腫瘍の病因に候補協同遺伝子の機能ゲノム解析のためのモザイクゼブラフィッシュ遺伝子導入

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Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

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Abstract

Introduction

癌は、経時的な病理学的突然変異、欠失、および染色体ゲインの蓄積によって特徴付けプログレッシブ疾患である。これらの遺伝的異常は、低酸素症応答を強調して細胞骨格の細胞周期、細胞死、エネルギー代謝および組立に至るまで多数の細胞プロセスに影響を与えることができる。したがって、腫瘍形成は、生物学的プロセスのスペクトルにわたって複数の遺伝子異常の集団行動を反映している。全ゲノムシーケンシング、exomeシーケンシング、目標とシーケンシング、深いシーケンシングおよびゲノムワイド関連解析を含む最近の統合的なゲノム研究の努力は、腫瘍1-4の本質的にすべてのタイプの小説遺伝子変異の数が増えを同定した。多くの場合、遺伝的病変は、疾患の病因の協力を示唆し、非ランダム様式5-8で一緒に起こる。 Fを生じた異常に発現する遺伝子の大規模な配列の発癌性の役割を解剖ロムこれらのゲノムの病変は、新たな治療戦略を考案すると、これらの薬剤に対する腫瘍細胞の応答を理解する必要があるが、これは困難な作業であることが判明している、 ハイスループット機能ゲノム解析を行うための非常に強固な動物モデル系を必要とする生体内

哺乳動物、特にげっ歯類は、癌生物学で好まモデルですが、ゼブラフィッシュは、かなりの注目を集め始めている。硬骨魚ゼブラフィッシュ( ダリオフィッシュは、1960年代から開発調査のためのモデル生物として使用されており、最初の1982年9-11に腫瘍病因の研究に適用した。メンテナンス、小さなボディサイズ、および高い繁殖力やすさは、ゼブラフィッシュの大規模フォワード遺伝子スクリーニングのための堅牢なモデルは、異常なおよび病理学的表現型10を付与する変異を同定することを可能にする。ゼブラフィッシュの胚の光透過性のように、この癌モデルの普及を支えるもう一つの重要な特徴であるそれは、リアルタイム9にげっ歯類12が比較的困難であるアプリケーションを、腫瘍の発達を見つけるために実施されるin vivoイメージングを可能にする。ゼブラフィッシュリファレンスゲノム(Zv9)の最近の比較ゲノム解析は、71%で82%が男性でのオンラインメンデル遺伝(OMIM)データベース13における疾患関連遺伝子と相関しているのヒトオルソログを有するとともに、26206タンパク質をコードする遺伝子を明らかにし、 14。したがって、ゼブラフィッシュは、神経芽細胞腫8を含むヒトの癌、多様なタイプの、T細胞急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)15,16、17,18黒色腫、ユーイング肉腫19、横紋筋肉腫20,21、膵臓癌をモデル化するために使用されている22、肝細胞癌23および骨髄性悪性疾患24,25を 、そして異種移植研究11,26用癌モデルとして選択されている。

安定したトランスジェニックゼブラフィッシュにおけるアプローチは、一般的に、機能獲得正常な発生または疾患の病因27,28における遺伝子の影響を研究するために使用される。このようなモデル( 図1A)を開発するためには、一細胞の野生型胚に組織特異的プロモーターにより駆動される目的の遺伝子を含むDNA構築物を注入する。注入された胚は性的に成熟する際に3〜4ヶ月の注射後、それらは創設者の魚としてそれらをライセンス供与し、それらの生殖細胞、構​​築物のDNAの組込みを示すものをスクリーニングするために、野生型の魚と外部交配されている。そのようなコピー数および導入遺伝子の組み込み部位、などの多くの要因が、安定したトランスジェニック系統における導入遺伝子の発現に影響を​​与える。したがって、トランスジェニック腫瘍モデルを開発するために、単一の癌遺伝子を過剰発現する複数の安定したトランスジェニック系統を最初に生成し、腫瘍誘発につながるかもしれないレベルで導入遺伝子を発現する線についてスクリーニングされなければならない。しかし、候補oの過剰発現ncogene生殖細胞に対して毒性であり、直接導入遺伝子29を過剰発現させることによって、安定したトランスジェニック系統を生成することは困難である。したがって、このアプローチは、適切な癌モデルを生成するために失敗のリスクが高いと、時間がかかること。

