Mosaïque poisson zèbre transgénèse pour l'analyse génomique fonctionnelle des gènes candidats de coopération dans la tumeur pathogenèse

Developmental Biology
 

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Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

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Abstract

Introduction

Les cancers sont des maladies évolutives marquées par l'accumulation de mutations pathologiques, des suppressions et des gains de chromosomes au cours du temps. Ces anomalies génétiques peuvent influer sur des processus cellulaires multiples allant du cycle cellulaire, la mort cellulaire, le métabolisme énergétique et l'assemblage du cytosquelette d'insister sur les réponses telles que l'hypoxie. Par conséquent, la tumorigenèse reflète les actions collectives de multiples aberrations génétiques à travers un éventail de processus biologiques. Des efforts récents d'intégration génomiques de recherche, y compris l'ensemble du séquençage du génome, le séquençage de l'exome, le séquençage ciblé, le séquençage profond et études d'association pangénomique, ont identifié un nombre croissant d'altérations génétiques dans pratiquement tous les nouveaux types de tumeurs 1-4. Dans de nombreux cas, les lésions génétiques se produisent ensemble d'une manière non aléatoire 8/5, ce qui suggère leur coopération dans la pathogenèse de la maladie. Disséquer les rôles oncogéniques de la vaste gamme de gènes exprimés de façon aberrante résultant felon ces lésions génomiques est nécessaire de concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques et de comprendre les réponses des cellules tumorales à ces agents, mais cela se est avéré être une tâche ardue, nécessitant des systèmes de modèles animaux très robustes pour la conduite de l'analyse génomique fonctionnelle à haut débit dans vivo.

Bien que les mammifères, notamment les rongeurs, des modèles favorisées en biologie du cancer, du poisson-zèbre est commencé à attirer une attention considérable. Le téléostéens poisson zèbre (Dario rerio) a été utilisé comme un organisme modèle pour l'étude de développement depuis les années 1960 et a été appliquée à l'étude de la pathogenèse de la tumeur première fois en 1982 9-11. Facilité de maintenance, de petite taille du corps, et une fécondité élevée rendre le poisson zèbre, un modèle robuste pour les grands écrans génétiques à terme pour identifier les mutations qui confèrent des phénotypes anormaux et pathologiques 10. La transparence optique des embryons de poisson zèbre est un autre élément clé de soutien plus large utilisation de ce modèle de cancer,il permet l'imagerie in vivo être menées pour localiser le développement de la tumeur en temps réel 9, une application qui est relativement difficile chez les rongeurs 12. Génomique comparative récente analyse du génome de référence poisson zèbre (Zv9) a révélé 26 206 gènes codant pour des protéines, avec 71% ayant orthologues humains, dont 82% sont corrélés avec des gènes associés à la maladie de la ligne mendélienne héritage à Man base de données (OMIM) 13, 14. Par conséquent, le poisson-zèbre a été utilisé pour modéliser différents types de cancers humains, y compris le neuroblastome 8, des cellules T de la leucémie lymphoblastique aiguë (LAL-T) 15,16, 17,18 mélanome, le sarcome d'Ewing 19, 20,21 rhabdomyosarcome, le carcinome du pancréas 22, carcinome hépatocellulaire et 23 tumeurs malignes 24,25 myéloïde, et a été choisi comme un modèle de cancer pour la xénotransplantation étudie 11,26.

Un transgénique stableapproche chez le poisson zèbre est couramment utilisé pour étudier l'effet de gain de fonction des gènes dans le développement normal ou maladie pathogenèse 27,28. Pour développer un tel modèle (figure 1A), on injecte un produit d'assemblage d'ADN contenant le gène d'intérêt dirigé par un promoteur spécifique d'un tissu dans une des cellules d'embryons de type sauvage. Trois à quatre mois après l'injection, lorsque les embryons injectés atteignent la maturité sexuelle, ils sont par croisement avec des poissons sauvages pour dépister ceux qui décrivent l'intégration de la construction d'ADN dans leur lignée germinale, qui les licences que les poissons fondateur. De nombreux facteurs, tels que le nombre de copies et le site d'intégration du transgène, affectent l'expression du transgène dans des lignées transgéniques stables. Ainsi, afin de développer un modèle de tumeur transgénique, plusieurs lignées transgéniques stables surexprimant un seul oncogène doivent être générés premier et projeté de la ligne exprimant le transgène à un niveau qui pourrait conduire à l'induction de tumeurs. Cependant, si la surexpression d'un candidat oncogene est toxique pour les cellules germinales, il est difficile de générer une lignée transgénique stable directement en surexprimant le transgène 29. Par conséquent, cette approche peut prendre beaucoup de temps, avec un risque élevé d'échec pour générer un modèle de cancer approprié.

Ici, nous montrons une stratégie de rechange sur la base de la transgenèse mosaïque transitoire (figure 1B) qui fournit des avantages uniques par rapport transgénèse classique stable pour l'étude génomique fonctionnelle in vivo. Dans cette approche, un ou plusieurs constructions transgéniques sont injectés dans le stade d'une cellule d'transgéniques ou de type sauvage embryons. Les constructions d'ADN injectés contenant des transgènes sont alors mosaically et aléatoirement intégrés dans le poisson injecté primaire, résultant en génotypes mixtes au sein des populations de cellules multiples dans chaque poisson 30. De plus, la co-injection d'ADN dans des embryons multiples construit une des cellules conduit à la co-intégration dans la même cellule dans des sites aléatoires, ce qui permet à une traCE les cellules avec une expression de transgènes et d'explorer les interactions des gènes différents au cours pathogenèse de la maladie chez les animaux mosaïque 31. Comme preuve de principe, nous transitoirement surexprimé ALK par mutation activée (F1174L) avec le gène rapporteur mCherry dans le système nerveux sympathique périphérique (SNPS) sous le contrôle du hydroxylase dopamine bêta (d βh) de promoteur en poissons sauvages et poissons transgéniques surexprimant MYCN. ALK, qui code pour un récepteur tyrosine kinase, est le gène le plus fréquemment muté dans le neuroblastome à haut risque 5-7,32,33. ALK (F1174L), comme l'un des mutations activatrices somatiques les plus fréquentes et les plus puissants, est sur-représentée dans MYCN- amplifié patients de neuroblastome à haut risque et en synergie avec MYCN surexpression d'accélérer neuroblastome tumorigenèse chez les souris transgéniques stables et des modèles de poisson zèbre transgénique 8,34,35. Par mosaïquela surexpression transitoire de ALK (F1174L) avec mCherry dans le poisson transgénique MYCN, on a récapitulé l'accélération de l'apparition de la tumeur observée dans le poisson transgénique stable surexprimant la fois ALK (F1174L) et MYCN, ce qui suggère que la stratégie de transgénèse mosaïque peut être utilisé pour rapidement et efficacement évaluer les contributions respectives de plusieurs oncogènes dans l'initiation de la tumeur in vivo.

Protocol

NOTE: Toutes les études de poisson zèbre et l'entretien des animaux ont été effectuées en accord avec la Mayo Clinic Institut IACUC approuvé le protocole # A41213.

