure, der tilbydes af instrumentet vil give meget mere reproducerbare resultater. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at hud indeholder forskellige leukocytes delsæt 2,14, CD11c + DC'er, CD8 + og CD4 + T-celler, og Foxp3 + celler blev observeret i encellede befolkninger udarbejdet af den protokol, der præsenteres her. Vigtigt er det, protokollen giver et relativt højt udbytte af levedygtige lymfocytter. På grund af effektiviteten af ​​protokollen, især nyttig, når studerer patientmateriale, hvor ofte kan opnås kun en enkelt 4 mm hudbiopsi. Ved hjælp af metoden, var vi i stand til at vise, at T-celler isoleret fra det læsionale hud af psoriasispatienter viste en højere kapacitet til at producere IL-17A og IFNy i forhold til sund hud 9.

Afhængigt af problemstilling, kan det være nødvendigt yderligere at oprense visse celle-undergrupper efter fremstillingen af ​​enkeltcellesuspensioner. I dette tilfælde kan større stykker skind anvendes til at sikre udbyttet af tilstrækkelige celler til delmængde af analyser. Når du gør det, skal du sørge for, at huden skal skæres i mindre piECEs på ca. 2 mm x 2 mm før du starter isolation protokol.

Konklusionen er, at denne protokol giver en forbedret måde at isolere huden hjemmehørende celler, lette meningsfuld fænotypisk og funktionel analyse på en enkelt celle niveau, og derved forbedre vores indsigt huden immunreaktioner.

Kritiske trin i den nuværende protokol er den rette fjernelse af subkutant fedtvæv og opskæring af huden i mindre stykker, især ved behandling af mere end en biopsi i en dissociation rør. Fedtvæv og / eller store væv stykker vil få dissociator at arbejde forkert, beder om omvalg. Dette vil alvorlig skade cellernes levedygtighed. Begrænsningen af ​​teknikken er, at celleantal afledt af en enkelt 4 mm hudbiopsi er ikke nok til efterfølgende isolering af delmængder af celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Hud biopsier fra psoriasispatienter blev venligst stillet til rådighed af Dr. Andreas Koerber (Dermatology afdeling på University of Essen, Tyskland) efter oral eller skriftligt informeret samtykke til videnskabelig brug.

XH understøttes også af NSFC 61263039 og NSFC 11.101.321.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
  2. Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
  3. Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
  4. Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
  5. Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
  6. Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
  7. Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
  8. Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
  9. He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
  10. Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
  11. Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
  12. Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics