Lymfocyttisolasjonsmetoder fra menneskelig hud for fenotypeanalyser og

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Menneskets hud har en viktig barrierefunksjon og inneholder forskjellige immunceller som bidrar til vev homeostase og beskyttelse mot patogener. Når huden er relativt enkelt å få tilgang til, gir det en ideell plattform for å studere perifere immunreguleringsmekanismer. Immunhørende celler i frisk hud oppførsel immunosurveillance, men også spille en viktig rolle i utviklingen av inflammatoriske hudsykdommer, slik som psoriasis. Til tross for nye innsikter, er vår forståelse av biologi underliggende ulike inflammatoriske hudsykdommer fortsatt begrenset. Det er behov for god kvalitet (single) celle populasjoner isolert fra vevsprøve hudprøver. Så langt har isoleringsprosedyrer blitt alvorlig hemmet av mangel på å skaffe et tilstrekkelig antall levedyktige celler. Isolasjon og påfølgende analyse har også blitt påvirket av tap av immunceller avstamning markører, på grunn av mekanisk og kjemisk stress forårsaket av dagens dissosiasjon handlinger for å innhenteenkel cellesuspensjon. Her beskriver vi en modifisert metode for å isolere T-celler fra både sunn og involvert psoriasis menneskelig hud ved å kombinere mekanisk hud dissosiasjon ved hjelp av en automatisert vev dissociator og collagenase behandling. Denne metodikken bevarer uttrykk for de fleste immun avstamning markører som CD4, CD8, foxp3 og CD11c på utarbeidelse av enkeltcellesuspensjoner. Eksempler på vellykket CD4 + T-celler isolert og påfølgende fenotypiske og funksjonelle analyser er vist.

Introduction

Huden, som den primære grensesnittet mellom kroppen og miljøet, gir den første linjen i forsvaret mot ytre fysiske, kjemiske og biologiske fornærmelser som såret, ultrafiolett stråling og mikroorganismer. Hud består av to hovedrom, epidermis og dermis, og inneholder en rekke forskjellige immunceller, inkludert Langerhans-celler, makrofager, dendrittiske celler (DCS), og omtrent 20 milliarder minne-T-celler, nesten dobbelt så mange tilstede i hele blodvolumet 1 , 2. En voksende mengde data støtter forestillingen om at huden har viktige immunologiske funksjoner, både under vev homeostase og i ulike patologiske tilstander. Immunceller bosatt i normal hud er antatt å gjennomføre immunosurveillance 3 og har blitt vist å spille en rolle i utviklingen av inflammatoriske sykdommer slik som psoriasis 4. I psoriasis angrepne hud, både CD4 + og CD8 + infiltrert T-celler var observed og det ble vist at forholdet mellom CD4 og CD8 varierer avhengig av sykdomsstatus 5. Men disse populasjoner av celler som er vanskelige å studere fordi eksisterende teknikker tillater isolering av bare noen få celler.

Den tiden brukte teknikker for T-celle isolert fra menneskelig hud kombinerer mekanisk hud dissosiasjon med enzymatisk behandling. Menneskelig hud biopsier er i utstrakt hakket og inkuberes med enzymer som trypsin, collagenase og / eller EDTA 6-8. Tatt i betraktning at huden er en barriere vev som er meget motstandsdyktig mot strekkrefter og mekanisk dekomponering, de etablerte fremgangsmåter for T-celle-isolasjon produsert svært få celler, og til og med lavere antall levedyktige celler, noe som gjør ex vivo cellekultur av disse cellepopulasjoner vanskelig og utfordrende.

Her rapporterer vi en modifisert metode for å isolere lymfocytter fra både sunn og involvert psoriasis menneskelig hud ved å kombinere mechanical dissosiasjon av huden ved hjelp av en automatisert vev dissociator i stedet for den etablerte fremgangsmåten i stor utstrekning hakking, sammen med enzymatisk fordøyelse ved hjelp av kollagenase. Forskjellige immunlevedyktige celleundergrupper inkludert DC og T-celler ble observert etter fremstilling av en enkeltcellesuspensjon. Viktigere ekspresjonen av de overflatemarkører CD3, CD4 og CD8 ble godt bevart. Celler dermed forberedt, er klar til bruk i ex vivo cellekulturer eller flowcytometrisk analyse. Denne protokollen har blitt benyttet for analyse av enkelt hud biopsier (4 mm) avledet fra angrepne hud av psoriasispasienter. Resultatene viste at huden bosatt pasient T-celler produsert mer inflammatoriske cytokiner som IL-17 og IFNy i forhold til friske frivillige 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Hud biopsier fra friske individer ble oppnådd fra abdominal hud til overs for personer som gjennomgår elektiv plastisk kirurgi etter muntlig eller skriftlig informert samtykke for vitenskapelig bruk. Bruken av menneskelig hud ble godkjent og i samsvar med regelverket fastsatt av medisinske etiske komiteer for menneskelig forskning av Radboud University Medical Center, Nijmegen, Nederland og Universitetet i Essen, Tyskland.

1. Utarbeidelse av enkeltcelle utestengelse fra menneskelig hud (Work steril i en Flow-kabinett hvis Følgende Cell Culture er påkrevd)

  1. Fremstille cellekulturmedium: RPMI 1640 + penicillin / streptomycin (sluttkonsentrasjoner 100 enheter / ml og 100 ug / ml, henholdsvis) + pyruvat (0,02 mM) og Glutamax (0,02 mM), uten serum tilsatt.
  2. Forbered komplett dyrkingsmedium: kultur medium fremstilt i trinn 1,1 + 10% humant sammenslått serum (HPS); oppbevar ved 4 ° C. Bringe mediet til 20 ° C ± 2 før ossing.
  3. Skaff hudbiopsi ved hjelp av en 4mm runde biopsi slag instrument og holde den i RPMI1640 fullstendig kulturmedium ved 20 ° C ± 2 for opp til 4 timer eller ved 4 ° C ON. Behandle biopsi så snart som mulig etter ankomst i laboratoriet.
    MERK: Lengre lagring av huden vil påvirke celle yield og celle levedyktighet.
  4. Etikett en blå-avkortet dissosiasjon rør og tilsett 5 ml komplett kulturmedium i den merkede rør.
  5. Tilsett 2 ml fullstendig kulturmedium til hver brønn (totalt 3 brønner) med en steril 6-brønners kulturplate. Bruk sterile verktøy for å plassere biopsi i en enkelt brønn, skyll, flytte den over til en annen godt og gjenta dette trinnet en gang, og dermed oppnå en totalt tre skyllinger.
  6. Overfør godt skylt hudbiopsi til en steril petriskål, tilsett 100 mL av komplette kulturmediet på toppen av biopsi, og nøye skrape av underhudsfett vev ved hjelp av en rustfri sterilt skalpell.
    MERK: Ther er et kritisk punkt.
  7. Skjær hver hudbiopsi i 4 mindre stykker på en steril petriskål. Overføringsprøver (opptil fire av 4 mm biopsier per rør) til den klare for dissosiasjon rør inneholdende 5 ml fullstendig dyrkingsmedium.
  8. Tett lukke rørene med hetten, og fest opp ned til ermet av automatiserte vev dissociator. Sørge for at alle prøvemateriale ligger i området av rotoren.
  9. Start dissosiasjon prosessen ved å kjøre "program m_spleen _01" (en forhåndsdefinert program levert av instrumentet internminne eller ved ledsaget programkortet) for å distansere biopsien på riktig rotasjonshastighet for 56 sek.
  10. Etter behandling, løsne dissosiasjon røret fra dissociator og sørge for at alt det dissosierte materialet samles i bunnen av røret.
  11. Tilsett 150 pl kollagenase IA (80 mg / ml) inn i røret dissosiasjon og inkuberes prøven i et ristende vannbad ved 37° C i 60 min. Tilsett 100 ul av DNase I (5 MU / ml) i thedissociation rør, bland godt.
    MERK: Høyere konsentrasjon av kollagenase eller lengre inkubasjonstid vil endre celle levedyktighet.
  12. Fest dissosiasjon røret til ermet av automatiserte vev dissociator og kjør "program M_ milt _01" for å distansere biopsien en gang til.
  13. Plasser en 70 pM nyloncellefilter på toppen av et 50 ml Falcon-rør. Påfør dissosierte prøvemateriale til denne cellen sil for å fjerne celleklumper / vev rusk.
  14. Vask cellefilter en gang med 5 ml fullstendig dyrkingsmedium. Sentrifuger ved 20 ° C ± 2, 450 xg i 10 minutter og supernatanten aspireres.
  15. Gjenta vasketrinnet en gang til. Resuspender cellepelletene i 300 ul av fullstendig kulturmedium. Encellede suspensjoner er klar for videre analyse; fortsette med protokoller for ex vivo cellekultur eller strømningscytometri-analyse.
  16. Ved ytterligere intracellular cytokin farging, stimulere cellene med PMA (12,5 ng / ml), Ionomycin (500 ng / ml) og Brefeldine A (5 mikrogram / ​​ml) i 4 timer ved 37 ° C, 5% CO2 inkubator i 4 timer før utføring strømnings cytometri analyse.

2. Polyklonale Aktivering av Skin-Resident T-celler (Ex Vivo Cell Culture)

  1. Delmengde 100 ul enkeltcellesuspensjoner (fremstilt i trinn 1.15) inn i en rundbunnet 96-brønns plate.
    NB: For hver av 4 mm hud biopsi, kan de innsamlede enkeltcellesuspensjoner bli delt inn i minst to brønner i en 96-brønns plate.
  2. Legg til anti-CD3 / anti-CD28-mAb-belagte mikrokuler (25.000 perler per brønn), rekombinant, humant cytokin rIL-2 (sluttkonsentrasjon 25 U / ml) og rIL-1 p (sluttkonsentrasjon 50 ng / ml).
  3. Dekk kulturplaten med en godt merket plate lokk, inkuberes i 5% CO2, 100% fuktighet, 37 ° C inkubator. Endre medium når mediet fargen blir til gul.

3. Flowcytometri analyse av primær / Dyrkede Skin-Resident T celler

  1. Forbered FACS buffer: PBS + 0,2% BSA.
  2. Overfør cellene av interesse i en v-bunn 96-brønns plate. Sentrifuger ved 20 ° C ± 2, 450 x g i 2 min, og aspirer supernatanten.
  3. Resuspender pelleten i 100 pl PBS. Sentrifuger ved 20 ° C ± 2, 450 x g i 2 min, og aspirer supernatanten.
  4. Flekk-celler med 100 ul fremstilte eFluorescence780 konjugerte festbar levedyktighet fargestoff (1: 1000 fortynning ved å bruke PBS) ved 4 ° C i 30 min. Tilsett 100 ul FACS-buffer, sentrifuger ved 20 ° C ± 2, 450 x g i 2 min, og aspirer supernatanten.
  5. Velg ønsket celleoverflaten markør mAbs, for eksempel: CD45-BV421 (HI30, 01:20), CD3-ECD (UCHT1, 01:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 01:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 01:50), CD56-PE (MEM-188, 01:50), CD25-PeCy7 (BC96, 01:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 01:10), og CD1c-APC (AD5-8E7, 01:10), forberede mAbs-blandingen ved hjelp av FACS buffer i henhold til hver mAb fortynningsfaktoren testet. Definer gate innstillinger ved hjelp isotypekontrollantistoff av antistoff sammen med ikke-flekken prøve.
  6. Legg 25 ul av klare for mAb-blandingen i hver brønn. Inkuber 20 min ved 20 ° C ± 2, beskytte mot lys.
  7. Tilsett 100 ul FACS-buffer, sentrifuger ved 20 ° C ± 2, 450 x g i 2 min, og aspirer supernatanten.
  8. For prøver som bare krever celleoverflaten flekker, fortsetter du med trinn 3.16.
  9. Ved intracellulær foxp3 farging:
    1. Forbered fiksering og permeabiliseringsbuffer ved å blande en del av konsentratet med 3 deler av fortynningsmidler.
    2. Forbered 1x permeabiliseringsbuffer: en del av 10x permeabiliseringsbuffer + 9 deler sterilisert H 2 O.
  10. Resuspender pellets i 100 mL av fiksering og permeabililise buffer, bland godt, og inkuber ved 4 ° C i 30 min.
  11. Tilsett 100 ul permeabiliseringsbuffer til hver brønn, sentrifuger ved 450 xg ved romtemperatur i 2 min, og aspirer supernatanten.
  12. Vask cellene med permeabiliseringsbuffer en gang til.
  13. Velg nødvendige intracellulære mAbs, for eksempel, foxp3-eFluo450 (PCH101, 01:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 01:50) og IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Fremstille mAbs blandingen ved hjelp av permeabiliseringsbuffer som inneholdt 2% normalt rotteserum i henhold til hver mAb fortynningsfaktoren testet. Definer gate innstillinger ved hjelp isotypekontrollantistoff av antistoff sammen med ikke-flekken prøve.
  14. Tilsett 20 ul klare for mAb-blandingen i hver brønn. Inkuber ved 4 ° C i 30 min, beskytte mot lys.
  15. Etter 30 min inkubering, tilsett 100 ul permeabiliseringsbuffer i hver brønn. Sentrifuger ved 20 ° C ± 2, 450 x g i 2 min, og aspirer supernatanten.
  16. Vask celler med permeabilization buffer en gang til. Resuspender pellet i 110 mL av FACS buffer, og overføre cellesuspensjoner i microFACS tube.
    MERK: Sample er klar for måling med 10-farge flowcytometri.
  17. Ved eksakt celle nummer nødvendig, legge til 10 mL av godt blandet ensartet suspensjon av Fluorosfærer i hver prøve rett før du utfører målinger ved hjelp av flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen som presenteres her vil gi mellom 2200 ± 615 (gjennomsnitt ± SEM, hud hos friske frivillige) opp til 178 000 ± 760 (gjennomsnitt ± SEM, angrepne hud av psoriasispasienter) levedyktige lymfocytter fra menneskelig hud når du bruker en enkel 4 mm hudbiopsi.

Forskjellige typer av CD45 + celler ble identifisert i enkeltcellesuspensjoner avledet fra hud hos friske individer blant CD4 + T-celler (~ 45%), CD8 + T-celler (~ 30%), og CD11c + DC (~ 5% ), mens noen B-celler (CD19 +), NK-celler (CD56 + CD3 -), eller monocytter / makrofager (CD14 + eller CD1c +) ble observert (Figur 1a). Metodikken gir også mulighet for analyse av CD4 + CD25 + foxp3 + celler i menneskelig hud biopsier. Ved å benytte intracellulær farging etter montering og permeabiliseringen, er det mulig å påvise ekspresjonen av transkripsjons factor foxp3 i CD25 + T-celler (figur 1A).

Encellede suspensjoner avledet fra menneskelig hud biopsier viste en høy autofluorescence bakgrunn i FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD), FL9 (pacific blue) og FL10 (krom oransje) kanaler som bruker en cytometer (data ikke vist) . For korrekt analyse av lymfocytt-populasjonen, anbefaler derfor bruken av en anti-human CD45 mAb konjugert med en Brilliant Violet 421 fluorokrom for portstyring av den lymfocyttpopulasjon og utelukkelse av autofluorescent cellepopulasjon (figur 1B). Flertallet av fastboende celler i menneskelig hud var CD3 + T-celler (figur 1C). For celleviabilitet analyse anbefales det å bruke et fikses levedyktighet fargestoff for å skille levedyktig fra døde / døende celler (figur 1C). Vanligvis denne protokollen resulterer i 65,3% ± 7,7 (gjennomsnitt ± SD) levedyktige celler. For ytterligere analyse av flowcytometri data, er det Advised til porten på den levedyktige cellepopulasjon, da døde eller døende celler miste deres cellemembranintegritet, og kan ikke bindes spesifikt antistoff, og dermed øke bakgrunnsfarging.

T-celler isolert ved denne protokollen er godt egnet for ytterligere funksjonell analyse. Ved å bruke en enkelt 4 mm biopsi av angrepne hud av psoriasispasienter, ble det vist at biopsi avledet av T-celler IL-17A og IFNy følgende fire timers stimulering med PMA / ionomycin i nærvær av Brefeldin A (figur 2).

Nylaget encellede hud suspensjoner fra involverte psoriasis hudlesjoner kan brukes også for ytterligere ex vivo cellekultur og påfølgende funksjonell analyse. Etter ekspansjon etter polyklonal stimulering med anti-CD3 / anti-CD28-mAb-belagte mikrokuler i nærvær av det pro-inflammatoriske cytokiner IL-1 eller IL-23 i 8 dager, kan cellene for eksempel bli analysert for deres cytokine produserende kapasitet (figur 3). Ved å gjøre dette, ble det observert en klar forskjell mellom det cytokin produksjon av potensialet av celler avledet fra hud hos friske og psoriasis individer. T-celler fra psoriatiske individer viste en mye høyere kapasitet til å produsere den psoriasis forbundet cytokiner IL17A og IFNy. Dette innebærer at selv etter ex vivo kulturen en prototypisk psoriasis cytokin fenotype opprettholdes, fraværende i tilfelle av friske kontroller.