ここで、我々は、in vivoでの機能的ゲノム研究のための伝統的な安定した形質転換を介して独自の利点を提供するモザイク一過性遺伝子導入( 図1B)に基づいて、別の戦略を示している。このアプローチでは、1つ以上の導入遺伝子構築物は、トランスジェニックまたは野生型の胚の1細胞期に注入される。導入遺伝子を含有する注入されたDNA構築物は、個々の魚30内の複数の細胞集団内の混合遺伝子型をもたらし、その後、モザイク状にランダムに一次注入した魚に統合である。また、1細胞胚における複数のDNA構築物の同時注入は、TRAに1を許可する、ランダムな部位での同じ細胞に統合を共同につながる導入遺伝子の発現で細胞をCEとモザイク動物31における疾患の病因の間に異なる遺伝子の相互作用を探る。原理の証明として、我々は一過性に、野生型魚とMYCN過剰発現するトランスジェニック魚のドーパミンベータヒドロキシラーゼ(DのβH)プロモーターの制御下に末梢交感神経系(PSNS)にmCherryをレポーター遺伝子と突然変異的に活性化ALKを(F1174L)過剰発現さ。受容体チロシンキナーゼをコードするALK、高リスク神経芽5-7,32,33において最も頻繁に変異している遺伝子である。ALK(F1174L)は 、活性化変異を最も頻繁に強力な体細胞の一つとして、で過剰表現されMYCN-高リスク神経芽腫患者を増幅し、安定したトランスジェニックマウスおよびトランスジェニックゼブラフィッシュモデル8,34,35の両方で神経芽細胞腫腫瘍形成を加速するMYCNの過剰発現と相乗作用。モザイクによって、MYCN遺伝子導入魚におけるmCherryを持つALK(F1174L)の一過性の過剰発現は、私たちはモザイク遺伝子導入戦略が急速にかつ効率的に使用することができることを示唆し、ALK(F1174L)MYCNの両方を過剰発現する安定したトランスジェニック魚で観察された腫瘍の発症の加速を再現したin vivoでの腫瘍の開始の複数の癌遺伝子の相対的な貢献を評価する。