1. Constructions d'ADN pour la transgenèse

  1. Amplifier un 5,2 kb dopamine beta hydroxylase (d βh) région promotrice 8 en utilisant le clone CH211-270H11 BAC (de BACPAC centre de ressources (BPRC)) comme une matrice d'ADN. Utilisation d'un système approprié de PCR pour l'amplification par PCR de matrices d'ADN longues de long et précis et les programmes de cycles suivants pour la PCR: 94 ° C pendant 2 min, 10 cycles de (94 ° C, 15 sec, 50 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), suivie de 30 cycles de (94 ° C, 15 sec, 53 ° C, 30 sec, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (amorce sens 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' et amorce anti-sens 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
  2. Créez le d βh -pDONRP4-P1R entrée cloNE 8 en utilisant le système de clonage recombinant commercial comme passerelle multisite. Mélanger 1 pl de produit de DßH purifiée PCR (172 ng / pl), 1 pi (150 ng / ul) vecteur donneur pDONRP4-P1R (avec d'autres vecteurs de passerelle sont des dons généreux du Dr Chi-Bin Chien, Univ. De l'Utah) , 4 pi de tampon TE (pH 8,0) avec 2 pi de BP clonase mélange enzymatique, incuber pendant 1 heure à 25 ° C, puis se transforment en un TOP10 Shot E. compétente coli selon le protocole du fabricant.
  3. Générez le d βh: transgénique EGFP-MYCN construire 8 en utilisant le système de clonage recombinant mentionné dans l'étape 1.2. Mélanger 1 ul de chaque clone d'entrée (150 ng / ul) comprenant un 5,2-kb promoteur de DßH (DßH -pDONR P4-P1R construction), EGFP manque un codon d'arrêt (PME-EGFP construction), et MYCN humaine ADNc (un don généreux du Dr Hogarty à l'Hôpital pour enfants de Pennsylvanie, MYCN-pDONRP2R-P3 construction), 1 pi (150 ng / pl) du vecteur de destination modifié contenant des sites de reconnaissance I-Scel (un don généreux de Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Allemagne), 4 pi de tampon TE ( pH 8,0) avec 2 ul de mélange enzymatique Clonase LR, incuber pendant 1 h à 25 ° C, puis à transformer chimiquement compétente E. coli comme un haut de tir 10 et suivre le protocole du fabricant.
  4. Assurez-MITF: transgénique MITF construire huit en digérant le vecteur PNP-MITF avec Notl et Sali enzymes de restriction pendant 2 h à température ambiante, et en sous-clonant le libéré 2,65 kb (un don généreux de Dr. D. Raible, Univ of Washington.) Fragment d'ADN qui contient le promoteur de MITF et la séquence codante du gène MITF poisson zèbre dans les sites Notl et Mlul d'un vecteur pBluescript modifié contenant flanquant des sites de reconnaissance I-Scel (un don généreux du Dr. Hui Feng, Boston University), en utilisant la ligase d'ADN T4 selon le protocole du fabricant.
    NOTE: Pour augmenter l'efficacité de la génération de lignées MYCN dites-vous stables, d βh: EGFP-MYCN et MITF:. Constructions d'ADN MITF sont co-injectés dans l'une des cellules d'embryons de nacre étape Nacre désigne un type de poisson mutant manquant d'un crête neurale dérivés mélanophores 36 au cours du développement. Ainsi, l'apparition de cellules de pigment dans les embryons injectés suggère l'intégration de MITF: MITF construit ADN dans le génome. Il a été démontré que deux ou trois constructions d'ADN peuvent être co-injectés co-intégrées dans le génome de poisson 31. Ainsi, la pigmentation causée par l'expression MITF peut servir de marqueur pour l'intégration de la DßH: transgène EGFP-MYCN et pour faciliter l'identification des MYCN lignée transgénique stable.
  5. Mélanger le d βh: EGFP-MYCN et MITF: ADN MITFdes constructions à un rapport de 3: 1 dans un volume total de réaction de 15 ul avec 1 ul d'enzyme I-Scel et 0,75 ul de tampon. Assurez-vous que la quantité totale d'ADN dans la réaction ne dépasse pas 750 ng.
  6. Effectuer la digestion I-Scel à température ambiante pendant 4 h ou O / N. Le deuxième jour, l'I-SceI- ADN digéré sont prêts pour la micro-injection ou peuvent être conservés à -20 ° C pour l'injection dans le futur. Stocker l'enzyme I-Scel à -80 ° C en petites aliquotes à maintenir son efficacité enzymatique.
  7. Sous-cloner l'ALKF1174L humaine et le gène ALK-type sauvage à partir du vecteur pcDNA3 (un don généreux de M. George au Dana-Farber Cancer Institute) 7 dans les sites EcoRI et Notl d'un vecteur pENTRY1A (un don généreux de Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Allemagne) en utilisant l'ADN ligase T4 selon le protocole du fabricant.
  8. Générez le d βh: ALKF1174L </ Em> ou DßH: constructions transgéniques ALKWT utilisant le système recombinant comme mentionné dans le protocole 1.2. Brièvement, combiner trois clones d'entrée, DßH -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (ou ALKWT -pENTRY1A) et P3e-polyA, dans le vecteur de destination modifié contenant des sites de reconnaissance I-Scel (un don généreux de Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Allemagne), en utilisant LR Clonase enzyme Mix, selon le protocole du fabricant.
  9. Mélanger le d βh: ALKF1174L (ou DßH: ALKWT) et DßH: mCherry constructions d'ADN à un ratio de 3: 1 et les linéarisent avec I-Scel enzyme comme décrit dans le protocole 01/05 au 01/06.

2. microinjection

  1. Utilisation micropipettes en verre d'un diamètre de 1,0 mm pour toutes les injections 37. Casser la pointe des micropipettes de verre avec une lame de rasoir avant l'injection. Calibrer le volume d'injection par injectioning H 2 O dans une goutte d'huile minérale. Mesurer le diamètre des gouttelettes obtenues et régler le micro-injecteur (pression ou la durée d'impulsion de pression) afin d'assurer que le volume d'injection est inférieure à 10% du volume total de la pile de cellules d'embryons une étape.
  2. Ajouter un 0,5 pi supplémentaires de frais enzyme I-Scel (5 unités / ul) dans 5 pi de solution injectable contenant de l'ADN construit juste avant l'injection pour augmenter l'efficacité de la transgénèse 38. Injecter 50 à 80 pg de constructions d'ADN linéarisées dans le cytoplasme des embryons de stade unicellulaire. Pour assurer le succès de l'injection, mélanger l'échantillon avec 0,25% de phénol rouge pour la visualisation. Si les cellules deviennent rouges après l'injection, il indique la micro-injection est réussie. Afin d'assurer un taux de réussite élevé pour générer des poissons transgéniques, nous injectons généralement jusqu'à 500 embryons.
  3. Pour générer poissons transgéniques exprimant de manière stable MYCN, coinject linéarisé d βh: EGFP-MYCN et MITF: constructions d'ADN MITF (à un ratio de 3: 1) dans des embryons de la pigmentation mutant nacre poisson zèbre au stade unicellulaire. L'expression de Mitf sert en tant que journaliste pour l'intégration des constructions transgéniques dans le génome du poisson.
  4. Pour surexpression mosaïque de ALK dans le type sauvage ou MYCN embryons transgéniques, co-injecter le linéarisé d βh: ALK F1174L (ou DßH: ALKWT) avec DßH: mCherry constructions d'ADN (à un ratio de 3: 1) dans l'une des cellules embryons résultant de l'élevage de la F1 hétérozygotes Tg (DßH: EGFP-MYCN) poisson transgénique de type sauvage AB poissons. Ainsi, la moitié des enfants sont transgéniques pour MCYN et la moitié sont de type sauvage.