Figur 1
Fig. 1: Forskjellige typer av leukocytter er identifisert i enkeltcellesuspensjoner avledet fra hud hos friske individer folie hørende lymfocytter isolert ved anvendelse av protokollen som er beskrevet i teksten ble farget med fluorokromkonjugerte-konjugerte mAb'er i området pluss rettes levedyktighet fargestoff og umiddelbart analysert ved hjelp flowcytometri. (A) Flow cytometric påvisning av monocytter (CD14), DC (CD11c), B-celler (CD19), NK-celler (CD56 + CD3 -), CD4 +, CD8 + og CD25 + foxp3 + undergrupper innenfor huden bosatt lymfocytter. Anti-Human CD45 / BV421 mAb skiller lymfocytter fra autofluorescent celler. Lede strategier som brukes for CD45 + celler er vist i (B). (C) Prosent av levedyktig CD45 + CD3 + T-celler etter isolasjon. Antall viser prosentandelen av positive celler. En representant eksperiment av tre forskjellige eksperimenter / givere vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: T-celler avledet fra angrepne huden av psoriasispasienter kan Produce IL-17A og IFNy. En enkelt 4 mm hudbiopsi ble tatt fra angrepne hud psoriasis pasient ved muntlig eller skriftlig informert samtykke for vitenskapelig bruk. De hud bosatt T-celler ble isolert ved anvendelse av protokollen beskrevet i teksten. Produksjon av IL-17A og IFNy ved hud hørende T-celler. Intracellulær akkumulering av cytokiner i respons til 4 timers stimulering med PMA / ionomycin i nærvær av Brefeldin A ble målt ved flow-cytometri. Prosentandelen av cytokin-positive celler er vist. Data over tre forskjellige pasienter vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Skin-resident T-celler er i stand til å produsere IL-17A og IFNy følgende ex vivo A) eller IL-23 (50 ng / ml, b) i 8 dager. Deretter ble cellene stimulert i 4 timer med PMA / ionomycin i nærvær av Brefeldin A og deretter analysert for intracellulær cytokinproduksjon ved hjelp av strømningscytometri. Et representativt eksempel ut av tre uavhengige eksperimenter / givere vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en protokoll for å effektivt isolere huden bosatt T-celler fra menneskelig hud biopsier. Fordelen med denne protokollen er isolasjon av relativt høye antall av levedyktige lymfocytter, og som uttrykker relevante overflatemarkører. Cellen undergrupper identifisert var: CD11c + dansk sokkel, CD4 + og CD8 + T-celler og foxp3 + CD25 + celler. Viktigere, ex vivo kultur isolert hud bosatt T-celler var veldig godt mulig og lov for påfølgende funksjonell analyse.

Human hud kan bli dissosiert til enkeltcellesuspensjoner ved å kombinere mekanisk dissosiasjon med enzymatisk nedbrytning av de ekstracellulære adhesjonsproteiner som virker til å opprettholde den strukturelle integriteten til vevene. Selv dispase basert lag separasjon av epidermis og dermis er en mye brukt metode for å bestemme celleinfiltrasjon i disse respektive hudlagene, la vi merke til at dispase behandling førte to en vesentlig reduksjon av celleoverflate-ekspresjon av CD25 og CD27 (ikke vist). Ettersom disse markørene er viktig å karakterisere lymfocytter undergrupper, tror vi at dispase behandling påvirkninger påfølgende immunfenotyping. Det er ikke sannsynlig at fjerning av dermis er ansvarlig for den observerte reduksjonen i CD25 eller CD27 uttrykkende celler, da det i hud hos friske individer flertallet av T-celler som er lokalisert i dermis mens minutt T-celle-tallene er til stede i epidermis 10 -12. Den ødeleggende effekt av dispase på proliferasjonen kapasiteten av isolerte keratinocytter har blitt rapportert tidligere 13. Derfor blir forsiktig bruk av dispase garantert hvis cellefunksjon er målet for studien. I vår protokollen har vi brukt Collage type I å skaffe enkelt celle suspensjon av hud biopsier. Selv om Kollagenase I har høy tryptisk aktivitet sammenlignet med Collagenase IV, og således er mer skarpt, har vi valgt denne bestemte Kollagenase fordi det har vært tekorrigert for sin egnethet for cellekultur. Bruken av en Kollagenase IV som er egnet for cellekultur kan være et fremtidig skritt for ytterligere å optimalisere vår nåværende protokoll.