Protocol

注:すべてのゼブラフィッシュの研究や動物の維持管理は、メイヨークリニック研究所IACUC承認されたプロトコル#A41213と一致して行われた。

遺伝子導入のための1。DNA構築

  1. DNAテンプレートとして(BACPACリソースセンター(BPRC)から)CH211-270H11 BACクローンを用いて5.2 kbのドーパミンβヒドロキシラーゼさ(dβH)プロモーター領域8を増幅する。 2分間94°C(94°C、15秒、50℃、10サイクルの30秒、68℃:長いDNA鋳型の長さの正確なPCR増幅のためのPCRシステムの適切かつPCRのための以下のサイクルプログラムを使用(94℃、15秒、53℃、30秒、68℃、8分)、68℃、4分(フォワードプライマー5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 'の30サイクル、続いてC、8分)リバースプライマー5'GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ')。
  2. DβH-pDONRP4-P1RエントリーCLOを作成します。そのようなマルチサイトゲートウェイとして商業的組換えクローニングシステムを用いね8。 (他のゲートウェイベクトルは博士カイビンチェン、大学からの寛大な贈り物ですと共に。ユタ)を精製DβHPCR産物(172 ng /μLで)、1μL(150 ng /μLで)pDONRP4-P1Rドナーベクターの1μLを混ぜる、BPクロナーゼ酵素ミックスの2μlのTEバッファー4μlの(pH8.0)を、25℃で1時間インキュベートした後、ワンショットTOP10 コンピテントに変換大腸菌製造業者のプロトコルに従って。
  3. EGFP-MYCN遺伝子導入コンストラクト8ステップ1.2で述べた組換えクローニングシステムを使用して:DのβHを生成します。 EGFPは、停止コドンを欠いている、5.2 kbのDβHのプロモーターを含む各エントリークローン(150 ng /μLで)(DβH-pDONR P4-P1R構築物)の1μLを混ぜる(PME-EGFPを構築)、およびヒトMYCNのcDNA(寛大な贈り物ペンシルベニア州の小児病院のDr. Hogarty、MYCN-pDONRP2R-からI-SceIの認識部位を含有する改変デスティネーションベクター(博士C. Grabher、カールスルーエ大学、カールスルーエ、ドイツ)からの寛大な贈り物、TEバッファー4μlの(のP3構築物)、1μL(150 ng /μLで) LRクロナーゼ酵素ミックス2μlのでpH8.0)、25℃で1時間インキュベートした後、化学的にコンピテントに変換大腸菌のようなワンショットトップ10と、製造業者のプロトコルに従ってください。
  4. MITFを行います。MITF遺伝子導入は、PNP-MITFベクトル消化し ​​て8を構築NotIおよびSalI制限酵素で2時間室温で、およびリリース2.65-kbのをサブクローニングすることにより(博士D. Raible、大学からの寛大な贈り物をワシントンの。) MITFプロモーターおよび隣接するI-SceI制限酵素認識部位を含有する改変pBluescriptベクターのNotI及びMluI部位にゼブラフィッシュMITF遺伝子のコード配列を含むDNA断片(博士ホイ鉄からの寛大な贈り物ngの、ボストン大学)、製造業者のプロトコールに従ってT4 DNAリガーゼを用いて。
    注:安定したMYCN発現性の線の発生効率を高めるために、DβH:EGFP-MYCNMITF:MITF DNA構築物は、1細胞期真珠層の胚に同時注入された真珠層は 、神経由来の堤を欠く変異魚のタイプを指定する。開発36中にメラニン保有。このように、注入された胚における色 ​​素細胞の出現はMITFの統合を提案する:MITF DNAがゲノム中に構築する。それは、2つまたは3つの共注入DNA構築物は、魚のゲノム31に共和分できることが実証されている。 EGFP-MYCN遺伝子およびMYCN安定したトランスジェニック系統の識別を容易にするためにこのように、MITF発現によって引き起こされる色素沈着は、DβHの統合のためのマーカーとして役立つことができる。
  5. EGFP-MYCNMITF:MITF DNA のDβHを混ぜるI-SceI制限酵素の1μLとバッファの0.75μlの15μlの反応の総体積:1の比率3で ​​構築します。反応中のDNAの総量は750 NGを超えていないことを確認してください。
  6. 4時間またはO / N RTでI-SceIの消化を行ってください。二日目は、I-SceI-は DNAがマイクロインジェクションのために準備ができているか、将来的に注射のために-20℃で保存することができます消化。その酵素の効率を維持するために、少量のアリコートで-80℃で、I-SceI制限酵素を保管してください。
  7. 博士C. GrabherからpENTRY1Aベクトル(寛大な贈り物のEcoRI及びNotI部位にpcDNA3ベクター(ダナ·ファーバー癌研究所で博士ジョージからの寛大な贈り物)7から人間ALKF1174Lと野生型ALK遺伝子をサブクローニング製造業者のプロトコールに従ってT4 DNAリガーゼを用いて技術、カールスルーエ、ドイツ)のカールスルーエ大学。
  8. DのβHを生成します。ALKF1174L </ em>のか、DβH:プロトコル1.2で述べたように、組換えシステムを使用してALKWTジェニック構築します。簡単に言えば、3エントリークローンを組み合わせ、DβH-pDONRP4-P1R、ALKF1174L- pENTRY1A(またはALKWT -pENTRY1A)とP3E-ポリA、I-SceIの認識部位(博士C. Grabher、カールスルーエからの寛大な贈り物を含有する改変デスティネーションベクターへ工科大学、カールスルーエ、ドイツ)を、製造元のプロトコールに従って、LRクロナーゼ酵素ミックスを用いた。
  9. ミックスDβH:ALKF1174L(またはDβH:ALKWT)とDβH:mCherryを DNAは3で構築:1の割合とプロトコル1.5から1.6に記載されているように、I-SceIを酵素でそれらを線形化する。

2.マイクロインジェクション

  1. すべての注射37用の1.0ミリメートル径のガラスマイクロピペットを使用してください。注射の前にカミソリの刃でガラスマイクロピペットの先端を折ります。注入により注入量のキャリブレーション鉱物油の滴中にH 2 Oをる。得られた液滴の直径を測定し、注入量は、1細胞期胚の全細胞体積の10%未満であることを確実にするインジェクター(圧力または圧力パルスの持続時間)を調整する。
  2. DNAは遺伝子導入38の効率を向上させるために右の注射の前に構築を含む注射液5μlの新鮮なI-SceI制限酵素の追加の0.5μL(5単位/μl)を追加します。 1細胞期胚の細胞質に線形化されたDNA構築物の50〜80頁を注入する。注射の成功を確実にするために、可視化のための0.25%フェノールレッドでサンプルを混ぜる。細胞は、注射後の赤を回す場合には、マイクロインジェクションが成功したことを示します。トランスジェニック魚を生成するための高い成功率を確実にするために、我々は、典型的には500人もの胚を注入する。
  3. EGFP-MYC:安定的MYCNを発現するトランスジェニック魚を生成するには、線形化されたDのβHを coinjectNとMITF:MITF DNA構築物(3:1の比率)1細胞期での色素沈着変異体真珠層のゼブラフィッシュの胚へ。 MITFの発現は、魚のゲノムにおけるトランスジェニックコンストラクトの統合のためのレポーターとして機能します。
  4. 野生型又はMYCN遺伝子導入胚におけるALKのモザイク過剰発現のために、線形化されたDのβHを共同注入する:ALK F1174L(またはDβH:ALKWT)DβH:1 -細胞へ:mCherryを DNAは、(1比3で)構築野生型ABの魚を有するトランスジェニック魚:F1ヘテロ接合のTg(EGFP-MYCNDβH)の繁殖から生じた胚。したがって、子孫の半分はMCYNについてトランスジェニックであり、半分が野生型である。

安定またはモザイクトランスジェニック魚3.画面

  1. トリカイン(0.02%)Aで主に注入された真珠層の胚を麻酔、安定したMYCN発現性ラインの識別の効率を高めるために、T日色素沈着のための受精後、画面の3-5。生殖細胞にEGFP-MYCN導入遺伝子:DβHを運ぶ創業者の魚のためにさらなるスクリーニングのために性的成熟にそれらを新鮮な卵の水で新しいペトリ皿に色素沈着を持つ胚を移し、上げる。
  2. EGFP-MYCN、さらなる遺伝子型決定のため1〜2日後に受精でのEGFP陽性胚のために、野生型ABの魚と画面との異系交配着色されたF0の成魚の生殖系列伝達との創設者を特定するには。 PCRチューブにシングルEGFP陽性F1胚を配置し、すべての液体を除去する。シングル胚に4倍の溶解バッファー12.5μlのが含まれているのgDNA抽出緩衝液50μl、35μlのH 2 Oおよび2.5μlのプロテイナーゼK(10mg / mlの)を追加します。 1Mの1Mトリス(pHは8.4)の500μlを添加、4倍の溶解緩衝液50ミリリットルを作成するにはプロテイナーゼKを不活性化するために98ºCでのインキュベーションの10分に続いて55℃、2.5ミリリットルで2〜3時間にわたって反応をインキュベート塩化カリウムトンH 2 OのO 47ミリリットル注:F0 MYCN安定したトランスジェニック魚は、野生型ABの魚と交配された後、子孫のすべてが着色されている。このため、色素沈着はMYCN-ポジティブ魚の同定のためのマーカーとして使用することはできません。 MYCN遺伝子導入魚に、EGFP-MYCN融合タンパク質は、上頸神経節や、延髄などのシーケンシャル交感神経鎖のセグメント神経節と非PSNSのドーパミン作動性ニューロンの交感神経ニューロンを含む、PSNSで表現されている間、脳神経節8。このように、EGFPの発現は、MYCN安定トランスジェニック胚の同定のためのマーカーとして役立ち得る。
  3. 、テンプレートとして着色されたF1胚から抽出されたgDNAを2μlのを使用して、MYCNとをプライマー-test F1:5'-CTG CTT GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN -R3:5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 」、および次のプログラムのウィット時間GC-RICH PCRシステム:3分間95℃を1サイクル、30秒間95℃の25サイクル、30秒間58℃、3分間72℃。私たちは通常、MITFMYCN過剰発現する、着色された胚における統合されたMYCN導入遺伝子存在を確認するために、単一の交配から複数の6創業者の魚を14〜16着色された胚を遺伝子型は、この方法により同定した。
  4. EGFP陽性F1胚の残りを上げる。フィンクリップ、さらに魚にMYCN導入遺伝子統合を確認するために、上記のプロトコルを使用して、生後2-3カ月でそれらを遺伝子型。野生型ABの魚とF1 MYCN安定したトランスジェニック魚を繁殖させる。 DβH:ALK F1174L(ALKWTまたはDβH:):線形化されたDのβHを共同注入PROTOCOL 2.4で説明したようにmCherryを DNAが1細胞胚に構築する。
  5. 立体的なフッ素を使用してプロトコル2.4で説明した実験で胚を発現性MYCNをソートescence顕微鏡とPSNSにおけるEGFP-MYCNの発現のために受精後の日数1-3で主に注入した胚を選別する。その後、受精後の日の2-5の間に、トリカイン(0.02%)で胚を麻酔して、再度、立体蛍光顕微鏡を用いてPSNSにmCherryを発現に基づくものMYCN-正または負の胚を並べ替える。 mCherryをの発現はモザイク主要注入された動物の組織におけるALKの共発現のためのマーカーとして役立つ。
    :ALK F1174LDβH:mCherryを、DβH:ALKWTDβH:mCherryを 、またはDβH野生型の魚とMYCN安定したトランスジェニック魚の繁殖に起因〜600子孫は、DβHを含む、線状化DNA構築物でグループごとに注入した:mCherryを一人で、それぞれ。 mCherryをモザイク発現は、主に注射した魚の70〜90%で観察することができる。分の1へのワン半分注入された魚の3分の1は、腫瘍の腕時計のための幼虫段階を生き残った。
  6. mCherryを + MYCN +とmCherryを + MYCNのすべてを上げる-胚は、ゼブラフィッシュブック39から標準的なプロトコルに従って、および5週間の受精後から始まる腫瘍の発症を監視します。

モザイクトランスジェニックフィッシュ4.腫瘍の腕時計

  1. 腫瘍の発症の証拠を5週間の受精後から始まる2週間ごとmCherry-ポジティブ主に注入された魚を監視します。
  2. トリカイン(0.02%)とmCherryをの存在のために画面に魚を麻酔-およびEGFPは、デジタル視覚DS-U1カメラを備えたニコンSMZ-1500立体蛍光顕微鏡PSNSに発現腫瘍。
  3. 腫瘍がALK導入遺伝子を発現しているかどうかを確認するには、ALK遺伝子型判定PCRにmCherry-とEGFP陽性塊を分離する。
  4. PCRを用いて、ゲノムDNAを増幅するALK P7:5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 'およびALKの P18:5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3'および以下のPCR反応:1サイクル以下のプライマーを用いて開発された腫瘍から抽出された5分間94℃で、30サイクル(30秒間、30秒間94℃、55℃、および60秒間72°C)。その後、シーケンスALKの P7プライマーを用いたPCR産物は、さらにmCherryを陽性腫瘍における突然変異又は野生型ALKの存在を確認する。

Representative Results

変異により活性化したALKのF1174Lまたは野生型ALKの過剰発現が神経芽誘導にMYCNと共同作業できるかどうかを調べるために、我々はMYCNを過剰発現するトランスジェニック魚のPSNSでのDβHプロモーターの制御下で活性化されたヒトALKまたは野生型ヒトALKのいずれかを過剰発現さ。 ALKF1174LまたはDβH - -以下の構築物、DβHのどちらかALKWTは、DβHで同時注入された- 1細胞の野生型またはMYCN遺伝子組換え胚へのmCherryを2A)8。 mCherryをの発現はモザイク主要注入された動物の組織におけるALKの共発現のためのマーカーを務めた。予想される遺伝子型のすべてが注入された魚で表現された:(1)MYCNが作動ALKF1174LmCherryをモザイク状の共発現で魚を発現性ALKとmCherryをモザイク状の共発現、指定されたMYCNと(2)MYCN発現性魚。 (3)MYCNはmCherryを 、指定されたMYCNのモザイク式で魚を発現性、モザイクmCherryを。モザイクALKmut;活性化ALKF1174LmCherryを 、指定されたWTのモザイク共発現と(4)は、野生型の魚。とWT指定された野生型ALKmCherryを 、のモザイク共発現と(5)は、野生型の魚、モザイクALKWT。腫瘍の時計は、その後492注射した動物の合計5週間の受精後(WPF)から2週間毎に行った。

エイトGFP + / mCherryを+腫瘍のDβHとの同時注入魚を発現性MYCNで9 WPFにより、間腎腺に人間の副腎相当を生じ- ALKF1174 LとDβH - mCherryを図2Bおよび3)。これらの腫瘍はなかったhistologically、免疫組織化学的、およびヒト神経芽細胞腫への超微細構造匹敵する(データが参照8に記載されています)。 ALKWTDβH - -これとは対照的に、全く腫瘍はDβHと同時注入MYCN発現性魚類の生後9週までに見られなかったmCherryを図2Cおよび3、P = 0.002)またはDβHを注入した-一人でmCherryを図2Dおよび3、 P = 0.007)。腫瘍はMYCNの両方で発生した、モザイクALKWTとMYCN、モザイクmCherryを魚誘導の同じ速度で生後12週間後。また、神経芽細胞腫は、モニタリングの15週間の間に、野生型ALKmCherryをまたはALKF1174LmCherryを導入遺伝子のいずれかと同時注入あらゆる野生型の魚では検出されなかった。まとめると、これらの知見は、変異により活性化されたALKのモザイク過剰発現はMYCN誘発腫瘍oをを加速することを示しNSETは、関係なく、個々のモザイク動物での組み込み部位、及びDβHプロモーターによって駆動されるレベルでは、野生型ALKの過剰発現のこのモデル系において神経芽細胞腫を誘導するためにMYCNの過剰発現と協力する表示されません。

図1
図1:従来型の安定した腫瘍形成に候補癌遺伝子の共同出資の研究にモザイク一過ゼブラフィッシュトランスジェニック戦略の概略概要 (A) 安定したトランスジェニック戦略 。。線形化されたトランスジェニックDNA構築物を含有する候補癌遺伝子は、導入遺伝子がランダムゲノム遺伝子座での魚のゲノムに組み込まれ得る1細胞期の野生型または変異体真珠層ゼブラフィッシュ胚に注入される。生殖細胞への導入遺伝子の組み込みはGENERATIOために必要とされる安定したトランスジェニック系統のn個。主に注入された胚は、導入遺伝子の生殖系列伝達と創設者の魚をスクリーニングするために、野生型または変異体真珠層魚と外部交配される、性成熟(魚のF0世代)に達するために3〜4ヶ月かかる。創業者の魚の結果として得られる子孫は、それらのゲノム中に導入遺伝子のヘテロ接合対立遺伝子を運ぶ、F1世代と呼ばれる。腫瘍形成におけるそのような遺伝子のような二つの候補癌遺伝子、「an」および遺伝子「B」、の共同効果を評価するために、我々は化合物の導入遺伝子を運ぶ子孫の唯一の四半期によると、これらの遺伝子を過剰発現する二つの安定のトランスジェニック系統のF1子孫を繁殖さ。そのため、安定したトランスジェニック系統を生成する比較的低い効率のため、このアプローチは、ハイスループット機能ゲノム解析には適していない。 (B) モザイク一過性トランスジェニック戦略 。安定した遺伝子導入と同様に、線形化されたトランスジェニックDNAの共同候補遺伝子を含むnstructsは1細胞期の野生型胚に注入することができる。導入遺伝子は、生殖細胞のゲノムに組み込まれる必要がないので、多くの時間と労力が創始魚を識別するプロセスで保存することができる。候補癌遺伝子のいずれかを過剰発現するトランスジェニック魚のラインは(我々の場合、MYCN遺伝子導入魚が開発された)使用可能な場合、代替的に、他の候補遺伝子を含む線状化トランスジェニックDNA構築物で協力を研究するために1細胞期トランスジェニック胚に注入することができる腫瘍形成。最大3つの導入遺伝子構築物を同時注入し、主に注入された魚31で共発現することができます。このように、腫瘍形成における候補癌遺伝子の相互作用は、主に注入された魚で評価することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図2:活性ALKのモザイク発現はMYCNの発症はエルゼビア(参照3466510609819)から許可を得て、 神経芽腫8修正姿を誘発加速させる(A)モザイク遺伝子導入を構築するためのアプローチ。 (BF)主に注入された胚の2日齢の幼虫。マージされた蛍光明視野像(上パネル)における頭蓋神経節(CG、矢印)を含む、ドーパミン作動性ニューロンにおける安定したEGFP発現の側面図、。頭蓋神経節(CG、矢印)、延髄(MO、矢印)でモザイクmCherryを発現 (下部パネル)の側面図。いくつかの異所性mCherryを発現が非PSNSおよび非ドーパミン作動性ニューロンで観察される。 (G - K)7週齢の主に注射した魚。(B、G)MYCN発現性魚類共注入とDβH - ALKF1174LDβH - mCherryを構築物(MYCN、モザイクALKmut)。EGFP -とmCherryを陽性腫瘍は7週間(Gで白空の矢印)で発生した。 DβHと同時注入(C、H)MYCN発現性の魚- ALKWTDβH - mCherryをは (MYCNを、モザイクALKWT)構築。 DβHを注射された魚を発現性(D、I)MYCN - mCherryを単独で (MYCN、モザイクmCherryを)を構築。 DβHと同時注入(E、J)は、野生型(WT)魚- ALKF1174LDβH - mCherryをは (WTを、モザイクALKmut)構築。 ALKWTDβH - - DβHと同時注入(F、K)は、野生型(WT)魚mCherRYのコンストラクト(WT、モザイクALKWT)。 mCherryをまたはDβH - -神経芽細胞腫は、DβH-ALKWTDβHと同時注入魚発現性MYCNでは観察されなかっただけでは7 WPFでmCherryをし 、またはMYCN導入遺伝子を継承していなかったとどちらALKWT遺伝子または注射した兄弟姉妹のいずれかでALKF1174L遺伝子 。スケールバー、Bが100μm - FGで1ミリメートル- K。ニコンSMZ-1500の立体蛍光顕微鏡デジタル視力DS-U1カメラを装備し、ライカDFC 345FXデジタルカメラを搭載したライカMZ10F立体的な蛍光顕微鏡がimages.Theは、Adobe Photoshopので処理し、コンパイルされた画像を取得した蛍光を捕捉するために使用されたおよびIllustrator CS3(アドビ)ソフトウェア。 拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。

図3
図3:DNA構築物でモザイク同時注入などのMYCN遺伝子導入魚における神経芽腫の発症または野生型(WT)魚。 。DβH - ALKWTDβH - mCherryを (モザイクALKWT); - ALKF1174 LとDβH - mCherryを (モザイクALKmut)エルゼビア(3466510609819を参照)DβHから許可を得て転載。またはDβH - mCherryを (モザイクmCherryを)一人 ​​で8。 ALKF1174 LとDβH - - DβHと同時注入魚を発現性MYCNで9 WPFによる腫瘍の発症との間の差mCherr Y(MYCN、モザイクALKmut)とDβHで同時注入MYCNラインのその- ALKWT DβH - mCherryを (MYCN、モザイクALKWT)またはDβH - mCherryを単独(MYCN、モザイクmCherryを)は、両側フィッシャーの正確確率検定により、それぞれP = 0.002およびp = 0.007、で有意である。

Discussion

この代表的な研究では、これらの遺伝子が著しく化合物、安定したトランスジェニック魚の共発現における当社の以前の知見と一致、神経芽細胞腫の発症を加速するために協力することを示すためにトランスジェニック魚を発現性MYCNmCherryをレポーター遺伝子で活性化ALKの一過性同時注入と同時発現を使用両方のALKMYCN 8を活性化した。このモザイクトランスジェニックアプローチは、従来の方法に比べていくつかの明確な利点を有している。最も重要なことは、典型的には、安定した発現性ALKの育種および識別に関与する過剰な時間と労力をなくすように、安定したトランスジェニック動物を必要とすることなく、主に注射された動物(F0世代)候補癌遺伝子を共発現の効果の迅速な検査を可能にするトランスジェニック魚。また、MYCN上の有無にかかわらず、野生型ALKの過剰発現の効果を調べた腫瘍の開始の式、。結果は、我々の魚モデルにおける野生型ALKの過渡過剰発現に関係なくMYCN遺伝子の状態、神経芽細胞腫、腫瘍形成を開始するのに十分ではないことを示している。これは、野生型の魚の両方で活性化したALKMYCNの一過性の共発現は、主に注入された魚に腫瘍形成の初期の発症を誘導することができるかどうか、将来的にテストするために興味深いものになるだろう。この研究は、より忠実に両遺伝子の体細胞変化が高リスク神経芽細胞腫患者5のサブセットに共起する実際の疾患コンテキストを模倣する。

モザイク過渡トランスジェニック戦略の重要な設計要素は、主に注入されたゼブラフィッシュ胚の中と陽性の魚を監視する導入遺伝子の統合を成功さを持つ動物のスクリーニングに役立つ任意の目的の候補癌遺伝子との同時注入のためのレポーター遺伝子を含めることで、 tumoRの発症および進行。遺伝子導入の効率を高めるために、我々は大幅にメガヌクレアーゼ38を注入した胚の76%にメガヌクレアーゼなしで主に注入された胚の26%から導入遺伝子の均一なプロモーター依存的発現を増加させる、I-SceIをメガヌクレアーゼ媒介トランスジェニックアプローチを適用している。 I-SceIをメガヌクレアーゼ媒介トランスジェニックアプローチの使用が顕著に遺伝子導入の効率を改善したものの、積極的に導入遺伝子のために注入された胚の割合はまだよく100パーセント未満に留まる。したがって、共注入レポーター遺伝子の発現は、さらに、腫瘍の発症のために魚を監視する前に、候補遺伝子の統合の成功と注入した胚を識別するためのマーカーとして役立つことができる。これとは対照的に、トランスポゾン媒介トランスジェニックアプローチは、モデル脊椎動物で人気の遺伝的ツールとなっているし、正常に遺伝子導入、挿入変異誘発、遺伝子トラップのために使用されてきたpingの、および40,41をトラップエンハンサー。受精胚へのトランスポザーゼmRNAとのTol2トランスポゾンの同時注入は、染色体組み込みの効率を高め、導入遺伝子42の正常な生殖系列伝達を増強する初期の組み込み事象を容易にすることができる。しかし、DNA転位の「カット·アンド·ペースト」のメカニズムに起因し、導入遺伝子の単一コピーは、挿入遺伝子座42あたりの染色体に組み込まれる。したがって、共注入の候補遺伝子は、おそらく異なるセル内の候補遺伝子の発現が、主に注射した魚で共注入遺伝子のより複雑な一過モザイク発現パターンにつながる可能性が異なる部位での魚のゲノム中に個々に一体化されている。

全体的に、今回の研究は、共同、おそらく相乗的、高番目の複数の癌遺伝子間の関係を評価するための迅速な手段としてモザイク遺伝子導入の将来の使用をサポートしていますroughput方法、げっ歯類を含む他の動物モデル、と会うことは困難である挑戦。これまで、この戦略は成功し横紋筋肉31の活性化RAS誘導性の開始を抑制する遺伝子を同定し、MYC誘導性T細胞急性リンパ芽球性白血病31の放射線感受性を変更するために、トランスジェニックゼブラフィッシュに適用されている。さらに、Langenauの 、15は熱ショック誘導可能なトランスジェニックアプローチ共射出アプローチを組み合わせることは、腫瘍における癌遺伝子の協調的役割を探求において非常に有用であるかを、主に注射した魚の熱ショックにより導入遺伝子の発現を誘導することができることを実証している進行は、原発腫瘍が確立された後にオンにする遺伝子発現を可能にするように。ごく最近、Langenauのと同僚は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ43RAG2遺伝子を標的とすることにより、最初の免疫不全のゼブラフィッシュモデルを開発した。ロスRAG2の機能について、候補遺伝子を過剰発現する異種の癌細胞を移植し、自己再生能力にモザイク導入遺伝子発現の効果を評価するのに有用であり得るという利点を複数の組織および癌細胞の43の堅牢かつ長期生着を可能にし、治療応答およびこれらの癌細胞の増殖速度。

最後に、モザイクトランスジェネシスは、安定した遺伝子導入を介して別のユニークな利点を提供しています。安定したトランスジェニック動物において、導入遺伝子は、体のあらゆる単一細胞のゲノムに組み込まれ、世代から世代27に遺伝されている。しかし、多くの癌は44生殖細胞において体細胞の代わりに、継承された変異を遺伝的変化から生じる。このように、一次側の導入遺伝子の統合のモザイクパターンが魚を注入し、個々のモザイクトランスジェニック魚の細胞集団内の混合遺伝子型は、より良い目を再現だろうE体細胞の欠陥が患者に見られる、安定したトランスジェニック系統内の単一挿入部位に起因する人工的な位置効果を避けるだろう。一方、主に注入された魚に導入遺伝子を過剰発現する細胞のモザイクと小さな人口が機械論的研究をより困難にする。

要約すると、モザイクトランスジェニック戦略は、腫瘍の開始と普及への癌遺伝子の協調的な貢献を迅速かつ効果的な評価のための強力なツールを提供します。この進歩は、緊急に発癌性のメカニズムおよび経路のさらなる生産的な調査のために、効果的な標的療法を開発するために必要とされる候補癌遺伝子間の相互作用、上の精液情報を生成することが期待されている。つ以上の共注入DNA構築物の共和分の効率を増加させると、缶の様々なタイプで同時に発現される複数遺伝子の組合せの間の複雑な関係を検討するための機会を開くだろう役員。今後の課題は、獲得し、過剰発現されている唯一のタンパク質コードを変更する変異のために、または遺伝子にその使用を腫瘍過程において役割を果たしているのではなく、制限する可能性のあるゲノムまたはエピジェネティックな変化に対応するために、モザイクトランスジェニック戦略を変更することになりますか増幅した。最近では、このような転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼなどの改善されたゲノム編集技術、(TALENS)45とクラスタ化された定期的にinterspaced短い回文反復(CRISPR)/ CRISPR関連(CAS)システム46、広く、より迅速かつ効率的に内因性を修正するために使用されるようになってきた細胞および生物46の様々なタイプの遺伝子。このような技術は、我々は、ゼブラフィッシュモデル系におけるゲノム配列および遺伝子発現の標的化、高効率な変更を実行するために、より良い腫瘍の病因におけるゲノムまたはエピジェネティックな変化の役割の根底にある機構(単数または複数)を理解することができるようになる。これらは、順番に、第拍車をかける可能性がある癌の範囲のための新たな分子治療薬の電子開発。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix
Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

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