3. écran pour le poisson transgénique stable ou en mosaïque

  1. Pour augmenter l'efficacité de l'identification des lignes de MYCN dites-vous stables, anesthésier embryons de nacre principalement injectés avec tricaïne (0,02%) at jours 3-5 de post-fécondation et l'écran de la pigmentation. Transférer les embryons avec une pigmentation d'une nouvelle boîte de Pétri avec de l'eau d'oeuf frais et de les élever à la maturité sexuelle pour un examen plus poussé pour le poisson fondateur, qui portent le d βh: transgène EGFP-MYCN dans les cellules germinales.
  2. Pour identifier le fondateur avec transmission germinale de EGFP-MYCN, poissons F0 adulte pigmentée outcross de type sauvage AB poissons et de l'écran pour les embryons de EGFP positif à 1-2 jours après la fécondation pour plus génotypage. Placez une seule F1 embryon de EGFP positif dans un tube PCR et éliminer tout le liquide. Ajouter 50 ul de tampon d'extraction ADNg qui contient 12,5 pi de tampon de lyse 4x, 35 ul H 2 O et 2,5 pl de proteinase K (10 mg / ml) à seul embryon. Incuber le mélange réactionnel pendant 3/2 heure à 55 ° C, suivi par 10 min d'incubation à 98ºC pour inactiver la proteinase K. Pour 50 ml de tampon de lyse 4x, ajouter 500 ul de Tris 1 M (pH 8,4), 2,5 ml de 1M KCl to 47 ml de H 2 O. NOTE: Après F0 MYCN stable poissons transgéniques sont élevés avec le type sauvage AB poissons, tous les descendants sont pigmentée. Ainsi, la pigmentation peut pas servir de marqueur pour l'identification des poissons MYCN- positive. Alors que dans le poisson transgénique MYCN, la protéine de fusion EGFP-MYCN est exprimé dans la SNPS, y compris les neurones sympathiques du ganglion cervical supérieur et séquentielle segmentaire ganglion de la chaîne sympathique et les neurones dopaminergiques non-PSN, telles que le bulbe rachidien et 8 ganglions crâniens. Ainsi, l'expression de EGFP peut servir de marqueur pour l'identification des embryons transgéniques stables MYCN.
  3. Utilisez 2 pi de gDNA extraites de l'embryon F1 pigmentée comme matrice, les amorces MYCN -test F1: 5'-CTG CTT GAG GAG AAC CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT TTG AGG ATC AG-3 », et l'esprit de programme suivanth, le GC-RICH système de PCR: 1 cycle de 95 ° C pendant 3 min, 25 cycles de 95 ° C pendant 30 sec, 58 ° C pendant 30 sec, et 72 ° C pendant 3 min. Nous génotype généralement de 14 à 16 embryons pigmentées à partir d'un seul accouplement pour confirmer la présence du transgène MYCN intégré dans les embryons pigmentées, plus de 6 fondateur poissons surexprimant MITF et MYCN ont été identifiés par cette méthode.
  4. Levez le reste des embryons F1 EGFP-positif. Nageoire et le génotype eux à 2-3 mois de l'âge en utilisant le protocole ci-dessus pour confirmer davantage l'intégration des MYCN transgène dans le poisson. F1 Race MYCN poisson transgénique stable avec de type sauvage AB poissons. Co-injecter le d linéarisé βh: ALK F1174L (ou DßH: ALKWT) avec DßH: mCherry d'ADN dans les cellules des embryons une comme décrit dans le protocole 2.4.
  5. Trier le MYCN dites-vous embryons dans l'expérience décrite dans le protocole 2.4 utilisant un fluor stéréoscopiqueescence microscope et dépister les embryons principalement injectés à jour 1-3 de post-fécondation pour l'expression de EGFP-MYCN dans le SNPS. Puis, au cours de 2-5 jours de post-fécondation, les embryons avec anesthésier tricaïne (0,02%) et de trier les embryons MYCN- positifs ou négatifs de nouveau sur la base de l'expression de mCherry dans les SNPS fluorescence en utilisant un microscope stéréoscopique. L'expression de mCherry sert de marqueur pour la co-expression de ALK dans les tissus des animaux injectés primaire mosaïque.
    REMARQUE: ~ 600 progéniture résultant de l'élevage de MYCN poisson transgénique stable avec de type sauvage poissons ont été injectés par groupe avec les constructions d'ADN linéarisées, y compris d βh: ALK F1174L et DßH: mCherry, DßH: ALKWT et DßH: mCherry ou DßH : mCherry seul, respectivement. Mosaïque de mCherry expression peut être observée dans 70-90% des poissons principalement injecté. La moitié de ONE-tiers des poissons injecté survécu par le stade de larves pour montre de la tumeur.
  6. Relevez tous les mCherry + MYCN + et + mCherry MYCN - embryons selon les protocoles standards du livre poisson zèbre 39 et de surveiller l'apparition de la tumeur à partir de 5 semaines post-fécondation.

4. tumeur Watch à Mosaic poissons transgéniques

  1. Surveiller mCherry- positif poissons principalement injecté tous les deux semaines à partir de 5 semaines post-fécondation des preuves de l'apparition de la tumeur.
  2. Anesthésier poisson avec tricaïne (0,02%) et l'écran de la présence de mCherry - et dites-vous EGFP tumeurs dans les SNPS sous le Nikon SMZ-1500 fluorescence stéréoscopique microscope équipé d'un viseur d'appareil photo numérique DS-U1.
  3. Pour vérifier si les tumeurs expriment le transgène de ALK, isoler la mCherry- et des masses de EGFP positif pour ALK génotypage PCR.
  4. En utilisant la PCR, l'ADN génomique à amplifierextrait de tumeurs développées avec les amorces suivantes: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT GTC CGG AAT GC-3 'et ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT GC-3' et la réaction PCR suivant: 1 cycle de 94 ° C pendant 5 min, 30 cycles de (94 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 sec, et 72 ° C pendant 60 secondes). Ensuite, la séquence du produit PCR avec ALK P7 amorce pour confirmer encore l'existence de mutant ou de type sauvage ALK dans les tumeurs mCherry-positifs.

Representative Results

Afin de déterminer si la surexpression de F1174L ALK par mutation activée ou de type sauvage ALK pourrait collaborer avec MYCN dans le neuroblastome induction, nous avons surexprimé soit ALK humaine activée ou de type sauvage ALK humaine sous le contrôle du promoteur d de βh dans le SNPS des poissons transgéniques surexprimant MYCN. Chacune des constructions suivantes, DßH - ALKF1174L ou DßH - ALKWT, ont été co-injectés avec DßH - mCherry dans une cellule de type sauvage ou MYCN embryons transgéniques (figure 2A) 8. L'expression de mCherry servi en tant que marqueur pour la co-expression de ALK dans les tissus des animaux injectés primaire mosaïque. Tous génotypes attendus étaient représentés dans le poisson injecté: (1) MYCN dites-vous poisson avec coexpression mosaïque de activé ALKF1174L et mCherry MYCN dites-vous poisson avec coexpression mosaïque de type sauvage ALK et mCherry, MYCN désigné; mosaïque ALKWT; (3) MYCN dites-vous du poisson avec l'expression mosaïque de mCherry, MYCN désigné; mosaïque mCherry; (4) de type sauvage poisson avec coexpression mosaïque de activé ALKF1174L et mCherry, WT désigné; mosaïque ALKmut; et (5) de type sauvage poisson avec coexpression mosaïque de type sauvage ALK et mCherry, désignée WT, mosaïque ALKWT. Une montre de la tumeur a été ensuite effectuée toutes les 2 semaines à partir de 5 semaines post-fécondation (WPF) sur un total de 492 animaux injectés.

Huit GFP + / + mCherry tumeurs ont été soulevées dans la glande interrénal, la glande surrénale équivalent humain, par 9 WPF dans le poisson de MYCN dites-vous co-injectés avec d βh - ALKF1174 L et DßH - mCherry (figures 2B et 3). Ces tumeurs étaient histogiquement, immunohistochimique et ultrastructural comparable à neuroblastome humain (données peuvent être trouvés dans la référence 8). En revanche, aucune tumeur n'a été observée par 9 semaines d'âge dans le poisson de MYCN dites-vous co-injectés avec DßH - ALKWT et DßH - mCherry (figures 2C et 3, p = 0,002) ou injectés avec DßH - mCherry seul (figures 2D et 3, p = 0,007). Les tumeurs ont été soulevées dans les deux MYCN; mosaïque ALKWT et MYCN; poissons mosaïque mCherry avec le même taux d'induction après 12 semaines d'âge. En outre, les neuroblastomes ne ont pas été détectés dans des poissons de type sauvage co-injectés avec soit l'ALK-type sauvage et mCherry ou ALKF1174L et mCherry transgènes au cours des 15 semaines de suivi. Pris ensemble, ces résultats montrent que la surexpression mosaïque de par mutation activé ALK accélère MYCN tumeur induite par onset, quel que soit le site d'intégration dans les animaux mosaïques individuelles, et que la surexpression de type sauvage ALK au niveau commandé par le promoteur de la DßH ne apparaît pas à collaborer avec MYCN d'induire la surexpression de neuroblastome dans ce système de modèle.

Figure 1
Figure 1: aperçu schématique de stable conventionnelle et stratégies transitoires de poisson zèbre transgénique mosaïque dans l'étude des Contributions coopératives d'oncogènes candidats à la tumorigenèse (A) de la stratégie transgénique Stable.. Linéarisé transgénique construction d'ADN contenant oncogène candidat est injecté dans la première étape des cellules de type sauvage ou embryons de poisson zèbre mutant nacre où le transgène peut être intégré dans le génome du poisson à des loci génomiques aléatoire. Intégration de transgène dans les cellules germinales est requise pour l'generation de la ligne transgénique stable. Principalement embryons injectés prennent 3-4 mois pour atteindre la maturité sexuelle (génération F0 de poissons), qui sera par croisement de type sauvage ou de poisson mutant nacre pour dépister le poisson fondateur de la transmission de la lignée germinale transgène. La progéniture résultant de poisson fondateur, dite génération F1, portent les allèles hétérozygotes du transgène dans leur génome. Pour évaluer les effets de collaboration de deux oncogènes candidats, tels que le gène "a" et le gène "b", dans la tumorigenèse, nous BRED la descendance F1 de deux lignées transgéniques stables surexprimant ces transgènes, avec seulement un quart de la descendance portant les transgènes composés. En raison de l'efficacité relativement faible de générer des lignées transgéniques stables, cette approche ne est pas possible pour les analyses à haut débit de génomique fonctionnelle. (B) Mosaïque stratégie transgénique transitoire. Semblable à la transgénèse stable, linéarisé co ADN transgénique nstructs contenant des gènes candidats peuvent être injectés dans une scène cellules d'embryons de type sauvage. Parce que le transgène ne doit pas être intégré dans le génome des cellules germinales, beaucoup de temps et d'efforts peuvent être enregistrés dans le processus d'identification des poissons fondateur. Alternativement, si la ligne de poissons transgéniques surexprimant l'un des oncogènes candidats est disponible (dans notre cas, MYCN poissons transgéniques ont été développés), constructions d'ADN transgéniques linéarisées contenant d'autres gènes candidats peuvent être injectés dans une des cellules d'embryons transgéniques étape pour étudier leur coopération dans tumorigenèse. Jusqu'à trois constructions transgéniques peuvent être co-injectés et co-exprimées dans le poisson principalement injecté 31; Ainsi, l'interaction des oncogènes candidats dans la tumorigenèse peut être évaluée dans le poisson principalement injecté. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2: Expression de Mosaic Activé ALK accélère l'apparition de MYCN induite par neuroblastome 8 modification chiffre avec la permission d'Elsevier (référence 3466510609819).. (A) pour la construction de la transgénèse approche mosaïque. (BF) 2-day-old larves d'embryons principalement injectés. Des vues latérales d'expression de EGFP stable dans les neurones dopaminergiques, y compris les ganglions crâniens (CG, pointes de flèches) dans les images de fluorescence-fond clair fusionnées (panneaux supérieurs). Des vues latérales d'expression de mCherry mosaïque (panneaux inférieurs) dans les ganglions crânienne (CG, pointes de flèche), le bulbe rachidien (MO, flèches). Certains expression ectopique de mCherry est observée dans le non-SNPS et les neurones non dopaminergiques. (G - K) 7 semaines vieux poissons principalement injectés.(B, G) MYCN dites-vous poissons co-injectés avec d βh - ALKF1174L et DßH - mCherry construit (MYCN; mosaïque ALKmut). EGFP - et les tumeurs -positifs mCherry surgi à 7 semaines (flèches blanches vides à G). (C, H) ​​MYCN dites-vous poissons co-injectés avec DßH - ALKWT et DßH - mCherry construit (MYCN; mosaïque ALKWT). (D, I) MYCN dites-vous poissons injectés avec DßH - mCherry construire seul (MYCN; mosaïque mCherry). (E, J) de type sauvage (WT) poissons co-injectés avec DßH - ALKF1174L et DßH - mCherry construit (WT; mosaïque ALKmut). (F, K) de type sauvage (WT) poissons co-injectés avec DßH - ALKWT et DßH - mCherconstructions ry (WT; mosaïque ALKWT). Neuroblastomes ont pas été observés dans le MYCN dites-vous poissons co-injectés avec DßH-ALKWT et DßH - mCherry ou DßH - mCherry seul à 7 WPF, ou dans l'un des frères et sœurs qui ne héritent pas le transgène MYCN et ont été injectés avec soit le gène ALKWT ou le gène ALKF1174L. Barres d'échelle, 100 pm B - F et 1 mm de G - K. Un microscope à fluorescence stéréoscopique Nikon SMZ-1500 équipé avec une vue de la caméra numérique DS-U1 et un Leica MZ10F fluorescence stéréoscopique microscope équipé d'un appareil photo numérique Leica DFC 345FX ont été utilisés pour capturer le images.The fluorescente acquises images ont été traitées et compilées avec Adobe Photoshop et Illustrator CS3 (Adobe) logiciel. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grandede ce chiffre.

Figure 3
Figure 3: Début de neuroblastome en MYCN poissons transgéniques ou de type sauvage (WT) poisson comme Mosaïques co-injectés avec les constructions ADN. Reproduit avec la permission d'Elsevier (référence 3466510609819) d βh - ALKF1174 L et DßH - mCherry (mosaïque ALKmut);. DßH - ALKWT et DßH - mCherry (de ALKWT mosaïque); ou DßH - mCherry (mosaïque mCherry) seul 8. La différence entre l'apparition de la tumeur par 9 WPF dans le poisson de MYCN dites-vous co-injectés avec DßH - ALKF1174 L et DßH - mCherr y (MYCN; mosaïque ALKmut) et que, dans la ligne de MYCN co-injectés avec DßH - ALKWT DßH - mCherry (MYCN; mosaïque ALKWT) ou DßH - mCherry seul (MYCN; mosaïque mCherry) est significatif à p = 0,002 et P = 0,007, respectivement, par deux queue test exact de Fisher.

Discussion

Dans cette étude représentative, nous avons utilisé co-injection transitoire et co-expression de ALK activé avec le gène rapporteur mCherry dans MYCN dites-vous les poissons transgéniques à montrer que ces gènes coopèrent pour accélérer nettement le début de neuroblastome, conformément à notre constatation précédente composé stable coexprimant de poissons transgéniques deux ALK et MYCN 8 activé. Cette approche transgénique mosaïque possède plusieurs avantages distincts par rapport au procédé conventionnel. Plus important encore, il permet l'examen rapide des effets de co-exprimant des oncogènes candidats chez les animaux principalement injectés (génération F0), sans l'exigence d'animaux transgéniques stables, comme en éliminant le temps excessive et le travail généralement impliqués dans l'élevage et l'identification des ALK dites-vous stable poissons transgéniques. Nous avons également examiné l'effet de la surexpression de type sauvage ALK, avec ou sans MYCN plusexpression, sur l'initiation de la tumeur. Les résultats montrent que la surexpression transitoire de type sauvage ALK dans notre modèle de poisson ne est pas suffisante pour amorcer la tumorigenèse neuroblastome, indépendamment du statut de l'oncogène MYCN. Il serait intéressant de tester à l'avenir si la co-expression transitoire de deux ALK activé et MYCN dans les poissons de type sauvage pourrait induire l'apparition précoce de la tumorigenèse dans le poisson principalement injecté. Cette étude serait plus fidèlement imiter le contexte de la maladie réelle, dans laquelle des modifications somatiques des deux gènes co-produisent dans un sous-ensemble de patients atteints de neuroblastome à haut risque 5.

Un élément important de design de la stratégie transgénique transitoire mosaïque est l'inclusion d'un gène rapporteur pour co-injection avec des oncogènes candidats d'intérêt, ce qui facilite le dépistage des animaux avec l'intégration réussie des transgènes entre les embryons de poisson zèbre principalement injectées et de suivre le poisson positif pour toumor apparition et la progression. Pour augmenter l'efficacité de la transgénèse, nous avons appliqué l'approche transgénique méganucléase I-Scel-médiation, ce qui augmente significativement l'expression de promoteur dépendant uniforme de transgènes de 26% des embryons principalement injectés sans méganucléase à 76% des embryons injectés avec méganucléase 38 . Bien que l'utilisation de la méganucléase médiation approche transgénique I-Scel a amélioré l'efficacité de la transgénèse remarquable, le pourcentage des embryons injectés positive pour les transgènes reste encore bien en dessous de 100%. Ainsi, l'expression d'un gène rapporteur co-injectés peut servir de marqueur pour identifier les embryons injectés avec intégration des transgènes candidats devant en outre la surveillance du poisson pour l'apparition de tumeurs. En revanche, un transposon médiation approche transgénique Tol2 est devenu un outil génétique populaire chez les vertébrés du modèle et a été utilisé avec succès pour la transgenèse, mutagenèse insertionnelle, piégeage de gènesping, et l'amplificateur piégeage 40,41. Co-injection de transposons Tol2 avec la transposase de l'ARNm dans des embryons fécondés peut faciliter premiers événements d'intégration qui augmente l'efficacité de l'intégration chromosomique et potentialise succès la transmission germinale du transgène 42. Cependant, en raison du mécanisme "couper-coller" de transposition de l'ADN, une seule copie du transgène est intégré dans le chromosome par locus d'insertion 42. Ainsi, les gènes candidats co-injectés sont probablement intégrés individuellement dans le génome du poisson à différents sites, ce qui pourrait conduire à l'expression de gènes candidats dans des cellules différentes et un modèle transitoire et mosaïque plus compliqué expression de gènes co-injectés dans le poisson principalement injecté.

Globalement, l'étude actuelle prend en charge l'utilisation future de la transgénèse mosaïque comme moyen rapide d'évaluer la collaboration, peut-être synergique, les relations entre plusieurs oncogènes dans un haut-èmeroughput manière, un défi qui est difficile à rencontrer d'autres modèles animaux, y compris les rongeurs. Jusqu'à présent, cette stratégie a également été appliquée avec succès chez le poisson zèbre transgénique pour identifier les gènes qui suppriment le RAS initiation induite activé de rhabdomyosarcome 31 et modifient la sensibilité de rayonnement de T-cellulaire induite MYC-leucémie lymphoblastique aiguë 31. En outre, Langenau et al, 15 ont démontré que la combinaison de l'approche de co-injection avec une approche transgénique choc thermique inductible peut induire l'expression du transgène par choc thermique dans le poisson principalement injectée, ce qui serait très utile pour explorer les rôles de coopération d'oncogènes dans la tumeur progression, car elle permet l'expression du gène à être allumé après que la tumeur primaire soit établie. Très récemment, Langenau et ses collègues ont développé le premier modèle de poisson zèbre immunodéprimés en ciblant gène rag2 avec ingénierie à doigt de zinc 43 nucléases. Pertede la fonction de rag2 permise greffe robuste et à long terme de multiples tissus et les cellules cancéreuses 43, un avantage qui pourrait être utile dans la transplantation des cellules cancéreuses hétérogènes qui surexpriment transgènes candidats et évaluer l'effet de l'expression du transgène mosaïque sur l'auto-capacité de renouvellement, thérapeutique réponses et le taux de ces cellules cancéreuses de croissance.

Enfin, la transgénèse mosaïque offre un autre avantage unique sur la transgénèse stable. Chez les animaux transgéniques stables, les transgènes sont intégrés dans le génome de chaque cellule dans le corps et sont héréditaires d'une génération à 27. Cependant, de nombreux cancers proviennent des altérations génétiques dans les cellules somatiques au lieu de mutations héréditaires dans les cellules germinales 44. Ainsi, la mosaïque d'intégration du transgène dans le primaire injecté des poissons et les génotypes mixtes au sein des populations de cellules de poisson transgéniques mosaïques individuels permettrait de mieux récapituler ee somatiques défauts trouvés chez les patients et éviterait l'effet positionnel artificielle provoquée par un seul site d'insertion dans une lignée transgénique stable. D'autre part, la mosaïque et une petite population de cellules surexprimant des transgènes dans le poisson principalement injecté étude mécaniste rend plus difficile.

En résumé, la stratégie transgénique mosaïque fournit un outil robuste pour l'évaluation rapide et efficace de la contribution coopérative d'oncogènes à l'initiation de la tumeur et la propagation. Cette avance devrait générer des informations séminal sur l'interaction entre les oncogènes candidats, qui est urgent pour complément d'enquête de production de mécanismes et voies oncogéniques et pour développer une thérapie ciblée efficace. Accroître l'efficacité de cointégration de plus de trois constructions d'ADN co-injectés ouvrirait la possibilité pour l'examen des relations complexes entre les combinaisons multigéniques simultanément exprimées dans divers types de boîteURCE. Défis pour l'avenir sera de modifier la stratégie transgéniques mosaïque pour accueillir une modification génomique ou épigénétique qui pourrait jouer une rôle dans le processus néoplasique, plutôt que de limiter son utilisation aux mutations que changent seule protéine-codage ou de gènes surexprimés, gagné ou amplifié. Récemment, l'amélioration des techniques de montage sur le génome, comme transcription nucléases de type activateur de effectrices (TALENS) 45 et regroupés répétitions palindromiques courts régulièrement espacées (CRISPR) / (CAS) systèmes CRISPR associée 46, ont largement pris l'habitude de plus rapidement et efficacement modifier endogène gènes dans divers types de cellules et des organismes 46. Ces techniques nous permettraient d'effectuer ciblé, modifications hautement efficaces de la séquence du génome et l'expression des gènes dans le système de modèle de poisson zèbre et de mieux comprendre le mécanisme (s) sous-tend le rôle des altérations génomiques ou épigénétiques dans la pathogenèse de la tumeur. Ceux-ci, à leur tour, sont susceptibles de stimuler eLe développement de l'thérapeutique moléculaires pour une gamme de cancers.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix
Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

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