På grunn av sin natur, er huden svært motstandsdyktig mot strekkrefter og mekanisk dekomponering. Så langt har en omfattende analyse av immunceller i menneskelig hud blitt hemmet av tekniske utfordringer med å skaffe nok celle tall når du bruker relativt harde fordøyelsen protokoller. Som en konsekvens er de fleste studier publisert til dags dato er avhengige av immunhistokjemiske analyser. Den direkte isolering av CD4 + T-celler fra hud biopsier er generelt ansett tungvint. Et alternativ ville være bruk av huden eksplantering krype ut kulturer 10. Men disse tar 2-3 uker med kultur, og huden eksplantatet kulturmediet inneholder et sett utvalgt av cytokiner og kjemokiner, som kan føre til preferensiell gjennomsøking av spesifikke T-celleundergrupper. I tillegg dyrkningsperioden kan affect fenotypen av cellene. Den nåværende protokollen gjør ikke bruk av tilsatte cytokiner eller chemokiner, og uttrykk for CD4 (og også andre cellemarkører) er godt bevart etter isolering, slik at både fenotypiske og funksjonelle studier av T-cellepopulasjoner direkte etter isolering.

Et kommersielt tilgjengelig automatisert vev dissociator brukes for dissosiasjon av hud-fragmenter før deres inkubasjon med kollagenase som er nødvendig for degradering av ekstracellulær matriks. For den etterfølgende frigjøring av cellene fra den ekstracellulære matriks, blir automatisert dissociator brukes på nytt. Selv om omfattende manuell klipping av hud kan gi lignende celle tall (data ikke vist), er resultatene mindre konsekvent og er mer avhengig av utøveren erfaring. Dissosiasjon av huden ved hjelp av en forhåndsdefinert prosedyre som tilbys av apparatet vil gi mye mer reproduserbare resultater. I samsvar med tidligere studier som viser at huden inneholder ulike leukocytes undergrupper 2,14, CD11c + DCS, CD8 + og CD4 + T-celler, og foxp3 + celler ble observert i encellede populasjoner utarbeidet av protokollen presenteres her. Viktigere, gir protokollen et forholdsvis høyt utbytte av levedyktige lymfocytter. På grunn av effektiviteten av protokollen, er det spesielt nyttig når man studerer pasientmateriale, hvor ofte bare en enkelt 4 mm hud biopsi kan oppnås. Ved hjelp av metoden, var vi i stand til å vise at T-celler isolert fra angrepne huden av psoriasispasienter viste en høyere kapasitet til å produsere IL-17A og IFNy i forhold til sunn hud 9.

Avhengig av problemstilling, kan det være nødvendig å ytterligere rense visse celleundergrupper etter fremstillingen av enkeltcellesuspensjoner. I dette tilfelle kan større deler av hud benyttes for å sikre at utbyttet av tilstrekkelig antall celler for delsett analyser. Når du gjør dette, sørg for at huden skal kuttes i mindre pieces på rundt 2 mm x 2 mm før du starter isolasjon protokollen.

I konklusjonen, protokoll gir en bedre måte å isolere huden bosatt celler, tilrettelegging menings fenotypiske og funksjonell analyse på en enkelt celle nivå, og dermed forbedre vår innsikt i hudens immunresponser.

Kritiske trinn i den aktuelle protokoll er forsvarlig fjerning av subkutane fettvev og kutting av huden i mindre biter, særlig ved behandling av mer enn en biopsi i en dissosiasjon rør. Fettvev og / eller store biter vev vil føre til at dissociator å jobbe feil, ber om re-løper. Dette vil alvorlig skade cellenes levedyktighet. Begrensningen av teknikken er at celle tall avledet fra en enkelt 4 mm hud biopsi er ikke nok for etterfølgende isolering av undergrupper av celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Skin biopsier fra psoriasispasienter ble vennlig levert av Dr. Andreas Koerber (Dermatology avdeling ved Universitetet i Essen, Tyskland) etter muntlig eller skriftlig informert samtykke for vitenskapelig bruk.

XH støttes også av NSFC 61263039 og NSFC 11101321.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman - Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman - Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman - Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman - Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman - Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman - Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
  2. Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
  3. Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
  4. Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
  5. Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
  6. Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
  7. Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
  8. Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
  9. He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
  10. Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
  11. Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
  12. Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics